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Gegenstand der Erfindung sind ein Verfahren zur simultanen Bestimmung der Verunreinigungen von einem Aminoglycosid, insbesondere Gentamicinsulfat, und einem Glykopeptid, insbesondere Vancomycinhydrochlorid, insbesondere für Arzneimittel oder medizinische Produkte, die diese Wirkstoffmischung enthalten, eine dafür geeignete HPLC-Anlage und deren Verwendung.
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Die Qualitätskontrolle von pharmazeutischen Substanzen ist eine Voraussetzung für die sichere Anwendung von Arzneimitteln und Medizinprodukten, die pharmazeutische Substanzen enthalten. Hierzu gehört die Bestimmung von Verunreinigungen einer pharmazeutischen Substanz.
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Für diese Analyse sind Arzneibücher, wie das Europäische Arzneibuch, von großer Bedeutung, in denen die Kontrolle von Verunreinigungen reguliert wird. So enthält das Europäische Arzneibuch Monographien zu pharmazeutischen Substanzen, in den Prüfungsverfahren zur Erfassung von Verunreinigungen einschließlich sogenannter "verwandter Substanzen" aufgeführt sind.
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Häufig enthalten Arzneimittel oder medizinische Produkte Wirkstoffmischungen aus zwei oder mehr pharmazeutischen Substanzen, die ebenfalls kontrolliert werden müssen. Dabei kann es sich um eine Kombination aus einem Aminoglycosid und einem Glykopeptid handeln, die als Antibiotika-Kombination eingesetzt werden. So wird z.B. von der Heraeus Medical GmbH der Revisions-Polymethylmethacrylat-Knochenzement Copal® G + V hergestellt und vertrieben, der eine Kombination der Antibiotika Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid enthält.
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Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid sind im Knochenzement in fester Form enthalten und die beiden Antibiotika können durch wässrige Extraktion des unlöslichen Zementpulvers in Lösung gebracht werden. Wegen der Wasserlöslichkeit der beiden Antibiotika ist eine Trennung durch selektive Lösungsstufen nicht möglich. Ein Verfahren zu Trennung von Gentamicin- und Vancomycin-Verunreinigungen ist in der Technik nicht bekannt.
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Zur Bestimmung der Verunreinigungen von Vancomycin und Gentamicin werden bislang an jeder Zementprobe zwei separate Messungen durchgeführt.
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Die Trennung und Quantifizierung der Haupt- und Nebenkomponenten von Gentamicinsulfat erfolgt mit Hilfe einer isokratischen HPLC-Methode. Insbesondere wird die durch wässrige Extraktion des Knochenzements erhaltene Lösung nach den Vorgaben des europäischen Arzneibuchs zur Bestimmung der Verunreinigungen in Gentamicinsulfat (Monograph 01/2008:0331 corrected 6.0) analysiert. Das eingesetzte HPLC-Verfahren beruht auf einer isokratischen Trennung über eine PS-DVB Trennsäule. Die Detektion erfolgt mit einem elektrochemischen Detektor nach Zudosieren von 0,5M NaOH. Die Messzeit pro Analyse beträgt ca. 75 min.
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Die aktuelle Methode zur Bestimmung der Verunreinigungen in Gentamicinsulfat gemäß dem europäischen Arzneibuch (erstmals veröffentlicht in Monograph 04/2011:0331 corrected 7.1) beruht ebenfalls auf einer isokratischen Trennung über eine Standard C18-Phase. Die Detektionsmethode durch elektrochemische Detektion nach Zudosieren von 0,5M NaOH wurde beibehalten, da Gentamicin keine UV-aktiven Gruppen enthält. Durch Anpassen von Säulentyp und verwendetem Laufmittel ist das Analysensystem jedoch deutlich robuster als die vorherige Methode. Die aktuell gültige Version ist Monograph 04/2011:0331 corrected 7.6, worin keine wesentlichen Änderungen zu Version 7.1 vorgenommen wurden.
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Die Trennung und Quantifizierung der Haupt- und Nebenkomponenten von Vancomycinhydrochlorid erfolgt mit Hilfe einer separaten Gradienten-HPLC. Hierfür wird die durch wässrige Extraktion des Knochenzements erhaltene Lösung auf Vancomycin Verwandte Substanzen gemäß dem europäischen Arzneibuch (Monograph 01/2008:1058 corrected 7.0) geprüft. Die Messzeit pro Analyse beträgt ca. 30 min.
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Somit gibt es gemäß dem europäischen Arzneibuch zwei verschiedene HPLC-Methoden, die eine Quantifizierung der Verunreinigungen von Gentamicinsulfat oder Vancomycinhydrochlorid erlauben. Die Anwendung dieser Methoden auf eine Mischung der beiden Antibiotika erfordert eine zweifache Analyse des Wirkstoffgemischs. Dieses Vorgehen hat im Wesentlichen zwei Nachteile:
- 1.) Bei einigen Nebenkomponenten von Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid kommt es zu Überlagerungen. Aus diesem Grund lassen sich die Nebenkomponenten nicht einzeln sondern nur in Summe quantifizieren. Dies steht im Widerspruch zu den Forderungen des Arzneibuchs.
- 2.) Die Anwendung von zwei verschiedenen Methoden erfordert die Anschaffung und Optimierung von zwei unterschiedlichen HPLC-Systemen bzw. die Beauftragung eines externen Dienstleisters mit jeweils zwei Analysen pro Probe.
