DE102010025294B4 - Verfahren zur Isolierung paradontaler Stammzellen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Isolierung parodontaler Stammzellen, gekennzeichnet durch die Schritte: – Einbringen einer aus dem Alveolarknochen entnommenen Gewebeprobe in eine Nährlösung, – Kultivieren der Gewebeprobe bis eine Konfluenz von 80–85% erreicht ist, – Entnehmen der vitalen Zellen, – Zellsortierung der vitalen Zellen nach für die stammzellspezifischen Marker CD146 und/oder STRO-1 positiven Zellen, wobei die Gewebeprobe weder enzymatisch noch mechanisch zerkleinert ist oder wird.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung parodontaler Stammzellen.
• Parodontitis ist eine destruktive entzündliche Erkrankung des Parodontiums, gekennzeichnet durch die Zerstörung parodontalen Gewebes, nämlich des Desmodonts, des Wurzelzements, des Alveolarknochens (Os alveolare) und des Zahnfleischs (Gingiva) [1].
• Sobald Gewebe verloren ist, ist es das oberste Ziel der Parodontaltherapie, das erkrankte Gewebe, wenn und soweit möglich, in seine ursprüngliche Form, Architektur und Funktion zu bringen. Dies ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die eine Harmonisierung vieler Maßnahmen erfordert, sowohl auf zellulärer und molekularer Ebene [2]. Erfolgreiche parodontale Regeneration bedeutet die Bildung neuen gingivalen Bindegewebes, die Wiederherstellung von Knochen, und am das Einfügen neuer Bindegewebsfasern im neu gebildeten Zement auf der ehemals erkrankten Wurzeloberflächen [3–5].
• Es ist eine Vielzahl von Verfahren zur Regeneration des verloren gegangenen Gewebes angeregt worden, einschließlich der gesteuerten Geweberegeneration und die Anwendung von Wachstumsfaktoren sowie Knochen- und Schmelz-Matrix-Proteinen auf die Wurzeloberflächen [6–10]. Von der Verwendung dieser Faktoren wird eine Regeneration der Defekte durch Anregen der bei der Regeneration beteiligten zellulären Ereignisse erwartet. Jedoch führen die erwähnten Verfahren nur zu einer begrenzten Regeneration peridentalen Gewebes und zu inkohärenten und nicht vorhersehbaren klinischen Ergebnissen [11–13].
• Das parodontale Ligament (PDL) ist ein spezialisiertes, vaskuläres und hoch zelluläres Bindegewebe, das den Zement mit der Innenwand des Alveolarknochens verbindet und in erster Linie den Zahn in der Alveolartasche stützt. Die breite Palette von im PDL aufgefundenen Zellpopulationen umfasst Zementoblasten, Osteoblasten, Fibroblasten, Myofibroblasten, Endothelzellen, Nervenzellen und Epithelzellen neben einer kleineren Populationen von Vorläuferzellen oder Stammzellen. Das PDL spielt eine entscheidende Rolle bei der Zahnfunktion, der Homöostase und der Reparatur von beschädigtem Gewebe als Reaktion auf Parodontalerkrankungen oder mechanische Traumata [2, 14, 15].
• Stammzellen sind Vorläuferzellen, die durch ihre Fähigkeit sich selbst zu erneuern, sich zu differenzieren und spezialisierte Zellen zu produzieren, charakterisiert sind [16–19]. Es gibt zwei Hauptkategorien von Stammzellen: embryonale Stammzellen und adulte Stammzellen. Embryonale Stammzellen stammen aus Blastozysten von Säugetieren und haben die Fähigkeit, spezialisierte Gewebe aus den drei Keimblätter zu erzeugen: Mesoderm, Ektoderm und Endoderm. Allerdings sind die Isolierung und die Verwendung dieser Stammzellen technisch schwierig und ethisch sehr umstritten. Doch sind adulte (postnatale) Stammzellen in einer Reihe von Organen des menschlichen Körpers leicht zugänglich und in ethischer Hinsicht weniger problematisch [20–22]. Kürzlich wurde Zahngewebe, wie das Desmodont, die Zahnpulpa, die Zahnpapille und der Zahnfollikel als leicht zugängliche Quelle von adulten Stammzellen erkannt [20].
