DE102012016347B4 - Microscope for SPIM microscopy - Google Patents

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Abstract

Mikroskop zur SPIM Mikroskopie, umfassend,- eine Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine kohärentes Licht abstrahlende Beleuchtungslichtquelle (1) und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe (3) in einer Beleuchtungsrichtung mit einem Lichtblatt, über ein Beleuchtungsobjektiv (7);- einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht in einer Detektionsrichtung, das von der Probe (3) abgestrahlt wird,- einer Abbildungsoptik, die die Probe (3) über ein Abbildungsobjektiv (7) in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet,- wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs (7) oder einer definierten Ebene in der Nähe des geometrischen Fokus des Abbildungsobjektivs (7) eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv (7) eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblattes in einem von Null verschiedenen Winkel schneidet,- eine Probenkammer (10), die mit einer Flüssigkeit gefüllt wird, in der die Probe (3) angeordnet ist oder angeordnet werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass die- Probenkammer (10) in Detektionsrichtung und/oder in Beleuchtungsrichtung ein lichtdurchlässiges Fenster aufweist, wobei in mindestens einem lichtdurchlässigen Fenster eine Aufnahme mit einem Gewinde (8) vorhanden ist,- in die ein Adapter (5) eingeschraubt ist,- der eine ringförmige Öffnung aufweist, in der ein Dichtungsring (6) eingebracht ist,- gegen den ein Objektiv (7) in Form eines Beleuchtungsobjektivs (7) oder eines Abbildungsobjektivs (7) gedrückt werden kann, um die Probenkammer (10) abzudichten,- wobei das Objektiv (7) mit einer Seitenfläche eines an seinem der Probenkammer (10) zugewandten Ende ausgebildeten Konus gegen den Dichtungsring (6) gedrückt wird;- wobei das Mikroskop weiterhin ein Set verschiedener, an jeweils eine Geometrie unterschiedlicher Objektive (7) angepasster und in die Aufnahme einschraubbarer Adapter (5) umfasst, wobei- die Adapter (5) zur Anpassung an unterschiedliche Objektive (7) unterschiedliche Innendurchmesser der ringförmigen Öffnung aufweisen,- einer der Adapter (5) für den Einsatz von Trockenobjektiven in Richtung einer in der Probenkammer (10) befindlichen Probe (3) ein flüssigkeitsdichtes Deckglas (9) aufweist und- die anderen Adapter (5) des Sets für den Einsatz von Wassertauchobjektiven ausgebildet sind.Microscope for SPIM microscopy, comprising,- an illumination device, comprising an illumination light source (1) emitting coherent light and an illumination beam path for illuminating a sample (3) in an illumination direction with a light sheet, via an illumination objective (7);- a detection device for detecting Light in a detection direction, which is emitted by the sample (3),- imaging optics which images the sample (3) at least partially onto the detection device via an imaging lens (7) in an imaging beam path,- the light sheet being in the focus of the imaging lens ( 7) or a defined plane in the vicinity of the geometric focus of the imaging lens (7) and wherein the imaging lens (7) has an optical axis which intersects the plane of the light sheet at an angle other than zero, - a sample chamber (10) Which is filled with a liquid in which the sample (3) angeor dnet is or can be arranged, characterized in that the sample chamber (10) has a transparent window in the direction of detection and/or in the direction of illumination, with a receptacle having a thread (8) being present in at least one transparent window, - in which a Adapter (5) is screwed in - which has an annular opening in which a sealing ring (6) is introduced - against which a lens (7) in the form of an illumination lens (7) or an imaging lens (7) can be pressed to to seal the sample chamber (10),- the objective (7) being pressed against the sealing ring (6) with a side surface of a cone formed at its end facing the sample chamber (10);- the microscope also having a set of different, each attached to one Geometry of different lenses (7) adapted and screwed into the recording adapter (5) includes, where- the adapter (5) to adapt to different lenses (7) u have different inner diameters of the annular opening, - one of the adapters (5) for the use of dry objectives in the direction of a sample (3) located in the sample chamber (10) has a liquid-tight cover glass (9) and - the other adapters (5) of the set are trained for the use of water diving lenses.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop mit einer Probenkammer, welches ein Abbildungsobjektiv zur Abbildung einer Probe auf einen Detektor sowie Mittel zur Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt in der Fokusebene des Abbildungsobjektivs bzw. in einer definierten Ebene in der Nähe der dieser Fokusebene umfasst. Die Mittel zur Beleuchtung umfassen eine kohärentes Licht abstrahlende Beleuchtungsquelle.The invention relates to a microscope with a sample chamber, which includes an imaging objective for imaging a sample onto a detector and means for illuminating the sample with a light sheet in the focal plane of the imaging objective or in a defined plane near this focal plane. The means for illumination include an illumination source that emits coherent light.

