DE102012219691A1

DE102012219691A1 - Modifizierte Gelatine, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE102012219691A1
Application number: DE201210219691
Authority: DE
Inventors: Eva Hoch; Kirsten Borchers; Günter Tovar
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2032-10-27
Also published as: DE102012219691B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur auf einem Substrat, die Verwendung eines Gelatinederivats in diesem Verfahren sowie das Gelatinederivat an sich.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur auf einem Substrat, die Verwendung eines Gelatinederivats in diesem Verfahren sowie das Gelatinederivat an sich.
Automatisierte Verfahren für das Dispensieren, Extrudieren und Elektrospinnen sowie computergestützte generative Fertigungsverfahren wie das FDM-Verfahren (FDM = „fused deposition modelling”), selektives Laserschmelzen oder dreidimensionales (auch als 3D bezeichnet) Tintenstrahldruckverfahren ermöglichen einen schichtweisen Aufbau von komplexen dreidimensionalen Strukturen. Sie werden eingesetzt, um biomimetische und anatomisch angepasste Gerüststrukturen für Implantate oder für dreidimensionale Zellkulturen in der Gewebezüchtung/-konstruktion („tissue engineering”) herzustellen.
In der Gewebezüchtung/-konstruktion übernimmt zunächst ein Trägermaterial die Funktionen der natürlichen extrazellulären Matrix (EZM), welche die Zellen dreidimensional organisiert und Anreize für das Wachstum und die Bildung des gewünschten Gewebes schafft (S. F. Yang, K. F. Leong, Z. H. Du und C. K. Chua (2001); The design of scaffolds for use in tissue engineering part I; Tissue Engineering 7(6): 679–689). Die Eigenschaften und Anforderungen an das Trägermaterial sind von dem zu erzeugenden Gewebe und dessen Anwendung abhängig (J. L. Drury und D. J. Mooney (2003); Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications; Biomaterials 24: 4337–4351).
Gelatine ist ein vielversprechendes Trägermaterial für die Gewebezüchtung/-konstruktion sowie die Zellkultur. Sie wird durch Spaltung aus Kollagen gewonnen, welches ein natürlicher Bestandteil der extrazellulären Matrix ist. Gelatine als Kollagenderivat besitzt daher natürlicherweise die Aminosäuresequenz Arginin-Lysin-Asparginsäure (RGD), an welche Zellen mit speziellen Proteinen in ihrer Zellmembran adhärieren können. Diese Aminosäuresequenz wird auch als Zelladhäsionssequenz bezeichnet. Im Gegensatz zu Kollagen ist Gelatine bei einem physiologischen pH-Wert und einer Temperatur oberhalb von ungefähr 25°C wasserlöslich (siehe van den Bulcke 2000). Folglich können in Gelatinelösungen Zellen suspendiert und mittels Systemen zur Handhabung kleiner Mengen an Flüssigkeiten („liquid-handling-systems”) verarbeitet werden.
Dies gilt allerdings nur für ein stark eingeschränktes Prozessfenster (W. Babel (1996); Gelatine – ein vielseitiges Biopolymer; Chemie in unserer Zeit 30: 86–95; http://www.gelita.com/de/lösungen-und-produkte/viskoelastische-eigenschaften, August 2012). Gelatine besitzt nämlich wie Kollagen die Fähigkeit, physikalisch zu einem Hydrogel zu vernetzen, indem supramolekulare Triple-Helices ausgebildet werden. Dieser Übergang vom flüssigen Zustand (Sol) in den festen Zustand (Gel) ist abhängig vom Molekulargewicht der Gelatine, der Gelatinekonzentration, der Temperatur und dem pH-Wert.
Durch die Ausbildung der Hydrogelstruktur ist die Prozessierbarkeit von Gelatinelösungen, insbesondere in generativen Fertigungsverfahren, stark eingeschränkt. Außerdem ist die Ausbildung der Triple-Helices thermoreversibel, das heißt die Triplehelix, die aus drei über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander verknüpften Gelatinemolekülen besteht, ist bei physiologischen Bedingungen nicht stabil. Dadurch kann Gelatine als Matrixmaterial zur Verarbeitung von vernetzbaren Zell-Matrix-Suspensionen zum Aufbau künstlicher Gewebe bislang nicht universell eingesetzt werden.
In R. Landers, U. Hubner, R. Schmelzeisen und R. Mulhaupt (2002); Rapid Prototyping of scaffolds derived from thermoreversible hydrogels and tailored for applications in tissue engineering; Biomaterials 23: 4437–4447), wurden Gelatine, Agarose und Agar eingesetzt, um mittels Dispensierverfahren thermoreversible dreidimensionale Architekturen für dreidimensionale Zellkulturen aufzubauen. Dabei wurden Gelatinelösungen bei hohen Temperaturen von 40°C dispensiert und durch Abkühlung auf 20°C zu Gelen verfestigt. Bei einer Temperatur von 37°C, insbesondere unter physiologischen Bedingungen, waren diese Gele jedoch nicht stabil und sind somit als Gerüststruktur für eine Zellkultur nicht geeignet.
Zur Verbesserung der mechanischen Eigenschaften von Gelatinegelen können diese chemisch vernetzt werden. Hierfür werden beispielsweise Vernetzer-Moleküle wie Glutardialdehyd (A. Bigi, G. Cojazzi, S. Panzavolta, K. Rubini und N. Roveri (2001); Mechanical and thermal properties of gelatin films at different degrees of glutaraldehyde crosslinking; Biomaterials 22(8): 763–768) oder Genipin (M. T. Nickerson, J. Patel, D. V. Heyd, D. Rousseau und A. T. Paulson (2006); Kinetic and mechanistic considerations in the gelation of genipin-crosslinked gelatin; International Journal of Biological Macromolecules 49(4–5): 298–302) eingesetzt.
Zur Erzeugung stabiler Gelatine-Gele ist es auch bekannt, dass chemisch modifizierte Gelatine-Derivate, z. B. methacrylierte Gelatine, eingesetzt werden, welche mit Hilfe eines Fotoinitiators durch UV-Bestrahlung radikalisch vernetzt werden (A. I. Van den Bulcke, B. Bogdanov, N. De Rooze, E. H. Schacht, M. Cornelissen und H. Berghmans (2000); Biomacromolecules 1: 31–38; E. Hoch, C. Schuh, T. Hirth, G. E. M. Tovar und K. Borchers (2012); Stiff gelatin hydrogels can be photo-chemically synthesized from low viscous gelatin solutions using molecularly functionalized gelatin with a high degree of methacrylation; Journal of Materials Science: Materials in Medicine; DOI 10.1007/s10856-012-4731-2).
Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem liegt daher unter anderem insbesondere darin, ein Gelatinederivat bereitzustellen, das insbesondere in einem Verfahren zur Herstellung einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur auf einem Substrat verwendet werden kann. Das Gelatinederivat soll sich insbesondere dadurch auszeichnen, dass es insbesondere bei physiologischen Temperaturen, insbesondere bei ungefähr 37°C, stabile, thermo-ir reversibel gebildete Gele ausbilden kann und dass es bevorzugt in Lösungen einsetzbar ist, welche für die Verarbeitung bei Temperaturen unterhalb von 37°C in Druck- oder Pipettierverfahren, insbesondere Druckverfahren, insbesondere in einem Tintenstrahldruckverfahren, insbesondere in einem „Tropfen auf Verlangen”-Tintenstrahldruckverfahren („drop on demand ink jet”) verwendet werden. Insbesondere soll das Gelatinederivat in den Lösungen keine Hydrogele ausbilden und erst nach dem Aufbringen dieser Lösungen auf ein Substrat, bevorzugt einen Träger, zu einem stabilen, irreversibel, bevorzugt thermo-irreversibel, gebildeten Gel umgesetzt werden können.
Dieses technische Problem wird insbesondere durch die Lehre der unabhängigen Ansprüche gelöst.
Erfindungsgemäß ist das technische Problem insbesondere durch ein Verfahren zur Herstellung einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur auf einem Substrat gelöst, das mindestens die folgenden Schritte umfasst:

a) Aufbringen mindestens eines in einem flüssigen Medium enthaltenen Gelatinederivats auf das Substrat und
b) Fixieren des mindestens einen in Schritt a) aufgebrachten Gelatinederivats durch intermolekulare, insbesondere intermolekulare chemische Vernetzung des Gelatinederivats, wobei das Gelatinederivat mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe und mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe aufweist, wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Aldehyd, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxyaryl und Acyl, und wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus einer Gruppe A bestehend aus Maleinimidgruppe und C-C-Doppelbindung, oder aus einer Gruppe B bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe, Thiolgruppe, C-N-Dreifachbindung und Diengruppe, wobei wenn die artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe die Diengruppe ist, wird die nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxyaryl.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Gelatinederivat weist somit jeweils mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe und mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe auf. Diese Gruppen wurden in Gelatine, insbesondere nicht strukturell modifizierte Gelatine durch geeignete chemische Reaktionen mit den in einer nicht-strukturell modifizierten Gelatine vorhandenen funktionellen Gruppen der Aminosäure-Seitenketten, insbesondere durch Addition oder Substitution, eingeführt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Kopplung an die funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenkette eine Addition oder Substitution der entsprechenden funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenkette verstanden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung des Gelatinederivats ein Teil der in einer nicht-strukturell modifizierten Gelatine vorhandenen funktionellen Gruppen der Aminosäure-Seitenketten zu den artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen und ein anderer Teil zu den artifiziell eingeführten Vernetzer-Gruppen umgesetzt.
Die artifiziell einzuführenden Vernetzergruppen oder artifiziell einzuführenden nicht-vernetzbaren Gruppen können entweder direkt oder über eine molekulare Spacergruppe (Abstandshalter) an die Gelatine gebunden werden. Die Ankopplung erfolgt über Standardchemie an die genannten funktionellen Gruppen der Aminosäurereste der Gelatine (G. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press 1996). Die Spacergruppe kann bevorzugt an ihrem Ende, das nicht für die Kopplung an die Gelatine vorgesehen ist, die artifiziell einzuführende Vernetzergruppe oder die artifiziell einzuführende nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe tragen oder diese wird in einem zweiten Schritt ebenfalls mittels Standardchemie an die Spacergruppe gekoppelt. Bevorzugt werden einseitig geschützte Spacergruppen verwendet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das flüssige Medium eine Lösung oder Suspension in einem wässrigen Lösemittel, insbesondere also eine wässrige Lösung oder Suspension. Erfindungsgemäß eingesetzt werden kann auch eine Lösung oder Suspension in einem organischen Lösemittel.
Durch das Fixieren des in Schritt a) aufgebrachten Gelatinederivats durch intermolekulare chemische Vernetzung des Gelatinederivats wird bevorzugt ein Gelatinederivatgel erhalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die C-C-Doppelbindung aus der Gruppe A ausgewählt ist aus Methacrylgruppe und Acrylgruppe.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Gelatinederivat aus einer nicht strukturell modifizierten Gelatine hergestellt wurde, welche funktionelle Gruppen aufweist, die ausgewählt sind aus Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Säureamingruppen, Indolgruppen, Imidazolgruppen und Carboxylgruppen.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei an die in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen und/oder die artifiziell eingeführten Vernetzer-Gruppen gekoppelt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen und die artifiziell eingeführten Vernetzer-Gruppen an die in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen gekoppelt sind, wobei die in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Säureamingruppen, Indolgruppen, Imidazolgruppen und Carboxylgruppen.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei eine Spacergruppe zwischen den in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen und den artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen und/oder den artifiziell eingeführten Vernetzer-Gruppen vorliegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Spacergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substituierten und nichtsubstituierten kurz- oder langkettigen Alkylgruppen, Aromaten, substituierten und nicht-substituierten Oligoethylenglycolgruppen und substituierten und nicht-substituierten Polyethylenglycolgruppen.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei mindestens 85% der in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen in Kopplung mit den artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen und den artifiziell eingeführten Vernetzer-Gruppen vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei ein molares Verhältnis von artifiziell eingeführten Vernetzergruppen zu artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen von 15:1 bis 1:15 vorliegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei ein molares Verhältnis von artifiziell eingeführten Vernetzergruppen zu artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen von 15:1 bis 1:15 eingesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei zur Herstellung des mindestens einen Gelatinederivats ein molares Verhältnis einer chemischen Substanz zur Erzeugung der artifiziellen Vernetzergruppen zu einer chemischen Substanz zur Erzeugung der artifiziellen nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen von 15:1 bis 1:15 eingesetzt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zur Herstellung des Gelatinederivats ein molarer Überschuss an den chemischen Substanzen verwendet, welche die artifiziell eingeführten Vernetzergruppen und artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen erzeugen, bevorzugt liegt ein molarer Überschuss von 1 bis 5 für die chemische Substanz zur Erzeugung der artifiziellen Vernetzergruppen und ein molarer Überschuss von 5 bis 10 für die chemische Substanz zur Erzeugung der artifiziellen nicht vernetzbaren funktionellen Gruppen vor, bezogen auf die in der nicht strukturell modifizierten Gelatine vorhandenen funktionellen Gruppen, bevorzugt auf deren Aminogruppen.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei in Schritt a) das Aufbringen des Gelatinederivats auf das Substrat ortsselektiv und das in Schritt b) durchgeführte Fixieren des in Schritt a) aufgebrachten Gelatinederivats durch elektromagnetische Strahlung flächig oder ortsselektiv erfolgt.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das flüssige Medium in einem Temperaturbereich von 25°C bis 40°C eine Viskosität von maximal 15 mPas aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das flüssige Medium einen Gelatinederivat-Feststoffgehalt von mindestens 5 Gewichts-% aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das flüssige Medium mit einem minimalen Feststoffanteil des Gelatinederivats von 5 Gewichts-%, bevorzugt 10 Gewichts-%, bevorzugt 15 Gewichts-%, bevorzugt 20 Gewichts-% bei 37°C, bevorzugt 30°C, b evorzugt 25°C eine Viskosität von maximal 20 mPas, insbesondere weniger als 20 mPas, insbesondere weniger als 13 mPas, insbesondere weniger als 10 mPas aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Verfahren ein „Tropfen auf Verlangen”-(„drop-on-demand”)-Tintenstrahl-Druckverfahren ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei in Schritt a) mindestens ein Zusatzstoff zusammen mit dem Gelatinederivat auf das Substrat aufgebracht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei der mindestens eine Zusatzstoff mit dem mindestens einen Gelatinederivat vernetzbar ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei der mindestens eine Zusatzstoff ausgewählt ist aus Kollagen, Glycosaminglycanen, Polysaccharide, Proteinen, DNA, antimikrobiell wirksamen Substanzen und Farbmitteln oder Derivaten dieser Zusatzstoffe, die mit artifiziell eingeführten Vernetzergruppen ausgewählt aus der Gruppe A und/oder Gruppe B derivatisiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine erfindungsgemäße Verwendung des Gelatinederivats zur Herstellung einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur, bevorzugt mittels Druck- oder Pipettierverfahren, auf einem Substrat, wobei das Gelatinederivat mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe und mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe aufweist,
wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Aldehyd, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxyaryl und Acyl, und
wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus einer Gruppe A bestehend aus Maleinimidgruppe und C-C-Doppelbindung, oder aus einer Gruppe B bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe, Thiolgruppe, C-N-Dreifachbindung und Diengruppe,
wobei wenn die artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe eine Diengruppe ist, wird die nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxyaryl.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Gelatinederivat, das mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe und mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe aufweist, wobei das Gelatinederivat mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe und mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe aufweist, wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Aldehyd, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxyaryl und Acyl, und
wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus einer Gruppe A bestehend aus Maleinimidgruppe und C-C-Doppelbindung, oder aus einer Gruppe B bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe, Thiolgruppe, C-N-Dreifachbindung und Diengruppe,
wobei wenn die mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe eine Diengruppe ist, wird die nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxyaryl.
Die Erfindung betrifft auch eine zwei- oder dreidimensionale Struktur auf einem Substrat oder eine zwei- oder dreidimensionale Struktur losgelöst von dem erfindungsgemäß eingesetzten Substrat, hergestellt mittels eines der erfindungsgemäßen Verfahren.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „ein erfindungsgemäßes Verfahren” insbesondere ein vorliegend beschriebenes Verfahren gemäß der Verfahrensabfolge der Schritt a) und b) verstanden, wobei ein erfindungsgemäßes Verfahren auch eine oder mehrere der bevorzugten Ausgestaltungen dieser Verfahrenslehre ist.
In besonders bevorzugter Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren, welches aus den Schritten a) und b) besteht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren, welche aus den Schritten a), b), c) und d) besteht.
Unter dem Begriff „Vernetzung” wird ein chemischer Vorgang verstanden, bei dem die in dem Gelatinederivat vorhandenen Vernetzergruppen intermolekular miteinander reagieren, so dass mindestens eine kovalente chemische Bindung zwischen zwei gleichermaßen oder verschieden derivatisierten Gelatinederivat-Molekülen ausgebildet wird. Mit der erfindungsgemäßen Vernetzung wird nicht die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen oder anderer rein physikalischer Wechselwirkungen verstanden.
Erfindungsgemäß kann es bevorzugt zusätzlich zur irreversiblen Vernetzung durch die Vernetzergruppen auch zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen in dem nach dem Schritt b) fixiert vorliegenden Gelatinederivatgel kommen, beispielsweise durch Hydroxylgruppen und/oder weiteren funktionellen Gruppen, die zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen geeignet sind.
Unter dem Begriff „Vernetzergruppe” wird eine funktionelle Gruppe verstanden, die entweder mit einer identischen oder sehr ähnlich aufgebauten Gruppe oder mit einer komplementären funktionellen Gruppe eine chemische Reaktion eingehen kann, wodurch mindestens eine, insbesondere thermo-irreversible, kovalente Bindung gebildet werden kann. Dabei kann bevorzugt zur Initiierung der Reaktion ein Initiator notwendig sein. Die Bildung der mindestens einen kovalenten Bindung ist unter physiologischen Bedingungen, insbesondere bei einem pH-Wert von 6 bis 8 und bei einer Temperatur von 30 bis 45°C, irreversibel. Sie werden bevorzugt durch chemische Kopplung an die funktionellen Gruppen der Aminosäurenseitenkette in das Gelatinemolekül eingebracht. Eine erfindungsgemäße artifiziell eingeführte Vernetzergruppe kann in einer bevorzugten Ausführungsform auch eine nicht-vernetzbare Gruppe sein, falls keine geeignete komplementäre Vernetzergruppe vorliegt, mit der sie mindestens eine kovalente Bindung ausbilden kann.
Unter dem Begriff „funktionelle Gruppen” werden Atomgruppen in organischen Verbindungen verstanden, welche die Stoffeigenschaften und das Reaktionsverhalten der sie tragenden Verbindungen maßgeblich bestimmen.
Unter dem Begriff „funktionelle Gruppen der Aminosäure-Seitenketten” werden funktionelle Gruppen verstanden, die sich, bevorzugt endständig, in den Seitenketten der Aminosäuren und nicht in dem polymeren Rückgrat des Gelatine-Moleküls befinden.
Erfindungsgemäß sind die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen und die artifiziell eingeführten Vernetzergruppen bevorzugt ein Teil einer funktionellen Gruppe. Erfindungsgemäß wird bevorzugt allein der Teil der funktionellen Gruppe wiedergegeben, der entscheidend ist, um den erfindungsgemäß beabsichtigten technischen Effekt der Vernetzbarkeit oder der Nicht-Vernetzbarkeit zu gewährleisten. Die artifiziell eingeführten Vernetzergruppen und/oder die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen sind in dem erfindungsgemäßen Gelatinederivat deshalb entweder mit einem Kohlenstoff oder einem Heteroatom, bevorzugt mit einem Heteroatom verbunden. Bevorzugt kann die Vernetzergruppe Acrylgruppe als Acrylatgruppe oder Acrylamidgruppe, bevorzugt Acrylamidgruppe vorliegen. Bevorzugt liegt die Methacrylgruppe als Methacrylat- oder Methacrylamidgruppe vor.
Unter dem Begriff „artifiziell eingeführte Vernetzergruppe” werden funktionelle Gruppen verstanden, die durch chemische Kopplung an die funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten in das Gelatinemolekül eingebracht werden und mit den im gleichen oder einem anderen Gelatinederivat vorhandenen gleichen und/oder komplementären funktionellen Gruppen chemisch reagieren.
Unter dem Begriff „artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare Gruppe” werden funktionelle Gruppen verstanden, die durch chemische Kopplung an die funktionellen Gruppen der Aminosäurenseitenkette in das Gelatinemolekül eingebracht werden und mit den im gleichen oder einem anderen Gelatinederivat vorhandenen gleichen und/oder komplementären funktionellen Gruppen nicht chemisch reagieren und keine zur reversiblen Gelierung führende physikalische Wechselwirkung ausbilden.
Unter dem Begriff „Spacergruppe” wird eine zwischen den funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten des Gelatinemolekül und der artifiziell eingeführten nicht-vernetzenden Gruppe oder der artifiziell eingeführten Vernetzergruppe liegende, und diese Gruppen verbindende Molekülkette verstanden, die aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzung zusätzlich das Gelierverhalten und die Löslichkeit und Mischbarkeit des Gelatinederivats und die physikalischen Eigenschaften des vernetzten Gelatinederivat-Gels beeinflusst.
Unter dem Begriff „nicht strukturell modifizierte Gelatine” werden Gelatinen verstanden, die aus natürlich vorkommenden Kollagenen unmittelbar durch Hydrolyse erhalten werden. Die nicht strukturell modifizierte Gelatine weist in den Seitenketten allein funktionelle Gruppen auf, welche in natürlich vorkommenden Aminosäuren vorhanden sind. Die nicht strukturell modifizierte Gelatine weist einen hohen Hydroxyprolingehalt und eine Aminosäuresequenz auf, welche zwei, sich wiederholende Aminosäureblöcke enthält, nämlich Glycin-Prolin-X und Glycin-X-Hydroxyprolin, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Glycin, Prolin und Hydroxyprolin ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine nicht strukturell modifizierte Gelatine eine Gelatine, deren funktionelle Gruppen der Aminosäurenseitenketten nach dem Gewinnungsprozess aus Kollagen nicht verändert wurden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „flächig”, insbesondere einem flächigen Aufbringen des Gelatinederivats oder einem flächigen Fixieren des aufgebrachten vernetzbaren Materials verstanden, dass das Aufbringen des Materials oder die fixierende Strahlung gleichmäßig über die gesamte zu beschichtende oder fixierende Materialschicht erfolgt. Demgemäß kann ein flächiger Auftrag des Gelatinematerials oder ein flächiges Einwirken der Strahlung zur Ausbildung von dreidimensional ausgebildeten beziehungsweise fixierten Schichten führen. Insbesondere aufgrund des flächigen Materialauftrags beziehungsweise flächigen Einwirkens der Strahlung wird das Gelatinederivat gleichmäßig aufgebracht beziehungsweise fixiert.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „ortsselektiv”, insbesondere einem ortsselektiven Aufbringen eines Gelatinederivats oder einem ortselektiven Fixieren des aufgebrachten Gelatinederivats verstanden, dass ein Aufbringen des Gelatinederivats nicht gleichmäßig auf das gesamte Substrat oder die im Schritt davor aufgetragene Materialschicht oder der fixierenden Strahlung nicht gleichmäßig über die gesamte Materialschicht erfolgt.