• Es ist bekannt, dass das menschliche PDL eine heterogene Population von Vorläuferzellen [23, 24] enthält die sich in vitro in Zementoblasten oder Osteoblasten [25–28] differenzieren und unter bestimmten Bedingungen in vitro mineralisierten Knoten bilden können [14, 23]. Diese Zellen sind verantwortlich für die Wahrung der Gewebehomöostase und spielen eine entscheidende Rolle bei der parodontalen Regeneration [25, 29]. Eine Studie identifiziert und charakterisiert menschliche PDL-abgeleitete mesenchymale Stammzellen als parodontale-Ligament-Stammzellen (PDLSCs) [30].
• Bemerkenswert ist, dass diese von Wurzeloberflächen von extrahierten Zähnen isolierten PDLSCs die Kompetenz zur Geweberegeneration und parodontalen Reparatur aufweisen [30–32]. Von PDLSCs wurde auch berichtet, dass diese eine unverwechselbare mesenchymale Stammzellpopulation auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, in vivo eine Zement-/PDL-ähnliches Gewebe zu erzeugen [30], im Gegensatz zur Dentin/Pulpa-ähnlichen Struktur und Lamellenknochen-/Knochenmark-ähnlichen Struktur, die durch deren Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) und Knochenmark-Stromazellen und mesenchymalen Stammzellen erzeugt werden [33–35]. PDLSCs haben zusätzlich eine höhere Proliferationsrate als Knochenmark-Stromazellen-Stammzellen (BMSSCs), mit einer längeren Lebensdauer und eine höhere Anzahl von Populationsverdopplungen in vitro. Das Vermögen von PDLSCs sich in andere Zelllinien zu entwickeln und ähnliche Eigenschaften wie das parodontale Ligament zu entwickeln wurde durch ihre Eigenschaft bewiesen, sich in vitro in Zementoblast-ähnliche Zellen, Adipozyten und Kollagen-bildende Zellen zu differenzieren und ihre Fähigkeit, in vivo eine Zement-/PDL-ähnliche Struktur zu erzeugen. PDLSCs exprimieren mit anderen dentalen Stammzellen vergleichbare mesenchymale Stammzell-Marker, wie Stro-1 und CD146, und exprimieren ein hohes Maß an Scleraxis, einen Sehnen-spezifischen Transkriptionsfaktor, der nur schwach in DPSCs oder BMSSCs [30, 36] exprimiert wird.
• Diese adulten Stammzellen sind daher eine ideale und leicht zugängliche Quelle für Zellbasiertes Tissue Engineering im dentalen Bereich [37].
• Aus Li et al. 2009 [41] ist ein Verfahren zur Isolierung von parodontalen Ligament Stammzellen aus einer Zahnwurzel bekannt.
• Die Nutzung des Potenzials der PDLSCs zum Erzeugen von funktionellem parodontalen Gewebe stellt einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz für die Regeneration parodontalen Gewebes unter dem Dach des sich entwickelnden Gebiet des Tissue Engineering dar [38, 39].
• Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein besonders einfaches Verfahren zur Isolierung, Vermehrung und/oder Identifizierung parodontaler Stammzellen zu schaffen.
• Diese Aufgabe wird durch das Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1 gelöst. Die Unteransprüche geben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung wieder.
• Material und Methoden:
• Isolierung und Kultivierung des Gewebes:
• Zur Isolierung und Kultivierung parodontaler Stammzellen wurden gesunde Weisheitszähne oder Prämolare wurden ausgewählt. Die Proben wurden sofort nach der Extraktion in 50 ml sterile Polypropylen-Röhrchen mit modifiziertem Minimum Essential Medium (MEM) Eagle Alpha (Sigma-Aldrich Deutschland) ergänzt mit Antibiotika (100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin) und 1% Amphotericin (Biochrom AG).