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Die bekannten Analysenmethoden zur Bestimmung der Verunreinigungen erfordern somit eine aufwändige Doppelanalyse und durch Überlagerung einzelner Signale ist keine exakte Quantifizierung möglich. Auch bei anderen Wirkstoffkombinationen aus einem Aminoglycosid und einem Glykopeptid ist in der Regel eine Doppelanalyse möglich, eine simultane Analyse der Verunreinigungen beider Komponenten in einem Arbeitsgang aber nicht.
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Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, die vorstehend genannten Nachteile des Standes der Technik zu überwinden. Insbesondere soll eine simultane Trennung und Quantifizierung der Haupt- und Nebenkomponenten in einer Wirkstoffmischung von einem Aminoglycosid, insbesondere Gentamicin, und einem Glykopeptid, insbesondere Vancomycin, unter Bestimmung der verwandten Substanzen beider Wirkstoffe in einem Analysenlauf realisiert werden.
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Die Aufgabe der Erfindung konnte überraschenderweise durch Anwendung einer Gradienten-HPLC-Methode unter kombiniertem Einsatz von UV-Detektion und elektrochemischer Detektion zur simultanen Trennung und Quantifizierung aller Neben- und Hauptkomponenten der Wirkstoffmischung gelöst werden.
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Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Verunreinigungen in einer Wirkstoffmischung aus einem Aminoglycosid und einem Glykopeptid, insbesondere Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid, umfassend die Trennung der Bestandteile der Wirkstoffmischung durch eine Gradienten-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, wobei die Verunreinigungen des Glykopeptids durch UV-Detektion und die Verunreinigungen des Aminoglycosids durch elektrochemische Detektion bestimmt werden, wobei die elektrochemische Detektion stromabwärts von der UV-Detektion erfolgt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird zwischen der UV-Detektion und der elektrochemischen Detektion eine Elektrolytlösung in den Eluatstrom zudosiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Aminoglycosid Gentamicinsulfat und das Glykopeptid Vancomycinhydrochlorid, wobei es hierbei ebenfalls bevorzugt ist, dass zwischen der UV-Detektion und der elektrochemischen Detektion eine Elektrolytlösung in den Eluatstrom zudosiert wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, an Stelle von zwei Analysen pro Probe nur noch eine Analyse pro Probe bei verbesserter Trennleistung durchzuführen. Durch die simultane Bestimmung der Verunreinigungen in der Wirkstoffmischung ergibt sich eine deutliche Ersparnis an Zeit, Materialien und Kosten. Ferner lassen sich die Nebenkomponenten der Wirkstoffe in der Mischung einzeln quantifizieren, so dass deutlich genauere Aussagen möglich sind.
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Die Erfindung betrifft ferner eine HPLC-Anlage zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und deren Verwendung. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen wiedergegeben. Im Folgenden wird die Erfindung ausführlich erläutert.
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In der Anmeldung werden folgende Abkürzungen verwendet:
| HPLC | Hochleistungsflüssigkeitschromatographie |
| Ph. Eur. | Europäisches Arzneibuch (European Pharmacopoeia) |
| TFA | Trifluoressigsäure |
| PFP | Pentafluorpropionsäure |
| ACN | Acetonitril |
| IPAD | Integrierte gepulste amperometrische Detektion |
| UV | Ultraviolettlicht |
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Organische Verunreinigungen werden in Ph. Eur. auch als "verwandte Substanzen" bezeichnet. Sofern nicht anders angegeben, gelten die Begriffsdefinitionen und soweit anwendbar die Bedingungen, die in Ph. Eur. ausgeführt sind.
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1 zeigt den schematischen Aufbau eines Beispiels einer HPLC-Anlage gemäß der Erfindung.
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2a–c zeigen Chromatogramme von Getamicinsulfat, Vancomycinhydrochlorid bzw. einer Wirkstoffmischung von Getamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid, die gemäß dem Referenzbeispiel erhalten werden.
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3a–b zeigen Chromatogramme von Vancomycinhydrochlorid, die aus einer Wirkstoffmischung von Getamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid gemäß dem Referenzbeispiel (3a) bzw. gemäß dem Beispiel der Erfindung (3b) erhalten werden.
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4a zeigt einen Overlay-Plot der Chromatogramme von Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid, der bei Anwendung der erfindungsgemäßen Gradienten-Methode gemäß dem Beispiel erhalten wird. 4b zeigt als Ausschnitt von 4a nur Bereich der Gentamicinsignale.
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Aminoglycoside und Glykopeptide werden als Antibotika in großem Umfang eingesetzt. Die als Antibiotika eingesetzten Stoffklassen weisen in der Regel unterschiedliche Wirkmechanismen auf. Aminoglycosid-Antibiotika sind z.B. bakterizid und wirken hauptsächlich gegen gram-negative Aerobier. Glykopeptid-Antibiotika wirken gegen gram-positive Bakterien. Es werden daher häufig Kombinationspräparate, d.h. Mischungen verschiedener Antibiotika, z.B. Mischungen aus einem Aminoglycosid und einem Glykopeptid, eingesetzt.
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Aminoglycoside, wie z.B. Gentamicin, und deren Verunreinigungen weisen keine UV-aktiven Gruppen auf und sind daher bei der UV-Detektion nicht sichtbar bzw. bestimmbar. Dagegen können Glykopeptide, wie z.B. Vancomycin, und deren Verunreinigungen durch UV-Detektion bestimmt werden. Sowohl Aminoglycoside als auch Glykopeptide sind durch elektrochemische Detektion bestimmbar. Diese Eigenschaften werden durch die vorliegende Erfindung ausgenutzt.