Unter dem Begriff „zweidimensionale Struktur” wird in einem dreidimensionalen Raum mit den Raumachsen x, y und z eine Struktur mit Kantenlängen x', y' und z' entlang der Raumachsen verstanden, bei der die Längen der kürzesten Kante von x' und y' einer durch die Kanten x' und y' aufgespannten Fläche deutlich größer als die Kantenlänge z' ist, vorzugsweise um den Faktor 5, vorzugsweise Faktor 10, vorzugsweise Faktor 20, vorzugsweise Faktor 30, vorzugsweise Faktor 40, vorzugsweise Faktor 50, vorzugsweise Faktor 100, vorzugsweise Faktor 1000, bevorzugt 10000. Der Begriff „zweidimensionale Struktur” bedeutet demgemäß nicht, dass keine räumliche Ausdehnung in Richtung der dritten Dimension erfolgt.
Das erfindungsgemäße Gelatinederivat bildet bei physiologischen Temperaturen in dem flüssigen Medium, insbesondere in den, insbesondere wässrigen, Lösungen, keine Hydrogele aus. Die Viskosität dieser das erfindungsgemäße Gelatinederivat enthaltenden Lösungen ist niedrig genug, um damit ihre Verarbeitung in Pipettier- und Druckverfahren, insbesondere Tintenstrahldruckverfahren, insbesondere in „Tropfen-auf-Verlangen”-Tintenstrahldruckverfahren zu ermöglichen. Durch das Einbringen von artifiziellen Vernetzergruppen und artifiziellen nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen kann einerseits der gewünschte Vernetzungsgrad eingestellt und dennoch die Ausbildung von reversiblen Hydrogelen verhindert werden. Somit ist erfindungsgemäß bevorzugt vorgesehen, eine Vielzahl an in natürlicher Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen in den Seitenketten der Aminosäuren strukturell zu modifizieren. Die Löslichkeit des Gelatinederivats und deren Mischbarkeit mit anderen Reaktivharzen zur Verwendung in Formulierungen von biokompatiblen Reaktivtinten für ein „Tropfen-auf-Verlangen”-Tintenstrahldruckverfahren kann durch den Einbau der artifiziellen Vernetzergruppen und/oder der artifiziellen nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen, bevorzugt zusätzlich mit Spacergruppen gesteuert werden.
Erfindungsgemäß werden Gelatinederivate mit artifiziell eingeführten Vernetzergruppen und artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren Gruppen eingesetzt, die es erlauben, unabhängig voneinander das Gelierverhalten der Gelatine durch „Maskieren” der funktionellen Gruppen der Aminosäurereste zu vermindern und den Vernetzungsgrad einzustellen. Dazu wird die benötigte Menge an artifiziellen Vernetzergruppen an die funktionellen Gruppen der Aminosäurereste der Gelatine eingeführt, um die gewünschte Festigkeit der kovalent vernetzten Gelatinederivat-Gele einzustellen. Zusätzlich werden weitere funktionelle Gruppen der Aminosäurereste der Gelatine mit artifiziell eingeführten nicht vernetzbaren funktionellen Gruppen maskiert, um die Viskosität der in Schritt a) eingesetzten Gelatinelösung zu erniedrigen und das Gelieren bei niederen Temperaturen, z. B. Raumtemperatur, und hohen Feststoffgehalten (10 Gewichts% bis 30 Gewichts-%) zu verhindern.
Insbesondere beeinflusst der Anteil der artifiziell eingeführten Vernetzergruppen die mechanischen und/oder physiko-chemischen Eigenschaften der in Schritt b) erhaltenen, vernetzten Gelatinederivat-Gele, sowie deren Festigkeit und Quellbarkeit. Die Quellbarkeit und Festigkeit hängt maßgeblich vom Vernetzungsgrad, bevorzugt vom Derivatisierungsgrad, bevorzugt vom Acrylierungsgrad, bevorzugt vom Methacrylierungsgrad ab.
Es ist insbesondere möglich, durch die Einführung von artifiziellen nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen die Viskosität des in Schritt a) aufgebrachten flüssigen Mediums bei der gleichzeitigen Anwesenheit von wenigen artifiziellen eingeführten Vernetzergruppen im Vergleich zu einer nicht strukturell modifizierten Gelatine zu erniedrigen. Insbesondere ist vorgesehen, dass durch Einführung von einer bestimmten Anzahl an artifiziellen Vernetzergruppen und einer bestimmten Anzahl an artifiziellen nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen eine bestimmte mechanische Festigkeit und Quellbarkeit der vernetzten Gelatinederivat-Gele und gleichzeitig eine bestimmte Viskosität des in Schritt a) aufgebrachten flüssigen Mediums eingestellt werden. Die erfindungsgemäßen Gelatinederivat-Gele sind insbesondere biokompatibel, insbesondere cytokompatibel.
Überraschenderweise wurde eine Verwertbarkeit der erfindungsgemäß vorliegenden chemisch modifizierten Gelatine für Drucktechniken festgestellt. Eine chemische Funktionalisierung wurde zunächst mit Vernetzergruppen durchgeführt, um (unabhängig) stabile Gelatine-Gele herstellen zu können. Festgestellt wurde, dass nach Einführung von ausreichend vielen Vernetzergruppen, das heißt der Maskierung von ausreichend vielen funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten der strukturell nicht modifizierte Gelatine die Gelatine aufgrund verringerter Viskosität und Gelierbarkeit bei niedrigen Temperaturen (insbesondere 20 bis 40°C) überraschenderweise verdruckt werden kann. Erfindungsgemäß werden vorteilhafterweise und überraschenderweise insbesondere zur Maskierung der funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten der natürlichen Gelatine nicht vernetzbare Gruppen eingeführt, um unabhängig vom Vernetzungsgrad eine Erniedrigung der Gelierfähigkeit und/oder Viskosität zu erreichen. Die Erfindung stellt daher kontrolliert und gezielt einstellbar, insbesondere für Drucktechniken einsetzbare, Gelatinederivate zur Verfügung, wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eingesetzt wird, um gezielt und kontrolliert zu vernetzen, insbesondere irreversibel zu vernetzen, und wobei in der natürlichen Gelatine vorkommende, die Viskosität für die vorgesehenen Einsatzzwecke nachteilig beeinflussende, natürlicherweise vorkommende funktionelle Gruppen der Aminosäureseitenketten durch nicht-vernetzbare artifiziell eingeführte funktionelle Gruppen zusätzlich kontrolliert und gezielt maskiert werden, das heißt gekoppelt werden, insbesondere substituiert werden.
Das eingesetzte Gelatinederivat genügt insbesondere den Anforderungen des zwei- und dreidimensionalen Druckverfahrens, bevorzugt des Tintenstrahl-Druckens, hinsichtlich der einzuhaltenden Viskosität, der Oberflächenspannung, des Verlaufsverhaltens und der Druckstabilität.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die artifiziell einzuführenden Vernetzergruppen und/oder die Spacergruppen, durch chemische Reaktion an die funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten der nicht strukturell modifizierten Gelatine addiert. Bevorzugt findet dabei eine Addition an die oder Substitution der funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten der nicht strukturell modifizierten Gelatine statt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die artifiziell einzuführenden Vernetzergruppen an die funktionellen Gruppen der zuvor eingebrachten Spacergruppen chemisch gekoppelt, bevorzugt addiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die artifiziell einzuführenden nicht-ververnetzbaren funktionellen Gruppen und/oder die Spacergruppen durch chemische Reaktion an die funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten der nicht strukturell modifizierten Gelatine addiert. Bevorzugt findet eine Addition oder Substitution der funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten der nicht strukturell modifizierten Gelatine statt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die artifiziell einzuführenden nicht-ververnetzbaren funktionellen Gruppen an die funktionellen Gruppen der zuvor eingebrachten Spacergruppen chemisch gekoppelt, bevorzugt addiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die artifiziell eingeführte Vernetzergruppe ausgewählt aus der Gruppe A bestehend aus Maleinimidgruppe und C-C-Doppelbindung, insbesondere Methacrylgruppe, Acrylgruppe, Maleinimidgruppe, Allylgruppe und Vinylgruppe, bevorzugt Methacrylgruppe und Acrylgruppe, bevorzugt Methacrylgruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt a) genau ein Gelatinederivat auf das Substrat aufgebracht und in Schritt b) unter Verwendung eines Initiators, bevorzugt eines Fotoinitiators, bevorzugt eines UV-sensitiven Fotoinitiators, bevorzugt eines UVA-sensitiven Fotoinitiators, bevorzugt eines IR-sensitiven Fotoinitiators, bevorzugt eines thermischen Initiators vernetzt, wenn die artifiziell eingeführte Vernetzergruppe aus der Gruppe A ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das mindestens eine in dem flüssigen Medium vorhandene Gelatinederivat nicht intermolekular vernetzt. Das in Schritt a) mindestens eine in dem flüssigen Medium vorhandene Gelatinederivat ist bevorzugt frei von einer intermolekularen Vernetzung.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das in Schritt a) aufgebrachte Gelatinederivat genau eine Art von artifiziell eingeführten Vernetzergruppen auf. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das in Schritt a) aufgebrachte Gelatinederivat als artifiziell eingeführte Vernetzergruppen, bevorzugt allein, Methacrylatgruppen auf. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das in Schritt a) aufgebrachte Gelatinederivat als artifiziell eingeführte Vernetzergruppen, bevorzugt allein, Acrylatgruppen auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das in Schritt a) aufgebrachte Gelatinederivat zwei, insbesondere drei, insbesondere vier, insbesondere alle unterschiedlichen artifiziell eingeführten Vernetzergruppen aus der Gruppe A auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden in Schritt a) mindestens zwei unterschiedliche Gelatinederivate auf das Substrat aufgebracht, wobei das erste Gelatinederivat mindestens eine erste artifiziell eingeführte Vernetzergruppe ausgewählt aus der Gruppe B aufweist und das zweite Gelatinederivat mindestens eine zweite artifiziell eingeführte Vernetzergruppe aufweist, welche zur Ausbildung mindestens einer kovalenten Bindung mit der ersten Vernetzergruppe fähig ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden in Schritt a) die mindestens zwei unterschiedlichen Gelatinederivate zeitgleich oder nacheinander, bevorzugt bei mehrfacher Durchführung der Schritte a) und b) abwechselnd, in unterschiedlichen flüssigen Medien auf das Substrat aufgebracht, insbesondere wenn eines der Gelatinederivate mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzergruppe ausgewählt aus der Gruppe B aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt in Schritt b) die Fixierung mittels elektromagnetischer Strahlung oder Erwärmung, falls die artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe A.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt in Schritt b) die Fixierung, falls in Schritt a) ein Gelatinederivat, welches mindestens eine artifiziell eingeführte erste Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe B aufweist, durch Auftragen eines zweiten Gelatinederivats, welches eine zur ersten artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe komplementäre zweite artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt in Schritt b) die Fixierung, falls in Schritt a) ein Gelatinederivat, welches mindestens eine erste artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe B aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in Schritt a) mindestens zwei, bevorzugt mindestens drei, bevorzugt mindestens vier Gelatinederivate auf das Substrat aufgebracht und anschließend gemeinsam in dem Schritt b) durch intermolekulare Vernetzung der Gelatinederivate fixiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt a) genau ein Gelatinederivat auf das Substrat aufgebracht und in dem Schritt b) das in Schritt a) aufgebrachte Gelatinederivat durch intermolekulare Vernetzung des Gelatinederivats fixiert, insbesondere wenn die artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe A. In einem darauffolgenden Verfahrensschritt c) wird bevorzugt mindestens ein weiteres Gelatinederivat auf das Substrat und/oder auf das in Schritt b) fixierte Gelatinederivat aufgebracht und in einem Verfahrensschritt d) durch intermolekulare Vernetzung des mindestens einen Gelatinederivats fixiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verfahrensfolge der Schritte a) und b) mehrfach wiederholt, insbesondere mindestens zwei Mal, bevorzugt mindestens drei Mal, bevorzugt mindestens vier Mal, bevorzugt mindestens fünf Mal, bevorzugt mindestens zehn Mal, bevorzugt mindestens zwei bis 1000 Mal, bevorzugt mindestens fünf bis 900 Mal, bevorzugt mindestens fünf bis 500 Mal, bevorzugt mindestens fünf bis 100 Mal, bevorzugt mindestens zehn bis 80 Mal, bevorzugt mindestens 40 bis 60 Mal.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt a) und c) dasselbe Gelatinederivat aufgebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn ein erstes Gelatinederivate mindestens eine erste artifiziell eingeführte Vernetzergruppe aufweist, die aus der Gruppe B ausgewählt ist, werden in Schritt a) mindestens zwei verschiedene Gelatinederivate auf das Substrat aufgebracht, wobei ein zweites Gelatinederivat mindestens eine zweite artifiziell eingeführte Vernetzergruppe aufweist, die komplementär ist zu der ersten artifiziell eingeführte Vernetzergruppe und mit dieser mindestens eine kovalente Bindung ausbildet. In dem Schritt b) werden die in Schritt a) aufgebrachten mindestens zwei Gelatinederivate durch intermolekulare Vernetzung der verschiedenen Gelatinederivate fixiert.
In einem bevorzugt darauffolgenden Verfahrensschritt c) werden mindestens zwei weitere Gelatinederivate auf das Substrat und/oder auf die in Schritt b) fixierten Gelatinederivate aufgebracht und in einem Verfahrensschritt d) durch intermolekulare Vernetzung der mindestens zwei Gelatinederivate fixiert, insbesondere wenn eines der Gelatinederivate mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzergruppe aufweist, die aus der Gruppe B ausgewählt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verfahrensfolge der Schritte a) und b) mehrfach wiederholt, insbesondere mindestens zwei Mal, bevorzugt mindestens drei Mal, bevorzugt mindestens vier Mal, bevorzugt mindestens fünf Mal, bevorzugt mindestens zehn Mal, bevorzugt mindestens zwei bis 1000 Mal, bevorzugt mindestens fünf bis 900 Mal, bevorzugt mindestens fünf bis 500 Mal, bevorzugt mindestens fünf bis 100 Mal, bevorzugt mindestens zehn bis 80 Mal, bevorzugt mindestens 40 bis 60 Mal.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, gemäß der mindestens zwei verschiedene Gelatinederivate eingesetzt werden, sind die artifiziell eingeführte Vernetzergruppen aus der Gruppe B ausgewählt, wobei die Gruppe B besteht aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe, Thiolgruppe, C-N-Dreifachbindung und Diengruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, gemäß der mindestens zwei verschiedene Gelatinederivate eingesetzt werden, ist die artifiziell eingeführte Vernetzergruppe ausgewählt aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe und Thiolgruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in Schritt a) mindestens zwei verschiedene Gelatinederivate auf das Substrat aufgebracht, wobei das erste Gelatinederivat mindestens eine erste artifiziell eingeführte Vernetzergruppe aufweist, wobei die erste artifiziell eingeführte Vernetzergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe und Thiolgruppe und das zweite artifiziell eingeführte Gelatinederivat mindestens eine zweite artifiziell eingeführte Vernetzergruppe aufweist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, C-N-Dreifachbindung, Diengruppe, Thiolgruppe und Aminogruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, gemäß der mindestens zwei verschiedene Gelatinederivate eingesetzt werden, sind die ersten und die zweiten artifiziell eingeführten Vernetzergruppen fähig, miteinander mittels einer Ringschlussreaktion oder ringfreien Reaktion mindestens eine kovalente Bindung auszubilden, insbesondere ohne die Zugabe eines Katalysators. Diese Art der Vernetzung wird auch „Klickchemie” genannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, gemäß der mindestens zwei verschiedene Gelatinederivate eingesetzt werden, sind die ersten und die zweiten artifiziell eingeführte Vernetzergruppen fähig, miteinander eine Ringschlussreaktion einzugehen, wobei gilt:

i) wenn die erste artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eine Azidgruppe ist, ist die zweite artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eine C-C-Doppelbindung, eine C-C-Dreifachbindung oder eine C-N-Dreifachbindung,
ii) wenn die erste artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eine C-C-Doppelbindung oder eine C-C-Dreifachbindung ist, ist die zweite artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eine C-C-Doppelbindung oder eine C-C-Dreifachbindung,
iii) wenn die erste artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eine C-C-Doppelbindung oder eine C-C-Dreifachbindung ist, ist die zweite artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eine Diengruppe oder
iv) wenn die erste artifiziell eingeführte Vernetzergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe oder Thioketongruppe, ist die zweite artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eine Diengruppe.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, gemäß der mindestens zwei verschiedene Gelatinederivate eingesetzt werden, sind die ersten und die zweiten artifiziell eingeführte Vernetzergruppen fähig, miteinander eine ringfreie Reaktion einzugehen, wobei gilt:

v) wenn die erste artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eine Thiolgruppe ist, ist die zweite artifiziell eingeführte Vernetzergruppe eine C-C-Doppelbindung oder C-C-Dreifachbindung oder
vi) wenn die erste Vernetzergruppe eine C-C-Doppelbindung oder C-C-Dreifachbindung ist, ist die zweite Vernetzergruppe eine Thiolgruppe oder eine Aminogruppe.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die intermolekulare Vernetzung des mindestens einen Gelatinederivats durch thermische oder fotoinitiierte Initiierung, wenn die artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe A. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die intermolekulare Vernetzung fotoinitiiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Moleküle des mindestens einen Gelatinederivats durch radikalische oder additive Initiierung miteinander vernetzt.
Insbesondere findet eine radikalische Initiierung in Schritt b) statt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die artifiziell eingeführten nicht-vernetzenden funktionellen Gruppen ausgewählt aus Halogen, Acetyl, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxyaryl und Acyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Alkyl ein Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, bevorzugt Methyl, bevorzugt Ethyl, bevorzugt Propyl, bevorzugt Butyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Heteroalkyl ein O-substituiertes Heteroalkyl, bevorzugt ein Si-substituiertes Heteroalkyl, bevorzugt ein P-substituiertes Heteroalkyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Heterocycloalkyl ein O-substituiertes Heterocycloalkyl, bevorzugt ein Si-substituiertes Heterocycloalkyl, bevorzugt ein P-substituiertes Heterocycloalkyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Heteroaryl ein O-substituiertes Heteroaryl, bevorzugt ein Si-substituiertes Heteroaryl, bevorzugt ein P-substituiertes Heteroaryl.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Heteroarylalkyl ein O-substituiertes Heteroarylalkyl, bevorzugt ein Si-substituiertes Heteroarylalkyl, bevorzugt ein P-substituiertes Heteroarylalkyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Arylheteroalkyl ein O-substituiertes Arylheteroalkyl, bevorzugt ein Si-substituiertes Arylheteroalkyl, bevorzugt ein P-substituiertes Arylheteroalkyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die artifiziell eingeführten funktionellen Gruppen substituiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die artifiziell eingeführten Vernetzergruppen substituiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Acyl ein Acetyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Spacergruppen ausgewählt aus kurz- oder langkettigen Alkylgruppen, insbesondere mit Kohlenwasserstoffketten von C₁-C₃₀, bevorzugt C₁-C₂₀, bevorzugt C₁-C₁₅, bevorzugt C₅-C₃₀ und modifizierten oder unmodifizierten Oligo- und Polyethylenglycolgruppen R-[O-CH₂-CH₂]_n-R, wobei n = 1 < n < 40, bevorzugt 1 < n < 20, bevorzugt 3 < n < 40, bevorzugt 3 < n < 20 ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen Methylgruppen und/oder Acetylgruppen, bevorzugt Acetylgruppen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen Methylgruppen und/oder Acetylgruppen, bevorzugt Acetylgruppen, und die artifiziell eingeführten Vernetzergruppen ausgewählt aus der Gruppe A bestehend aus Maleinimid-Gruppe und C-C-Doppelbindung, insbesondere Methacrylgruppe, Acrylgruppe, Maleinimid-Gruppe, Allylgruppe und Vinylgruppe, bevorzugt Methacrylgruppe und Acrylgruppe, bevorzugt Methacrylgruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen Acetylgruppen und die artifiziell eingeführten Vernetzergruppen Methacrylgruppen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind mindestens 30%, mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, bevorzugt mindestens 98%, bevorzugt mindestens 99%, bevorzugt 100% aller in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine in den Seitenketten vorkommenden funktionellen Gruppen, insbesondere aller Hydroxyl- und/oder Aminogruppen, strukturell durch die artifiziell eingeführten Vernetzergruppen und/oder die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen modifiziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird durch die Verfahrensfolge der Schritte a) und b) mindestens eine Schicht der zwei- oder dreidimensionalen Struktur hergestellt, wobei zunächst in einem Schritt a) das mindestens eine Gelatinederivat, welches bevorzugt fotovernetzbare Vernetzergruppen aufweist, zusammen mit einer Fotoinitiator-Komponente auf das Substrat aufgebracht, das insbesondere stützend und/oder modellierend während der Herstellung der zwei- oder dreidimensionalen Struktur wirkt, und wobei in einem Schritt b) das mindestens eine aufgebrachte Gelatinederivat und die Fotoinitiator-Komponente durch elektromagnetische Strahlung fixiert wird. In Schritt b) reagiert zumindest ein Teil, insbesondere im Wesentlichen alle, bevorzugt alle der fotovernetzbaren Vernetzergruppen des mindestens einen Gelatinederivats miteinander, wodurch ein fotovernetztes Material erhalten wird. Die Fixierung in Schritt b) findet vorzugsweise dergestalt statt, dass durch die elektromagnetische Strahlung die Fotoinitiator-Komponente, insbesondere durch Spaltung, angeregt wird, um die fotoinitiierte Reaktion, bevorzugt Polymerisationsreaktion der insbesondere fotovernetzbaren Gruppen des Gelatinederivats zu starten. Durch diese kontrollierte Kettenreaktion wird zumindest ein Teil, bevorzugt im Wesentlichen alle, vorzugsweise alle der in dem elektromagnetisch bestrahlten Bereich liegenden fotovernetzbaren Vernetzergruppen umgesetzt.
Die Abfolge der Verfahrensschritt a) und b) führt zur Bildung einer verfestigten Schicht des aufgebrachten Gelatinederivats. Die erfindungsgemäß bevorzugte wiederholte Abfolge der Verfahrensschritte a) und b) führt zur Bildung einer entsprechenden Zahl von Schichten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das fotovernetzbare Material durch die elektromagnetische Strahlung innerhalb einer in Schritt a) aufgebrachten Schicht in alle drei Raumrichtungen x, y und z, also dreidimensional, flächig oder ortsselektiv, insbesondere ortsselektiv, fixiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Zusatzstoff ein Bestandteil der natürlichen extrazellulären Matrix, insbesondere von Säugern, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kollagenen, modifizierten und unmodifizierten Glykosaminglykanen und Proteinen, insbesondere Adhäsionsproteine, oder Derivaten dieser Zusatzstoffe, die mit artifiziell eingeführten Vernetzergruppen ausgewählt aus der Gruppe A und Gruppe B derivatisiert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Glykosaminglykan ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Heparinsulfat und Heparin oder Derivaten dieser Zusatzstoffe, die mit artifiziell eingeführten Vernetzergruppen ausgewählt aus der Gruppe A und Gruppe B derivatisiert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Proteine ausgewählt aus Glycoprotein, Wachstumsfaktoren und Antiköpern oder Antikörperfragmenten oder Derivaten dieser Zusatzstoffe, die mit artifiziell eingeführten Vernetzergruppen ausgewählt aus der Gruppe A und Gruppe B derivatisiert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der in Schritt c) aufgebrachte mindestens eine Zusatzstoff nicht vernetzbar mit dem mindestens einen Gelatinederivat.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Farbmittel ein Farbstoff oder ein Pigment oder Derivaten dieser Zusatzstoffe, die mit artifiziell eingeführten Vernetzergruppen ausgewählt aus der Gruppe A und Gruppe B derivatisiert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Glycosaminglykane mit Methacrylatgruppen, Acrylgruppen oder Thiolgruppen funktionalisiert oder anderen Derivaten dieser Zusatzstoffe, die mit artifiziell eingeführten Vernetzergruppen ausgewählt aus der Gruppe A und Gruppe B derivatisiert sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass in Verfahrensschritt a) biologische Komponenten, insbesondere Zellen, Zellteile, Zellorganelle, Mikroorganismen und/oder Viren gemeinsam mit dem mindestens einen Gelatinederivat in dem flüssigen Medium auf das Substrat aufgebracht werden. Dieses flüssige Medium wird bevorzugt als Zell-Matrix-Suspension bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Teil der Vernetzergruppen in dem mindestens einen Gelatinederivat in Schritt b) nicht vernetzt, insbesondere 1 bis 60%, insbesondere 10 bis 50%, insbesondere 20 bis 40%, vorzugsweise 25 bis 35% der Vernetzergruppen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das mindestens eine Gelatinederivat, bevorzugt mit der Fotoinitiator-Komponente, in einem wässrigen oder organischen Medium aufgenommen.