Ein Mikroskop, bei dem Beleuchtungsstrahlengang und Detektionsstrahlengang im Wesentlichen senkrecht zueinander angeordnet sind, und bei der die Probe mit einem Lichtblatt in der Fokusebene des Abbildungsobjektivs, d.h. senkrecht zu dessen optischer Achse, beleuchtet wird, ist für die Untersuchung von Proben nach dem Verfahren der Selective-Plane-Illumination-Microscopy (SPIM) ausgelegt. Im Unterschied zur konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM), bei der eine dreidimensionale Probe in einzelnen, unterschiedlich tiefen Ebenen Punkt für Punkt abgetastet wird und die dabei gewonnenen Bildinformationen nachfolgend zu einer dreidimensionalen Abbildung der Probe zusammengesetzt werden, beruht die SPIM-Technologie auf der Weitfeldmikroskopie und ermöglicht die bildliche Darstellung der Probe auf der Grundlage von optischen Schnitten durch einzelne Ebenen der Probe.A microscope in which the illumination beam path and detection beam path are arranged essentially perpendicular to one another and in which the sample is illuminated with a light sheet in the focal plane of the imaging lens, i.e. perpendicular to its optical axis, is used for examining samples using the selective method -Plane Illumination Microscopy (SPIM). In contrast to confocal laser scanning microscopy (LSM), in which a three-dimensional sample is scanned point by point in individual planes of different depths and the image information obtained is then combined to form a three-dimensional image of the sample, SPIM technology is based on of wide-field microscopy and enables the imaging of the sample based on optical sections through individual planes of the sample.

Die Probe wird in dem überlappenden Bereich von Beleuchtung und Detektion platziert. Fluoreszenzsignale, die durch das Beleuchtungslichtblatt angeregt werden, werden über das gesamte Gesichtsfeld des Detektionsobjektivs auf eine Kamera abgebildet. Durch die rechtwinklige Beleuchtung mit einem dünnen Lichtblatt wird nur ein kleiner Teil der axialen Ausdehnung der Probe beleuchtet und somit ein optischer Schnitt erzeugt. Um einen anderen Bereich in der Probe zu beobachten, wird die Probe, unabhängig von der Optik, mit einer Probenpositioniereinheit durch das Lichtblatt gefahren.The sample is placed in the overlapping area of illumination and detection. Fluorescence signals excited by the illuminating light sheet are imaged onto a camera over the entire field of view of the detection lens. Due to the perpendicular illumination with a thin sheet of light, only a small part of the axial extent of the sample is illuminated, thus creating an optical section. In order to observe a different area in the sample, the sample is moved through the light sheet with a sample positioning unit, independently of the optics.

Die Vorteile der SPIM-Technologie bestehen unter anderem in der größeren Geschwindigkeit, mit der die Erfassung der Bildinformationen erfolgt, der geringeren Gefahr des Ausbleichens von biologischen Proben sowie einer erweiterten Eindringtiefe des Fokus in die Probe.The advantages of the SPIM technology include the greater speed with which the image information is acquired, the lower risk of fading of biological samples and an extended penetration depth of the focus into the sample.

Prinzipiell werden bei der SPIM-Technologie Fluorophore, die in der Probe enthalten sind oder in diese eingebracht werden, mit Laserlicht angeregt, welches zu einem sogenannten Lichtblatt geformt ist. Mit dem Lichtblatt wird jeweils eine ausgewählte Ebene in der Tiefe der Probe beleuchtet und mit einer Abbildungsoptik ein Bild dieser Probenebene in Form eines optischen Schnitts gewonnen. Im Wesentlichen äquivalent zu einer solchen Anregung mit einem statischen Lichtblatt ist die schnelle Hin- und Herbewegung eines dünnen, rotationssymmetrischen Laserstrahls in der Fokusebene des Abbildungsobjektivs. Effektiv, d.h. im zeitlichen Mittel über den Zeitraum der Beobachtung, ergibt sich somit die Form eines Lichtblatts.In principle, with SPIM technology, fluorophores that are contained in the sample or are introduced into it are excited with laser light, which is formed into a so-called light sheet. A selected plane in the depth of the sample is illuminated with the light sheet and an image of this sample plane is obtained in the form of an optical section using imaging optics. Essentially equivalent to such an excitation with a static sheet of light is the rapid back and forth movement of a thin, rotationally symmetrical laser beam in the focal plane of the imaging objective. Effectively, i.e. averaged over time over the period of observation, the result is the form of a light sheet.

