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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung nach dem Anspruch 1.
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Stand der Technik
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Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Vorrichtungen zum Messen von Kraftgrößen bekannt. Allerdings existieren kaum Vorrichtungen, mit denen sich sehr kleine Kraftgrößen messen lassen, insbesondere im Bereich der Biophysik in der Größenordnung von 1 oder 10 pN. Solche Kraftgrößen zu messen kann allerdings interessant sein, insbesondere um die Leistungsfähigkeit von DNA-getriebenen mikromotorischen Einrichtungen zu überprüfen oder die Wechselwirkungen zwischen biologisch relevanten Liganden zu bestimmen. Die gängigen Methoden messen Kräfte zwischen oberflächengebundenen Objekten. Es ist jedoch wünschenwert, Kraftmessungen in Lösung, ohne Oberflächenbindung durchzuführen. Shroff et al. (Shroff, H., Reinhard, B. M., Siu, M., Agarwal, H., Spakowitz, A., Liphardt, J.: Biocompatible force sensor with optical readout and dimensions of 6 nm3 in Nano Letters 5.150–15.14, Jg. 2005) hat mithilfe von Förster-Resonanzenergietransfer (FREI) Kräfte in oligonukleotid-basierten Strukturen bestimmt. Allerdings konnten mit der dort vorbestellten Methode nur Kräfte gemessen werden, die intrinsisch in kurzen, zirkularisierten DNA-Strängen auftreten. Die Methode eignet sich daher nicht, um allgemein Kräfte auf der pN-Skala messen zu können.
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Offenbarung der Erfindung
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Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung anzugeben, mit welcher Kräfte auf der pN-Skala, insbesondere in der Größenordnung 1 bis 10 pN gemessen werden können, wobei eine möglichst universelle Anwendbarkeit für verschiedene mechanische Konstellationen gegeben sein soll.
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Die Aufgabe wird mit einer Vorrichtung nach Anspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung. Die Vorrichtungen können vorteilhaft sowohl an Oberflächen als auch in Lösung angewendet werden.
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Die Erfindung bietet den Vorteil, dass durch die Verwendung eines Fluorophors mit Akzeptor an zwei Elementen eine hochauflösende Wegerfassung geschaffen werden kann. Durch Ermitteln der relativen Position der beiden Elemente, d. h. der entsprechenden Weggrößen, mithilfe von bevorzugt einer Mehrzahl von Fluorophoren oder einer Mehrzahl von Akzeptoren an dem ersten Element oder an dem zweiten Element ist es bei Kenntnis der Federkonstante einer zwischen den Elementen angeordneten Feder möglich, eine Kraft sehr genau zu bestimmen. Eine weitere bevorzugte Möglichkeit neben der Verwendung einer Feder ist der Aufbau einer Balkenwaagenanordnung mit den zwei Elementen. Auf diese Weise kann, bei Kenntnis einer Kraft, die mit einem bestimmten Hebelarm auf die Balkenwaage wirkt, eine entsprechende Gegenkraft bei Kenntnis des Kraftangriffspunktes der Gegenkraft bestimmt werden. Für die Verfahren und Vorrichtungen zur Ermittlung der relativen Position, d. h. der Weggröße zwischen den zwei Objekten werden folgende Merkmale bei erfindungsgemäßen oder bevorzugten Ausführungsformen eingesetzt.
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Besonders bevorzugt sind Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung, die in der Lage sind, Weggrößen zur erfassen oder Abstände zwischen zwei Objekten im Raum zu erfassen, die kleiner sind als 2 nm, besonders bevorzugt kleiner als 1 nm. Typische Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung erreichen eine Dynamik, d. h. größtmögliche, erfassbare Weggröße von mehr als 10 nm, bevorzugter mehr als 20 nm. Damit werden die Bereiche der herkömmlichen FREI-Messung deutlich verlassen.