Dadurch entsteht ein flüssiges Medium, insbesondere eine Suspension oder Lösung, die in Schritt a) auf das Substrat aufgebracht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das in Schritt a) aufzubringende flüssige Medium, insbesondere die Gelatinederivatlösung oder -suspension, einen Anteil von bis zu 50 Gewichts-%, bevorzugt bis zu 30 Gewichts-%, bevorzugt bis zu 25 Gewichts-% des mindestens einen Gelatinederivats auf, bevorzugt 1 bis 20 Gewichts-%, bevorzugt 2 bis 18 Gewichts-%, bevorzugt 5 bis 15 Gewichts-%, bevorzugt 10 bis 15 Gewichts-% auf (bezogen auf das Gewicht des flüssigen Mediums).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt der Anteil an Gelatinederivat in dem flüssigen Medium mindestens 5 Gewichts%, insbesondere mindestens 7 Gewichts-%, insbesondere mindestens 9 Gewichts-%, insbesondere mindestens 10 Gewichts-%, insbesondere mindestens 15 Gewichts-% (bezogen auf das Gewicht des flüssigen Mediums).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der Feststoffgehalt des flüssigen Mediums mindestens 5 Gewichts-%, insbesondere mindestens 7 Gewichts-%, insbesondere mindestens 9 Gewichts-%, insbesondere mindestens 10 Gewichts-% (bezogen auf das Gewicht des flüssigen Mediums).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Gelatinederivat ein Molekulargewicht von 15000 bis 700000 g/mol, bevorzugt 15000 bis 250000 g/mol, bevorzugt 20000 bis 200000 g/mol, bevorzugt 30000 bis 150000 g/mol, bevorzugt 50000 bis 100000 g/mol. Das Molekulargewicht wurde bestimmt mittels Lichtstreuung (gemäß B. E. Tabor (1962); Determination of Molecular Weights of Gelatin by Scattered Light Measurements; Letters of Nature 194(4826): 372–373) oder Gelpermeationschromatographie (C. J. Coester, K. Langer, H. Von Briesen und J. Kreuter (2000); Gelatin nanoparticles by two step desolvation a new preparation method, surface modifications and cell uptake; Journal of Microencapsulation 17(2): 187–193).
In allgemeiner Form werden Verfahren zur Molekulargewichtsbestimmung beschrieben von Martinsen et al. (1991), Carbohydrate Polymers, 15(2), 171–193.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Gelatinederivat einen Bloomwert von 50 bis 300, bevorzugt 100 bis 300, bevorzugt 100 bis 250, bevorzugt 200 bis 250 (R. Schrieber und H. Gareis (2007); Gelatine handbook, theory and industrial practice; Wiley-Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, S. 104f).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Lösung eine Viskosität von maximal 20 mPas, insbesondere maximal 15 mPas, insbesondere maximal 10 mPas, insbesondere weniger als 20 mPas, bevorzugt weniger als 15 mPas, bevorzugt weniger als 10 mPas auf. Die genanten Viskositäten liegen in einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C vor. Bevorzugt liegt die Viskosität, bestimmt unter den vorgenannten Bedingungen, bei mindestens 1 mPas, vorzugsweise mindestens 2 mPas, insbesondere 3 mPas, vorzugsweise 4 mPas. Besonders bevorzugt liegt die Viskosität in einem Bereich von 1 bis 20 mPas, vorzugsweise 2 bis 20 mPas, insbesondere 4 bis 20 mPas.
Die Viskosität wurde bestimmt durch ein Viskometer oder Rotationsrheometrie gemäß http://www.atascientific.com.au/blog/2010/02/18/an-introduction-to-viscosity-and-rheology, Oktober 2012.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die wässrige Lösung einen pH-Wert von 6 bis 8, bevorzugt 6,5 bis 7,5.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als Substrat, auf welches das mindestens eine Gelatinederivat in Schritt a) aufgebracht wird, eine steife oder flexible Stützstruktur verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Stützstruktur eine Plastikfolie, Plastikfilm, Membran, Glas, Metall, Halbmetall, Verbundmaterial, Keramik, Flies oder Papier sein, vorzugsweise aus biokompatiblen und insbesondere bioabbaubaren Materialien.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die erfindungsgemäß hergestellte zwei- oder dreidimensionale Struktur von der Stützstruktur abgetrennt, insbesondere durch chemischen, physikalischen oder biologischen Abbau, und so eine zwei- oder dreidimensionale Struktur ohne Stützstruktur erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der zwei- oder dreidimensionalen Struktur ein automatisiertes Verfahren, insbesondere ein Dispensier-Verfahren, ein Extrudier-Verfahren oder ein Elektrospinnen, insbesondere ein computer-gestütztes 3D-Tintenstrahldruckverfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der zwei- oder dreidimensionalen Struktur ein piezo-elektrisches oder thermisches Tintenstrahl-Druckverfahren, insbesondere ein „drop-on-demand”- oder kontinuierliches Tintenstrahldruckverfahren, insbesondere ein „drop-on-demand”-Tintenstrahldruckverfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren zur Herstellung einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur ein Dispensierverfahren oder ein Liquid-Handling-Verfahren, wie händisches oder automatisiertes Pipettieren.
In besonders bevorzugter Ausführungsform kann die zwei- oder dreidimensionale Struktur selbst ein künstliches Gewebe, ein künstliches Organ, ein Implantat, ein Transplantat oder ein Bestandteil einer dieser Komponenten sein.
Bei Dispensierverfahren, vorliegend ein kontinuierliches Dosierverfahren, wird bevorzugt Tinte durch eine Düse oder Nadel gepumpt oder gepresst, indem bevorzugt Druckluft auf eine Tintenkartusche beaufschlagt wird und der Flüssigkeitsstrahl durch das Öffnen oder Verschließen eines Ventils gestartet und gestoppt wird. Das Dispensierverfahren wird bevorzugt mit viskosen Flüssigkeiten, insbesondere > 20 mPas betrieben. Dagegen arbeiten Tintenstrahl-Druckverfahren, vorliegend Verfahren, bei denen durch Spannungspulse piezoelektrisch oder thermisch in einer Tintenkammer Einzeltropfen im Picoliter bis Nanoliterbereich erzeugt werden („drop on demand”), im Allgemeinen in einem Viskositätsbereich von < 20 mPas.
„Drop on Demand”-Tintenstrahl-Verfahren erreichen Auflösungen von weniger als 200 μm, bevorzugt weniger als 100 μm, während Dispensiertechniken im mm-Bereich operieren. Da Struktureinheiten in natürlichen Geweben – beispielsweise der Abstand zwischen zwei Blutkapillaren – im Submillimeterbereich liegen, ist es erforderlich, bevorzugt für den künstlichen Aufbau von Geweben oder Organen, diese Fertigungsverfahren einzusetzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt das Volumen eines Dosiervorgangs 1 pL (picoliter) bis 999 nL (nanoliter), bevorzugt 100 pL bis 900 nL, bevorzugt 500 pL bis 800 nL, bevorzugt 1 nL bis 500 nL, bevorzugt 1 pL bis 1000 pL, bevorzugt 100 pL bis 900 pL, bevorzugt 10 pL bis 500 pL. Das in Schritt a) aufgebrachte Volumen des flüssigen Mediums besteht aus 1 bis 40000 Dosiervorgängen, bevorzugt 1 bis 10000 Dosiervorgängen, bevorzugt 1 bis 1000 Dosiervorgängen, bevorzugt 1 bis 100 Dosiervorgängen, bevorzugt 10 bis 1000 Dosiervorgängen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten zwei- oder dreidimensionalen Strukturen zum Aufbau künstlicher Gewebe oder Organe, z. B. Knorpel, Implantaten oder Transplantaten, zur Oberflächenfunktionalisierung oder zur Herstellung von Druckfarben verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform gelten die Aussagen bezüglich des Gelatinederivats, welche in Zusammenhang mit dem Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren getroffen wurden mutatis mutandis auch für dessen Verwendung zur Herstellung einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur.
In einer bevorzugten Ausführungsform gelten die Aussagen bezüglich des Gelatinederivats, welche in Zusammenhang mit dem Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren getroffen wurden mutatis mutandis auch für das erfindungsgemäß bereitgestellten Gelatinederivat als solches.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Figuren, Tabellen und den dazugehörigen Ausführungsbeispielen beschrieben.
Die Figuren zeigen:
1a zeigt eine 10 Gewichts-%ige Lösung von GM₂, ein Gelatine-Derivat mit niedrigem Gehalt and Vernetzergruppen ohne zusätzliche Maskierung verbleibender funktioneller Gruppen der Gelatine-Aminosäurereste. Diese Lösung geliert bei Raumtemperatur und ist nicht druckbar.
1b zeigt eine 10 Gewichts-%ige Lösung von GM₂A₈, ein Gelatine-Derivat mit niedrigem Gehalt an Vernetzergruppen, welches durch weitere Einführung von nicht-vernetzenden funktionellen Gruppen bei Raumtemperatur nicht geliert. Die Viskosität der Lösung beträgt 4,1 mPas und ist druckbar.
2 zeigt einen Tropfen einer GM₁₀-Tinte in einer 10 Gewichts-%igen Lösung, erzeugt mit einem Piezo-elektrischen „drop-on-demand”-Tintenstrahldruckknopf bei 37°C.
3 zeigt einen mittels Tintenstrahldruck gedruckten Array. Tinte: 10 Gewichts-%ige Lösung eines Gelatine-Derivats mit hohem Anteil an maskierten funktionellen Gruppen der Gelatine-Aminosäurereste. Viskosität der Lösung bei 37°C beträgt 3,8 mPas.
4 zeigt dispensierte GM₁₀-Tinte mit unterschiedlichen Massenanteilen bei Raumtemperatur (a = 15 Gewichts-%ige Lösung; b = 20 Gewichts-%ige Lösung; c = 30 Gewichts-%ige Lösung).
5 zeigt das Speichermodul G' des linearen viskoelastischen Bereiches als Maß der mechanischen Festigkeit von Hydrogelen aus methacrylierter Gelatine sowie methacrylierter und acetylierter Gelatine mit unterschiedlichen Massenanteilen in der Lösung.
6 zeigt die Quellbarkeit von Hydrogelen aus methacrylierter Gelatine sowie methacrylierter und acetylierter Gelatine bei unterschiedlichen Massenanteilen.
7 zeigt einen Zytokompatibilitätsassay in Anlehnung an DIN-EN ISO 10993-5 mit procinen Chondrozyten.
8 zeigt eine Reaktion des Cell Proliferating Reagent WST-1. Durch die Stoffwechselaktivität mitochondrialer Dehydrogenasen kommt es zur Umwandlung des im Reagenz enthaltenen Formazansalzes in das dunkelrote Formazan. [www.rocheappliedscience.com].
Beispiele
1. Herstellung methacrylierter Gelatine:
Die Erzeugung von photovernetzbaren Gelatinederivaten erfolgte durch chemische Derivatisierung von Gelatine mit Methacrylsäureanydrid (MAAnh). Hierfür wurden 25 g Gelatine in circa 250 mL MilliQ^TM-Wasser bei 37°C unter Rühren vollständig gelöst und der pH-Wert der Reaktionslösung mit NaOH (1 M bis 4 M) auf pH 7,4 eingestellt. Es folgte die tropfenweise Zugabe von Methacrylsäureanydrid zur Reaktionslösung. Das Volumen an zugesetztem Methacrylsäureanydrid wurde von 1,3 mL bis 26,1 mL variiert zur Gewinnung von methacrylierten Gelatinederivaten unterschiedlichen Methacrylierungsgrades. Die Reaktionsdauer betrug in Abhängigkeit des zugegebenen Methacrylsäureanydrid-Volumens 30 min bis 120 min.
Tabelle 1 gibt einen Überblick über alle eingesetzten Volumina, Massen und Reaktionszeiten.

