DE102012112324A1

DE102012112324A1 - Verfahren zur Detektion eines DNA-Schadens

Info

Publication number: DE102012112324A1
Application number: DE102012112324.1A
Authority: DE
Inventors: Oliver Rothfuss; Simon Lehle; Klaus Schulze-Osthoff
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2014-06-18
Also published as: EP2931916A1; WO2014090762A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion eines DNA-Schadens sowie ein Kit, das die notwendigen Komponenten zur Durchführung des vorstehenden Verfahrens enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion eines DNA-Schadens sowie ein Kit, das die notwendigen Komponenten zur Durchführung des vorstehenden Verfahrens enthält.
Die DNA steht unter konstantem Stress durch sowohl endogene als auch exogene Faktoren. Dieser Stress kann zur Schädigung der DNA führen. DNA-Schädigungen treten mit einer Rate von 1.000 bis 1.000.000 molekularen Läsionen pro Zelle pro Tag auf. Obwohl dadurch nur etwa 0,000165% der etwa 6.000.000.000 Basen bzw. 3.000.000.000 Basenpaare des menschlichen Genoms betroffen sind, können nicht-reparierte Läsionen in kritischen Genen, wie beispielsweise Tumorsuppressorgenen, die Fähigkeit einer Zelle, ihre Funktion auszuüben, beeinträchtigen und die Wahrscheinlichkeit einer Tumorentstehung erhöhen.
Mögliche Ursachen von DNA-Schäden sind Stoffwechselvorgänge, chemische Substanzen oder ionisierende Strahlung, wie beispielsweise UV-Bestrahlung, Elektronen oder Protonen.
Verfahren zum Nachweis von DNA-Schäden sind folglich nicht nur für die Grundlagenforschung von Interesse. Sie dienen auch zum Nachweis potentieller Genotoxizität von Substanzen, Chemikalien, Lebensmitteln oder Umweltfaktoren. Sie sind deshalb in vielen Bereichen der toxikologischen Analytik, sei es in der Industrie oder Kosmetik- bzw. Arzneimittelentwicklung, von Relevanz.
Eine der bekanntesten und am häufigsten verwendeten Methoden zum Nachweis von DNA-Schäden ist die sogenannte ”Southern-Blot-Analyse”. Diese ist in der Lage, via eines Mehrschrittverfahrens DNA-Strangbrüche semiquantitativ zu detektieren und erfordert große Mengen von Probenmaterial; vgl. Niwa, O. (2003): Induced Genomic Instability in Irradiated Germ Cells and in the Offspring; Reconciling Discrepancies Among the Human and Animal Studies, Oncogene 22, Seiten 7078–7086.
Die Einzelzellgelelektrophorese, allgemein bekannt als Comet Assay, erlaubt die Detektion von Einzel- und Doppelstrangbrüchen sowie von Alkali-empfindlichen DNA-Stellen unter alkalischen Bedingungen; vgl. Tice et al. (2000): Single Cell Gel/Comet Assay: Guidelines for In Vitro and In Vivo Genetic Toxicology Testing, Environ. Mol. Mut. 35, Seiten 206–221, und Singh et al. (1988): A Simple Technique for Quantitation of Low Levels of DNA Damage in Individual Cells, Exp. Cell Res. 175, Seiten 184–191.
Die beiden vorstehend genannten Verfahren ermöglichen jedoch höchstens eine teilweise quantifizierbare Aussage.
Kiyosawa (1990): Cigarette Smoking Induces Formation of 8-Hydroxydeoxyguanosine, One of the Oxidative DNA Damages in Human Peripheral Leukocytes, Free Radical Res. Commun. 11, Seiten 23–27, beschreiben eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Kombination mit verschiedenen Nachweismethoden.
Taghizadeh et al. (2008): Quantification of DNA Damage Products Resulting from Deamination, Oxidation and Reaction with Products of Lipid Peroxidation by Liquid Chromatography Isotope Dilution Tandem Mass Spectrometry, Nat. Protocols 3, Seiten 1287–1298, beschreiben einen quantitativen Ansatz zur Detektion von spezifisch geschädigten DNA-Produkten unter Verwendung von Isotopen und Tandemmassenspektrometrie.
Santos et al. (2006): Quantitative PCR-Based Measurement of Nuclear and Mitochondrial DNA Damage and Repair in Mammalian Cells, Methods Mol. Biol. 314, Seiten 183–199, beschreiben ein Verfahren zum Nachweis von Schädigungen der mitochondrialen DNA unter Verwendung einer Endpunkt-PCR.
Clark et al. (2011): Direct Detection and Sequencing of Damaged DNA Bases, Genome Integr. 2:10, beschreiben ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Schäden auf der Basis eines Sequenzierungsprotokolls.
All die vorstehend genannten Verfahren sind aufwändig, erfordern z. T. eine radioaktive Markierung, schwierige Optimierungsmaßnahmen und/oder benötigen eine große Menge von genomischer DNA. Sie sind außerdem zeitaufwändig und für ein Hochdurchsatzscreening nicht geeignet.
Rothfuss et al. (2010): Analysis of Differential DNA Damage in the Mitochondrial Genome Employing a Semi-Long Run Real-Time PCR Approach, Nucleic Acids Res. 38(4), e24, beschreiben ein auf einer quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) basierendes Verfahren zum quantifizierbaren Nachweis von Schäden in der mitochondrialen DNA. Dieses Verfahren hat jedoch u. a. den Nachteil, dass genomische Schäden außerhalb der mitochondrialen DNA nicht erfasst werden.
Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis eines DNA-Schadens bereitzustellen, mit dem die Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden werden.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren zur Detektion eines DNA-Schadens, das folgende Schritte aufweist:

(1) Bereitstellen von
– auf Schäden zu untersuchender DNA (DNA_S) und
– zumindest einer unbeschädigten Referenz-DNA (DNA_R),
(2) Amplifizieren der
– DNA_S in einer ersten quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR_S) und der
– DNA_R in einer zweiten quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR_R),
(3) Bestimmen der Amplifizierungseffektivität (A) der
– qRT-PCR_S zum Erhalt eine Wertes A_S und der
– qRT-PCR_R zum Erhalt eine Wertes A_R und
(4) Detektieren eines DNA-Schadens, wenn folgendes gilt: A_S < A_R, wobei es sich bei der DNA_S und der DNA_R um Gesamtzell-DNA handelt.

Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass sich das von Rothfuss et al. (2010; a. a. O.) beschriebene Verfahren nicht nur zur Untersuchung von mitochondrialer DNA sondern generell zur Untersuchung von Gesamtzell-DNA eignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber dem von Rothfuss et al. (2010; a. a. O.) beschriebenen Verfahren den Vorteil, dass solche DNA-Schäden nachweisbar sind, die die gesamte DNA einer Zelle betreffen. So wirken sich auch Schäden außerhalb der mitochondrialen DNA häufig stark auf die Funktionalität der betroffenen Zelle und damit gegebenenfalls des gesamten Organismus aus.
Erfindungsgemäß wird unter ”Gesamtzell-DNA” sämtliche DNA einer Zelle verstanden, einschließlich nuklearer und mitochondrialer DNA.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit besonders geeignet, um beispielsweise die Genotoxizität, Mutagenität oder Karzinogenität von Substanzen zu bestimmen.
Erfindungsgemäß kann Gesamtzell-DNA jeglicher Spezies untersucht werden, wie beispielsweise Vertebraten-, Säugetier-, murine oder humane DNA. Es versteht sich, dass die DNA_S und DNA_R aus der gleichen Spezies stammen.
”Zumindest eine DNA_R” bedeutet, dass ein, zwei, drei bzw. mehrere (Anzahl n) DNA_R-Fragmente bereitgestellt werden können.
Die auf Schäden zu untersuchende DNA_S kann wahlweise in einem vorausgehenden Schritt, entweder in isolierter Form oder aber in nicht-isolierter Form als Bestandteil eines biologischen Materials, mit einer Substanz inkubiert werden, die hinsichtlich ihrer Genotoxizität, Mutagenität oder Karzinogenität untersucht werden soll. Die unbeschädigte Referenz-DNA bzw. DNA_R wird einem solchen Inkubationsschritt nicht unterzogen bzw. lediglich mit dem Lösungsmittel bzw. Puffer inkubiert, in dem die zu testende Substanz gelöst ist.