Die SPIM-Technologie ist beispielsweise beschrieben in Stelzer et al., Optics Letters 31, 1477 (2006), in Stelzer et al., Science 305, 1007 (2004), in der DE 102 57 423 A1 und in der WO 2004/053 558 A1 .The SPIM technology is described, for example, in Stelzer et al., Optics Letters 31, 1477 (2006), in Stelzer et al., Science 305, 1007 (2004), in the DE 102 57 423 A1 and in the WO 2004/053558 A1 .

Ausgestaltungen von Probenkammern, in denen jeweils die abzubildende Probe angeordnet ist, sind beispielsweise aus der WO 2007 / 065711 A1, DE 10 2007 018 862 A1 und der US 5,363,190 A bekannt. Dabei können wahlweise Objektive dicht an, beziehungsweise in Fenster der Probenkammer gesetzt werden, um die in einer Flüssigkeit befindliche Probe zu beleuchten oder abzubilden. Eine mögliche Ausführung einer mit unterschiedlichen Objektiven verwendbaren Dichtung ist beispielsweise in der DE 11 2004 000 341 T5 beschrieben. Möglichkeiten zur Herstellung einer dichten Verbindung unterschiedlicher Objektive mit einem Probenraum unter Verwendung von Adaptern sind aus der US 6,024,454 A , der DE 693 03 791 T2 sowie der DE 94 20 563 U1 bekannt.Configurations of sample chambers, in which the sample to be imaged is arranged, are known, for example, from WO 2007/065711 A1, DE 10 2007 018 862 A1 and the US 5,363,190A known. Lenses can optionally be placed close to or in the window of the sample chamber in order to illuminate or image the sample in a liquid. A possible embodiment of a seal that can be used with different lenses is, for example, in DE 11 2004 000 341 T5 described. Possibilities for producing a tight connection of different lenses with a sample chamber using adapters are from US 6,024,454A , the DE 693 03 791 T2 as well as the DE 94 20 563 U1 known.

In 1 ist zunächst der grundsätzliche Aufbau eines SPIM-Mikroskops dargestellt. Das Licht einer Beleuchtungsquelle 1 wird über eine Beleuchtungsoptik 2 zu einem Lichtblatt geformt und auf eine Probe 3 gelenkt. Probe 3 und Lichtblatt befinden sich in der Fokusebene eines Abbildungsobjektivs 7. Die optische Achse des Abbildungsobjektivs 7 steht senkrecht zu der Richtung, aus der die Probe 3 beleuchtet wird. Die Beleuchtungsoptik 2 umfasst in der Regel mehrere optische Elemente, die das kohärente Licht der Beleuchtungsquelle 1 kollimieren und daraus ein Lichtblatt formen. Im Stand der Technik umfasst die Beleuchtungsoptik 2 in der Regel auch eine Zylinderlinse, deren flache Seite zur Probe 3 weist und deren gewölbte Seite in Richtung der Beleuchtungsquelle 1 weist.In 1 the basic structure of a SPIM microscope is shown first. The light from an illumination source 1 is formed into a light sheet via illumination optics 2 and directed onto a sample 3 . Sample 3 and light sheet are in the focal plane of an imaging lens 7. The optical axis of the imaging lens 7 is perpendicular to the direction from which the sample 3 is illuminated. The illumination optics 2 generally comprises a number of optical elements which collimate the coherent light from the illumination source 1 and form a sheet of light therefrom. In the prior art, the illumination optics 2 generally also include a cylindrical lens, the flat side of which points towards the sample 3 and the curved side of which points in the direction of the illumination source 1 .