• Unter der Sterilbank wurden unter völlig aseptischen Bedingungen Anteile des Alveolarknochens, die an der Wurzeloberfläche befestigt waren, gelöst und in kleine Stücke geschnitten. Der abgetrennte Knochensplitter wurde in modifiziertem Minimum Essential Medium Eagle Alpha (Sigma-Aldrich Deutschland), ergänzt mit 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 1% Amphotericin (Biochrom AG), eingetaucht und fünfmal mit diesem gespült. Die daraus resultierenden Knochensplitter wurden dann in eine Kulturflasche (Sarstedt AG) gegeben und zum Anheften an deren Boden darin belassen. Danach wurde modifiziertes Minimum Essential Medium Eagle Alpha (Sigma-Aldrich Deutschland) mit 15% fötalem Kälberserum, 400 mmol/ml L-Glutamin (Biochrom AG), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 1% Amphotericin (Biochrom AG), vorsichtig zugegeben, um nicht die adhärenten Knochensplitter zu lösen. Die Kolben wurden dann bei 5% Kohlendioxid im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Die Zellen wuchsen aus dem Gewebe und der erste Mediumwechsel wurde nach einer Woche durchgeführt. Die Flaschen wurden in regelmäßigen Abständen alle 24 Stunden mittels Phasenkontrast-Mikroskopie überprüft. Das Kulturmedium wurde dann 3-mal pro Woche gewechselt bis die Zellen etwa 80–85% Konfluenz erreicht hatten.
• Zellbehandlung:
• Nachdem die Zellen 80–85% Konfluenz erreicht hatten wurden die Zellen wie folgt kultiviert:
  Die Zellen wurden mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Biochrom AG) gewaschen. 2 ml 0,10% Trypsin wurden zugegeben und die Zellen darin für 1 min inkubiert, um die Zellen aus der Flasche zu lösen. Um die Wirkung von Trypsin zu stoppen wurden 5 ml der Kultur-Medium mit fötalem Kälberserum (FCS) hinzugefügt. Das die Zellen enthaltende Medium wurde in ein steriles Falcon-Röhrchen (Sarstedt AG) überführt und bei 2.000 Upm für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt. Die Zellen in den Röhrchen wurden in 2 ml modifiziertem Minimum Essential Medium Eagle Alpha (Sigma-Aldrich Deutschland), ergänzt mit 15% fötalem Kälberserum, 400 mmol/ml L-Glutamin (Biochrom AG), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 1% Amphotericin (Biochrom AG), resuspendiert. Die Zellen wurden anschließend gezählt. Ein Teil wurde der ersten durchflusszytometrischen Analyse unterzogen und die verbleibenden Zellen bei 30 Zellen/cm² in jeder Kulturflasche ausgesät. 10 ml Medium wurden dann in jedem Kolben zugegeben. Die Kolben wurden dann bei 5% Kohlendioxid im Brutschrank bei 37°C inkubiert und die Zellen zum Wachsen belassen. Wiederum wurde das Kulturmedium 3-mal pro Woche gewechselt.
• Erste durchflusszytometrische Analyse:
• Die Zellen wurden durch Durchflusszytometrie mittels CD14-, CD34- und CD45-Antikörpern (alle von Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland), CD146/MUC18 (von eBioscience, NatuTec GmbH) und STRO-1 (BioLegend, San Diego, CA) charakterisiert. Die Bindung der primären Antikörper und der entsprechenden Isotyp-Kontrolle wurde nach Standardprotokollen durch rFcR Blocking Reagent (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland) durchgeführt und mit FACSCalibur E6370 und FACSComp 5.1.1 Software (Becton Dickinson) ausgewertet. Die Kurven wurden für die Marker auf den Zellen ausgedruckt.