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Aminoglycoside und Glykopeptide werden häufig in Salzform eingesetzt. Die Ausdrücke Aminoglycosid und Glykopeptid wie hier verwendet umfassen daher immer auch Salze davon, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben.
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Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Glycopeptide sind Vancomycin, Dalbavancin und Ramoplanin, wobei Vancomycin bevorzugt ist. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Aminoglycoside sind Gentamicin, Tobramycin, Amikacin, Netilmicin und Sisomicin, wobei Gentamicin bevorzugt ist.
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Die zu analysierende Wirkstoffmischung ist bevorzugt eine Kombination aus einem Glycopeptid ausgewählt aus Vancomycin, Dalbavancin und Ramoplanin oder einem Salz davon und einem Aminoglycosid ausgewählt aus Gentamicin, Tobramycin, Amikacin, Netilmicin und Sisomicin oder einem Salz davon, wobei die Kombination von Vancomycin, insbesondere Vancomycinhydrochlorid, und Gentamicin, insbesondere Gentamicinsulfat, besonders bevorzugt ist.
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Einzelheiten zu den genannten Aminoglycosiden und Glykopeptiden finden sich in den jeweiligen Monographien im Ph. Eur., worin auch chromatographische Verfahren zur Bestimmung der Verunreinigungen der jeweiligen Aminoglycoside und Glykopeptide beschrieben sind und Angaben zu verwandten Substanzen gemacht werden. Sofern nicht anders angegeben, wird auf die 7. Ausgabe der Ph. Eur. Bezug genommen. Im folgenden wird die Erfindung insbesondere anhand der Kombination von Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid näher erläutert. Die Angaben gelten sinngemäß auch für Kombinationen anderer Aminoglycoside und Glykopeptide, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben.
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Gentamicin ist ein Aminoglycosid-Antibiotikum, das in Form des Sulfatsalzes verwendet wird. Gentamicin wird aus Micromonospora purpurea gewonnen und ist ein Gemisch strukturell ähnlicher Aminoglycoside. Nähere Einzelheiten zu Gentamicinsulfat finden sich z.B. in Ph. Eur. 7.6, Monographie 04/2011:0331.
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Vancomycin ist ein Glykopeptid-Antibiotikum, das als Hydrochlorid verwendet wird. Vancomycin kann aus Amycolatopsis orientalis-Stämmen gewonnen werden und ist eine Mischung verwandter Glykopeptide, wobei Vancomycin B die Hauptkomponente ist. Nähere Einzelheiten zu Vancomycinhydrochlorid finden sich z.B. in Ph. Eur. 7.0, Monographie 01/2008:1058.
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In der Regel erfolgt eine wässrige Extraktion der Wirkstoffmischung aus einem medizinischen Produkt, insbesondere einem Knochenzementpulver, oder einem Arzneimittel. Es können auch andere übliche Verfahren zur Trennung der Wirkstoffmischung aus dem medizinischen Produkt oder dem Arzneimittel eingesetzt werden. Die Wirkstoffmischung kann gegebenenfalls andere Bestandteile aus dem medizinischen Produkt oder dem Arzneimittel enthalten, sofern sie die Analyse nicht stören. Natürlich können auch bereits isoliert vorliegende Wirkstoffmischungen analysiert werden.
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Zur Probenvorbereitung wird die Wirkstoffmischung bevorzugt in der anfänglich eingesetzten mobilen Phase für die HPLC gelöst. Es ist aber auch möglich, direkt das bei der wässrigen Extraktion erhaltene Extrakt einzusetzen, welches gegebenenfalls auf die gewünschte Konzentration eingestellt wird. Die Konzentration der einzelnen Wirkstoffe in der Probe hängt naturgemäß auch von dem Mengenverhältnis der beiden Wirkstoffe im Arzneimittel oder dem medizinischen Produkt ab. Die Probenkonzentration wird bevorzugt so gewählt, dass die Konzentration an Gentamicinsulfat mit den Vorgaben der Ph. Eur.-Monographie übereinstimmt (etwa 1 mg/ml).
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Das erfindungsgemäße Verfahren für Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid basiert auf dem aktuell gültigen Analysesystem durch Flüssigkeitschromatographie für Gentamicinsulfat gemäß Ph. Eur. 7.6, Monographie 04/2011:0331 und wurde zur simultanen Bestimmung von Gentamicin- und Vancomycinverunreinigungen in Wirkstoffmischungen aus Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid weiterentwickelt. Die chromatographischen Parameter wurden für die simultane Bestimmung in zwei Punkten angepasst:
- 1) Hinter der Trennsäule wurde ein UV-Detektor angeordnet. Dieser reagiert selektiv auf die Verunreinigungen von Vancomycin, da Gentamicin keine UV-aktiven Gruppen enthält. Hinter dem UV-Detektor erfolgt das Zudosieren von Elektrolytlösung, insbesondere wässrige NaOH, und die elektrochemische Detektion, in der beide Wirkstoffe und deren Verunreinigungen registriert werden.
- 2) Anstelle einer isokratischen Trennung wurde ein geeigneter Gradient mit ansteigendem Acetonitrilgehalt eingesetzt, der eine vollständige Separation der beiden Wirkstoffe und ihrer verwandten Substanzen ermöglicht.
