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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Inkubationskammer mit einem Feuchtigkeitsreservoir, einer Klimatisierungseinrichtung, die die Einstellung einer gewünschten Temperatur ermöglicht, sowie einer Halterung für biologische oder chemische Proben.
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Inkubationskammern, die auch als Inkubationsschränke bezeichnet werden, werden eingesetzt, um Bakterien, andere Mikroorganismen und Ziellinien auf geeigneten Medien zu kultivieren, d. h. in der Regel zu vermehren. Sie können auch dazu dienen, Verdauvorgänge von Proteinen oder größeren Peptiden durch bestimmte proteolytische Enzyme, wie z. B. Trypsin, Chemotrypsin, Elastase usw. in kleinere Peptide oder Teile des Ausgangsmaterials unter reproduzierbaren Bedingungen ablaufen zu lassen. Die kleineren Peptidmoleküle haben gänzlich andere chemische Eigenschaften und sind viel einfacher handhabbar, so dass ihre Struktur leichter bestimmbar ist.
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Werden Proteine enzymatisch verdaut, und die daraus resultierenden Peptide durch chemische oder durch andere physikalisch-chemische Methoden analysiert sowie deren Aminosäuresequenzen bestimmt, lassen sich mittels verschiedener Techniken die Proteinprimärsequenzen bestimmen. Man spricht in der Proteomanalyse dann auch von einem sogenannten Bottom-Up Ansatz. Für eine umfassende Analyse der Primärsequenzen von Proteinen stellt diese Methode den Stand der Technik dar.
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Die Verdauenzyme sind von ihrer Struktur her selbst Proteine oder proteinähnliche Verbindungen. Wie alle Proteine sind sie sehr empfindlich gegen chemische oder physikalische Änderungen in ihrer Umgebung. Viele verlieren ihre Aktivitäten, wenn sie austrocknen, überhitzt werden oder mit organischen Lösungsmitteln in Berührung kommen. Der Verdau von Proteinen erfolgt in Lösung, in Gelmatrizes, auf Membranen oder im Zusammenhang mit der bildgebenden Massenspektrometrie in Gewebeschnitten. Dabei müssen bestimmte Voraussetzungen erfüllt werden, wozu z. B. die Natur der Lösung bzw. der Lösungsmittel, der pH-Wert, der Salzgehalt, die Temperatur und ggf. weitere Randbedingungen gehören.
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Die Struktur- und Sequenzaufklärung von Proteinen ist die primäre Voraussetzung für die Erkennung ihrer Funktion im lebenden Organismus. Dafür ist es erforderlich, nicht nur die Sequenz der Aminosäurebausteine zu kennen. Diese Eigenschaften werden heute durch verschiedene massenspektrometrische Techniken untersucht und aufgeklärt. Neben Peptiden können aber auch die noch intakten Proteine mittels Massenspektrometrie analysiert werden, um das genaue Molekulargewicht zu bestimmen und mögliche Degradierungen zu erkennen.
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In den letzten Jahren hat sich die Bildgebende Massenspektrometrie etabliert, die es ermöglicht, Proteine direkt zu erkennen und zu bestimmen/zu detektieren, ohne sie durch Extraktion zuvor aus ihrem originären Umfeld entfernen zu müssen. Dabei werden u. a. unterschiedliche Ionisationsmethoden verwendet, wie MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization-Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation), DESI (Desorption Elektrospray Ionisation – Desorptions Elektrospray Ionisation), SIMS (Secondary ion mass spectrometry – Sekundärionen-Massenspektrometrie). Diese Methode hat den großen Vorteil, dass man dadurch die örtliche Verteilung der einzelnen Proteine erfassen kann, wobei die örtliche Zuordnung zu bestimmten Bereichen eines Gewebes in z. B. Nieren, Leber oder Gehirn dem Wunsch Rechnung trägt, Näheres über die Funktion der Proteine zu erfahren.
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Die Massenanalyse von intakten Proteinen direkt aus Geweben ist im Vergleich zu kleineren Molekülen deutlich schwieriger. Im Gegensatz zu Proteinen lassen sich die Peptide besser aus Geweben extrahieren, in Matrixkristalle einbauen und im Massenspektrometer ionisieren. Um aber die aus einem Protein durch enzymatischen Verdau resultierenden Peptide im originären Ort des Gewebes zu belassen, müssen während des Verdauprozesses bestimmte Kriterien eingehalten werden.