Problemstellungproblem

Ein großer Vorteil der Lichtscheibenmikroskopie ist das Beobachten lebendiger Proben über einen längeren Zeitraum. Durch die einzigartige Geometrie der Optik, der Anforderung die Probe völlig frei bewegen zu können und die Probe unter physiologischen Bedingungen zu beobachten, hat sich ein besonderes Probenkammerdesign durchgesetzt. Die Probenkammer wird mit einer Flüssigkeit gefüllt (in der Regel Puffer wie z.B. PBS), die Probe wird zur Beobachtung in diese Flüssigkeit eingetaucht, ebenso wie das Detektionsobjektiv. Damit keine Flüssigkeit aus der Probenkammer austritt, muss die Schnittstelle zwischen Detektionsobjektiv und Probenkammer dicht abgeschlossen sein. Verschiedene Wassertauchobjektive haben aber ganz unterschiedliche geometrische Maße (2), alternativ zum Tauchobjektiv sollte auch noch die Möglichkeit bestehen, mit einem Luftobjektiv durch ein Deckglas in die Probenkammer zu beobachten.A major advantage of light sheet microscopy is the observation of living specimens over a longer period of time. Due to the unique geometry of the optics, the requirement to be able to move the sample freely and to observe the sample under physiological conditions, a special sample chamber design has prevailed. The sample chamber is filled with a liquid (usually a buffer such as PBS), the sample becomes Observation immersed in this liquid, as well as the detection lens. The interface between the detection lens and the sample chamber must be sealed so that no liquid escapes from the sample chamber. However, different water diving lenses have very different geometric dimensions ( 2 ), as an alternative to the diving lens, there should also be the option of observing the sample chamber through a cover glass with an air lens.

Das bedeutet, dass die Probenkammer speziell auf das Detektionsobjektiv konstruiert sein muss und ein einfacher Wechsel zwischen verschiedenen Detektionsobjektiven nicht möglich ist. Aber genau das ist notwendig. Bei verschiedenen Proben, und auch bei unterschiedlicher Probengröße, ist ein Wechsel des Objektivs unvermeidlich, da die Vergrößerung und/oder Numerische Apertur auf die Probe angepasst werden muss. Um ein universell einsetzbares Lichtscheibenmikroskop zu konstruieren, das mit ganz unterschiedlichen Proben genutzt werden kann, muss es eine einfache Möglichkeit geben die Objektive zu wechseln. Ansonsten muss für jedes Objektiv eine eigene Probenkammer konstruiert werden. Dies ist umständlich für den Anwender (er muss für jedes Objektiv immer die passende Kammer parat haben), sehr aufwendig (teilweise ist eine Neuberechnung des Optik Designs nötig) und teuer.This means that the sample chamber has to be specially designed for the detection objective and it is not possible to simply switch between different detection objectives. But that is exactly what is necessary. With different samples, and also with different sample sizes, changing the lens is unavoidable, since the magnification and/or numerical aperture must be adapted to the sample. In order to construct a universal light sheet microscope that can be used with very different samples, there must be an easy way to change the lenses. Otherwise, a separate sample chamber must be constructed for each objective. This is cumbersome for the user (he always has to have the right chamber ready for each lens), very time-consuming (sometimes the optics design has to be recalculated) and expensive.

2 zeigt mögliche verwendete Objektive in einem SPIM Aufbau.
2 (a) ist beispielsweise ein Luftobjektiv 5x NA 0.16, das im Probenraum ein Deckglas benötigt. 2b)-d) sind beispielhaft Wassertauchobjektive mit einer NA 1.0 und unterschiedlicher Vergrößerung: (b) 20x, (c) 40x und (d) 63x. 2 shows possible lenses used in a SPIM setup.
For example, 2 (a) is an air objective 5x NA 0.16, which requires a coverslip in the sample chamber. 2b)-d) are examples of water immersion lenses with an NA 1.0 and different magnifications: (b) 20x, (c) 40x and (d) 63x.

Lösungsolution

Das dargestellte Problem wird durch die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs gelöst.
Bevorzugte Weiterbildungen sind in den abhängigen Patentansprüchen aufgeführt.The problem presented is solved by the features of the independent patent claim.
Preferred developments are listed in the dependent patent claims.

Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur SPIM Mikroskopie, mit

  • - einer Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine kohärentes Licht abstrahlende Beleuchtungslichtquelle 1 und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe 3 in einer Beleuchtungsrichtung mit einem Lichtblatt über ein Beleuchtungsobjektiv,
  • - einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht in einer Detektionsrichtung, das von der Probe 3 abgestrahlt wird,
  • - einer Abbildungsoptik, die die Probe 3 über ein Abbildungsobjektiv 7 in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet,
  • - wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs 7 oder einer definierten Ebene in der Nähe des geometrischen Fokus des Abbildungsobjektivs 7 im Wesentlichen eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv 7 eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblattes in einem von Null verschiedenen Winkel, bevorzugt senkrecht, schneidet.
Das Mikroskop umfasst eine Probenkammer 10 für die SPIM Mikroskopie, die mindestens ein lichtdurchlässiges Fenster in Detektionsrichtung und/ oder Beleuchtungsrichtung aufweist. Die Probenkammer 10 wird mit einer Flüssigkeit gefüllt, in der die Probe 3 angeordnet ist oder angeordnet werden kann.The invention relates to a microscope for SPIM microscopy, with
  • - an illumination device, comprising an illumination light source 1 emitting coherent light and an illumination beam path for illuminating a sample 3 in an illumination direction with a light sheet via an illumination objective,
  • - a detection device for detecting light in a detection direction, which is emitted by the sample 3,
  • - an imaging optics, which images the sample 3 via an imaging objective 7 in an imaging beam path at least partially onto the detection device,
  • - wherein the light sheet is essentially flat in the focus of the imaging lens 7 or a defined plane in the vicinity of the geometric focus of the imaging lens 7 and wherein the imaging lens 7 has an optical axis which extends to the plane of the light sheet at an angle other than zero, preferably perpendicular , cuts.
The microscope includes a sample chamber 10 for SPIM microscopy, which has at least one transparent window in the direction of detection and/or direction of illumination. The sample chamber 10 is filled with a liquid in which the sample 3 is or can be placed.

In mindestens einem lichtdurchlässigen Fenster ist eine Aufnahme, die mit einem Gewinde 8 versehen ist, vorgesehen, in die ein einschraubbarer Einsatz (Adapter 5) eingeschraubt ist. Dieser weist eine ringförmige Öffnung auf, in der ein Dichtungsring 6 eingebracht ist.In at least one translucent window there is a receptacle which is provided with a thread 8 and into which a screw-in insert (adapter 5) is screwed. This has an annular opening in which a sealing ring 6 is introduced.

Gegen den Dichtungsring 6 kann ein Objektiv 7 in Form eines Beleuchtungsobjektivs 7 oder eines Abbildungsobjektivs 7 gedrückt werden, um die Probenkammer 10 abzudichten. Dabei wird das Objektiv 7 mit einer Seitenfläche eines an seinem der Probenkammer 10 zugewandten Ende ausgebildeten Konus gegen den Dichtungsring 6 gedrückt.An objective 7 in the form of an illumination objective 7 or an imaging objective 7 can be pressed against the sealing ring 6 in order to seal off the sample chamber 10 . In this case, the objective 7 is pressed against the sealing ring 6 with a side surface of a cone formed at its end facing the sample chamber 10 .

Zur Erfindung gehört zudem ein Set verschiedener, an jeweils eine Geometrie unterschiedlicher Objektive 7 angepasster und in die Aufnahme einschraubbarer Adapter 5. Die Adapter 5 weisen zur Anpassung an unterschiedliche Objektive 7 unterschiedliche Innendurchmesser der ringförmigen Öffnung auf. Einer der Adapter 5 weist für den Einsatz von Trockenobjektiven in Richtung einer in der Probenkammer 10 befindlichen Probe 3 ein flüssigkeitsdichtes Deckglas 9 auf, während die anderen Adapter 5 des Sets für den Einsatz von Wassertauchobjektiven ausgebildet sind. The invention also includes a set of different adapters 5 that are each adapted to a geometry of different lenses 7 and can be screwed into the receptacle. The adapters 5 have different inside diameters of the annular opening for adaptation to different lenses 7 . One of the adapters 5 has a liquid-tight cover glass 9 for the use of dry objectives in the direction of a sample 3 located in the sample chamber 10, while the other adapters 5 of the set are designed for the use of water immersion objectives.