Unter einer quantitativen Echtzeit-PCR, auch Real-time-quantitative-PCR (qRT-PCR) genannt, versteht man eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerasekettenreaktion (PCR) beruht und zusätzlich die Quantifizierung der gewonnenen DNA ermöglicht. Der Fachmann ist mit der quantitativen Echtzeit-PCR vertraut. Diese wird beispielsweise beschrieben in der Publikation von Rothfuss et al. (2010; a. a. O.), die Bestandteil der vorliegenden Beschreibung ist.
Erfindungsgemäß entspricht die in die qRT-PCR_S-Reaktion eingesetzte DNA_S-Menge in etwa bzw. im Idealfall genau der in die qRT-PCR-Reaktion eingesetzten DNA_R-Menge. Alternativ kann auch ein an das zu untersuchende DNA_S- bzw. DNA_R-Fragment (”long run”, langes Amplikon) angrenzendes kurzes Fragment (ca. 50–70 bp, ”short run”, kurzes Amplikon) als interne Referenz jeweils in einem Parallelansatz mitamplifiziert werden, um Konzentrationsunterschiede herauszurechnen; vgl. Rothfuss et al. (2010; a. a. O.).
Die Amplifizierungseffektivität ist ein Maß für die Amplifizierbarkeit der in die qRT-PCR eingesetzten DNA. Wie die Erfinder festgestellt haben, lässt sich in dem erfindungsgemäßen Verfahren die DNA_S deutlich weniger effektiv als die DNA_R amplifizieren, da die DNA-Polymerase durch die Schäden in der DNA_S inhibiert wird. Die Amplifizierungseffektivität lässt sich mit im Stand der Technik bekannten Methoden ohne weiteres bestimmen, beispielsweise anhand der gemessenen PCR-Fluoreszenzsignale. Die Fluoreszenz in der qRT-PCR_S wird demnach im Vergleich zur Fluoreszenz in der qRT-PCR_R später ansteigen. Zur Ermittlung der Amplifizierungseffektivität können bspw. der c_t-Wert (”cycle threshold” für Schwellenwert-Zyklus) oder der c_p-Wert (”crossing point” für Kreuzungspunkt) verwendet werden. Diese Werte beschreiben den Zyklus, in dem die Fluoreszenz erstmalig signifikant über die Hintergrundfluoreszenz ansteigt (c_t) bzw. den Zyklus, in dem die Fluoreszenz maximal zunimmt (c_p).
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung handelt es sich bei der DNA_S und der DNA_R um nukleare DNA.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Schäden erfasst werden, die den Gesamtorganismus meist stärker beeinträchtigen als dies bei Schäden der mitochondrialen DNA der Fall ist. Letztere wird i. d. R. abgebaut und die betroffene Zelle bzw. der betroffene Organismus wird häufig nur wenig beeinträchtigt. Erfindungsgemäß wird unter nuklearer DNA ein Fragment einer solchen DNA verstanden, die aus dem Zellkern der jeweiligen Spezies isoliert wurde.
Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die in Schritt 2 zu amplifizierenden DNA_S und DNA_R jeweils Längen von ≥ 1.000 bp, vorzugsweise von ≥ 2.000 bp, weiter bevorzugt von ≥ 4.000 bp, höchst bevorzugt von ≥ 5.000 bp auf.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Sensitivität des Verfahrens deutlich erhöht wird. So lassen sich auch solche DNA-Schäden erfassen, die mit einer Frequenz von < 1 pro 1.000 bp auftreten. Dabei war besonders überraschend, dass eine Untersuchung derart langer DNA-Fragmente gelingt. Im Stand der Technik wurde vielmehr angenommen, dass die zur Amplifizierung verwendete DNA-Polymerase frühzeitig von dem zu untersuchenden DNA-Strang abfällt und deshalb derart lange DNA-Fragmente im Rahmen eines entsprechenden Detektionsverfahrens nicht untersucht werden können. Auch in dem Verfahren von Rothfuss et al. (2010; a. a. O.) werden nur relativ kurze DNA-Fragmente von bis zu ca. 1.000 bp untersucht, so dass DNA-Schäden leicht übersehen werden. Die erfindungsgemäße Weiterbildung schafft hier Abhilfe.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R jeweils eine DNA-Polymerase mit einer Syntheserate von > 1 kb/min, vorzugsweise von ≥ 2 kb/min, weiter bevorzugt von ≥ 3 kb/min, weiter bevorzugt von ≥ 4 kb/min und höchst bevorzugt von ≥ 5 kb/min verwendet.
Nach Erkenntnissen der Erfinder führt die Verwendung ”schneller” DNA-Polymerasen zu besonders guten Ergebnissen. Sie ermöglichen die Amplifizierung von langen DNA-Fragmenten mit hoher Effizienz. DNA-Polymerasen sind bei höheren Temperaturen nicht beliebig stabil bzw. aktiv. Schnelle DNA-Polymerasen müssen den im Rahmen der PCR vorhandenen hohen Temperaturen nur kurz ausgesetzt werden, so dass diese in ihrer Stabilität und Aktivität weitgehend unbeeinflusst bleiben. Grundsätzlich geeignet sind bspw. die DNA-Polymerasen Q5, die je nach Komplexität der zu amplifizierenden DNA Syntheseraten von bis zu 6 kb/min erreicht, Phusion, die je nach Komplexität Syntheseraten von bis zu 4 kb/min erreicht, sowie die DNA-Polymerase iProof, die je nach Komplexität der zu amplifizierenden DNA Syntheseraten von bis zu 4 kb/min erreicht. Nur teilweise geeignet sind die DNA-Polymerasen OneTaq, Vent, Deep Vent, Pfu oder Platinium Pfx, die jeweils Syntheseraten von ca. 1 kb/min erreichen.
Besonders bevorzugt ist es, wenn in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R jeweils eine KAPA2G^TM Fast DNA-Polymerase verwendet wird.
Nach Erkenntnissen der Erfinder führt die Verwendung dieser besonders schnellen DNA-Polymerase zu optimalen Ergebnissen. Nach Angaben des Herstellers Kapa Biosystems, Inc., Woburn, MA, USA, ist diese DNA-Polymerase in der Lage, DNA-Abschnitte in Geschwindigkeiten von bis zu 1 kb/sec bzw. 60 kb/min zu amplifizieren. Auch zeichnet sich die KAPA2G^TM Fast DNA-Polymerase durch hohe Sensitivität und die Fähigkeit aus, DNA-Schäden bzw. DNA-Modifizierungen mit hoher Zuverlässigkeit zu erkennen. Die Tauglichkeit der KAPA2G^TM Fast DNA-Polymerase für das erfindungsgemäße Verfahren war überraschend. So ist nämlich diese DNA-Polymerase nach Angaben des Herstellers für die Standard-Endpunkt-Polymerasekettenreaktionen, nicht aber für quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktionen vorgesehen. Im Rahmen der Standard-Endpunkt-Polymerasekettenreaktionen werden nur kurze DNA-Fragmente von maximal 1 kb amplifiziert. Wie die Erfinder festgestellt haben, können mit der KAPA2G^TM Fast DNA-Polymerase im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich längere DNA-Fragmente von bis zu ≥ 5.000 bp amplifiziert werden. Dies war nicht zu erwarten.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R jeweils ein DNA-Fluoreszenzfarbstoff mit einer Fluoreszenzintensität von ≥ 350 Fluoreszenzeinheiten (FU) verwendet.