• Magnetic activated cell sorting (MACS):
• Nach der Zellbehandlung erreichten die Zellen wiederum 80–85% Konfluenz, wenn sie der magnetischen Zellsortierung (MACS) unterzogen wurden. Nachdem das Medium abgezogen wurde, wurden die Zellen mit PBS gewaschen. 2–3 ml Trypsin (Verdünnung 1:10) wurde zu jeder Kulturflasche hinzugegeben und der Kolben wurden dann bei 5% Kohlendioxid im Brutschrank bei 37°C für 5 min inkubiert. 3 ml Medium (mit FCS) wurde dann jeder Flasche hinzugegeben, um Trypsin zu deaktivieren. Abgelöste Zellen wurden dann in ein neues Falcon-Röhrchen (Sarstedt AG) pipettiert und 5 min bei 1500 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das daraus resultierende Zellpellet in 10 ml frischem Medium resuspendiert. Die Zellzahl wurde bestimmt. Die Zellsuspension wurde erneut für 5 min bei 1.500 U/min zentrifugiert und der Überstand verworfen.
• MACS-Methode:
• Das Magnetfeld-Vorrichtung (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland) wurde mit Ethanol desinfiziert. Die Säule wurde anschließend mit 500 μl MACS-Puffer gespült. Der Puffer bestand aus 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS. Zwei Röhrchen wurden unter der Säule angeordnet: eine zum Waschen, die andere für die negative Fraktion.
• Nach dem Hinzufügen des rFCR-Blocking Reagenz (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland) zu den Zellen für 5 min, wurden die Zellen mit dem Antikörper CD 146 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers für 15 min bei 4°C inkubiert. Das 10-fache Volumen PBS wurde zur Zellsuspension hinzugegebene und für 10 min bei 1700 U/min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das daraus resultierende Zellpellet in 500 μl MACS-Puffer (weniger als 10⁸ Zellen) oder 1.000 μl MACS-Puffer (mehr als 10⁸ Zellen) resuspendiert. Die Zellen wurden dann in die Säule überführt und das Röhrchen für die negative Fraktion darunter gesetzt. Die Säule wurde dreimal mit 500 μl MACS-Puffer gewaschen. Danach wurde die Säule aus dem Magnetfeld genommen, die positive Zellen mit 1 ml Puffer gewaschen und mit einem Kolben in ein steriles Röhrchen gedrückt (Röhrchen für die positive Fraktion). Die positiven Zellen wurden dann mit Puffer auf ein Volumen von 5 ml aufgefüllt. Eine zweite Zellzahlbestimmung wurde dann durchgeführt werden, während die Zellsuspension für 10 min bei 1.700 U/min bei 4°C zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde dann verworfen, die Zellen im Medium resuspendiert und die Zellen in neuen Flaschen bei einer Konzentration von 30 Zellen/cm² ausgesät.
• Zweite durchflusszytometrische Analyse:
• Die Zellen wurden durch Durchflusszytometrie mittels CD14-, CD34- und CD45-Antikörpern (alle von Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland), CD146/MUC18 (von eBioscience, NatuTec GmbH) und STRO-1 (BioLegend, San Diego, CA) charakterisiert. Die Antikörper CD90 und CD105 (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) wurden zu diesen hinzugefügt. Die Bindung der primären Antikörper und die entsprechenden Isotypen-Kontrollen wurde nach Standardprotokollen durch Verwendung des rFcR Blocking Reagens (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland) durchgeführt und mit FACSCalibur E6370 und FACS-Comp 5.1.1 Software (Becton Dickinson) ausgewertet. Kurven wurden für die Marker auf den Zellen gezeichnet.
• Ergebnisse:
• Das Protokoll zeigte bemerkenswerte Ergebnisse in Bezug auf die gewählten Kriterien für die angenommene parodontale Stammzellenisolierung und -charakterisierung.
• Phasenkontrast-Mikroskopie:
• Eine Woche nach Aussäen des Gewebes nach der oben beschriebenen Methode wurden die Zellkulturen in regelmäßigen Abständen alle 24 Stunden durch Phasenkontrast-Mikroskopie überprüft.
• Nach der ersten Anheftungsphase begannen die Zellen aus den Gewebemassen auszuwachsen.