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Entscheidend ist das Vorsehen weiterer Bausteine für FREI-Paare oder für Metall-Nanopartikel, deren Plasmonen-Resonanzfrequenz sich in Abhängigkeit ihrer Umgebung ändern. Durch das Vorsehen der weiteren Partikel, d. h. eines weiteren Fluorophors, eines weiteren Akzeptors oder eines weiteren Metall-Nanopartikels, wird erreicht, dass eine Auflösung verbessert werden kann, besonders bevorzugt durch die Anwendung in der Funktionsweise eines Messschiebers.
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Erfindungsgemäße Verfahren erfassen ein Zusammenwirken des Flourophors mit dem Akzeptor, um einen Indikator für eine relative Position der beiden Elemente zu ermitteln. Dies geschieht wie im Stand der Technik bekannt durch Erfassen der Fluoreszenz, bevorzugt mit einem Fluoreszenzspektrometer und besonders bevorzugt mit einem Fluoreszenzmikroskop, das die Beobachtung einzelner Messvorrichtungen ermöglicht. Bevorzugt ist die Erfassungseinrichtung ausgebildet, so dass zumindest zwei Wellenlängen auflösbar sind. Aus der so ermittelten Fluoreszenz der FREI-Paare kann auf eine Positionierung der einzelnen Partikel (Fluorophor, Akzeptor oder bei der Metall-Nanopartikel-Anwendung: Metall-Nanopartikel) geschlossen werden.
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Besonders bevorzugt wird, dass auf dem ersten Element eine Mehrzahl von Fluorophoren und auf dem zweiten Element eine Mehrzahl von Akzeptoren angeordnet sind. Dadurch wird die Auflösung oder die Dynamik weiter vergrößert. Eine Vergrößerung der Dynamik, d. h. des maximalen Messbereichs für Weggrößen, wie insbesondere eine Abstandsänderung, wird erreicht, indem zumindest auf einem Element in Abständen von etwa mindestens 10 nm wiederholt Fluorophore oder Akzeptoren angeordnet werden. Besonders bevorzugt wird auf diese Weise erreicht, dass eine Messung von Abstandsänderungen im Bereich zwischen 1 und 100 nm unter Ausnutzung von FREI ermöglicht wird.
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Bei bevorzugten Ausführungsformen sind die Mehrzahl von Fluorophoren und die Mehrzahl von Akzeptoren auf den jeweiligen Elementen jeweils auf einer Trajektorie angeordnet, deren Kontur einer zu erfassenden Weggröße entspricht. Die zu erfassende Weggröße ist vorzugsweise eine definierte Kurve, beispielsweise eine Gerade oder ein Kreisbogenabschnitt. Kreisbogenabschnitte eignen sich dazu, Winkelverschiebungen oder Drehungen zwischen den Elementen zu messen.
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Vorzugsweise umfasst die Mehrzahl von Fluorophoren unterschiedliche Fluorophore oder die Mehrzahl von Akzeptoren unterschiedliche Akzeptoren. Auf diese Weise wird erreicht, dass sich nicht wiederholend Fluoreszenz-Bilder ergeben, welche schwer auseinanderzuhalten sind. Durch die Verwendung von unterschiedlichen FREI-Paaren wird erreicht, dass die Dynamik und die Auflösung stark erhöht werden können.
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Vorteilhafterweise sind die Fluorophoren und die Akzeptoren ausgewählt und angeordnet, sodass aus der erfassten Wechselwirkung der Fluorophoren und der Akzeptoren eine relative Position des ersten Elements zu dem zweiten Element eindeutig ermittelbar ist. Besonders bevorzugt ist die relative Position innerhalb eines vorbestimmten Messbereichs eindeutig ermittelbar. Der Messbereich hat vorzugsweise eine Auflösung von maximal 2 nm, noch bevorzugter maximal 1 nm und noch bevorzugter 0,5 nm oder 0,1 nm. Weitere typische Ausführungsformen der Erfindung haben vorzugsweise einen Messbereich von mehr als 15 nm, besonders bevorzugt mehr als 20 nm oder mehr als 50 nm. Eine Möglichkeit einer solchen Anordnung ist, zur Erhöhung der Auflösung eine Anordnung nach der Funktionsweise eines Messschiebers zu schaffen, wobei FREI-Paare derart auf den beiden Elementen angeordnet werden, sodass bei einer Verschiebung der Elemente relativ zueinander mehrere FREI-Paare gleichzeitig Wechselwirken, jeweils in anderen Bereichen ihres Messbereichs.