Nach Erkenntnissen der Erfinder führt die Verwendung von solchen besonders ”hellen” Fluoreszenzfarbstoffen zu guten Ergebnissen. Dies erlaubt es, den Farbstoff in geringer Konzentration einzusetzen. Dadurch werden eine zu starke Inhibition der PCR sowie Verlängerung der Elongationsdauer und eine Destabilisierung der DNA-Polymerase vermieden. Grundsätzlich geeignet sind beispielsweise die Farbstoffe SYBR Green I und SYBR Green II sowie Eva Green, Pico Green, Promega QuantiFluor^TM cyanine Farbstoffe wie bspw. YO-YO-1, Chromofy or BEBO, LCGreen und SYTO Farbstoffe. Die geforderte Fluoreszenzintensität von ≥ 350 FU bezieht sich auf die vom Hersteller angegebene End- bzw. einfache Konzentration des Farbstoffes.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung wird in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R jeweils ein sättigender Fluoreszenzfarbstoff, weiter bevorzugt der DNA-Fluoreszenzfarbstoff LightCycler^® 480 ResoLight Dye verwendet.
Nach Erkenntnissen der Erfinder führt die Verwendung derartiger Farbstoffe zu besonders guten Ergebnissen. Sättigende DNA-Fluoreszenzfarbstoffe sind solche, die vorzugsweise über die gesamte DNA verteilt binden, beispielsweise in jeder Base doppelsträngiger DNA interkalieren bzw. eingebaut werden. Während die SYBR Green-Farbstoffe nur in jede vierte bis fünfte Base interkalieren, interkaliert bspw. der LightCycler^® ResoLight Dye-Farbstoff in jede Base doppelsträngiger DNA. Die Tauglichkeit des DNA-Fluoreszenzfarbstoffes LightCycler^® ResoLight Dye für das erfindungsgemäße Verfahren war deshalb besonders überraschend, da dieser Farbstoff im Stand der Technik für andere Anwendungen beschrieben wird. So schlägt beispielsweise der Hersteller dieses Farbstoffes, die Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, die Verwendung dieses Farbstoffes zur Schmelzkurvenanalyse vor, nicht jedoch zur Verwendung in einer quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion. Wie die Erfinder festgestellt haben, liefert in dem erfindungsgemäßen Verfahren auch ”ausgeblichenes” LightCycler^® ResoLight Dye mit einer Fluoreszenzintensität von ca. 150 FU bzw. mit nur 7,5 FU noch auswertbare Ergebnisse.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden A_S und A_R durch die Werte der Kreuzungspunkte (”crossing points”, c_p) in der qRT-PCR_S und der qRT-PCR_R repräsentiert, so dass Folgendes gilt:

(3) Bestimmen der c_p-Werte der
– qRT-PCR_S zum Erhalt eines Wertes c_pS und der
– qRT-PCR_R zum Erhalt eines Wertes c_pR und
(4) Detektieren eines DNA-Schadens, wenn folgendes gilt: c_pS > c_pR.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Amplifizierungseffektivitäten durch einen aussagekräftigen Wert repräsentiert werden, der sich über Standard-Software, wie der LightCycler 480-Software, automatisiert bestimmen lässt. Hierzu wird die sog. ”second derivative maximum”-Analysemethode eingesetzt. Dabei handelt es sich um einen Algorithmus, der auf der Kinetik der PCR basiert. An den Kreuzungspunkten (c_p) der PCR-Reaktion erreicht die Reaktionsfluoreszenz das Maximum der zweiten Ableitung der Amplifizierungskurve, was dem Punkt entspricht, in dem die Beschleunigung des Fluoreszenzsignals maximal ist. Auf der DNA_S wird die DNA-Polymerase durch die vorhandenen Schäden inhibiert. Die Fluoreszenz in der qRT-PCR_S wird demnach im Vergleich zur Fluoreszenz in der qRT-PCR_R langsamer bzw. später ansteigen. Der c_pS-Wert ist größer als der c_pR-Wert.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird folgender weiterer Schritt durchgeführt: (5) Quantifizieren des DNA-Schadens, vorzugsweise in Läsionen pro 10 kb.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass nicht nur festgestellt wird, ob ein bestimmter DNA-Schaden vorliegt, sondern auch, wie groß dieser Schaden ist. Dadurch lassen sich beispielsweise Rückschlüsse auf den Grad der Genotoxizität einer Substanz schließen. Die Bestimmungsmethode zur Quantifizierung von Läsionen pro 10 kb ist beispielsweise beschrieben in Rothfuss et al. (2010; a. a. O.).
Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der DNA-Schaden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Einzelstrangbruch, Doppelstrangbruch und Nukleotidmodifizierungen wie Apyrimidinierung, Apurinierung, 5-Hydroxymethylierung an Cytosin oder Dimerisierung benachbarter Thymidine.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die wichtigsten, insbesondere in pathologischer Hinsicht relevanten DNA-Schäden zielgerichtet erfasst werden.
Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Nukleotidmodifizierungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Oxidation, einschließlich 8-Oxo-dA und 8-Oxo-dG; Methylierung, einschließlich O6-Methyl-dG und 5-Methyl-dC; Deaza-Nukleotidanaloga einschließlich 7-deaza-dA und 7-deaza-dG; Alkylierung; Dimerisierung, einschließlich T-T-Dimer-, T-C-Dimer-, C-T-Dimer-Bildung; Basenverlust.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass besonders relevante und auch physiologisch auftretende Nukleotidmodifizierungen zielgerichtet erfasst werden.
Ein weiterer Gegenstand des vorliegenden Verfahrens ist ein Kit zur Detektion eines DNA-Schadens, aufweisend:

(a) zumindest zwei PCR-Primer zur Amplifizierung einer DNA_S und einer DNA_R in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R,
(b) jedes der verschiedenen Nukleosidtriphosphate,
(c) eine DNA-Polymerase,
(d) zumindest einen DNA-Fluoreszenzfarbstoff,
(e) eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
(f) ggf. weitere Chemikalien und Reagenzien.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass sämtliche Komponenten und Informationen ”gebrauchsfertig” bereitgestellt werden, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen. Dadurch ist es auch weniger geschultem Personal möglich, das erfindungsgemäße Verfahren zuverlässig durchzuführen.
Bei dem erfindungsgemäßen Kit ist es bevorzugt, wenn es eine DNA-Polymerase mit einer Syntheserate von > 1 kb/min, vorzugsweise von ≥ 2 kb/min, weiter bevorzugt von ≥ 3 kb/min, weiter bevorzugt von ≥ 4 kb/min, weiter bevorzugt von ≥ 5 kb/min, und höchst bevorzugt eine KAPA2G^TM Fast DNA-Polymerase aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die nach Erkenntnissen der Erfinder am besten funktionierenden DNA-Polymerasen bereitgestellt werden.
Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Kits weist dieser einen DNA-Fluoreszenzfarbstoff mit einer Fluoreszenzintensität von ≥ 350 FU bezogen auf die End- bzw. einfache Konzentration gem. Hersteller, vorzugsweise einen sättigenden DNA-Fluoreszenzfarbstoff, und höchst bevorzugt LightCycler^® 480 ResoLight Dye, auf.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die nach Erkenntnissen der Erfinder am besten geeigneten DNA-Fluoreszenzfarbstoffe bereitgestellt werden.
Die Merkmale, Eigenschaften und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten für das erfindungsgemäße Kit entsprechend.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Hieraus ergeben sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
1 zeigt die schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
2 zeigt die erfolgreiche Amplifikation von DNA-Fragmenten > 3 kb mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, analysiert via Agarose-Gelektrophorese (oben links), im Vergleich zur nicht erfolgreichen Amplifikation mittels der Methode von Rothfuss et al. (2010; a. a. O, oben rechts), sowie die zugehörigen Schmelzkurven (n = 10–20) der erfolgreichen Amplifikate (unten) für lange und kurze Fragmente.