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Die Gradienten-HPLC wird bevorzugt als Ionenpaarchromatographie durchgeführt. Die stationäre Phase der Trennsäule ist bevorzugt eine Umkehrphase.
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Die für die mobile Phase bzw. den Eluenten verwendeten Lösungsmittel werden gewöhnlich wie üblich in entgaster Form eingesetzt. Als Eluent wird insbesondere eine wässrige Lösung verwendet. Als Wasser wird wie üblich bevorzugt Reinstwasser verwendet. Das als Eluent verwendete wässrige Lösungsmittel enthält bevorzugt einen organischen Modifier, wie Acetonitril, THF oder Methanol, bevorzugt Acetonitril. Der Gradient im Lösungsmittel wird bevorzugt durch mindestens einmalige Erhöhung des Anteils an organischem Modifier, insbesondere Acetonitril, erhalten.
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Der Eluent, vorzugsweise eine Mischung von Wasser und Acetonitril, enthält bevorzugt ein Puffersystem und ein Ionenpaarreagenz. Das Ionenpaarreagenz ist bevorzugt eine Kombination von Trifluoressigsäure und Pentafluorpropionsäure. Das Puffersystem wird bevorzugt aus dem Ionenpaarreagenz und Natronlauge gebildet.
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Die Gradienten-HPLC wird vorzugsweise anfänglich isokratisch betrieben, bis die Verunreinigungen von Gentamicinsulfat und die Gentamicin-Komponenten aus der Trennsäule eluiert worden sind. Die Zusammensetzung des Eluenten wird danach zur Elution der Verunreinigungen von Vancomycinhydrochlorid mindestens einmal geändert, insbesondere durch Erhöhung des Anteils des organischen Modifiers, insbesondere Acetonitril.
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Es ist bevorzugt, dass eine Elektrolytlösung zur Nachsäulendotierung zwischen dem UV-Detektor und dem elektrochemischen Detektor in den Eluatstrom zudosiert wird. Die Elektrolytlösung enthält insbesondere ein Leitsalz bzw. einen Leitelektrolyt für den Ladungstransport oder kann ihn in dem Eluat bilden. Ein Beispiel für eine bevorzugt eingesetzte Elektrolytlösung ist eine wässrige Natronlauge.
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Für Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid wird die Gradienten-HPLC bevorzugt mit den im Ph. Eur. 7.6, Monographie 04/2011:0331 angegebenen Parametern für die Flüssigkeitschromatographie durchgeführt, außer dass nach der Elution der Verunreinigungen von Gentamicinsulfat und der Gentamicin-Komponenten die Chromatographie fortgesetzt wird, wobei mindestens einmal der Anteil an Acetonitril in der mobilen Phase erhöht wird und zusätzlich eine UV-Detektion zur Bestimmung der Verunreinigungen von Vancomycinhydrochlorid stromaufwärts von der elektrochemischen Detektion durchgeführt wird. Gegebenenfalls wird ferner der Anteil an Acetonitril in der anfänglich verwendeten mobilen Phase gegenüber den Angaben in Ph. Eur. erhöht, z.B. auf einen Anteil von 4 bis 10 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen des Eluenten.
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Bei Anwendung der neu entwickelten Gradienten-HPLC eluieren Gentamicin und seine Verunreinigungen bzw. verwandten Substanzen im Verlauf der ersten 30 min. Nach der vollständigen Elution aller Gentamicinsignale folgen in den nächsten 30min Vancomycin und seine Verunreinigungen bzw. verwandten Substanzen.
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In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die für die Chromatographie und Detektion der Verunreinigungen von Gentamicinsulfat bevorzugten relevanten Parameter gemäß der Erfindung den entsprechenden Parametern für die Flüssigchromatographie von Gentamicinsulfat gemäß Ph. Eur. Monographie 04/2011:0331 corr. 7.6 gegenübergestellt. Da Gentamicinsulfat und dessen Verunreinigungen mit dem anfänglich eingesetzten wässrigen Eluenten isokratisch eluiert werden, ist der anschließend eingesetzte Gradient für die Chromatographie von Vancomycinhydrochlorid hierfür nicht relevant. Die Prozentangabe für den organischen Modifier bezieht sich auf das Volumen, bezogen auf das Gesamtvolumen des wässrigen Eluenten. Tabelle 1
| | Aktuell gültige Methode | Gradientenmethode gemäß der Erfindung |
| Ph. Eur. Monographie | 04/2011:0331 corr. 7.6 | angelehnt an 04/2011:0331 corr. 7.6 |
| Detektor | Elektrochemische Detektion (IPAD):
Arbeitselektrode: 3mm Goldelektrode
Referenzelektrode: Ag/AgCl
Nachsäulenlösung: 0,5M NaOH (0,3ml/min) |
| Wellenform | Detektion: +0,05 V
Oxidation: +0,75 V
Reduktion: –0,15 V
(identische Zeitintervalle für alle drei Methoden) |
| Auswertung | Gegen externen Standard (Sisomicin) |
| Probenkonzentration | 1mg/ ml |
| Säulentyp | Zorbax SB-C18 |
| Säulenmaterial | Sterisch geschützte C18-Phase |
| Säulendimensionen | 4,6 × 250mm / 5µm / 80 Å |
| Säulentemperatur | 35°C |
| pH-Wert | 2,6 |
| Ionenpaarreagenz | TFA + PFP |
| Puffersystem | TFA + PFP / NaOH |
| Organischer Modifier | 4,5% ACN | 7,6% ACN |
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Im Bereich der Gentamicinsignale liegt der einzige Unterschied zwischen der bevorzugten Ausführungsform der Gradientenmethode gemäß der Erfindung und der Referenzmethode gemäß aktuell gültigem Ph. Eur. in einem leicht erhöhten ACN-Gehalt. Das Peakbild der Verunreinigungssignale ist gut mit den Ergebnissen der zugrundeliegenden Monographie vergleichbar. Die Hauptpeaks von Gentamicin eluieren bei Anwendung der neuen Methode deutlich schärfer.