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Analog ist eine solche Anordnung auf Trajektorien für Metall-Nanopartikel vorteilhaft. Ebenso sind vorteilhafte Ausführungsformen von der Erfindung umfasst, welche Metall-Nanopartikel auf den beiden Elementen angeordnet haben, wobei die Auswahl der Metall-Nanopartikel und die Anordnung der Metall-Nanopartikel derart erfolgt, dass aus der erfassten Wechselwirkung der Metall-Nanopartikel eine relative Position des ersten Elements zu dem zweiten Element eindeutig ermittelbar ist, insbesondere innerhalb des Messbereichs, für welchen die oben genannten bevorzugten Grenzen gelten.
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Vorzugsweise sind der Fluorophor und der Akzeptor für einen Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer geeignet. Dies bietet den Vorteil einer leicht zu erfassenden Wechselwirkung, für welche verschiedene Paarungen mit verschiedenen abgegebenen Farbspektren bekannt sind, sodass durch Kombinationen mehrerer FREI-Paare eine Genauigkeitsverbesserung oder Messbereichsvergrößerung erreicht werden kann.
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Bevorzugte Metall-Nanopartikel für Ausführungsformen der Erfindung weisen die Eigenschaft auf, dass sich ihre Plasmonen-Resonanzfrequenz in Abhängigkeit ihrer Umgebung ändern, insbesondere in Abhängigkeit der Anwesenheit eines weiteren Metall-Nanopartikels. Vorzugsweise wird durch die Erfassungseinrichtung ein Streuspektrum der Metall-Nanopartikel erfasst. Metall-Nanopartikel, welche für typische Ausführungsformen der Erfindung benutzt werden sind Silber-Nanopartikel, welche ein Streuspektrum mit einem Maximum bei 450 nm aufweisen. Bei zwei benachbarten Silber-Nanopartikeln verschiebt sich das Maximum zu 550 nm. Durch die Analyse des Streuspektrums der Nanopartikel lässt sich daher eine Aussage darüber machen, wie die Nanopartikel relativ zueinander angeordnet sind. Durch Vorsehen von verschiedenen oder mehreren Nanopartikeln kann auf diese Weise analog zu der vorherigen Beschreibung der FREI-Paare eine Weggrößenmessung an zwei Elementen vorgenommen werden. Besonders bevorzugt umfasst die Mehrzahl von Metall-Nanopartikeln unterschiedliche Metall-Nanopartikel. Dabei bedeutet unterschiedlich unterschiedliche Größe oder eine unterschiedliche Art von Metall. Vorzugsweise sind die Metall-Nanopartikel wiederum so ausgewählt und dann in Elementen angeordnet, dass aus der erfassten Wechselwirkung der Metall-Nanopartikel eine relative Position des ersten Elements zu dem zweiten Element eindeutig ermittelbar ist, insbesondere in dem Messbereich.
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Bevorzugte Elemente der typischen Ausführungsformen der Erfindung sind länglich ausgebildet oder im Wesentlichen starr ausgebildet. Dabei bedeutet im Wesentlichen starr, dass bei Einsatz der Elemente zum Erfassen einer Weggröße keine das Messergebnis beeinträchtigenden Verformungen der Elemente geschehen.