Anstatt jeweils die ganze Probenkammer 10 an das Detektionsobjektiv 7 anzupassen, wird erfindungsgemäß die Schnittstelle ausgetauscht.Instead of adapting the entire sample chamber 10 to the detection objective 7, the interface is exchanged according to the invention.

In einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung sind die Objektive 7 in Richtung der Probenkammer 10 zur Erzeugung eines Anpressdrucks an der Probenkammer 10 in Richtung der optischen Achse verschiebbar und arretierbar.In an advantageous embodiment of the invention, the lenses 7 can be displaced and locked in the direction of the sample chamber 10 in order to generate a contact pressure on the sample chamber 10 in the direction of the optical axis.

3 zeigt einen erfindungsgemäßen Objektivadapter 5 als Schnittstelle, in (a) als Seitenansicht des Objektivadapters 5, in (b) als Frontansicht des Objektivadapters 5. Der Mittenteil 13 bleibt frei bzw. lichtdurchlässig. 3(c) ist eine Anwendung des Objektivadapters 5 am Beispiel des ZEISS 63x NA 1.0 als Detektionsobjektiv 7.
Es ist ein Adapter 5 dargestellt, der passend zum Objektiv 7 ausgewählt ist und in die Probenkammer 10 eingeschraubt wird. Der jeweilige Adapter 5 enthält einen Kunststoff- oder Gummiring 6 und schließt dadurch dicht mit dem Detektionsobjektiv 7, hier beispielhaft das aus 2d), ab. Mit dem Adapter 5 erhält man die notwendige Flexibilität. So ist es möglich, Wassertauchobjektive unterschiedlicher Größe mit der Probenkammer 10 zu verwenden, es können auch Adapter 5 mit Deckgläsern 9 (oder auch ganz unterschiedlichen Glasdicken) eingesetzt werden. 3 shows a lens adapter 5 according to the invention as an interface, in (a) as a side view of the lens adapter 5, in (b) as a front view of the lens adapter 5. The middle part 13 remains free or translucent. 3(c) is an application of the lens adapter 5 using the example of the ZEISS 63x NA 1.0 as a detection lens 7.
An adapter 5 is shown, which is selected to match the objective 7 and is screwed into the sample chamber 10 . The respective adapter 5 contains a plastic or rubber ring 6 and thus closes tightly with the detection objective 7, here by way of example 2d ), away. With the adapter 5 you get the necessary flexibility. It is thus possible to use water immersion objectives of different sizes with the sample chamber 10, and adapters 5 with cover glasses 9 (or even completely different glass thicknesses) can also be used.

Für die hier vorgestellten Adapter 5 wird im Falle des Wassertauchobjektivs die Probenkammer 10 gegen das Detektionsobjektiv 7 gedrückt. Dabei übernimmt ein Kunststoffring 6, der auf das Objektiv 7 gequetscht wird, die Abdichtung. Außerdem sorgt er dafür, dass das Objektiv 7 nicht beschädigt wird. Beispielsweise gibt es vier verschiedene Adapter 5, für jedes Objektiv 7 einen eigenen, da die jeweilige Objektivgeometrie unterschiedlich ist. Einer der Adapter 5 hat anstatt der Apertur (Öffnung) für das Tauchobjektiv ein Deckglas 9 eingeschraubt (austauschbar), da er beispielsweise mit dem 5x Luftobjektiv funktionieren muss.For the adapter 5 presented here, the sample chamber 10 is pressed against the detection objective 7 in the case of the water immersion objective. A plastic ring 6, which is squeezed onto the lens 7, takes over the sealing. It also ensures that the lens 7 is not damaged. For example, there are four different adapters 5, one for each lens 7, since the respective lens geometry is different. One of the adapters 5 has a cover glass 9 screwed in (replaceable) instead of the aperture (opening) for the diving lens, since it has to work with the 5x air lens, for example.

In 4 ist eine SPIM Probenkammer 10 dargestellt, die lichtdurchlässige Fenster 11 aufweist. Entlang der optischen Achse 12 erfolgt die hier nicht dargestellte SPIM Beleuchtung.
An einer Seite der Probenkammer 10 ist in einem mittels eines Gewindes 8 einschraubbaren Einsatz 5 (Adapter 5) ein Objektiv 7 vorgesehen, das mittels des Dichtringes 6 fest und flüssigkeitsdicht in den Adapter 5 eingequetscht ist.In 4 a SPIM sample chamber 10 is shown, which has light-transmitting windows 11 . The SPIM illumination, not shown here, takes place along the optical axis 12 .
An objective 7 is provided on one side of the sample chamber 10 in an insert 5 (adapter 5) that can be screwed in by means of a thread 8, which objective is squeezed firmly and liquid-tightly into the adapter 5 by means of the sealing ring 6.