3 zeigt (A) eine weitere schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Links: Gesamtzell-DNA, entweder geschädigt oder Referenz, wird analysiert und mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgewertet. Mitte: Unbeschädigte Template-Sequenzen von 2 bis 4 kb Länge werden erfolgreich amplifiziert, wohingegen verschiedene Arten von Läsionen bzw. Modifikationen die Elongationsreaktion beeinträchtigen oder verhindern. Kurze Fragmente von 40 bis 70 bp dienen als Referenztemplates. Rechts: Zunehmende Läsions- bzw. Modifikationsraten führen zu erhöhten DCp-Werten. (B) DNA-Stress, der durch verschiedene Stimuli erzeugt wird, kann unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens analysiert werden. Jurkat-Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen bzw. Dosen von Bleomycin, Cisplatin, Etoposid und ultraviolettem Licht behandelt. Sowohl die Läsionen der mitochondrialen DNA (mtDNA) als auch die der nuklearen DNA (nDNA) wurden unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens quantifiziert (n = 3, Mittelwert ± S. A.). (C) Einfluss von Umweltbedingungen auf die initiale UV-induzierte DNA-Schädigung. Jurkat-Zellen wurden mit 10 mJ/cm² UV-Licht in Gegenwart oder Abwesenheit von 10% Serum bzw. 500 μM Vitamin C bestrahlt. Die mitochondrialen und nuklearen Läsionsraten wurden unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens analysiert (n = 4, Mittelwert ± S. A.). (D) Vergleich des aus Rothfuß et al. (a. a. O.) bekannten Verfahrens mit dem erfindungsgemäßen Verfahren via Response-Operating-Characteristic-Analyse (ROC-Analyse). Jurkat-Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von Bleomycin für 20 Minuten behandelt; n = 15 pro Konzentration und Experiment. Die Experimente wurden in Dreifachansätzen durchgeführt.
Linke Teilabbildung: Repräsentative ROC-Analysen zur Behandlung mit 1, 10 und 100 nM Bleomycin vs. Referenz. Mitte: Durchschnittlicher ROC-Bereich unter der Kurve für das Verfahren nach Rothfuss et al. (2010; a. a. O.) und für das erfindungsgemäße Verfahren. Rechts: korrespondierende Läsionen pro 10 kb, quantifiziert durch das erfindungsgemäße Verfahren. (E) Einfluss der verschiedenen DNA-Läsionen bzw. Basenmodifikationen auf die relative Amplifizierungsrate der synthetischen Oligonukleotide. Synthetische DNA-Oligonukleotide mit eingefügten Einzelbasenmodifikationen wurden unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens amplifiziert (n = 4, Mittelwert ± S. A.). Die P-Werte wurden über den Student's t-Test (ungepaart, zweiseitig) bestimmt. Die Sterne indizieren * P < 0,05, ** P < 0,01 und *** P < 0,001.
4 zeigt die erfolgreiche Quantifizierung subletaler DNA-Schädigung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens. Jurkat-Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen Bleomycin 20 min lang stimuliert. Nach dem Waschen wurde die Hälfte der Zellen geerntet und analysiert, wohingegen die andere Hälfte der Zellen unter Standard-Zellkulturbedingungen weiterkultiviert wurde. Nach 6 h wurde der Anteil der toten Zellen durch AnnexinV/Propidiumiodid-Doppelfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt (n = 3, Mittelwert ± S. A.)
5 zeigt den Einfluss verschiedener DNA-Modifikationen auf die relative Amplifikationsrate synthetischer Oligonukleotide gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens, welche jeweils eine eingefügte modifizierte DNA-Base aufweisen (n = 4, Mittelwert ± S. A.).
6 zeigt die Charakterisierung der in 7 aufgeführten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC). Oben: Lichtmikroskopische Aufnahmen humaner dermaler Fibroblasten (hFib, links) und hiPSC (rechs). Letztere wurden durch standardmäßige retrovirale Transduktion der OSKM-Faktoren (Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc) aus hFib gewonnen. Mitte: Charakterisierung von Oberflächenmarkern von hiPSC (dunkelgrau) vs. Isotyp-Kontrollen (hellgrau) mittels Durchflusszytometrie (links, repräsentativer Datensatz) und Expressionsanalyse (rechts) relativer mRNA-Level von Pluripotentfaktoren bei hFib, hiPSC und humanen Embyonalen Stammzellen (hES). Unten: Immunfärbung ungerichtet differenzierter iPSC. Alpha-Fetoprotein (AFP, endodermaler Marker), beta-3-Tubulin (B3T, ektodermaler Marker) und apha Smooth Muscle Actin (SMA, mesodermaler Marker) sind gezeigt.
7 zeigt (A) die Analyse der Anfälligkeit für genotoxische Behandlungen. Humane primäre Fibroblasten und korrespondierende isogene induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) wurden mit Bleomycin bzw. UV-Bestrahlung behandelt. Die mitochondrialen und nukelaren Läsionsraten wurden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt (n = 3, Mittelwert ± S. A.). (B) Untersuchung der Reparatur von mtDNA. Humane primäre Fibroblasten und korrespondierende isogene iPSC wurden mit niedrigen und hohen Dosen von Bleomycin bzw. UV-Bestrahlung behandelt und direkt nach der Behandlung (als ”initial” gekennzeichnet) oder nach zwei Stunden Regeneration geerntet (n = 3, Mittelwert ± S. A.). (C) Vergleich der genomischen Schädigung verschiedener Gene. Linke Teilabbildung: Fibroblasten und korrespondierende iPSC-Klone wurden mit Bleomycin stimuliert und die DNA-Läsionsraten sowohl im Oct4- und Col1a1-Locus wurden bestimmt (n = 6, Mittelwert ± S. A.). Mitte: Q-PCR-Analyse der Histon-H3-Acetylierung (acH3) der ChIP-angereicherten Oct4- und Col1a1-Loci. Rechts: Korrespondierende qRT-PCR-Expressionsanalyse von Oct4 und Col1a1 sowohl in Fibroblasten als auch in korrespondierenden iPSC (n = 3, Mittelwert ± S. A.). P-Werte wurden mittels des Student's t-Test (ungepaart, zweiseitig) bestimmt. Die Sterne zeigen an * P < 0,05, ** P < 0,01 und *** P < 0,001.
8 zeigt die Robustheit des erfindungsgemäßen Verfahrens. Aliquote einer DNA-Probe wurden ein- bis fünfmal bei –20°C eingefroren und aufgetaut, bevor sie analysiert wurden. Auch wiederholte Einfrier-Auftau-Zyklen änderten die Zahl der ermittelten mtDNA-Schäden nicht (n = 3, Mittelwert ± S. A.). Auch die Zahl nuklearer DNA-Schäden wurde nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt).
1. Material und Methoden
1.1 Detektionsverfahren
Zur Durchführung der Echtzeit-PCR-Analyse wurde das LightCycler^® 480 II System (Roche) mit 96- oder 384-Well-Platten verwendet. Die PCR-Amplifizierung wurde unter Verwendung des KAPA2G^TM Fast Hot Start ReadyMix Kits (Pqlab) durch Messung der Interkalation des ResoLight-Farbstoffes (Roche) in doppelsträngige DNA verfolgt. Das Prinzip des erfindungsgemäßen Assays zur Quantifizierung von DNA-Schadensraten basiert auf der vergleichenden Bestimmung von DNA-Läsionen in DNA-Fragmenten von unterschiedlichen Längen relativ zu einer Referenzprobe. Die Verwendung der schnellen Hochleistungs-DNA-Polymerase der zweiten Generation KAPA2G^TM in Kombination mit dem ResoLight-Farbstoff, der minimale inhibitorische Wirkung auf die PCR ausübt, ermöglicht eine hocheffiziente Amplifizierung von elongierten PCR-Produkten von über 4.000 bp. Für jede untersuchte nukleare oder mitochondriale genomische Region wurden verschiedene HPLC-gereinigte Oligonukleotide konstruiert, die sequenzspezifisch DNA-Schäden in Amplikons von 3–4 kb (”long run”, langes Amplikon) detektieren können, während angrenzende Amplikons von 50–70 bp (”short run”, kurzes Amplikon) als interne ungeschädigte Referenz dienten. Für das erfindungsgemäße Verfahren wurden die in der nachfolgenden Tabelle 1 dargestellten Oligonukleotide verwendet, die sämtliche Standards in Sachen PCR-Effizienz und -Spezifität erfüllen:
Tab. 1: Verwendete Oligonukleotide; Abkürzungen: bp: Basenpaare, COL1A1: Kollagen Typ I alpha 1; mtDNA: mitochondriale DNA; OCT4 (POU5F1): POU class 5 homeobox 1.