• Die auswachsenden Zellen zeigten fibroblastisches Aussehen und koloniebildende Fähigkeiten. Die anhaftenden klonogenen Zellhaufen der Fibroblasten-ähnlichen Zellen waren ähnlich denen für andere mesenchymale Stammzell-Populationen [35] (siehe 1).
• Erste durchflusszytometrische Analyse:
• Nach Durchführung der ersten durchflusszytometrischen Analyse waren alle Zellen negativ für die Zelloberflächenmarker CD14, CD34 und CD45. Hinsichtlich der Zelloberflächenmarker CD146 und Stro-1-Zellen zeigten diese jedoch positive Ergebnisse:
  CD146 22.35%
  Stro-1 24.83%
  CD146/Stro-1 0.25%
• Zweite durchflusszytometrische Analyse:
• Nach Durchführung der zweiten durchflusszytometrischen Analyse der Zellen waren wiederum alle Zellen negativ für die Zelloberflächenmarker CD14, CD34 und CD45. Hinsichtlich der Zelloberflächenmarker CD146 und Stro-1-Zellen konnten erneut positive Werte gezeigt werden:
  CD146 35.25%
  Stro-1 22.99%
  CD146/Stro-1 10.48%
  CD90/CD 105 95.70%
• Diskussion:
• Während der Embryogenese, wird das Peridontium, also der Zahnhalteapparat, durch eine Interaktion zwischen Zellen des Zahnfollikels gebildet, die vorwiegend aus dem Ektomesenchym abgeleitet sind.
• Im reifen Parodontium sind viele verschiedene Zellpopulationen vorhanden, einschließlich Zementoblasten, Osteoblasten, Fibroblasten, Myofibroblasten, Endothelzellen, Nervenzellen und Epithelzellen. Neben diesen wurden kürzlich kleinere Populationen von Vorläufer- oder Stammzellen identifiziert [30]. Von diesen Vorläufer- oder Stammzellpopulationen wurde berichtet, dass diese an Blutgefäße angrenzend, also perivaskulär vorhanden sind und viele der typischen zytologischen Merkmale von Stammzellen, einschließlich geringer Größe, Reaktionsfähigkeit auf stimulierende Faktoren und langsamer Zykluszeiten, aufweisen. Es wird angenommen, dass im Falle von Verletzungen des Parodonts diese mesenchymalen Stammzellen vermutlich in Richtung der terminalen Differenzierung aktiviert werden und die Reparatur oder unter idealen Bedingungen sogar die Regeneration von Gewebe ermöglichen [40].
• Der vorgebliche Stammzellmarker, STRO-1, zum Isolieren und Reinigen von Stammelten des Knochenmarkstromas, wird auch von menschlichen PDLSCs exprimiert [30]. Von besonderer Bedeutung ist das Fehlen des hämatopoetischen Markers CD 14 (normalerweise auf Monozyten und Makrophagen), CD45 (auch als gemeinsames Leukozytenantigen bezeichnet) und CD34 (normalerweise auf hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen sowie im Endothel) oder auf PDLSCs oder Stammzellen des Knochenmarkstromas. Außerdem exprimieren PDLSCs den perivaskulären Zellmarker CD146 wie Stammzellen des Knochenmarkstromas, woraus sich ein perivaskulärer Ursprung dieser Zellen ergibt [30, 40]. Diese Expression wurde ausgenutzt, um menschliche mesenchymale Stammzellen mittels immunmagnetischer oder fluoreszenzaktivierter Auswahl zu isolieren [30].
• Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass parodontale Stammzellen (PDSCs), die aus Alveolarknochen gewonnen wurden, für die Zelloberflächenmarker CD146 und STRO-1 positiv waren, hingegen negativ für CD 14, CD34 und CD45. Die Zellen, die mit den Markern für CD90/CD105, die klassische Marker für mesenchymale Stammzellen sind, waren ebenfalls stark positiv. All dies zusammen bestätigt die Identität der isolierten und erweiterten parodontalen Stammzellen.