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Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung weisen Elemente auf, welche DNA umfassen, besonders bevorzugt sind die Elemente zumindest im Wesentlichen aus doppelsträngiger DNA aufgebaut. Besonders bevorzugt bestehen die Elemente aus doppelsträngiger DNA und den genannten Partikeln wie FREI-Partikeln oder Metall-Nanopartikeln. Die doppelsträngige DNA für das Element bietet den Vorteil, dass sie vergleichsweise starr ist. Besonders bevorzugt werden Kombinationen von doppelsträngiger DNA, die im Sinne eines DNA-Origamis zusammengebaut sind. Zur Erläuterung des Begriffs DNA-Origami wird auf den Artikel
Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M.: "Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.", Nature 459, 414–418 (2009) verwiesen. Die DNA-Origami-Struktur bietet den Vorteil, dass sie besonders starr ausgeführt werden kann. Besonders bevorzugt sind die Elemente mit einer äußeren Form aufgebaut, die eine Kontur entsprechend der zu erfassenden Weggröße aufweist. Entlang dieser Kontur sind vorzugsweise Partikel (FREI-Partikel oder Metall-Nanopartikel) angeordnet.
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Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Elemente mittels einer Kupplung aus einzelsträngiger DNA gekoppelt. Dies bietet den Vorteil, dass die Elemente für die beabsichtigte Messung vorpositioniert werden können. Einzelsträngige DNA bietet dabei den Vorteil, dass sie einer Verformung einen definierten Widerstand entgegensetzt, sodass durch die einzelsträngige DNA, die Messung nicht verfälscht wird. Einzelsträngige DNA kann zwischen den Elementen auch als Feder bekannter Federkonstante eingesetzt werden (vgl. Artikel Liedl, T. Högberg, B., Tytell, J., Ingber, D. E., Shih, W. M., Self-assembly of threedimensional prestressed tensegrity structures from DNA, Nature Nanotechnology, in press Aus der relativen Verschiebung der Elemente zueinander lassen und der bestimmten Weggröße lassen sich somit Kraftgrößen errechnen.
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Vorzugsweise werden die Elemente mit einer Kupplung, beispielsweise einer einzelsträngigen DNA an einem Fixpunkt gehalten, bevorzugt durch Anbindung an eine Oberfläche, insbesondere eine Glasoberfläche. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in Lösung durchgeführt. Bei bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens wird die Messung oder die Erfassung der Fluoreszenz oder der Streuung der Metall-Nanopartikel wiederholt durchgeführt, um Veränderungen oder Geschwindigkeiten zu ermitteln. Vorzugsweise werden die DNA-Origami Strukturen mit einem Selbstassemblierungsprozess hergestellt, wobei die Fluorophoren und die Akzeptoren während dieses Prozesses in die Struktur integriert werden. Analog werden Metall-Nanopartikel während des Selbstassemblierungsprozesses in die DNA-Origami Struktur integriert. Besonders bevorzugt sind die beiden Elemente steif aus DNA-Origami Strukturen aufgebaut, die parallel aneinander entlang gleiten können. Dies bietet den Vorteil einer besonders effizienten Messung entlang einer Dimension.
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In dieser Anmeldung ist der Ausdruck Weggröße allgemein zu verstehen, so sind unter Weggrößen alle Arten von Weggrößen, insbesondere auch Winkel und Abstände eingeschlossen.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen einer Position eines ersten Elements relativ zu einem zweiten Element. Diese Bestimmung kann auch als eine Bestimmung einer Weggröße aufgefasst werden.
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Für die erfindungsgemäßen Verfahren und bevorzugten Verfahren gelten die oben im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Vorrichtungen und bevorzugten Vorrichtungen erläuterten Merkmale analog, wobei sich analoge Vorteile ergeben.