Die PCR-Effizienz sämtlicher Amplikons wurde in Dreifachbestimmung ermittelt und ihre Produktspezifität und -größe wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese visualisiert (2). Der Reaktionsansatz bestand aus dem KAPA2G^TM Fast Hot Start ReadyMix, 0,05 × LightCycler^® 480 ResoLight Farbstoff, 500 nM von jedem Vorwärts- und Rückwärts-Primer (spezifisch für das lange bzw. kurze Amplikon) und äquivalente Mengen von genomischer Template-DNA. Die Zyklusbedingungen wurden an die Amplikongrößen angepasst: Preinkubationsphase von 5 min bei 95°C, gefolgt von bis zu 50 Zyklen von 10 s bei 95°C, 10 s bei 60°C und 1 s bei 72°C (kurze Amplikons) oder 2 min 15 s bei 72°C (lange Amplikons). Um die Genauigkeit und Effizienz des erfindungsgemäßen Systems mit einem etablierten PCR-basierten Ansatz zu vergleichen, verwendeten die Erfinder eine bekannte RT-PCR-Methode [Rothfuss et al. (2010; a. a. O.)] mit SYBR Green, Taq-Polymerase und etablierte Oligonukleotide, mit denen mtDNA-Fragmente mit einer Maximallänge von 1 kb amplifiziert werden können.
1.2 Datenanalyse
Die Datenanalyse basiert auf einer Messung der Werte für die sog. Kreuzungspunkte (”crossing points”, c_p) unter Verwendung von isolierter DNA aus unbehandelten Proben als Referenz. Für jeden genomischen Bereich wurde der Quotient aus Effizienz (E) hoch c_p-Wert vom langen Amplikon zum kurzen Amplikon in Korrelation zu der Amplifizierungsgröße des langen Amplikons verwendet, um gemäß der folgenden Gleichung die DNA-Läsionsrate pro 10 kb zu berechnen:
Läsionen pro 10 kb =
In dieser Formel stehen E_L und E_S für die Amplifizierungseffizienzen des langen und kurzen Amplikons, CpL(S) steht für den c_p-Wert für die auf Schäden zu untersuchende DNA_S bzw. das auf Schäden zu untersuchende lange Amplikon. CpS(S) steht für den c_p-Wert für das kurze Amplikon, angrenzend an die auf Schäden zu untersuchende DNA_S bzw. das auf Schäden zu untersuchende lange Amplikon. CpL(R1) steht für den c_p-Wert für die erste Referenz-DNA (DNA_R) bzw. das lange Amplikon der DNA_R. CpS(R1) ist der c_p-Wert für das kurze Amplikon, angrenzend an das lange Amplikon der ersten DNA_R. R2 bzw. Rn stehen für die zweite bzw. n-te Referenz-DNA, sodass n für die Anzahl der Referenz-DNA-Ansätze steht. a steht für die Anzahl von Basenpaaren des großen Fragments. E_L und E_S wurden durch serielle DNA-Verdünnung (50 – 6,25 ng pro Well) und lineare Regressionsanalyse bestimmt. Die Cp-Werte werden über die LightCycler^® 480 Software bestimmt. Für jede Bedingung wurde eine RT-PCR im Dreifachansatz durchgeführt, und der Mittelwert der c_p-Werte für die langen und kurzen Amplikons wurde verwendet, um die Läsionen in der nuklearen DNA zu quantifizieren.
1.3 Zellkultur und Induktion von genotoxischem Stress
Die humane T-lymphozytäre Jurkat-Zelllinie wurde von der ATTC (#CRL-2063) bezogen und in RPMI-1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS, PAA Laboratories) kultiviert. Zur Induktion von DNA-Schäden wurden die Zellen den angegebenen Dosen und zu den angegebenen Zeitpunkten der folgenden genotoxischen Agenzien exponiert: Bleomycin (Medac), UV-Bestrahlung (Stratalinker^® UV Crosslinker 2400, Stratagene), Cisplatin (Sigma-Aldrich) und Etoposid (Sigma-Aldrich), entweder in serumfreiem oder Standardmedium. Nach gründlichem Waschen wurden die Zellen unmittelbar auf Eis oder nach zwei Stunden (7B) geerntet, um eine Reparatur der DNA-Schäden zu ermöglichen.
1.4 Ableitung von primären humanen dermalen Fibroblastenlinien
Stechbiopsien der Haut mit einer Gesamtdicke von 6 mm wurden von der volaren Oberfläche des Unterarms von gesunden Freiwilligen nach Aufklärung, Zustimmung und Genehmigung des Ethikkomitees der Universität Tübingen erhalten. Die Biopsien wurden in Stücke von 4 mm² geschnitten und unter sterilen Bedingungen in eine Platte mit 6 Vertiefungen gegeben. Binnen 7–14 Tagen erfolgte ein dichtes Heranwachsen der Zellen, welche dann durch Trypsinierung passagiert wurden und unter Bedingungen mit geringem Sauerstoff (5% O₂) in RPMI-1640, versetzt mit 10% FCS, 2 mM L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin, kultiviert wurden.
1.5 Retrovirale Produktion und Induktion von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen
Zelllinien von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurden durch Transduktion von dermalen Fibroplasten mit Retroviren hergestellt, welcher die Reprogrammierungsfaktoren hOct3/4, hSOX2, hKlf4 und hc-Myc trugen (Addgene). Nach 5 Tagen wurden die Zellen entweder auf eine BD Matrigel^TM-Matrix (BD Biosciences) oder auf eine MEF-Nährschicht (LHR Biosciences) plattiert und in einem Medium für humane embryonale Stammzellen, enthaltend Knockout DMEM (Invitrogen), 20% Serumersatz (Invitrogen), 2 mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, Penicillin/Streptomycin, 25 μM β-Mercaptoethanol, 4 ng/ml FGF-2 (PeproTech) und 10% TeSR-1 Medium (Stem Cell Technologies), kultiviert. Das Medium wurde täglich gewechselt und die hiPS-Zellen wurden alle fünf bis sechs Tage unter Verwendung von Kollagenase/Dispase (Roche) passagiert.
1.6 Von embryonalen Körperchen abgeleitete in-vitro-Differenzierung
hiPS-Zellen wurden unter Verwendung von Kollagenase/Dispase geerntet, mit Accutase vereinzelt und für 2 Tage in AggreWell-Platten (Stemcell Technologies) in ES-Zellmedium ohne β-Mercaptoethanol und ohne FGF-2 kultiviert. Um eine ungerichtete Differenzierung zu induzieren, wurden die gebildeten embryonalen Körperchen auf Matrigel-beschichteten Kulturschalen entweder mit endodermalem/mesodermalem Differenzierungsmedium (Knockout DMEM supplementiert mit 20% FCS, 2 mM L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren, Penicillin/Streptomycin und 25 μM β-Mercaptoethanol) oder ektodermalem Differenzierungsmedium bestehend aus Neurobasal-Medium (Gibco), DMEM F12 (Invitrogen), BSA, L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren, Penicillin/Streptomycin, 25 μM β-Mercaptoethanol, Y27632 (Wako), B-27 (Invitrogen) und N2 (R&D Systems) für 8 Tage bei 37°C und 5% CO₂kultiviert. Das Medium wurde täglich erneuert. Die Proben wurden mit Accustain fixiert, mit 1% Triton X-100 permeabilisiert, und mit Anti-α-Fetoprotein (1:100, Sigma-Aldrich), Anti-α-Glattmuskelactin (1:200, Abcam) oder Anti-β3-Tubulin (1:500, Sigma-Aldrich) und Alexa-Fluor-546-konjugiertem Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:1000, Invitrogen) gefärbt. Die Kerne wurden mit DAPI (Invitrogen) gegengefärbt.
1.7 DNA-Isolierung
Die gesamte DNA wurde unter Verwendung des ”DNA Blood and Tissue Kit” (Qiagen) aus Zellen isoliert, die unter Standard- oder DNA-Schädigungsbedingungen kultiviert wurden. Die Reinheit der DNA wurde durch spektrometrische Analyse bestimmt (Nanodrop^®1000 Peqlab). Die isolierte hochreine DNA (A260/A280 > 1,8) wurde bei –20° gelagert.