Da es sich beim Objektiv 7 hier beispielhaft um ein Luftobjektiv handelt, weist der Adapter 5 ein mit ihm verbundenes Deckglas 9 auf, das das Objektiv 7 vor der in der Probenkammer 10 befindlichen Flüssigkeit schützt.Since the objective 7 is, for example, an air objective, the adapter 5 has a cover glass 9 connected to it, which protects the objective 7 from the liquid in the sample chamber 10 .

Die Erfindung ist nicht allein auf das Detektionsobjektiv 7 beschränkt, sondern kann analog auch für die Beleuchtungsobjektive 7 verwendet werden.The invention is not limited solely to the detection lens 7, but can also be used analogously for the illumination lenses 7.

Ohne Einschränkung lässt es sich auch auf Einzellinsen wie Zylinderlinsen zur Erzeugung des Lichtblatts, die in einer entsprechenden Halterung- oder Fassung angebracht sind, anwenden.It can also be used without restriction on individual lenses such as cylindrical lenses for generating the light sheet, which are fitted in a corresponding holder or socket.

Dabei könnte auch ein Aufbau mit bis zu vier Objektiven 7, in die Probenkammer 10 eingetaucht, realisiert werden. Denkbar wäre auch ein Fall, dass die Probenkammer 10 fest ist und alle Objektive 7 (bis zu 4) in die Probenkammer 10 gefahren werden.A structure with up to four lenses 7 immersed in the sample chamber 10 could also be implemented. A case would also be conceivable in which the sample chamber 10 is fixed and all objectives 7 (up to 4) are moved into the sample chamber 10 .

Werden beispielsweise zwei Tauchobjektive in einem Winkel zu einander verwendet, muss auch mindestens eins der Objektive 7 bewegbar sein um die Dichtigkeit zu gewährleisten.If, for example, two diving lenses are used at an angle to one another, at least one of the lenses 7 must also be movable in order to ensure tightness.

Eine weitere Voraussetzung ist, dass die Verschraubung zwischen Adapter 5 und Probenkammer 10 dicht sein muss. Dies kann durch eine zusätzliche Dichtung oder andere bekannte Maßnahmen erfolgen.Another requirement is that the screw connection between the adapter 5 and the sample chamber 10 must be tight. This can be done by an additional seal or other known measures.

Da die Lichtscheibenmikroskopie überwiegend bei lebenden Proben 3 eingesetzt wird, ist es von Vorteil, wenn die Adapter 5 und Probenkammer 10 sterilisiert werden können. D.h. die Materialen müssen gängigen Sterilisations und Reinigungsmitteln (z.B. 70% Ethanol) widerstehen. Außerdem wäre es von Vorteil, wenn die Materialien autoklavierbar sind. Der Dichtungsring 6 sollte aus diesem Grund austauschbar sein, auch da der Kunststoff mit der Zeit porös wird.Since light sheet microscopy is mainly used with living samples 3, it is advantageous if the adapter 5 and sample chamber 10 can be sterilized. This means that the materials must withstand common sterilization and cleaning agents (e.g. 70% ethanol). It would also be advantageous if the materials could be autoclaved. For this reason, the sealing ring 6 should be replaceable, also because the plastic becomes porous over time.

Claims (3)