Tabelle 1 zeigt Reaktionsansätze zur Variation des Methacrylierungsgrades (Gel = Gelatine, MAAnh = Methacrylsäureanhyrid, GM = methacrylierte Gelatine). Tabelle 1

Mol. Verhältnis von -NH2 in Gel: MAAnh	Bezeichnung	m_Gel	V_MAAnh	V_MilliQ	Reaktionsdauer
1:1,5	GM1,5	25 g	2,0 mL	250 mL	45 min
1:2	GM2	25 g	2,6 mL	250 mL	60 min
1:10	GM10	25 g	13,1 mL	250 mL	120 min

An die Synthese schloss sich eine mehrtägige Dialyse gegen MilliQ^TM-Wasser (RT bei GM₁₀; 30°C bei GM_1,5 und GM₂) an. Die Rückgewinnung des Syntheseproduktes als Feststoff erfolgte mittels Lyophilisation. Dafür wurde die Reaktionslösung zunächst bis zur vollständigen Erstarrung in flüssigem Stickstoff inkubiert. Die Gefriertrocknung selbst erfolgte mit dem Gerät Alpha 1–2 LD der Firma Christ bei einer Temperatur < –50°C und einem Druck < 0,12 mbar.
2. Herstellung methacrylierter und acetylierter Gelatine:
Die Erzeugung von methacrylierten und acetylierten Gelatinederivaten erfolgte durch chemische Derivatisierung von Gelatine mit Methacrylsäureanydrid (MAAnh) und Essigsäureanhydrid (Acetic anhydride, AcAnh). Hierfür wurde zunächst eine Methacrylierung der Gelatine wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Nach Abschluss 15 der Methacrylierung folgte die tropfenweise Zugabe von Essigsäureanhydrid zur Reaktionslösung. Das Volumen an zugesetztem Essigsäureanhydrid wurde dabei von 6,6 mL bis 7,0 mL variiert. Die Reaktionsdauer betrug ca. 60 mm.
Tabelle 2 gibt einen Überblick über alle eingesetzten Volumina, Massen und die Reaktionszeit.
Tabelle 2 zeigt Reaktionsansätze zur Herstellung methacrylierter und acetylierter Gelatine (AcAnh = Essigsäureanhyrid, GM = methacrylierte Gelatine, GMA = methacrylierte und acetylierte Gelatine). Tabelle 2

Mol. Verhältnis von -NH2 in Gel: AcAnh Bezeichnung m_GMA V_AcAnh V_MilliQ Reaktionsdauer

1:8,5 GM_1,5A_8,5 25 g 7,0 mL 250 mL 60 min

1:8 GM₂A₈ 25 g 6,6 mL 250 mL 60 min
An die Synthese schloss sich eine mehrtägige Dialyse gegen MilliQ^TM-Wasser (RT) an. Die Rückgewinnung des Syntheseproduktes als Feststoff gelang mittels Lyophilisation. Dafür wurde die Reaktionslösung zunächst bis zur vollständigen Erstarrung in flüssigem Stickstoff inkubiert. Die Gefriertrocknung selbst erfolgte mit dem Gerät Alpha 1–2 LD der Firma Christ bei einer Temperatur < –50°C und einem Druck < 0,12 mbar.
3. Herstellung von GM- und GMA-Lösungen:
Zunächst wurde die benötigte Menge GM (GM_x) und GMA (GM_xA_y) eingewogen und unter Rühren oder Schütteln bei RT oder 37°C vollständig in der entsprechenden Menge einer PBS⁺ („Phosphat gepufferte Salzlösung”)/Irgacure 2959-Lösung gelöst. Die Konzentration des wasserlöslichen Photoinitiators Irgacure 2959 betrug jeweils 0,5 wt% bezogen auf den Polymergehalt der Lösungen.
Alle eingesetzten Volumina und Massen sind Tabelle 3 zu entnehmen.
Tabelle 3 zeigt Volumina und Massen zur Herstellung photovernetzbarer Gelatinelösung (GM = methacrylierte Gelatine, GMA = methacrylierte und acetylierte Gelatine, I 2959 = Irgacure 2959, PBS = Phosphat-gepufferte Salzlösung/Saline). Tabelle 3

Massenanteil GM oder GMA [Gew.-%] m (GM oder GMA) [mg] V_PBS [μL] m_I2959 [mg] V_I2959-Stammlösung (c = 7 mg/mL in PBS⁺) [μ_L]