1.8 Chromatin-Immunopräzipitation
ChIP-Assays wurden nach dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt. In Kürze, 10⁷ hiPS-Zellen und Fibroblasten wurden quervernetzt und lysiert, und die DNA wurde unter Verwendung eines Bioruptor Sonicators (Diagenode) in Fragmente von 300–800 bp verkleinert. Extrakte wurden mit Protein-A-Agarose, die mit Lachsspermien blockiert war (Upstate), vorgeklärt und einer ChIP-Analyse mit Antikörpern gegen acetyliertes Histon H3K9/K14 (Merck-Millipore) zugeführt. Die RT-PCR wurde unter Verwendung des SYBR Green rtPCR-Kits (Fermentas) im Dreifachansatz durchgeführt. Die relative Anreicherung wurde über die 2^ΔΔCt Methode berechnet; vgl. Livak und Schmittgen (2001): Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2(-Delta C(T)) Method, Methods 25, S. 402–408.
1.9 Oligonukleotide, RNA-Isolierung und Echtzeit-PCR
Sämtliche Primer und Oligonukleotide, die einzelne DNA-Modifizierungen trugen, wurden mittels HPLC oder PAGE (Sigma-Aldrich) gereinigt. Die Sequenzen sämtlicher Oligonukleotide sind in der Tabelle 1 (siehe oben) und der nachfolgenden Tabelle 2 wiedergegeben:
Tab. 2: Verwendete Oligonukleotide
Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNeasy-Kits (Qiagen) aus hiPS-Zellen und Fibroblasten isoliert und durch Spektroskopie quantifiziert. Die cDNA wurde aus 200 ng Gesamt-RNA unter Verwendung des Transcriptor First Strand cDNA Synthesekits (Roche) synthetisiert. Die cDNA aus hES H9-Zellen wurden von Prof. Marek Los (Linköping, Schweden) zur Verfügung gestellt. Unter Verwendung des SYBR Green RT-PCR-Kits (Fermentas) sowie den in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgelisteten Primern wurde eine qRT-PCR durchgeführt und mit dem LightCycler^® 480 II Real-Time PCR-System (Roche) analysiert. Die Genexpressionsspiegel der hiPS-Zellen werden relativ zu den mRNA-Spiegeln der Fibroblasten und der Expression von GAPDH und β-Actin angegeben.

Tab. 3: Primer; Abkürzungen: COL1A1: Kollagen Typ I alpha 1; ESG1 (DPPA5): Embryonal stem cell specific gene 1; GAPDH: Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; GDF3: Growth differentiation factor 3; OCT4 (POU5F1): Octamer-binding transcription factor 4; REX1 (ZFP42): Reduced expression protein 1; SOX2: SRY(Sex determining region Y)-box 2; TERC: Telomerase RNA-Komponente; TERT: Telomerase Reverse Transkriptase.
1.10 Durchflusscytometrie
Die Durchflusszytometrie-Analyse wurde unter Verwendung des BD LSR-II-Instruments (BD Biosciences) und der BD FACS Diva Software durchgeführt. Die Durchflusszytometrie-Färbung erfolgte unter Verwendung des BD humanen und Maus pluripotenten Stammzellanalysekits, enthaltend PerCP-Cy5.5 Maus-Anti-Oct4, PE Maus-Anti-SSEA-1 und Alexa Fluor 647 Maus-Anti-SSEA-4 und der korrespondierenden Isotypkontrollen. Kontrollbeads wurden zur Kompensation verwendet, und die Zelltrümmer und Dupletten wurden durch geeignetes Gating ausgeschlossen.
1.11 Immunfluoreszenzmikroskopie
Die Zellen wurden in 24-Well-Platten auf Deckgläschen plattiert, die mit 1:20 verdünnter BD Matrigel^TM-Matrix beschichtet waren. Nach einer Fixierung mit Ac-custain (Sigma-Aldrich) wurden die Zellen blockiert und mit 3% normalem Ziegenserum und 0,05% Saponin in PBS permeabilisiert. Kaninchen-Antiseren gegen Nanog 1:150 (Abcam), Sox2 1:150 (Abcam) und monoklonale Maus-Antikörper gegen Tra 1–60 (1:100, Chemicon), Tra 1–81 (1:50, Chemicon) und SSEA-4 (1:100, BD Biosciences) wurden in Kombination mit Hühnchen Alexa 488-konjugiertem Anti-Maus-Antikörper (1:1000, Invitrogen) oder Alexa 594-konjugiertem Anti-Kaninchen-Antikörper (1:1000, Invitrogen) verwendet. Die Zellkerne wurden mit DAPI (Sigma-Aldrich) gegengefärbt. Fluoreszenzaufnahmen wurden unter Verwendung von ApoTome (Zeiss) angefertigt.
1.12 Statistik und Grenzwertoptimierungskurve (”Receiver-Operating Characteristic”, ROC)
Die Daten sind angegeben als Mittelwerte ± S. A. von zumindest drei unabhängigen Experimenten. ROC-Analysen wurden verwendet, um die Sensitivität der erfindungsgemäßen Analyse für DNA-Schäden im Vergleich mit dem Verfahren von Rothfuss et al. (2010, a. a. O.) unter Verwendung von niedrigen genotoxischen Dosen von Bleomycin an Jurkat-Zellen zu evaluieren, wie beschrieben in Oliver et al. (2008): 'Noisy patients' – Can Signal Detection Theory Help?, Nature Clinical Practice, Neurology 4, Seiten 306–316. In Kürze, Jurkat-Zellen wurden mit 1, 10, 100 und 2500 nM Bleomycin für 20 min unter serumfreien Bedingungen inkubiert. Unter Verwendung von isolierter DNA von behandelten und unbehandelten Jurkat-Zellen (echt-negativ), wurde im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Echtzeit-PCR mit spezifischen Oligonukleotiden für mtDNA [semilong-run PCR (Rothfuss et al., 2010, a. a. O.): AL4.F, AS2.R (974 bp); erfindungsgemäßes Verfahren: CL5.F, AS2.R (3723 bp)] durchgeführt. Die ROC-Analyse erfolgte mit der OriginPro 8 Software (OriginLab), und die ΔCp-Werte [ΔCp (langes Fragment) – ΔCp (kurzes Fragment)] wurden zur Berechnung des Bereichs unter der Kurve (AUC) verwendet.
2. Ergebnisse
Zellen sind von einer Vielzahl von DNA-Modifikationen betroffen, die spontan als Stoffwechselnebenprodukte, wie oxidative Läsionen, oder infolge der Exposition an genotoxische Agenzien oder Bestrahlung auftreten. Konventionelle DNA-Schadensanalysen detektieren entweder den gesamten DNA-Schaden in einer sequenzunabhängigen Weise, wie beispielsweise der Comet Assay und die Strangbruch-Endmarkierung, oder fokussieren auf einen definierten Typ der DNA-Läsion, indem auf Thymdin-Dimere oder die γ-H2AX-Färbung als Marker für DNA-Doppelstrangbrüche abgestellt wird. Tatsächlich verursachen genotoxische Bedingungen eine Vielzahl von verschiedenen DNA-Modifizierungen, das heißt Pyrimidin-Dimere, Oxidationsprodukte und Einzel- oder Doppelstrangbrüche. Viele dieser Modifizierungen haben eine Gemeinsamkeit: sie interferieren mit der DNA-abhängigen DNA-Polymerase und inhibieren die DNA-Synthese. Aus diesem Grund stellt die PCR-basierte DNA-Schadensquantifizierung eine geeignete Technik zur Detektion von verschiedenen DNA-Läsionen dar.
Zusätzliche Vorteile von PCR-basierten Verfahren sind noch augenfälliger: zum einen sind sie sequenzspezifisch, wodurch die Identifizierung einer differenziellen Läsionsinzidenz für ausgewählte genomische Loci in Hochdurchsatzanalysen ermöglicht wird. Zweitens lassen sich Echtzeit-PCR-Analysen, in denen etablierte Primer verwendet werden, ohne die Neuermittlung von experimentellen Rahmenbedingungen anwenden.