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Durch die geeignete Anordnung einer Vielzahl von FREI Paaren (bzw. Fluorophor-Quencher Paaren) unterschiedlicher Farben oder von Nanopartikeln entlang einer »Skala« kann eine präzise Messung von Abstandsänderungen in Bereichen zwischen einem und fünfhundert Nanometern ermöglicht werden. Die Skala kann aus zwei oder mehr steifen Elementen bestehen, die parallel gegeneinander verschoben werden können. Analog zur Funktionsweise eines Messschiebers kann jede Auslenkung der Elemente gegeneinander eine einzigartige Kombination opponierender FREI-Paare (oder Nanopartikelpaare) bewirken. Steht ein Farbstoff einem geeigneten Energietransferpartner gegenüber, wird seine Fluoreszenz gequencht. Ein frei stehender Farbstoff fluoresziert hingegen. Über das gemessene Fluoreszenzspektrum der angeregten Fluorophore – sowohl in Lösung als auch auf Einzelmolekülbasis – kann dann die Verschiebung der beiden Elemente gegeneinander bestimmt werden. Ebenso kann eine Verschiebung des Streuspektrums und somit der Elemente gegeneinander detektiert werden, wenn Nanopartikel unterschiedlicher Größen und Eigenschaften aneinander vorbei gleiten (im Folgenden wird das Prinzip nur noch Anhand der FREI-Paare erläutert). Wenn die Fluorophore an beliebige Positionen der steifen Elemente angebracht werden können, kann die Dynamik der Messanordnung frei bestimmt werden. Je weiter die beiden letzten FREI-Paare in Verschiebungsrichtung der parallelen Elemente auseinander liegen, desto größer ist die Dynamik. Die Auflösung lässt sich durch die Dichte und Anzahl der FREI-Paare bestimmen. Da die Spektren der einzelnen Farbstoffe als Superposition detektiert werden, lässt sich durch geeignete Kalibrierung des Systems jeder Position des spektralen Maximums eine eindeutige Entfernung zuordnen. Es können also auch Abstände aufgelöst werden, die wesentlich kleiner als die Abstände zwischen den FREI-Paaren in Verschiebungsrichtung sind.
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Vorzugsweise sind die beiden Elemente gekoppelt. Zusätzlich zu der Kupplung oder auch ohne Kupplung sind die zwei Elemente vorzugsweise über eine Feder verbunden, die zumindest im Wesentlichen aus einzelsträngiger DNA besteht. Der Vorteil ist, dass die elastischen Eigenschaften von einzelsträngiger DNA vergleichsweise gut erforscht sind, sodass die einzelsträngige DNA als Referenz für zu messende Kräfte verwendet werden kann. Dies kann geschehen, indem die einzelsträngige DNA auf einer Seite einer Balkenwaagenanordnung angeordnet wird oder indem die einzelsträngige DNA mithilfe der zwei Elemente quasi ”in Serie” mit der zu messenden Kraft angeordnet wird.
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Bei einer Balkenwaagenanordnung der beiden Elemente ist vorzugsweise das zweite Element als ein Widerlager für das erste Element angeordnet. Auf diese Weise kann das zweite Element als Referenz verwendet werden. Dies ist insbesondere deshalb vorteilhaft, da die erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugweise in Lösung, insbesondere in wässriger Lösung verwendet wird. Ein unabhängiger Gegenstand der Erfindung bildet eine Vorrichtung nach dem nebengeordneten Anspruch 7. [oben ändern!]
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert, wobei die Zeichnungen zeigen:
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1 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum Erfassen einer Kraftgröße in einer ersten bevorzugten Ausführungsform schematisch in einer perspektivischen Ansicht;
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2 zeigt eine weitere erfindungsgemäße Vorrichtung in einer schematischen perspektivischen Ansicht;
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3 zeigt eine weitere Vorrichtung in einer bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform in einer schematischen dreidimensionalen Ansicht;
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4 zeigt die Wirkungsweise der Ausführungsform der 3 in einer schematischen Seitenansicht genauer;
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5 zeigt eine erfindungsgemäße Abwandlung der Ausführungsform der 3 in einer schematischen Seitenansicht; und
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6 zeigt eine weitere erfindungsgemäße Abwandlung der Ausführungsform der 3 in einer schematischen Ansicht.