• In der aktuellen Studie wurde der perivaskuläre Zellmarker CD146 verwendet, um die Stammzellen magnetisch zu isolieren. Der Stammzellmarker STRO-1, der zum Isolieren und zum Reinigen von PDLSCs wie in der vorangegangenen Studie von Seo et al. 2004 [30] verwendet wurde, kam nicht zum Einsatz. Der Hauptgrund für diese Entscheidung war, dass der STRO-1-Antikörper ausschließlich als IgM vorhanden ist und daher zwei Probleme aufweist. Auf der einen Seite sind IgM-Antikörper in ihrer Bindung an ihre Antigene weniger spezifisch und daher bei der Auswahl der Zielzellen während der magnetischen Zellsortierung weniger genau und auf der anderen Seite verursacht der IgM-STRO-1-Antikörper aufgrund seiner Tendenz Pentamere zu bilden eine Verstopfung des magnetischen Filters durch Ausbildung von Zellaggregaten. Hingegen ist der CD146 Antikörper als IgG gegen den CD146-Oberflächenmarker der Stammzellen bekannt und sollte diese beiden Probleme lösen.
• Mesenchymale Stammzellen zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, klonogene Cluster von adhärenten fibroblastischen-ähnlichen Zellen oder Fibroblasten-Kolonie-bildenden Einheiten [35] zusammen mit der Aussicht einer extensiven Proliferation in vitro [40] zu bilden, Unter dem Umkehrmikroskop zeigten die Zellkulturen in dieser Studie diese Merkmale deutlich (siehe 1).
• Das Protokoll der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich in einigen Aspekten von der vorgenannten Studie Seo et al. 2004 [30].
• Im Anschluss an die Vorbereitung des Gewebes für die Kultur erfolgt keine enzymatische Verdauung mit Dispase oder Collagenase-I, noch wurden die Zell-Suspensionen durch Siebe mechanisch zerkleinert. Der andere wesentliche Unterschied ist, dass das in der vorliegenden Anmeldung verwendete Medium keinen Zusatz von Ascorbinsäure-2-phosphat aufweist, allerdings die fungizide Substanz Amphotericin hinzugefügt wurde.
• Die vorliegende Erfindung offenbart eine neue Quelle für die Isolierung parodontaler Stammzellen. In der vorangegangenen Studie von Seo et al. 2004 [30] wurde zur Frage der Isolierung von PDLSCs nur eine einzige Komponente des Zahnhalteapparates, nämlich das parodontale Ligament, angesprochen.
• Der Alveolarknochen bildet einen zentralen Bestandteil des Zahnhalteapparates. Außerdem kann er leicht mit minimal-invasiven Verfahren und natürlich ohne Extraktion des Zahnes entnommen werden, um dessen parodontales Ligament zu erhalten. Die Isolierung von Stammzellen aus dieser neuen Quelle, wie im Protokoll beschrieben, bildet daher eine vielversprechende und nur gering invasive Alternative.
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Claims (6)

1. Verfahren zur Isolierung parodontaler Stammzellen, gekennzeichnet durch die Schritte: – Einbringen einer aus dem Alveolarknochen entnommenen Gewebeprobe in eine Nährlösung, – Kultivieren der Gewebeprobe bis eine Konfluenz von 80–85% erreicht ist, – Entnehmen der vitalen Zellen, – Zellsortierung der vitalen Zellen nach für die stammzellspezifischen Marker CD146 und/oder STRO-1 positiven Zellen, wobei die Gewebeprobe weder enzymatisch noch mechanisch zerkleinert ist oder wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung ein Blutserum und ein Antibiotikum enthält.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung ein Fungizid enthält.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die vitalen Zellen kein CD14, CD34 und/oder CD45 exprimieren.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die entnommenen Zellen mittels magnetische Zellsortierung (MACS) gereinigt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung mittels Magnetpartikelgekoppelter anti-CD146-IgG-Antikörper erfolgt.

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