Das größte Hindernis für RT-PCR-basierte Quantifizierungsverfahren der DNA-Schädigung ist jedoch die Amplikon-Größe, die bislang auf wenige hundert Basenpaare begrenzt ist. Konventionelle fluoreszierende Farbstoffe, die für die RT-PCR verwendet werden, z. B. SYBR Green I, interkalieren in die DNA und inhibieren dadurch substantiell die Polymerase-getriebene Elongationsreaktion. Die PCR-basierte DNA-Schadensquantifizierung detektiert Läsionen, die zu einer Verzögerung in den Werten für die sog. Kreuzungspunkte (Cp) führen. Gemäß dem Gaußschen Verteilungstheorem tragen längere Amplikons mehr Läsionen, was zu erhöhten Cp-Verzögerungen führt, wodurch die Sensitivität der Schadensdetektion verstärkt wird.
Die Erfinder kombinierten die hochleistungsfähige und extrem schnelle KAPA2G^TM Fast DNA-Polymerase^® (Kapa Biosystems) und den fluoreszierenden DNA-Farbstoff der zweiten Generation ResoLight^® (Roche), der in sehr niedrigen Konzentrationen eingesetzt werden kann, wodurch es lediglich zu einer geringen Inhibition der PCR-Amplifizierung kommt. Das erfindungsgemäße Verfahren, welches intern auch als ”Long-Run DNA Damage Quantifizierungsverfahren (LORD-Q) bezeichnet wird, ermöglicht eine RT-PCR-Amplifizierung von Fragmenten von über 4 kb Länge.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist schematisch in der 1 dargestellt. Eine Zellkultur wird mit einer Testsubstanz inkubiert (”behandelt”), eine unbehandelte Zellkultur dient als Referenz (”unbehandelt”). Aus beiden Zellkulturen wird die DNA isoliert und je ein Fragment von ca. 4.000 bp (”long run”; langes Amplikon) und ein Kontrollfragment von ca. 50–70 bp (”short run”; kurzes Amplikon), das die unbeschädigte DNA repräsentiert und als interne Referenz zur Normierung der eingesetzten DNA-Mengen dient, einer quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR) unterzogen. In dem ”long run”-Ansatz kommt es bei der behandelten DNA aufgrund von DNA-Schäden zur Verlangsamung bzw. Verzögerung der Amplifikation mittels qRT-PCR. Anschließend wird das Ausmaß der DNA-Schädigung in der behandelten und unbehandelten Zellkultur in Läsionen pro 10 kb berechnet und dargestellt. Eine weitere schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens findet sich in der 3A.
Im Gegensatz hierzu erlauben Standard-qRT-PCR-Ansätze lediglich die Amplifizierung von wenigen hundert Basenpaaren (2).
Um zu testen, ob das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist, um den DNA-Schaden zu quantifizieren, behandelten die Erfinder zunächst humane Jurkat-T-Lymphozyten mit verschiedenen genotoxischen Stimuli, einschließlich UV-Bestrahlung und Inkubation mit Cisplatin, Etoposid und Bleomycin. Um eine Interferenz mit apoptotischer DNA-Fragmentierung zu vermeiden, wurden bewusst Bedingungen verwendet, unter denen keine Apoptose induziert wird, nämlich durch kurzzeitige Inkubation oder niedrige Wirkstoffkonzentrationen und Gegenwart eines Caspase-Inhibitors. Wie in 3B gezeigt, induzieren sämtliche Stimuli dosisabhängig DNA-Schäden. Interessanterweise ergibt die Analyse von verschiedenen DNA-Proben, dass die UV-Bestrahlung und Behandlung mit Cisplatin sowohl die mitochondriale als auch nukleare DNA schädigt, während eine kurzzeitige Inkubation mit Bleomycin, einem redoxbasierten genotoxischen Agens, und dem Topoisomerase II-Inhibitor Etoposid, primär das mitochondriale bzw. nukleare Genom schädigt (3B).
Als nächstes wurde getestet, ob über das erfindungsgemäße Verfahren der Einfluss von DNA-protektiven Bedingungen beobachtet werden kann. Dazu wurden Jurkat-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit des Antioxidans Vitamin C, welches Zellen gegenüber DNA-Schäden schützt, an UV-Licht exponiert (3C). Titrationsexperimente zeigten, dass Vitamin C in der Lage ist, nahezu vollständig die UV-induzierte DNA-Schädigung zu unterdrücken, wohingegen es bei hohen Konzentrationen geringfügig selbst DNA-Stress induzierte (4). Ferner resultierte Serumentzug in Kombination mit UV-Bestrahlung in einer höheren initialen DNA-Schädigung als UV-Bestrahlung allein, was eine protektive Rolle des Serums impliziert. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass das erfindungsgemäße Verfahren in der Lage ist, den Einfluss von Umweltfaktoren auf die DNA-Schädigung darzustellen.
Anschließend wurde die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem aus Rothfuss et al. (2010, a. a. O.) verglichen. Die Analyse von Jurkat-Zellen, die mit sehr niedrigen Dosen (10 nM) von Bleomycin behandelt wurden, zeigte, dass eine DNA-Schädigung von ca. 0,3 Läsionen pro 10 kb robust und signifikant mit dem erfindungsgemäßen Verfahren detektiert werden kann (3D). Anschließend wurden ROC-Analysen durchgeführt, mit denen die Sensitivität und Spezifizität in einer Fläche unter der Kurve (AUC) von 1,0 für perfekte Diskriminierung von zwei unterschiedlichen Gruppen und 0,5 für randomisierte Gruppen festgestellt wurde (3D). Die ROC-Analyse zeigte, dass das erfindungsgemäße Verfahren für die relevanten Konzentrationen von Bleomycin (AUC: 100 nm: 1,0, AUC 10 nM: 0,935) im Vergleich zu dem Verfahren von Rothfuss et al. (2010, a. a. O.) (AUC: 100 nm: 0,934, AUC 10 nM: 0,5) deutlich sensitiver ist.
Als nächstes wurden von den Erfindern verschiedene Formen der DNA-Modifizierung getestet, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren detektiert werden können. Neben Einzel- und Doppelstrangbrüchen kann die Inhibition der Polymerase auch durch chemische Veränderungen von DNA-Basen erzeugt werden. Zu diesem Zweck wurden verschiedene synthetische Oligonukleotide, bei denen jeweils eine einzelne Base spezifisch modifiziert wurde, als Template verwendet (vgl. Tabelle 2). Wie in der 3E dargestellt, führten Oligonukleotide mit einem Thymidin-Dimer (TT) oder einer abasischen Stelle zu einer starken Inhibition der RT-PCR-Amplifizierung im Vergleich zu dem nicht-modifizierten Template. Ferner führte 5'-N-Hydroxymethylcytosin, das eine Rolle in der epigenetischen Regulation und der Entwicklung von embryonalen Stammzellen spielt, nicht aber 5-Methylcytosin, zu einer vollständigen Inhibition der RT-PCR-Amplifizierung. Die anderen getesteten Basenmodifizierungen waren 7-Deaza-deoxyguanosin, 8-Oxo-deoxyadenosin und 8-Oxo-deoxyguanosin, die nur einen geringen Einfluss auf den Amplifizierungsprozess hatten (3E, 5).