10 100,0 828,6 0,5 71,4

15 150,0 742,9 0,75 107,1
4. Bestimmung der Viskosität von GM- und GMA-Lösungen
Zunächst wurden die GM- bzw. GMA-Lösungen wie in den Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Bestimmung der Viskosität erfolgte dann mittels eines Physica Modular Compact Rheometer (Modell MCR301) von Anton Paar mit einem Zylinder-Becher-Messsystem (Searle-Typ). Die Viskosität der Lösungen wurde für einen Scherratenbereich von 10 s–1 bis 1000 s–1 bei 25°C bzw. 37°C gemessen und die erhaltenen Werte anschließend gemittelt. Es zeigte sich, dass die Viskosität der Lösungen über diesen Scherratenbereich konstant waren. Das Messvolumen des Messsystems betrug ca. 6 mL.
5. Herstellung von GM- und GMA-Hydrogelen
Zunächst wurden die GM- bzw. GMA-Lösungen wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die Vernetzung der Hydrogele erfolgte in einer speziellen Aluminium-Gussform, welche zylindrische Vertiefungen mit einem Durchmesser von 3 cm und einer Tiefe von 1 mm besitzt. Es wurde jeweils eine Vertiefung mit einer der hergestellten GM- oder GMA-Lösungen gefüllt und eine Quarzglasscheibe zur Abdeckung auf die gefüllte Form aufgelegt. Anschließend wurde die Probe für 5 min bei circa 8,5 mW/cm² mit UVA-Strahlung bestrahlt. Nach erfolgter Bestrahlung wurde die Quarzglasscheibe entfernt, das vernetzte Gel vorsichtig mit Hilfe von Spateln aus der Form gelöst und Gele verschiedenen Durchmessers ausgestanzt (d = 2 cm für rheologische Untersuchungen, d = 1 cm für Untersuchung der Quellbarkeit).
6. Bestimmung der Quellbarkeit von GM- und GMA-Hydrogelen:
Für die Bestimmung der Quellbarkeit wurden die frisch erzeugten Hydrogele zunächst zur Entfernung nicht kovalent gebundener Makromonomere fünf Mal mit MilliQ-Wasser bei 37°C für jeweils circa 1 h gewaschen. Anschließend wurde die Gele über Nacht bei 80°C unter Vakuum getrocknet. Anschließend erfolgte eine Auswaage zur Bestimmung der Masse an vernetztem GM bzw. GMA (mP vernetzt). Danach wurden die Gele in PBS inkubiert (über Nacht bei 37 C, schwenkend) und anschließend die Massen der Hydrogele in gequollenem Zustand bestimmt. Hierfür wurden die Gele aus der Quelllösung entnommen, vorsichtig mit Filterpapier zur Entfernung auf der Gel-Oberfläche sitzender Flüssigkeitstropfen abgetupft und zügig ausgewogen. Die Quellbarkeit wurde wie folgt bestimmt:
7. Rheologische Untersuchungen von GM- und GMA-Hydragelen
Für die Untersuchung der mechanischen Festigkeit der GM- und GMA-Hydrogele (d = 2 cm) wurden wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt und über Nacht bei 37°C in PBS unter I eichtem Schwenken gequollen. Die oszillatorischen Messungen in Form eines so genannten Amplituden-Sweeps (AS) erfolgten an einem Physica Modular Compact Rheometer (Modell MCR301) der Firma Anton Paar mit einem Platte/Platte-Messsystem (2 cm). Der AS dient der Bestimmung des sogenannten linearen viskoelastischen Bereichs (LVEB). Über diesen Deformationsbereich ist eine vollständig reversible Verformung der Probe möglich. Nach Überschreiten der maximalen Amplitude des LVEB wird die innere Struktur der Probensubstanz irreversibel verändert und die Deformation dadurch zunehmend irreversibel. Je größer der LVEB beziehungsweise je höher die Deformation der Fließgrenze, desto elastischer ist eine Probe. Des Weiteren können über den Betrag von G' im LVEB (Bestimmung des Mittelwertes von G' über den LVEB) Informationen über die Festigkeit einer Probe gewonnen werden. Dabei gilt: je höher G', desto fester die Probe.
Für die Messungen wurden die in Tabelle 4 gezeigten Parametereinstellungen gewählt.
Tabelle 4 zeigt Parametereinstellungen der durchgeführten oszillationsrheometrischen Untersuchungen. Tabelle 4

Parameter Gewählte Einstellungen

Kraft N 2 N

Temperatur T 37°C

Kreisfrequenz ω 1,5 Hz

Deformation γ 0,01%–100%

Messpunktdauer 50 sec–0,5 sec
8. Dispensieren von GM-Lösungen
Für die Verarbeitung der GM-Lösungen mittels Dispensiertechnik wurde ein Hochviskositätsstand (Dispenser) verwendet. Der verwendete Dispenser besteht aus einem Dosiersystem, das in zwei Dimensionen (X- und Z-Richtung) verfahrbar ist. Ein pneumatisches Membran-Ventil und eine Zuleitung sind Bestandteile des Dosiersystems.
Das Substrat wird auf den Probentisch aufgebracht, der sich in die Y-Achse mit einer Geschwindigkeit von 10 mms^–1 bis 100 mms^–1 verschieben lässt. Der Arbeitsbereich der Anlage ist auf die Abmessungen 198 × 420 × 84 (X × Y × Z in mm) beschränkt. Bedient wird die Anlage durch ein LabVIEW-Programm. Die zu verarbeitende Tinte wird in eine Kartusche gefüllt, die auf die Zuleitung der Dosiereinheit geschraubt wird. Durch Anlegen eines Drucks auf das Ventil (Dosierdruck) und die Kartusche wird die Tinte dispensiert. Dabei lassen sich der Dosierdruck und der Druck auf die Kartusche an zwei Ventilen des Dispensers einstellen. Auf die Dosiernadelhaltemutter wird die gewünschte Dosiernadel geschraubt. Dosiernadeln mit Innendurchmessern von 0,11 mm bis 1,75 mm sind kommerziell erhältlich.
In der Ruhestellung ist das Ventil geschlossen. Durch einen Eingangsdruck wird der Kolben mit der Membran angehoben. Dadurch öffnet sich das Ventil und die Tinte kann in die Kanüle fließen. Nach Abschalten der Druckluft schließt sich die Membran mithilfe der Kolbenfeder wieder. Ist das Ventil geöffnet und der Druck auf die Kartusche ist ausreichend um einen Tintenfluss zu ermöglichen, so kommt es zu einer kontinuierlichen Materialförderung. Das Membran-Ventil ist geeignet für das Dispensieren von nieder- bis mittelviskose Flüssigkeiten.
Für die Verarbeitung der GM-Lösungen war nur ein geringer Druck auf die Kartusche (kleiner als 0,5 bar) nötig, um einen kontinuierlichen Tintenfluss zu ermöglichen. Dabei wurde die Tropfenbildungsdauer als Maß für den Druck auf die Kartusche bestimmt. Unter Tropfenbildungsdauer wird dabei die Zeit verstanden, die ein Tropfen benötigt, um sich an der Nadelspitze auszubilden und von der Nadel zu lösen. Eine bestimmte Tropfenbildungsdauer konnte über das Kartuschendruckventil eingestellt werden. Dabei gilt: Je höher der Druck auf die Kartusche, desto kleiner die Tropfenbildungsdauer. Diese wurde jeweils auf zwei Sekunden eingestellt. Die Verfahrgeschwindigkeit des Tisches wurde zwischen 10 mms^–1 und 100 mms^–1, die Nadelstärke zwischen 0,11 mm und 0,84 mm variiert.
Als Substrat dienten unbehandelte Glas-Objektträger, die zu Beginn eines jeden Dispensiervorgangs mit Klebestreifen auf dem Tisch befestigt wurden. Nach Auswahl und Anbringen der Nadel mit der Dosiernadelhaltemutter wurde der Abstand zwischen Nadel und Substrat kalibriert. Dabei wurde ein Stück Papier auf dem Substrat festgemacht. Anschließend wurde die Dosiereinheit so positioniert, dass der Abstand zwischen Nadel und Substrat ca. 0,1 mm betrug. Der gewünschte Abstand, die Verfahrgeschwindigkeit des Tisches und das zu dispensierende Muster wurden anschließend in das Lab-VIEW-Programm eingegeben. Es wurden folgende Werte für das Druckerzeugnis festgelegt: Länge = 40 mm; Breite = 1 mm. Anschließend wurde eine 3 mL-Kartusche mit der jeweiligen Tinte befllt und über einen geeigneten Schlauchadapter mit dem Schlauch für die Anlegung des Kartuschendrucks verbunden. Nach Einschalten der Druckluft wurde das Ventil für ca. 5 s geöffnet, um ein Verstopfen der Tinte in der Zuleitung und in der Nadel zu auszuschließen. Mit dem Starten des Programms begann der Dispensiervorgang.
9. Zytotoxizitätstest mit Extrakten von GM-Hydrogelen:
Zur Abschätzung der Zytotoxizität der GM-Hydrogele wurde ein Zytotoxizitäts-Assay der Gele in Anlehnung an DIN EN ISO 10993-5 (Biologische Beurteilung von Medizinprodukten – Teil 5: Prüfung auf Invitro-Zytotoxizität) in Form der Inkubation von Zellen mit Extrakten der Gele und anschließendem WST-1 Proliferations-Assay durchgeführt. Nach der DIN EN ISO 10993-5 wird die In-vitro-Zytotoxizität standardisiert an HaCaT-Zellen getestet. In diesem Fall wurden im Gegensatz dazu porcine Chondrozyten eingesetzt.
Hierfür wurden zunächst wie oben beschrieben Hydrogele hergestellt (d = 3 cm) und für 24 h bei 37°C in DMEM/Ham's F12 (ohne FCS) extrahiert. Des Weiteren wurden porcine Chondrozyten geerntet, gezählt und in eine 96-Wellplatte ausgesät (15 × 103 Zellen (Lebendzellzahl) in 200 μL zellspezifisches Kulturmedium pro Well). Am nächsten Tag wurde das Medium aus den mind. 80% konfluent bewachsenen Wells vorsichtig abgesaugt und dreimal 100 μL Hydrogel-Extrakt jeder Probe in drei Wells pipettiert. In alle mit Extrakten befüllten Wells wurden anschließend noch 10 μL FCS zugegeben. Als Positivkontrolle dienten mit zellspezifischem Kulturmedium befüllte Wells. Daran schloss sich eine 24-stündige Inkubation im Brutschrank an.
Zur relativen Quantifizierung des Einflusses der Extrakte auf die Vitalität der Zellen erfolgte am nächsten Tag die Durchführung eines Proliferations-Assays mittels des Cell Proliferating Reagent WST-1 der Firma Roche. Das verwendete Reagenz enthält ein Tetrazoliumsalz (WST = water soluble tetrazolium), welches durch mitochondriale Dehydrogenasen stoffwechselaktiver Zellen zu Formazan umgewandelt werden kann. Die Menge an gebildeten Formazan korreliert dabei direkt mit der Anzahl vitaler Zellen. Bei einer hohen Lebendzellzahl kommt es durch die verstärkte Stoffwechselaktivität der Zellen zur Entstehung großer Mengen an Formazan. Während die Tetrazoliumsalze der Lösung eine schwache Rotfäbung verleihen, färbt das gebildete Formazan diese dunkelrot bis braun. Die ablaufende Reaktion ist in 8 gezeigt. Die Quantifizierung des Formazans erfolgt über eine Absorptionsmessung bei 450 nm im ELISA-Reader.
Für die Durchführung des Proliferations-Assays wurden zunächst die Zellkulturüberstände von den Wells abgenommen. Nach erfolgter Zugabe einer 10-fachen Verdünnung des Cell Proliferating Reagent WST-1 in PBS folgte eine circa 60-minütige Inkubation im Brutschrank. Anschließend wurde die Absorption bei 450 nm bestimmt. Als Blindwert diente die 10-fache WST-Verdünnung. Für die Auswertung der Assays wurde zunächst von den erhaltenen Absorptionswerten der Blindwert abgezogen und anschließend für jede Probe der Mittelwert berechnet. Es erfolgte die Festlegung des Mittelwertes der Positivkontrolle (Zellen in DMEM/Ham's F12) als 100% und die Berechnung der relativen Proliferation der in den Extrakten inkubierten Zellen im Verhältnis zur Positivkontrolle. Die Bewertung der Zytotoxizität der untersuchten Hydrogele erfolgte entsprechend DIN EN ISO 10993-5 (siehe Tabelle 5).
Tabelle 5 zeigt Bewertung der Zytotoxizität anhand der relativen Proliferation der in den Extrakten kultivierten Zellen in Bezug auf die Proliferation von unter Standardbedingungen kultivierten Zellen (entsprechend DIN ISO EN 10993-5). Tabelle 5