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Zunächst ist es wichtig, dass der Verdau in einem bestimmten Temperaturbereich durchgeführt wird, der in der Regel in einem Bereich zwischen 25 und 50°C liegt, weil in diesem Temperaturbereich für die meisten Enzyme die ideale Reaktionstemperatur mit maximalem Reaktionsumsatz und minimalem Aktivitätsverlust liegt. Erforderlich für den Verdauprozess ist Wasser, wobei zu viel Wasser auf oder im Gewebe bewirkt, dass die Peptide ihren originären Platz verlassen und in alle Richtungen diffundieren. Dies führt zu einem Verlust der Ortsauflösung und damit der Möglichkeit getrennte Information von nah bei einander liegenden Arealen auf einem Gewebe zu erhalten, so dass die damit verbundenen wertvollen Informationen verloren gehen.
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Um dies sicherzustellen, muss im Gewebe ein konstanter, leicht kondensierender, aber nicht zu hoher, auf der anderen Seite aber auch nicht zu niedriger Wassergehalt vorhanden sein. Idealerweise liegt eine gesättigte Feuchtigkeit nicht nur an der Oberfläche sondern auch in tieferen Bereichen des Gewebes vor, die ausreichend für die enzymatische Reaktion über eine längere Zeit bis zu mehreren Stunden ist.
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Es gibt einige Publikationen, die Inkubationskammern vorschlagen, die für den jeweiligen Anwendungsfall in der Art eines Provisoriums geschaffen werden, wobei auch gelegentlich der gänzliche Verzicht auf Inkubatoren durch besondere Techniken der Enzymzugabe vorgeschlagen wird. Bei den bekannten Inkubationskammern ist über die Ausbeute der Verdauprozesse wenig berichtet worden, wobei allerdings direkt oder indirekt Probleme berichtet werden, die das Einhalten der zuvor erörterten Randbedingungen betreffen. Ein großes Problem stellt auch die Wasserkondensation in der Inkubationskammer dar, da herabfallende oder fließende Wassertropfen das Gewebe überfluten können.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Inkubationskammer zu schaffen, die z. B. den Ablauf der erörterten Verdauprozesse unter definierten und reproduzierbaren Bedingungen gewährleistet.
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Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine Inkubationskammer der eingangs genannten Art gelöst, bei welcher die Klimatisierungseinrichtung über zwei getrennte Klimatisierungszonen verfügt, die getrennt voneinander regelbar sind, wobei eine erste Zone im Bereich des Deckels der Inkubationskammer angeordnet ist.
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Es hat sich gezeigt, dass sich durch die Anordnung einer Klimatisierungszone im Bereich des Deckels die Randbedingungen, unter welchen beispielsweise ein Verdauprozess ablaufen soll, leichter einhalten lassen, wobei die getrennte Temperaturregelung im Bereich des Deckels die dortige Bildung von Tropfen in Folge von Wasserkondensation sicher vermeiden hilft. Vom Deckel auf das Gewebe herabfallende Wassertropfen stellen damit kein Problem mehr dar. Durch das Halten einer optimalen Temperatur werden die Verdauprozesse optimiert und können in minimaler Zeit ein optimales Ergebnis erreichen. Ortsinformationen in Gewebeproben können sicher erhalten werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass wenigstens eine der beiden Klimazonen auch eine Kühlfunktion aufweist. Auf diese Weise ist es möglich, die Temperatur in der Kammer beispielsweise bis auf 4°C herunterzukühlen, was sich als Temperatur für die Objekthalterung und die darin gehaltenen Objekt- und Probenträger für den Enzymauftrag als vorteilhaft erweist. Nach dem Erwärmen der Inkubationskammer für den enzymatischen Verdau kann die Kammer dann auch wieder langsam gleichmäßig heruntergekühlt werden, ohne dass es zu einer unerwünschten Wasserkondensation innerhalb der Kammer kommt, die insbesondere auf den Proben, wie z. B. dort angeordneten Gewebeschnitten stattfinden könnte.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die zweite Klimatisierungszone, die vorzugsweise auch die Kühlfunktion ermöglicht, in der Bodenplatte der Inkubationskammer angeordnet ist. Diese zweite Klimatisierungszone kann in ihrer Leistungsfähigkeit auch stärker ausgebildet sein, da sie primär für das Einstellen einer bestimmten Temperatur von z. B. bis zu 60°C in der Inkubationskammer zur Verfügung stehen kann, während die erste Klimatisierungszone im Deckel durch gezielte Temperierung der Innenseite des Deckels hauptsächlich der Bildung von Kondensattropfen an dieser Stelle entgegenwirkt.