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In der nachfolgenden Tabelle 2 sind die für die Chromatographie und Detektion der Verunreinigungen von Vancomycinhydrochlorid bevorzugten relevanten Parameter den entsprechenden Parametern für die Flüssigchromatographie von Vancomycinhydrochlorid gemäß Ph. Eur. Monographie 02/2008:1058 corr. 7.0 gegenübergestellt. Die Prozentangabe für den organischen Modifier bezieht sich auf das Volumen, bezogen auf das Gesamtvolumen des wässrigen Eluenten. Tabelle 2
| | Aktuell gültige Methode | Gradientenmethode gemäß Erfindung |
| Ph. Eur. Monographie | 01/2008:1058 corr. 7.0 | Angelehnt an 04/2011:0331 corr. 7.6 |
| Detektor | UV-Detektion bei 280nm |
| Säulentyp | LiChrospher® 100 RP-18 | Zorbax® SB-C18 |
| Säulenmaterial | Standard C18-Phase | Sterisch geschützte C18-Phase |
| Säulendimensionen | 4,6 × 250mm / 5µm / 100 Å | 4,6 × 250mm / 5µm / 80 Å |
| Säulentemperatur | 25°C | 35°C |
| Auswertung | Fl. % (Fläche des Hauptpeaks aus verdünnter Probenlösung)* | Fl. %** |
| Probenkonzentration | 2mg/ml | 2,6mg/ml |
| pH-Wert | 3,2 | 2,6 |
| Ionenpaarreagenz | Triethylamin | TFA + PFP |
| Puffersystem | Phosphorsäure / Triethylamin | TFA + PFP / NaOH |
| Organischer Modifier | 13min isokratisch:
1% THF + 7% ACN
13–22min linear auf:
1% THF + 29% ACN | 30 min: 7,6% ACN isokratisch
30–35min: 7,6% → 12% ACN
35–50min isokratisch
50–60min: 12% → 32% ACN
60–75min isokratisch |
* Bestimmung Flächenprozent gegen externen Standard (relativ)
** Bestimmung Flächenprozent absolut
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Die neu entwickelte Gradientenmethode unterscheidet sich deutlich von der aktuell gültigen Methode gemäß Ph. Eur. zur Bestimmung von Vancomycinverunreinigungen in Vancomycinhydrochlorid. Aufgrund der folgenden Zusammenhänge ist eine verbesserte Leistung des Analysensystems gemäß der Erfindung zu erwarten:
- – Der Einsatz einer modernen C18-Phase mit optimierten Porengrößen und das Anheben der Säulentemperatur sollten zu einer höheren Bodenzahl führen.
- – Die Verwendung einer sterisch geschützten C18-Phase und die Vermeidung von THF als organischer Modifier unterstützen die Robustheit der Methode.
- – Die Auswertung in Form einer 100%-Methode macht die Analysenergebnisse unabhängig von Schwankungen in der Konzentration von Referenz- und Probelösungen.
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Die Erfindung betrifft auch eine HPLC-Anlage zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die HPLC-Anlage umfasst einen Gradientenmischer 1 mit Anschlüssen für mindestens zwei Lösungsmittelvorratsbehälter zur Bereitstellung des Eluenten bzw. der mobilen Phase, eine Gradientenpumpe P1 zum Fördern des Eluenten über eine Leitung vom Gradientenmischer zum und durch die Trennsäule, ein Injektionsventil 2 zum Einbringen der Probe in den Eluentenstrom vor der Trennsäule, eine Trennsäule, einen UV-Detektor UV und einen elektrochemischen Detektor ED, wobei am Ende der Trennsäule eine Leitung für das Eluat angebracht ist, an der der UV-Detektor und der elektrochemische Detektor stromabwärts vom UV-Detektor angeordnet sind.
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In einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere für die Kombination von Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid, umfasst die HPLC-Anlage ferner eine isokratische Pumpe P2 mit einem Anschluss für einen Lösungsmittelvorratsbehälter zur Bereitstellung einer Elektrolytlösung, wobei die Leitung für das Eluat zwischen dem UV-Detektor und dem elektrochemischem Detektor mit der isokratischen Pumpe zur Zudosierung von Elektrolytlösung in den Eluatstrom verbunden ist.
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Als UV-Detektor und elektrochemischer Detektor eignen sich alle üblichen, dem Fachmann bekannten Detektoren. Beispiele für elektrochemische Detektoren sind amperometrische und coulometrische Detektoren, z.B. in Form einer integrierten gepulsten amperometrischen Detektion (IPAD). Die Detektion basiert auf der Messung des Stromflusses zwischen zwei Elektroden während der Oxidation oder Reduktion von Analytmolekülen.