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Bevorzugte Ausführungsformen
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In der 1 ist eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Erfassen einer Kraftgröße gezeigt. Die Vorrichtung umfasst mehrere DNA-Doppelstränge 2, wobei ein DNA-Doppelstrang jeweils durch einen dickeren Schlauch in der 1 schematisch dargestellt ist. Die DNA-Doppelstränge 2 bilden ein erstes Element 3 und ein zweites Element 4, die vergleichsweise steif sind. Dabei bedeutet ”vergleichsweise steif”, dass die Elemente im Rahmen der vorgesehenen Verwendung der Vorrichtung nur eine geringförmige oder keine Verformung erfahren. Die beiden Elemente 3 und 4 sind mittig durch zwei einzelsträngige DNA 6 und 7 gekoppelt und bilden auf diese Weise eine Balkenwaagen-Anordnung. Mit der Anordnung der 1 lassen sich Kraftwirkungen verschiedener Bindungspaare unmittelbar miteinander vergleichen. So können die Bindungskräfte eines ersten Paares 10 und 11 mit den Bindungskräften eines zweiten Paares 12 und 13 verglichen werden. Da die Hebelarme bekannt sind, kann bei bekannter Kraftwirkung zwischen den Einzelteilen des Paares 12 und 13 auf die Anziehungskräfte zwischen dem Paar 10 und 11 geschlossen werden.
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Es sollte angemerkt werden, dass aufgrund der geringen Länge der einzelsträngigen DNA 6 und 7 als Kupplungspunkte der Balkenwaage eine Verformung der einzelsträngigen DNA 6 und 7 nur eine untergeordnete Rolle spielt.
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Zur Überprüfung der relativen Position der beiden Elemente 3 und 4 ist ein Fluorophor 20 und eine Akzeptor 21 vorgesehen. Je nach relativer Position des Fluorophors 20 und des Akzeptors 21 wird durch dieses Paar eine Fluoreszenz ausgestrahlt oder nicht. Daher bedient sich die Erfindung vorzugsweise der FREI-Technik, wobei geeignete FREI-Paare beispielsweise Alexa 488 und BHQ-1 (Fluorophor und Quencher) sind. Daneben oder zusätzlich ist es auch möglich, ein Paar aus zwei Fluorophoren einzusetzen. Fluorophore oder Quencher, wie die genannten, oder beispielsweise auch Alexa 546 können bezogen werden von der Firma biomers.net GmbH, Söflinger Straße 100, 89077 Ulm, Deutschland. Ebenso können von dieser Firma Thiol-Verbindungen bezogen werden. Die Thiol-Verbindungen werden insbesondere benötigt, um Metall-Nanopartikel an DNA anzubinden.
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Es wird bereits an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass anstelle des Fluorophor-Akzeptor-Paares 20 und 21 ein Paar von Metall-Nanopartikeln verwendet werden kann, deren Interaktion erfasst werden kann.
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In der 2 ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Vorrichtung der 1 gezeigt. Dabei wird bei der Beschreibung nicht noch einmal auf alle Einzelheiten eingegangen, insbesondere zeigen gleiche Bezugszeichen gleiche oder ähnliche Teile und werden nicht noch einmal explizit erläutert.
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Im Unterschied zu der Anordnung der 1 wird bei der Balkenwaagen-Anordnung der 2 auf einer Seite der Balkenwaage eine einzelsträngige DNA 25 verwendet, deren elastische Eigenschaften weitgehend bekannt sind. Dabei ist auch bekannt, welche Kraft F durch diese einzelsträngige DNA 25 auf die Balkenwaagen-Anordnung, insbesondere auf die Enden der Hebel-förmigen Elemente 3 und 4 ausgeht.
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In der 3 wird eine molekulare Federwaage gezeigt, die eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Kraftmessung ist. Wiederum werden für ähnliche Teile gleiche Bezugszeichen verwendet, so werden mit dem Bezugszeichen 2 beispielsweise doppelsträngige DNA bezeichnet. Es sollte angemerkt werden, dass nicht jede einzelne doppelsträngige DNA, welche in der 3 durch einen Zylinder dargestellt ist, auch mit einem Bezugszeichen 2 versehen ist.