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Das Feuchtigkeitsreservoir der Inkubationskammer ist vorzugweise als Wanne ausgebildet, deren aktive Oberfläche durch eine Filz- oder Schaumstofflage oder andere Wasser speichernde Stoffe vergrößert ist. Diese Wanne kann wie die Objekthalterung aus wärmeleitfähigem Metall und/oder Kunststoff bestehen, wobei Objekthalter und Wanne auch einstückig ausgebildet sein können. Der Objekthalter ist so gestaltet, dass die Objektträger und/oder Probenträger in einem bestimmten Abstand zum Feuchtigkeitsreservoir gehalten sind. Gegebenenfalls kann die Halterung so beschaffen sein, dass die Objektträger oder Probenträger wahlweise mit nach unten zum Reservoir oder nach oben zum freien Raum hin liegenden Proben anordbar sind.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eine Lüftervorrichtung vorgesehen. Eine Lüftervorrichtung bietet den Vorteil, dass sich durch gezielte Luftumwälzung in allen Bereich der Kammer homogene Temperatur und Feuchtigkeitseigenschaften bereitstellen lassen und die Verdunstungsgeschwindigkeit beeinflusst werden kann. Vorzugsweise ist die die Lüfterleistung dabei zwischen 0 und einem Maximalwert einstellbar, da sie zur Einstellung der Umgebungsbedingungen herangezogen werden kann. So kann bei einer zu hohen gemessenen Feuchte die Lüfterleistung erhöht werden, um die Kondensationsvorgänge im Bereich der aktiven Probenoberfläche reduzieren.
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Vorzugsweise sind in der Inkubationskammer ohnehin Temperatur- und/oder Feuchtigkeitssensoren vorgesehen, die die Heizleistung und/oder die Lüfterleistung in Abhängigkeit von den gemessenen Werten über eine Steuervorrichtung steuern. Auf diese Art und Weise lassen sich alle Parameter in Echtzeit beeinflussen, wobei bestimmte Vorgabewerte, beispielsweise die Temperaturdifferenz zwischen der ersten und der zweiten Klimatisierungszone vorab gespeichert sein können.
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Der Deckel der Inkubationskammer sollte aus Gründen der Zugänglichkeit abnehmbar oder wenigstens aufschwenkbar sein.
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Nachfolgend wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher auf ein Ausführungsbeispiel der Erfindung eingegangen. Es zeigen:
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1 eine geschnittene Darstellung einer Inkubationskammer;
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2 einen Schnitt in der Lüfterebene;
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3 einen gegenüber 1 gedrehten Schnitt der Inkubationskammer;
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4 eine Schnittdarstellung der Inkubationskammer in der Ebene des Objektträgerhalters.
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In 1 ist eine Inkubationskammer 10 gezeigt, die einen allseits umschlossenen Raum 12 aufweist. In einem abnehmbaren Deckel 14, sind zur Ausbildung einer ersten Klimatisierungs zone elektrische Heizelemente (nicht im Einzelnen dargestellt) vorgesehen. In einer Bodenplatte 16 sind Peltier-Elemente vorgesehen, die als Kühl- oder Heizelemente zur Ausbildung einer zweiten Klimatisierungszone eingesetzt werden. In der Kammer 12 ist ein Objektträgerhalter 18 angeordnet, auf welchem Objektträger 20 oder MALDI-Probenträger oder sonstige Träger angeordnet werden können.