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Eine bevorzugte Ausführungsform der HPLC-Anlage gemäß der Erfindung ist in 1 als Beispiel gezeigt, die die Erfindung aber in keiner Weise beschränken soll. Darin sind:
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Bezugszeichenliste
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- Eluent A, Eluent B
- Lösungsmittelvorratsbehälter zur Bereitstellung der mobilen Phase mit einem Gradienten. Es können auch mehr als zwei Lösungsmittel verwendet werden
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- Gradientenmischer, bevorzugt ist ein Niederdruck-Gradientenmischer
- P1
- Gradientenpumpe
- 2
- Injektionsventil
- AS
- Autosampler zur automatischen Bereitstellung der Probe, eine manuelle Einbringung der Probe ist natürlich ebenfalls möglich
- 3
- Vorsäule, kann dieselbe stationäre Phase wie die Trennsäule enthalten. Ihr Einsatz ist zur Erhöhung der Lebensdauer der Trennsäule zweckmäßig, da damit Komponenten zurückgehalten werden können, die ansonsten dauerhaft auf der Trennsäule haften blieben
- Trennsäule
- enthält die stationäre Phase, die bevorzugt eine Umkehrphase ist, z.B. poröse Silica-Mikrokugeln an die eine sterisch geschützte C18-Phase gebunden ist, wie Zorbax SB-C18 von Agilent
- UV
- UV-Detektor, z.B. für Detektion bei 280 nm
- Eluent C
- Lösungsmittelvorratsbehälter zur Bereitstellung der Elektrolytlösung, z.B. Natronlauge
- P2
- Isokratische Pumpe
- 4
- T-Stück
- 5
- Mischer (durch laminare Strömung)
- ED
- elektrochemischer Detektor, z.B. IPAD
- 6
- Abfallbehälter
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Die einzelnen Elemente der HPLC-Anlage sind über Leitungen miteinander verbunden, z.B. Schläuche aus PTFE oder FEP. Die Lösungsmittel werden gewöhnlich in entgaster Form eingesetzt. Die HPLC-Anlage kann auch übliche Entgasereinrichtungen umfassen.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der HPLC-Anlage gemäß der Erfindung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der Verunreinigungen in einer Wirkstoffmischung aus einem Aminoglycosid und einem Glykopeptid, bevorzugt einer Wirkstoffmischung von Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid.
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Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für Analysen im Rahmen von Stabilitätsstudien oder zur Routineprüfung von Arzneimitteln oder medizinischen Produkten, z.B. Knochenzementpulvern, wie Copal G + V, die eine Mischung von Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid enthalten.
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Die Erfindung wird durch nachstehende Beispiele weiter erläutert, die die Erfindung aber in keiner Weise beschränken sollen.
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Beispiele
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Probenvorbereitung
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Es wurden jeweils 3 Chargen (Chargen 1–3) des Knochenzements Copal® G + V von Heraeus Medical GmbH zur Bestimmung der Verunreinigungen verwendet. Aus jeder Charge wurden mit Wasser eine Wirkstoffmischung aus Gentamicinsulfat und Vancomycinchlorid extrahiert. Aus den Wirkstoffmischungen wurde jeweils eine Lösung in dem anfänglich eingesetzten Eluenten mit einer Konzentration für Gentamicinsulfat von etwa 0,5 mg/ml im Referenzbeispiel und etwa 1 mg/ml im Beispiel angesetzt, die als Proben für das Referenzbeispiel und das Beispiel verwendet wurden. Für die quantitative Bestimmung der Verunreinigungen wurden Proben in zwei verschiedenen Analyselaboren analysiert.
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Referenzbeispiel
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Die Bestimmung der Verunreinigungen in der Wirkstoffmischung erfolgte gemäß dem bisher eingesetzten Verfahren, bei dem zwei gesonderte HPLC-Trennungen für Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid erforderlich sind.
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A. Gentamicinsulfat
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Für die Bestimmung der Verunreinigungen von Gentamicinsulfat in der Probe (Wirkstoffmischung) wird eine isokratische HPLC mit elektrochemischer Detektion gemäß Ph. Eur. Monographie 01/2008 corrected 6.0 durchgeführt. Die relevanten Parameter sind nachstehend angeführt:
| Ph. Eur. Monographie | Monographie 01/2008:0331 corr. 6.0 |
| Detektor | Elektrochemische Detektion (IPAD):
Arbeitselektrode: 3mm Goldelektrode
Referenzelektrode: Ag/AgCl
Nachsäulenlösung: 0,5M NaOH (0,3ml/min) |
| Wellenform | Detektion: +0,05 V
Oxidation: +0,75 V
Reduktion: –0,15 V
(identische Zeitintervalle für alle drei Methoden) |
| Auswertung | Fl. % |
| Probenkonzentration | 0,5mg/ml |
| Säulentyp | PLRP-S |
| Säulenmaterial | Polystyrol-Divinylbenzol |
| Säulendimensionen | 4,6 × 250mm / 8µm / 1000Å |
| Säulentemperatur | 55°C |
| pH-Wert | 3,0 |
| Ionenpaarreagenz | C8H17NaO3S |
| Puffersystem | H3PO4 / NaH2PO4 |
| Organischer Modifier | 0,1% THF |
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Das mit der Probe enthaltend Getamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid erhaltene Chromatogramm ist in 2c gezeigt. Zum Vergleich wurden mit demselben System Proben der Einzelsubstanzen chromatographiert. Die erhaltenen Chromatogramme für Getamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid sind in 2a bzw. 2b gezeigt.