Relative Proliferation [%] Bewertung der Zytotoxizität

81%–100% nicht zytotoxisch

71%–80% nchwach zytotoxisch

61%–70% mäßig zytotoxisch

0%–60% stark zytotoxisch
An die Synthese schloss sich eine mehrtägige Dialyse gegen MilliQ-Wasser (RT bei GM10; 30°C bei GM_1,5 und GM₂) an. Die Rückgewinnung des Syntheseproduktes als Feststoff erfolgte mittels Lyophilisation. Dafür wurde die Reaktionslösung zunächst bis zur vollständigen Erstarrung in flüssigem Stickstoff inkubiert. Die Gefriertrocknung selbst erfolgte mit dem Gerät Alpha 1–2 LD der Firma Christ bei einer Temperatur < –50°C und einem Druck < 0,12 mbar.
10. Verdrucken von Gelatine-Derivat-Lösungen
Die Verarbeitung der Gelatine-Derivat-Lösungen erfolgte mit einem Nano-Plotter NP 2.1 der Firma GeSiM mbH (Grossermannsdorf, Deutschland) mit einem Kartuschendispenser PEEK. Die Festlegung der Anzahl und Position der zu bedruckenden Substrate sowie die Einstellung der Druckhöhe (Abstand Düse Substrat ca. 0,5 mm) erfolgten mit dem Programm NPC 16. Das zu druckende Spotmusters wurde mit dem Programm SpotFrontEnd erstellt.
Für die Verarbeitung der Gelatine-Derivat-Tinten wurden die Kartusche und die Kartuschenheizung auf den Dispenser geschraubt und die gewünschte Tinte in die Kartusche überführt. Die Kartuschenheizung wurde auf 25°C bzw. 37°C temperiert. Zunächst wurde durch Anlegen eines Luftdrucks von 20 kPa bis 50 kPa der Dispenser mit Tinte gefüllt. Sobald an der Düse Tinte sichtbar wurde, wurde der Luftdruck minimiert. Der Unterdruck wurde anschließend so eingestellt, dass der Meniskus der Tinte in der Düse gehalten wurde. Dabei lag der eingestellte Druck zwischen –11 kPa und 5 kPa. Zusätzlich wurden die Pulsweite (ca. 50 μs), die Spannung (57 V bis 150 V) und die Frequenz (ca. 100 Hz) eingestellt, um ein geeignetes Tropfenbild zu erzeugen. Sobald geeignete Tropfen im Stroboskop zu erkennen waren, wurde der Druck gestartet. Pro Spot wurde 1 Tropfen bis 300 Tropfen Tinte auf das Substrat aufgebracht.
11. Zusammenfassung
In den Tabellen 6 und 7 werden die Eigenschaften verschiedener Gelatinederivate zusammengefasst.
Tabelle 6 zeigt die Viskosität von Lösungen aus Gelatine, methacrylierter Gelatine sowie methacrylierter und acetylierter Gelatine mit unterschiedlichen Massenanteilen bei 25°C und 37°C. Die Indizes geben jeweils den bei der Synthese eingesetzten molaren Überschuss an Methacrylsäureanhydrid und Essigsäureanhydrid (bezogen auf die eingesetzte Gelatine).

Tabelle 7 zeigt die Eigenschaften von Gelatine, methacrylierter Gelatine sowie methacrylierter und acetylierter Gelatine bei Raumtemperatur (25°C). Tabelle 6

Probe	Viskosität bei 25°C		Viskosität bei 37°9C
Probe	10 Gew.-%	15 Gew.-%	10 Gew.-%	15 Gew.-%
Gelatine	Geliert	Geliert	138 ± 0,2	450 ± 0,4
GM_1,5	Geliert	Geliert	127 ± 2,4	366 ± 8,1
GM_1,5A_8,5	n. b. (geliert nicht)	n. b. (geliert nicht)	4,1 ± 0,1	8,2 ± 0,1
GM₂	Geliert	Geliert	13,8 ± 0,9	37,6 ± 1,4
GM₂A₈	4,1 ± 0,1	8,5 ± 1,1	3,0 ± 0,0	5,5 ± 0,1
GM₁₀	4,9 ± 0,3	10,5 ± 0,2	3,8 ± 0,6	8,0 ± 1,2

Tabelle 7

	Modifizierungsgrad	Vernetzbarkeit _gegeben?	Inkjet-Druckbarkeit bei 25°C	Dispensierbarkeit bei RT
Gelatine	-	Nein	Nein (geliert)	Nein (geliert)
GM_1,5	Nieder	Ja	Nein (geliert)	Nein (geliert)
GM_1,5A_8,5	Hoch	Ja	Ca. ≤ 15 Gew.-%	n. b., vermutlich wie GM
GM₂	Nieder	Ja	Nein (geliert)	Nein (geliert)
GM₂A₈	Hoch	Ja	Ca. ≤ 15 Gew.-%	n. b. vermutlich wie GM
GM₁₀	Hoch	Ja	Ca. ≤ 15 Gew.-%	Ca. ≥ 15 Gew.-%

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verfahren zur Herstellung einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur auf einem Substrat, das mindestens die folgenden Schritte umfasst: a) Aufbringen mindestens eines in einem flüssigen Medium enthaltenen Gelatinederivats auf das Substrat und b) Fixieren des in Schritt a) aufgebrachten mindestens einen Gelatinederivats durch intermolekulare Vernetzung des Gelatinederivats, wobei das Gelatinederivat mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe und mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe aufweist, wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Aldehyd, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxyaryl und Acyl, und wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus einer Gruppe A bestehend aus Maleinimidgruppe und C-C-Doppelbindung, oder aus einer Gruppe B bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe, Thiolgruppe, C-N-Dreifachbindung und Diengruppe, wobei wenn die artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe eine Diengruppe ist, wird die nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxyaryl.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die C-C-Doppelbindung aus der Gruppe A ausgewählt ist aus Methacrylgruppe und Acrylgruppe.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen und die artifiziell eingeführten Vernetzer-Gruppen an die in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen gekoppelt sind, wobei die in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Thiolgruppen, Säureamingruppen, Indolgruppen, Imidazolgruppen und Carboxylgruppen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Spacergruppe zwischen den in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen und den artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen und/oder den artifiziell eingeführten Vernetzer-Gruppen vorliegt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Spacergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substituierten und nicht-substituierten kurz- oder langkettigen Alkylgruppen, Aromaten, substituierten und nicht-substituierten Oligoethylenglycolgruppen und substituierten und nicht-substituierten Polyethylenglycolgruppen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens 85% der in einer nicht strukturell modifizierten Gelatine vorkommenden funktionellen Gruppen in Kopplung mit den artifiziell eingeführten nicht-vernetzbaren funktionellen Gruppen und den artifiziell eingeführten Vernetzer-Gruppen vorliegen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in Schritt a) das Aufbringen des Gelatinederivats auf das Substrat ortsselektiv und das in Schritt b) durchgeführte Fixieren des in Schritt a) aufgebrachten Gelatinederivats durch elektromagnetische Strahlung flächig oder ortsselektiv erfolgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das flüssige Medium in einem Temperaturbereich von 25°C bis 40°C eine Viskosität von maximal 15 mPas aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das flüssige Medium einen Feststoffgehalt von mindestens 5 Gewichts-% aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in Schritt a) mindestens ein Zusatzstoff zusammen mit dem mindestens einem Gelatinederivat auf das Substrat aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine Zusatzstoff mit dem mindestens einen Gelatinederivat vernetzbar ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine Zusatzstoff ausgewählt ist aus Kollagen, Glykosaminglykanen, Proteinen, Polysaccharide, DNA, antimikrobiell wirksamen Substanzen und Farbmitteln.
Verwendung eines Gelatinederivats zur Herstellung einer zwei- oder dreidimensionalen Struktur auf einem Substrat, wobei das Gelatinederivat mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe und mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe aufweist, wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Aldehyd, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxyaryl und Acyl, und wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus einer Gruppe A bestehend aus Maleinimidgruppe und C-C-Doppelbindung, oder aus einer Gruppe B bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe, Thiolgruppe, C-N-Dreifachbindung und Diengruppe, wobei wenn die artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe eine Diengruppe ist, ist die nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxyaryl.
Gelatinederivat, das mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe und mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe aufweist, wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Aldehyd, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Alkoxyaryl und Acyl, und wobei die mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe ausgewählt ist aus einer Gruppe A bestehend aus Maleinimidgruppe und C-C-Doppelbindung, oder aus einer Gruppe B bestehend aus Azidgruppe, C-C-Doppelbindung, C-C-Dreifachbindung, Aldehydgruppe, Ketongruppe, Imingruppe, Thioketongruppe, Thiolgruppe, C-N-Dreifachbindung und Diengruppe, wobei wenn die mindestens eine artifiziell eingeführte Vernetzer-Gruppe eine Diengruppe ist, ist die nicht-vernetzbare funktionelle Gruppe ausgewählt aus Halogen, Alkyl, Haloalkyl, Heteroalkyl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, Arylheteroalkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl und Alkoxyaryl.
Zwei- oder dreidimensionale Struktur, hergestellt durch ein erfindungsgemäßes Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.