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Der Objekthalter 18 ist, wie aus 3 gut zu erkennen ist, als Wasserreservoir 22 ausgebildet, wobei dieses Wasserreservoir mit destilliertem Wasser oder Wassergemischen gefüllt ist, so dass es das für die Erzeugung der Luftfeuchtigkeit notwendige Feuchtigkeitsreservoir bildet. Zum Vergrößern der wirksamen Oberfläche ist das Wasser wenigstens teilweise in einer Wasser aufnehmenden und speichernden Schicht beispielsweise aus Filz oder Schaumstoff oder sonstigen geeigneten Materialien versehen. Eine entsprechende Lage kann auch auf dem Wasser aufliegen. Zwischen der Filz- oder Schaumstoffschicht und den Objektträgern 20 verbleibt ein Abstand, so dass eine unmittelbare Berührung des Objektträgers ausgeschlossen ist.
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Der verbleibende Zwischenraum zwischen Objektträger 20 und Filz- oder Schaumstoffschicht ist auch für die Luftzirkulation notwendig, die in 1 und 3 veranschaulicht ist. Im gezeigten Ausführungsbeispiel sind zwei Lüfter 24 an der Rückseite der Inkubationskammer 10 vorgesehen, die die Luft durch Luftkanäle 26 (siehe 2) aus dem Zwischenraum zwischen Objektträger 20 und Wasserreservoir 22 absaugen und in den Bereich zwischen der heizbaren Deckelplatte 14 und dem Objektträger 20 einblasen. Auf diese Weise wird der Verdunstungsvorgang begünstigt und ein gleichmäßiger Feuchtegehalt im gesamten Inneren 12 der Kammer sichergestellt.
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Durch die mit Feuchtigkeit gesättigte Luft, die direkt an den Objektträgern bzw. den darauf angebrachten und mit Enzymen beschichteten Gewebeschnitten vorbeigeführt wird, erreicht man eine gleichbleibende mit Wasser gesättigte Atmosphäre, die für ein ausreichendes und reproduzierbares Verdauergebnis ausschlaggeben ist. Durch die heizbare Deckelplatte 14 wird sichergestellt, dass eine Kondensatbildung an der Unterseite des Deckels ausgeschlossen ist, so dass keine Gefahr besteht, dass Kondensattropfen auf die Objektträger 20 herabtropfen können, was den Verdauprozess beeinträchtigen und zumindest die Ortsinformationen an den Probeschnitten beeinträchtigen könnte. Ein Feuchtigkeitssensor 28 im Kammerinneren überwacht die Feuchtigkeit ständig, so dass diese im Bereich der Sättigung um 100% gehalten werden kann. Ein Temperatursensor (nicht gezeigt) dient dem Einstellen der gewünschten Temperatur, wobei die Inkubationskammer 10 ein Aufheizen bis 60°C ermöglicht, da es sich gezeigt hat, dass die Verdauprozesse bei einigen Enzymen bei Reaktionstemperaturen über 37°C erheblich schneller ablaufen.
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Die Kühlfunktion hat den Vorteil, dass die Objektträger während des Auftragens der Enzyme in mehreren Schichten unter der Umgebungstemperatur gehalten werden können, so dass die Enzyme besser in das Gewebe eindringen können, bevor der Verdauprozess dann zu einem definierten Zeitpunkt gestartet wird.
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Die Inkubationskammer 10 ist durch eine geeignete Dichtung verschlossen, um unnötige Verluste an Feuchtigkeit einerseits und eine sicheren Abschottung von der außerhalb der Inkubationskammer 10 liegenden Atmosphäre andererseits sicherzustellen.
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Die Temperatur kann innerhalb der Inkubationskammer auch an mehreren Stellen gemessen und durch die beiden Klimazonen auch getrennt geregelt werden. Der gesamte Verlauf eines Verdauprozesses kann dabei von der Steuerelektronik protokolliert und später ausgedruckt werden, so dass der Anwender wertvolle Informationen erhält, die hilfreich sein können, die Verdauparameter für bestimmte Anwendungen zu optimieren bzw. die allseits gewünschte Reproduzierbarkeit des Verdauprozesses zu ermöglichen. Die Temperatur der heizbaren Deckelplatte 14 kann aktiv gesteuert oberhalb der Temperatur der beheizten Bodenplatte liegen, um Kondensationsvorgänge an der Unterseite sicher zu vermeiden.