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Eine vollständige Trennung der beiden Wirkstoffe ist nicht realisierbar. Die Verunreinigungssignale beider Wirkstoffe eluieren innerhalb der ersten 15–20min. Als Verunreinigungen von Gentamicin werden alle Signale gewertet, die in diesem Bereich detektiert werden, der infolge dieser Überlagerungen deutliche Signalanteile enthält, die auf verwandte Substanzen des Vancomycins zurückzuführen sind. Die daraus ermittelte "Summe der Verunreinigungen von Gentamicin" ist unten in Tabelle 3 wiedergegeben.
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B. Vancomycinhydrochlorid
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Für die Bestimmung der Verunreinigungen von Vancomycinhydrochlorid in der Probe (Wirkstoffmischung) wird eine Gradienten-HPLC mit UV-Detektion gemäß Ph. Eur. Monographie 01/2008:1058 corr. 7.0 durchgeführt. Die relevanten Parameter sind vorstehend in Tabelle 2 angeführt. Das sich daraus ergebende Chromatogramm ist in 3a gezeigt. Die daraus ermittelte "Summe der Verunreinigungen von Vancomycin" ist unten in Tabelle 4 wiedergegeben.
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Beispiel
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Die Bestimmung der Verunreinigungen in der Wirkstoffmischung aus Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid erfolgte simultan durch Gradienten-HPLC mit Kopplung von UV-Detektion und elektrochemischer Detektion. Es wurde eine HPLC-Anlage gemäß 1 eingesetzt. Dabei wurden folgende Materialien und Parameter eingesetzt (siehe auch Angaben in vorstehenden Tabellen 1 und 2 zu Gradientenmethode gemäß der Erfindung).
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Mobile Phasen
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Mobile Phase A:
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In einen 1 l Messkolben werden 900 ml Reinstwasser + 7 ml Trifluoressigsäure + 0,25 ml Pentafluorpropionsäure + 4 ml Natronlauge 50% vorgelegt. Der pH-Wert der Mischung wird auf 2,60 mit 1 molarer Natronlauge eingestellt. Nach Zugabe von 45 ml Acetonitril wird mit Reinstwasser zu 1 l aufgefüllt.
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Mobile Phase B:
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In einen 1 l Messkolben werden 600 ml Reinstwasser + 7 ml Trifluoressigsäure + 0,25 ml Pentafluorpropionsäure + 4 ml Natronlauge 50% vorgelegt. Der pH-Wert der Mischung wird auf 2,60 mit 1 molarer Natronlauge eingestellt. Nach Zugabe von 350 ml Acetonitril wird mit Reinstwasser zu 1 l aufgefüllt.
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Mobile Phase C:
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In einen 1 l Messkolben werden 300 ml Reinstwasser + 7 ml Trifluoressigsäure + 0,25 ml Pentafluorpropionsäure + 4 ml Natronlauge 50% vorgelegt. Der pH-Wert der Mischung wird auf 2,60 mit 1 molarer Natronlauge eingestellt. Nach Zugabe von 600 ml Acetonitril wird mit Reinstwasser zu 1 l aufgefüllt.
| Natronlauge für Nachsäulendotierung: | 40 ml Natronlauge 50%ig werden zu 1 l mit Reinstwasser verdünnt |
| Spülflüssigkeit für Dosiergerät: | Reinstwasser oder 50% Acetonitril in Reinstwasser |
| Lagermedium für Trennsäule: | 65% Acetonitril in Reinstwasser |
| Lagermedium für Pumpe 2: | 25% Isopropanol in Reinstwasser |
Flussraten:
| Flussrate Mobile Phase: | 1ml/min |
Gradienten-Zeitprogramm:
| Zeit [min] | Mobile Phase A [Vol%] | Mobile Phase B [Vol%] | Mobile Phase C [Vol%] |
| Init | 90 | 10 | 0 |
| 30 | 90 | 10 | 0 |
| 35 | 76 | 24 | 0 |
| 50 | 76 | 24 | 0 |
| 60 | 10 | 90 | 0 |
| 75 | 10 | 90 | 0 |
| 76 | 0 | 0 | 100 |
| 89 | 0 | 0 | 100 |
| 90 | 90 | 10 | 0 |
| 105 | 90 | 10 | 0 |
| Flussrate Nachsäulendotierung: | 0,3 ml/min |
Stationäre Phasen:
| Trennsäule: | Zorbax SB-C18, 250 × 4,6 mm, 5µm (Agilent) |
| Vorsäule: | Gemini C18 Cartridge (Phenomenex) |
Detektion:
| Detektion Vancomycin: | UV-Detektion bei 280 nm |
| Detektion Gentamicin: | Integrierte gepulste amperometrische Detektion (IPAD) |
| Referenzelektrode: | Ag/AgCl |
| Arbeitselektrode: | 3mm Goldelektrode |
Wellenform:
| Zeit [s] | Potential [V] | Integration |
| 0,00 | 0,05 | |
| 0,20 | 0,05 | Beginn |
| 0,40 | 0,05 | Ende |
| 0,41 | 0,75 | |
| 0,60 | 0,75 | |
| 0,61 | –0,15 | |
| 1,00 | –0,15 | |
Temperaturen:
| Trennsäule: | 35 °C |
| Elektrochemischer Detektor: | 30°C bzw. RT (23°C) |
| Autosampler: | 20°C bzw. RT (23°C) |
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Ergebnisse
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4a zeigt einen Overlay-Plot der Chromatogramme von Gentamicinsulfat und Vancomycinhydrochlorid bei Anwendung der neuen Gradienten-Methode. Im vorderen Bereich (bis ca. 30min) eluieren alle Gentamicin-Komponenten. Die Signale des Vancomycins eluieren deutlich später.