Mikroskop zur SPIM Mikroskopie, umfassend, - eine Beleuchtungseinrichtung, umfassend eine kohärentes Licht abstrahlende Beleuchtungslichtquelle (1) und einen Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung einer Probe (3) in einer Beleuchtungsrichtung mit einem Lichtblatt, über ein Beleuchtungsobjektiv (7); - einer Detektierungseinrichtung zur Detektierung von Licht in einer Detektionsrichtung, das von der Probe (3) abgestrahlt wird, - einer Abbildungsoptik, die die Probe (3) über ein Abbildungsobjektiv (7) in einem Abbildungsstrahlengang mindestens teilweise auf die Detektierungseinrichtung abbildet, - wobei das Lichtblatt im Fokus des Abbildungsobjektivs (7) oder einer definierten Ebene in der Nähe des geometrischen Fokus des Abbildungsobjektivs (7) eben ist und wobei das Abbildungsobjektiv (7) eine optische Achse aufweist, die die Ebene des Lichtblattes in einem von Null verschiedenen Winkel schneidet, - eine Probenkammer (10), die mit einer Flüssigkeit gefüllt wird, in der die Probe (3) angeordnet ist oder angeordnet werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass die - Probenkammer (10) in Detektionsrichtung und/oder in Beleuchtungsrichtung ein lichtdurchlässiges Fenster aufweist, wobei in mindestens einem lichtdurchlässigen Fenster eine Aufnahme mit einem Gewinde (8) vorhanden ist, - in die ein Adapter (5) eingeschraubt ist, - der eine ringförmige Öffnung aufweist, in der ein Dichtungsring (6) eingebracht ist, - gegen den ein Objektiv (7) in Form eines Beleuchtungsobjektivs (7) oder eines Abbildungsobjektivs (7) gedrückt werden kann, um die Probenkammer (10) abzudichten, - wobei das Objektiv (7) mit einer Seitenfläche eines an seinem der Probenkammer (10) zugewandten Ende ausgebildeten Konus gegen den Dichtungsring (6) gedrückt wird; - wobei das Mikroskop weiterhin ein Set verschiedener, an jeweils eine Geometrie unterschiedlicher Objektive (7) angepasster und in die Aufnahme einschraubbarer Adapter (5) umfasst, wobei - die Adapter (5) zur Anpassung an unterschiedliche Objektive (7) unterschiedliche Innendurchmesser der ringförmigen Öffnung aufweisen, - einer der Adapter (5) für den Einsatz von Trockenobjektiven in Richtung einer in der Probenkammer (10) befindlichen Probe (3) ein flüssigkeitsdichtes Deckglas (9) aufweist und - die anderen Adapter (5) des Sets für den Einsatz von Wassertauchobjektiven ausgebildet sind.Microscope for SPIM microscopy, comprising - an illumination device, comprising an illumination light source (1) emitting coherent light and an illumination beam path for illuminating a sample (3) in an illumination direction with a light sheet, via an illumination objective (7); - a detection device for detecting light in a detection direction, which is emitted by the sample (3), - imaging optics, which images the sample (3) at least partially onto the detection device via an imaging objective (7) in an imaging beam path, - wherein the light sheet is flat in the focus of the imaging lens (7) or a defined plane in the vicinity of the geometric focus of the imaging lens (7) and wherein the imaging lens (7) has an optical axis which intersects the plane of the light sheet at an angle other than zero, - a sample chamber (10), which is filled with a liquid, in which the sample (3) is or can be arranged, characterized in that the - sample chamber (10) has a light-transmitting window in the detection direction and/or in the direction of illumination, in at least one translucent window there is a receptacle with a thread (8), - in into which an adapter (5) is screwed, - which has an annular opening in which a sealing ring (6) is introduced, - against which an objective (7) in the form of an illumination objective (7) or an imaging objective (7) can be pressed to the sample chamber (10), - wherein the objective (7) is pressed against the sealing ring (6) with a side surface of a cone formed at its end facing the sample chamber (10); - wherein the microscope further comprises a set of different adapters (5) adapted to a geometry of different lenses (7) and screwable into the receptacle, wherein - the adapters (5) have different internal diameters of the annular opening for adaptation to different lenses (7). - one of the adapters (5) for the use of dry lenses has a liquid-tight cover glass (9) in the direction of a sample (3) located in the sample chamber (10) and - the other adapters (5) of the set for the use of water immersion lenses are trained. Mikroskop nach Anspruch 1, wobei die Probenkammer (10) einen austauschbaren Dichtungsring (6) aufweist.microscope after claim 1 , wherein the sample chamber (10) has an exchangeable sealing ring (6). Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei die Objektive (7) in Richtung der Probenkammer (10) zur Erzeugung eines Anpressdrucks an der Probenkammer (10) in Richtung der optischen Achse des Objektivs (7) verschiebbar und arretierbar sind.Microscope after one of Claims 1 and 2 , The lenses (7) being displaceable and lockable in the direction of the sample chamber (10) in order to generate a contact pressure on the sample chamber (10) in the direction of the optical axis of the lens (7).
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