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Die doppelsträngigen DNA 2 der 3 bilden wiederum ein erstes Element 3 und ein zweites Element 4, wobei das erste Element 3 als Rahmen ausgebildet ist, in dem das zweite Element 4 parallel zu der Längsachse des Rahmens, welche durch das erste Element 3 gebildet wird, angeordnet ist. Wiederum wird die Kraftwirkung eines Paares 12, 13 mittels einer Feder, welche durch eine einzelsträngige DNA 25 gebildet wird, untersucht. Die Funktionsweise der Ausführungsform der 3 wird anhand der 4 bis 6, welche auch verschiedene Möglichkeiten der Instrumentierung dieser Ausführungsform mit FRET-Paaren zeigen, näher erläutert. Die einzelsträngige DNA 26 hat (wie auch die einzelsträngige DNA 25) nicht die Eigenschaften einer Hookeschen-Feder. Allerdings ist das Federverhalten bekannt und so ermöglicht die aus der einzelsträngigen DNA 26 gebildete Feder eine Aussage über die Kraftgröße, welche durch das Paar 12, 13 ausgeübt wird, indem eine Verschiebung des zweiten Elements 4 relativ zu dem ersten Element 3 erfasst wird. Dies geschieht vorzugsweise mittels FREI-Paaren oder Metall-Nanopartikel-Interaktion.
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Um den üblichen FREI-Radius von 3 bis 9 nm zu verlassen und auch größere Wegänderungen erfassbar zu machen, werden modifizierte FREI-Anordnungen geschaffen, welche im Wesentlichen darauf basieren, dass mehrere FREI-Paare verwendet werden, wobei einzelne FREI-Paare auch mehrere Akzeptoren anstelle nur eines Akzeptors aufweisen können. Dies wird anhand der 4 bis 6 näher erläutert.
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In der 4 ist die Anordnung der 3 schematisch gezeigt, wobei allerdings eine andere zu untersuchende Struktur dargestellt ist.
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In der 4 wird eine Struktur 28 untersucht, wobei diese Struktur 28 in zeitlich aufeinander folgenden Zuständen gezeigt ist. Links ist die Struktur 28 in einem Ausgangszustand gezeigt. Nach Zugabe einer Reaktionsflüssigkeit oder durch anderen Einfluss von außen, verändert die Struktur 28 ihre Erscheinungsform, wobei sie aufgrund der durch die einzelsträngige DNA 26 ausgeübten Kraft F in die Länge gezogen wird. Da die elastischen Eigenschaften der einzelsträngigen DNA 26 bekannt sind, kann aus einer Verschiebung des zweiten Elements 4 relativ zum ersten Element 3 auf die Kraft F geschlossen werden. Ebenso können mehrere gleiche der Strukturen 28 in Serie angeordnet sein. Nach dem vorteilhafterweise verwendeten Selbstassemblierungsprozess des gesamten Objektes inklusive der Teile mit den Bezugszeichen 2, 3, 4, 26, 28, 31, 32, 33, 36, 37, 38 hat das Objekt seine finale Konformation erreicht. Durch Auslesen des Farbspektrums lässt sich sofort angeben, gegen welche Kraft, die durch die einzelsträngige DNA 26 ausgeübt wird, sich die Strukturen 28 gebildet haben.
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Die Verschiebung des zweiten Elements 4 gegenüber dem ersten Element 3 wird mit Fluoreszenz-Quencher-Paaren unter Ausnützung von FREI vorgenommen. Drei Fluorophore 31, 32 und 33 sind auf dem ersten Element 3 angeordnet. Die Fluorophore 31, 32 und 33 haben jeweils unterschiedliche Fluoreszenz-Farben, falls sie fluoreszieren. In der Position, welche das zweite Element 4 in der linken Hälfte der 4 einnimmt, ist jedem Fluorophor 31, 32, 33 jeweils ein Quencher 36, 37 oder 38 gegenüberliegend angeordnet. Die Quecher 36, 37 und 38 sind auf dem zweiten Element 4 angeordnet. Allerdings ist nur ein Quencher 36, jedoch zwei Quencher 37 und sogar drei Quencher 38 vorgesehen, wobei in der ersten Position jeweils der linke Quencher 37 oder 38 gegenüber der Fluorophore 32 oder 33 zu liegen kommt.