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4b zeigt aus dem Overlay-Plot von 4a nur den Bereich der Gentamicinsignale im elektrochemischen Detektor. 3b zeigt aus dem Overlay-Plot von 4a nur den Bereich der Vancomycinsignale im UV-Detektor.
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Im Unterschied zum Referenzbeispiel ist das neu entwickelte Analysensystem in der Lage die beiden Wirkstoffe annähernd quantitativ voneinander zu trennen. Bis auf ein Signal mit einer relativen Peakfläche von rund 0,2% (bei ca. 8min) eluieren alle Vancomycin-Signale deutlich später als die Signale des Gentamicins. Die Selektivität der Methode wurde somit drastisch erhöht.
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Im Bereich der Gentamicinsignale liefert die erfindungsgemäße Methode ein Peakbild das qualitativ mit dem Referenzspektrum gemäß Ph. Eur. Monographie 04/2011:0331 corr. 7.6 (siehe Tabelle 1) übereinstimmt. Durch den erhöhten Anteil an Acetonitril konnte die Laufzeit deutlich verkürzt werden. Die Auflösung zwischen dem ersten Hauptpeak (Gentamicin C1a) und dem vorangehenden Verunreinigungssignal erreicht nicht mehr die vollständige Basislinienseparation (Rs = 1,5), mit einem Wert von Rs = 0,9. Dennoch ist eine ausreichend exakte Quantifizierung des Parameters „Summe der Verunreinigungen von Gentamicin“ möglich. Die Auflösung zwischen den Hauptkomponenten erreicht in allen Fällen die Basislinienseparation ("Kritischstes Peakpärchen": Gentamicin C2b / C2a, Rs = 1,6).
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In nachstehender Tabelle 3 sind die Analysenergebnisse für "Summe der Verunreinigungen von Gentamicin" aus drei Produktionschargen Copal G + V wiedergegeben, die parallel in zwei verschiedenen Analysenlaboren mit den Methoden gemäß dem Beispiel und dem Referenzbeispiel erhalten wurden. Tabelle 3. Summe der Verunreinigungen Gentamicin
| Copal G + V Charge # | Referenzbeispiel | Beispiel |
| 1 | 9,2 %
9,6 % | 5,60 %
5,97 % |
| 2 | 9,5 %
9,3 % | 5,30 %
5,37 % |
| 3 | 8,9 %
9,2 % | 5,56 %
5,52 % |
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Durch die Beseitigung der Überlagerungen zwischen den Verunreinigungen der beiden Wirkstoffe werden für den Parameter "Summe der Verunreinigungen in Gentamicin" nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß dem Beispiel signifikant kleinere Werte ermittelt, die im Vergleich zu den Ergebnissen der bisher eingesetzten Methode (Referenzbeispiel) als deutlich richtiger einzustufen sind. Richtigkeit, Präzision und Robustheit des neuen Analysensystems wurden im Rahmen der Methodenvalidierung nachgewiesen.
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Bei Vancomycin ist eine grundlegende Selektivität, d.h. in diesem Fall die Differenzierung zwischen den beiden Wirkstoffen, von vornherein durch den Aufbau des Analysensystems sichergestellt, da Gentamicin im UV-Detektor nicht nachweisbar ist.
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Naturgemäß liefert die neu entwickelte Gradienten-Methode für Vancomycin ein anderes Peakbild als das bisher eingesetzte Analysensystem, da die chromatographischen Bedingungen grundlegend geändert wurden. Die Trennleistung der beiden Methoden ist jedoch gut vergleichbar. In beiden Fällen werden die Verunreinigungen ausreichend vom Hauptpeak abgetrennt und über einen Bereich von rund 30min eluiert. Die neu entwickelte Gradientenmethode erfüllt alle Systemeignungskriterien, die in der Monographie zu Vancomycinhydrochlorid für die Bestimmung der "verwandten Substanzen" festgelegt sind.
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In nachstehender Tabelle 4 sind die Analysenergebnisse für "Summe der Verunreinigungen von Vancomycin" aus drei Produktionschargen Copal G + V wiedergegeben, die mit den Methoden gemäß dem Beispiel und dem Referenzbeispiel erhalten wurden. Für das Beispiel wurden die Analysen parallel in zwei verschiedenen Analysenlaboren durchgeführt. Tabelle 4. Summe der Verunreinigungen Vancomycin
| Copal G + V Charge # | Referenzbeispiel | Beispiel |
| 1 | 10,3 % | 10,24 %
10,18 % |
| 2 | 11,1 % | 9,87 %
9,84 % |
| 3 | 10,7 % | 10,02
9,93 |
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Der quantitative Vergleich der Messwerte für den Parameter "Summe der Verunreinigungen" aus drei Produktionschargen zeigt eine gute Übereinstimmung der beiden Methoden. Richtigkeit, Präzision und Robustheit der neuen Methode wurden im Rahmen der Methodenvalidierung nachgewiesen. Die beiden Methoden sind somit für Vancomycin als äquivalent und richtig einzuschätzen.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist eine simultane Bestimmung der Verunreinigungen der Wirkstoffmischung in einer HPLC möglich, während bisher zwei gesonderte HPLC durchgeführt werden mussten. Darüber hinaus liefert das erfindungsgemäße Verfahren eine genauere Bestimmung der Verunreinigungen von Gentamicinsulfat gegenüber dem bisherigen Verfahren.