Dysfunktionale DNA-Reparatur und genomische Instabilität sind eng mit altersabhängigen Störungen, wie Xeroderma pigmentosum, Ataxia telangiectasia, Fanconi-Anämie, Parkinsonkrankheit und Krebs, assoziiert. Deshalb ist neben der Identifizierung und Charakterisierung von Genotoxizität die quantitative Bestimmung der DNA-Schadensanfälligkeit und -reparatur von großem Interesse. Aus diesem Grunde wurde das erfindungsgemäße Verfahren verwendet, um DNA-Reparaturprozesse zu beobachten, und es wurde ein signifikanter Unterschied in der Fähigkeit und den Kinetiken der DNA-Reparatur von verschiedenen Zelllinien festgestellt (Daten nicht gezeigt). Beispielsweise wurden humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS) und dermale Fibroblasten mit identischem genetischem Hintergrund für ihre Anfälligkeit für eine genotoxische Behandlung untersucht (6 für die Charakterisierung von hiPS-Zellen). Im Vergleich zu Fibroblasten zeigten hiPS-Zellen eine signifikant niedrigere initiale DNA-Schädigung sowohl nach UV-Bestrahlung als auch Bleomycin-Behandlung (7A). Um DNA-Reparaturprozesse zu beobachten, wurde die initiale DNA-Schädigung mit den Läsionen verglichen, die zwei Stunden nach der genotoxischen Behandlung noch vorhanden waren. Zum Vergleich von hiPS-Zellen und Fibroblasten wurden Bleomycin und eine UV-Bestrahlung in zwei Dosen verwendet, was in beiden Zelltypen ungefähr die gleiche Menge von initialen DNA-Schäden induzierte. Messungen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ergaben, dass hiPS-Zellen in der Lage waren, innerhalb der ersten zwei Stunden nach genotoxischen Behandlungen effizienter zu reparieren als isogene Fibroblasten (7B). Dies ist konsistent mit dem Befund, dass hiPS-Zellen nach einer DNA-Schädigung rasch ihre DNA-Reparaturenzyme hochregulieren.
Die Anfälligkeit von bestimmten genomischen Bereichen für DNA-Schädigung wird auch durch den Chromatin-Zustand beeinflusst. Dicht gepacktes Heterochromatin wird generell als weniger anfällig für DNA-Schädigung betrachtet, während Euchromatin, welches sich in einer offeneren aktiv transkribierten Konformation befindet, DNA-Läsionen favorisieren könnte. Um zu untersuchen, ob mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens die Anfälligkeit bestimmter DNA-Bereiche für DNA-Schädigungen beobachtet werden kann, wurde die DNA-Schädigung in zwei Gen-Loci gemessen. In hiPS-Zellen wird das Gen, welches für den Stammzellerneuerungsfaktor Oct4 kodiert, nicht aber jenes, das für Kollagen Typ 1 alpha 1 (Col1a1) kodiert, intensiv transkribiert, wohingegen Fibroblasten ein entgegengesetztes Expressionsmuster aufweisen (7C). Der Chromatin-Status wurde durch Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse (ChIP) der Histon H3K9/14 Acetylierung, charakteristisch für transkriptionsaktive DNA-Bereiche, bestätigt (7C). Tatsächlich zeigte die Analyse mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, dass Bleomycinbehandelte hiPS-Zellen signifikant mehr DNA-Läsionen im Oct4 Promotor akkumulieren als im Col1a1 Promotor, wohingegen Fibroblasten die entgegengesetzte DNA-Schädigung in den Promotoren zeigten (7C). Demnach ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Identifizierung von chromatinabhängigen sog. Hotspots für DNA-Läsionen, eine Anwendung, die nützlich ist in der Analyse von DNA-Läsionen in zelltypspezifischen oder Chromatin-abhängigen Tumorsuppressorgenen.
Zusammengefasst, das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine hochsensitive und akkurate Technik dar, die die sequenzspezifische Detektion von DNA-Schäden auch in den chromosomalen Gen-Loci, d. h. in nuklearer DNA, ermöglicht. Das Verfahren ist hochdurchsatzkompatibel und robust. Zyklen des Einfrierens und Auftauens von Proben-DNA zeigen keine Beeinflussung der experimentellen Ergebnisse (8). Zusätzlich können nicht nur DNA-schadensspezifische sondern auch epigenetisch relevante Basenmodifizierungen, wie 5-Hydroxymethylcytosin, detektiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet zur Identifizierung von Hotspots der DNA-Schädigung, der Charakterisierung der genotoxischen Anfälligkeit von bestimmten Zelltypen und zur Überwachung deren DNA-Reparaturkapazität. SEQUENZPROTOKOLL

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Rothfuss et al. (2010, a. a. O.) [0088]
Rothfuss et al. (2010, a. a. O.) [0088]

Claims

Verfahren zur Detektion eines DNA-Schadens, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen von – auf Schäden zu untersuchender DNA (DNA_S) und – unbeschädigter Referenz-DNA (DNA_R), (2) Amplifizieren der – DNA_S in einer ersten quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR_S) und der – DNA_R in einer zweiten quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR_R), (3) Bestimmen der Amplifizierungseffektivität (A) der – qRT-PCR_S zum Erhalt eine Wertes A_S und der – qRT-PCR_R zum Erhalt eine Wertes A_R und (4) Detektieren eines DNA-Schadens, wenn folgendes gilt: A_S < A_R, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der DNA_S und der DNA_R um Gesamtzell-DNA handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der DNA_S und der DNA_R um nukleare DNA handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt 2 zu amplifizierenden DNA_S und DNA_R jeweils Längen von ≥ 1000 bp aufweisen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA_S und DNA_R jeweils Längen von ≥ 2000 bp, vorzugsweise von ≥ 4000 bp, weiter bevorzugt von ≥ 5000 bp aufweisen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R jeweils eine DNA-Polymerase mit einer Syntheserate von > 1 kb/min verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R jeweils eine DNA-Polymerase mit einer Syntheserate von ≥ 2 kb/min, vorzugsweise von ≥ 3 kb/min, weiter bevorzugt von ≥ 4 kb/min, höchst bevorzugt von ≥ 5 kb/min verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R jeweils eine KAPA2G^TM Fast DNA-Polymerase verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R jeweils ein DNA-Fluoreszenzfarbstoff mit einer Fluoreszenzintensität von ≥ 350 Fluoreszenzeinheiten (FU) verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R jeweils ein sättigender DNA-Fluoreszenzfarbstoff verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R als DNA-Fluoreszenzfarbstoff LightCycler^® 480 ResoLight Dye verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass A_S und A_R durch die Werte der Kreuzungspunkte (”crossing points, c_p) in der qRT-PCR_S und der qRT-PCR_R dargestellt werden, so dass Folgendes gilt: (3) Bestimmen der c_p-Werte der – qRT-PCR_S zum Erhalt eine Wertes c_pS und der – qRT-PCR_R zum Erhalt eine Wertes c_pR und (4) Detektieren eines DNA-Schadens, wenn folgendes gilt: c_pS > c_pR.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass folgender weiterer Schritt durchgeführt wird: (5) Quantifizieren des DNA-Schadens.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Quantifizieren in Läsionen pro 10 kb erfolgt.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der DNA-Schaden ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Einzelstrangbruch, Doppelstrangbruch und Nukleotidmodifizierungen einschließlich Apyrimidinierung, Apurinierung, 5-Hydroxymethylierung an Cytosin oder Dimerisierung benachbarter Thymidine.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidmodifizierungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Oxidation, einschließlich 8-Oxo-dA und 8-Oxo-dG; Methylierung, einschließlich O6-Methyl-dG und 5-Methyl-dC; Deaza-Nukleotidanaloga einschließlich 7-deaza-dA und 7-deaza-dG; Alkylierung; Dimerisierung, einschließlich T-T-Dimer-, T-C-Dimer-, C-T-Dimer-Bildung; Basenverlust..
Kit zur Detektion eines DNA-Schadens, aufweisend: (a) zumindest zwei PCR-Primer zur Amplifizierung einer DNA_S und einer DNA_R in der qRT-PCR_S und qRT-PCR_R, (b) jedes der verschiedenen Nukleosidtriphosphate, (c) eine DNA-Polymerase, (d) zumindest einen DNA-Fluoreszenzfarbstoff, (e) eine Anleitung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, und (f) ggf. weitere Chemikalien und Reagenzien.
Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA-Polymerase mit einer Syntheserate von > 1 kb/min, vorzugsweise von ≥ 2 kb/min, weiter bevorzugt von ≥ 3 kb/min, weiter bevorzugt von ≥ 4 kb/min, weiter bevorzugt von ≥ 5 kb/min, und höchst bevorzugt eine KAPA2G^TM Fast DNA-Polymerase aufweist.
Kit nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass es einen DNA-Fluoreszenzfarbstoff mit einer Fluoreszenzintensität von ≥ 350 FE, vorzugsweise einen sättigenden DNA-Fluoreszenzfarbstoff, und höchst bevorzugt LightCycler^® 480 ResoLight Dye aufweist.