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Bei der Zustandsänderung der Struktur 28, wie sie in der rechten Hälfte der 4 dargestellt ist, wird das zweite Elemente 4 relativ zu dem ersten Element 3 nach links verschoben, wobei der Quencher 36 und beide Quencher 37 aus einem Bereich für eine Interaktion jeweils mit den Fluorophoren 31 und 32 verschoben werden. Auf diese Weise kommt es zu einem Fluoreszieren der Fluorophoren 31 und 32, wobei dieses Fluoreszieren erfasst wird. Allerdings ist der dritte der Quencher 38 noch nahe genug an dem Fluorophor 33 für eine Interaktion, sodass der Fluorophor 33 nicht fluoresziert. Auf diese Weise kann anhand der Fluoreszenzfarben, welche die Fluorophore 31 und 32 ausstrahlen und anhand des Fehlens des Farbspektrums des Fluorophors 33 festgestellt werden, dass das zweite Element 4 relativ zu dem ersten Element 3 die in der 4 gezeigte Position haben muss. Anhand dieser Bestimmung kann aufgrund der bekannten elastischen Eigenschaften der einzelsträngigen DNA 26 die Kraft F bestimmt werden.
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In der 5 ist eine weitere mögliche Anordnung von Fluorophor-Quencher-Paaren 31 bis 32 und 36 bis 38 gezeigt, wobei wiederum für gleiche oder ähnliche Teile gleiche Bezugszeichen verwendet werden. Es sollte angemerkt werden, dass dies auch auf die 6 zutrifft, wobei in den 5 und 6 die Struktur 28 für eine bessere Übersichtlichkeit nicht dargestellt ist.
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Neben einer Fluorophor-Quencher Wechselwirkung kann auch zwischen zwei Fluorophoren Energie übertragen werden. Anstelle von Quenchern 36, 37, 38 können diese Positionen vorteilhaft auch mit Fluorophoren besetzt werden, deren Absorptionsspektren auf die Emissionsspektren der Fluorophore 31, 32, 33 abgestimmt sind. Dies bietet den besonderen Vorteil, dass vor der Messung festgestellt werden kann, ob alle Farbstoffe auch am Objekt vorhanden sind. Dies geschieht vorzugsweise bei typischen Ausführungsformen durch gezieltes Anregen der unterschiedlichen Fluorophore mit Licht der geeigneten Wellenlänge.
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Die Anordnung der 5 eignet sich besonders für große Verschiebungen.
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In der 6 ist eine weitere mögliche Anordnung mit zahlreichen Fluorophoren gezeigt, Obwohl hier nur vier unterschiedliche Farbstoffe (31, 33, 36, 38) angebracht sind, lässt sich jeder Verschiebung ein charakteristisches Farbfrequenzspektrum zuordnen. Die kurze Reichweite des FREI-Energieübergangs (<10 nm) ist auf eine beliebig weite Verschiebungsstrecke übersetzt worden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Shroff, H., Reinhard, B. M., Siu, M., Agarwal, H., Spakowitz, A., Liphardt, J.: Biocompatible force sensor with optical readout and dimensions of 6 nm3 in Nano Letters 5.150–15.14, Jg. 2005 [0002]
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M.: ”Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.”, Nature 459, 414–418 (2009) [0017]
- Liedl, T. Högberg, B., Tytell, J., Ingber, D. E., Shih, W. M., Self-assembly of threedimensional prestressed tensegrity structures from DNA, Nature Nanotechnology, in press [0018]
