DE102009047549B4 - Method and means for patient and malignant specific detection of malignant cells - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur spezifischen Detektion von Malignomzellen eines Individuums mit den Schritten: a.) Hochauflösende Darstellung amplifizierter Genomabschnitte in einer isolierten Tumorprobe mittels Fine-Tiling Array, ggf. nach vorangegangener Gesamtgenomanalyse mittels einer CGH-Analyse (Comparative Genomic Hybridization), b.) Vervielfältigung (bevorzugt per PCR) und anschließende Sequenzierung der Fusionsbereiche der aneinander fusionierten amplifizierten Genomabschnitte innerhalb des Amplikons mit den Amplikon-Fusionsstellen (AFS), c.) Bereitstellen einer Probe, welche es erlaubt, die Fusionsbereiche in genomischer DNA malignomzellspezifisch und patientenindividuell zu amplifizieren oder spezifisch die Fusionsbereiche zu detektieren.Process for the production of a diagnostic agent for the specific detection of malignant cells of an individual with the following steps: a.) High-resolution representation of amplified genome sections in an isolated tumor sample using a fine-tiling array, if necessary after a previous total genome analysis using a CGH analysis (Comparative Genomic Hybridization), b .) Duplication (preferably by PCR) and subsequent sequencing of the fusion areas of the mutually fused amplified genome sections within the amplicon with the amplicon fusion sites (AFS), c.) Providing a sample which allows the fusion areas in genomic DNA to be specific for malignant cells and for each patient amplify or specifically detect the fusion regions.
Description
Die Erfindung betrifft die Malignomdiagnostik, insbesondere die Diagnostik von Malignomen mit amplifizierten (in mehreren Kopien vorliegenden) Genomabschnitten, welche Onkogene enthalten können, wie z. B. MYCN (Chromosom 2p24-25) in humanen Neuroblastomen.The invention relates to malignant diagnostics, in particular the diagnosis of malignancies with amplified (in multiple copies) genome sections which may contain oncogenes, such as. B. MYCN (chromosome 2p24-25) in human neuroblastomas.
Der Nachweis minimaler Mengen an Malignomzellen innerhalb gesunden Gewebes (z. B. innerhalb des Knochenmarkes) ist ein wichtiger diagnostischer Baustein unter Anderem im Rahmen der Untersuchung auf das Vorliegen einer minimalen Resterkrankung (Minimal residual disease = MRD) vornehmlich hämatologischer Malignome aber auch solider, bösartiger Tumore geworden. Der möglichst sensitive und spezifische, quantitative Nachweis einer minimalen Resterkrankung gibt einen Hinweis auf das Ansprechverhalten der malignen Zellen auf die bis zu diesem Zeitpunkt durchgeführte Therapie. Die PCR stellt eine der grundlegenden Methoden im Rahmen dieser Diagnostik dar. Bezogen auf eine generell zu erwartende Tumorspezifität kann man 2 verschiedene Formen der genomischen MRD-PCR Methoden unterscheiden. 1.) Die klonspezifische PCR in Rearrangementbereichen von Genen, die für Immunglobulinketten kodieren und 2.) PCRs, die über einen Translokationsbereich (z. B. BCR/ABL) gelegt werden und somit ebenfalls klonspezifisch sind, falls es sich nicht um eine Keimbahnmutation handelt. Während die erste Methode ausschließlich für hämatologische Malignome einzusetzen ist, da nur in diesen Zellen die klonspezifischen Rearrangements in den Immunglobulinkettengenen stattfinden, ist die zweite Methode grundsätzlich auch für jedes andere Malignom denkbar, wenn entsprechende Translokationen vorliegen. Sind die entsprechenden Translokationspunkte genau definiert, wie bei den exakten Translokationen, die notwendig sind, um sinnvolle Fusionsproteine zu generieren, können spezifische PCRs gut etabliert werden Ein Nachteil dieser Methode Liegt in der schlechten Abgrenzbarkeit der Translokationspunkte, wenn diese Translokationspunkte nicht genau definiert sind. Aufgrund der limitierten Reaktionsweite der PCR Reaktion ist es dann schwer eine funktionierende PCR zu etablieren, da es keine Methode gibt, die genau genug ist die Translokationsfusionsbereiche zuvor mittels Screening einzugrenzen. Die Erarbeitung entsprechender, individueller PCRs ist daher zeitaufwendig und kostspielig, da viele Primer nötig sind, um sich an den exakten Translokationspunkt heranzutasten. Weitere Methoden zur MRD-Diagnostik umfassen die quantitative Bestimmung möglichst malignomspezifischer Genexpressionsmuster. Der Nachteil besteht in der nicht genau zu kalkulierenden Malignotmzellspezifität der Expression vieler Gene im Vergleich zu den gesunden, umliegenden Geweben und einem dadurch bedingten erheblichen Unsicherheitsfaktor, vor allem bei niedriger Malignomzellzahl. Der Nachweis minimaler Mengen von Malignomzellen ist außerdem von großem Interesse bei der Erstdiagnose bösartiger Erkrankungen, um eine initiale, minimale Infiltration anderer Gewebe (z. B. Knochenmark oder Lymphknoten) bzw. minimale Mengen von in peripherem Blut zirkulierenden Malignomzellen zu detektieren. Dieser Nachweis kann einen direkten Einfluss auf die notwendige, zu planende Therapie und damit die Heilungschancen des individuellen Patienten haben. Ebenso ist es von Interesse, ob in Stammzell- bzw. Knochenmarkpräparaten, die für eine eventuelle autologe Transplantation/Retransfusion des erkrankten Indivuduums benutzt werden können, minimale Mengen von Malignomzellen enthalten sind.The detection of minimal amounts of malignant cells within healthy tissue (eg within the bone marrow) is an important diagnostic building block in the investigation of the presence of minimal residual disease (MRD), mainly hematological malignancies but also more solid, malignant Become tumors. The most sensitive and specific, quantitative detection of a minimal residual disease gives an indication of the response of the malignant cells to the therapy performed up to that point. PCR is one of the basic methods in this diagnosis. Based on a general tumor specificity one can distinguish 2 different forms of genomic MRD-PCR methods. 1.) The clone-specific PCR in rearrangement regions of genes coding for immunoglobulin chains and 2.) PCRs which are placed over a translocation region (eg BCR / ABL) and thus are also clone-specific, if it is not a germline mutation , While the first method is to be used exclusively for hematological malignancies, since only in these cells the clone-specific rearrangements take place in the immunoglobulin chain genes, the second method is in principle also conceivable for any other malignancy, if appropriate translocations are present. If the corresponding translocation points are precisely defined, as with the exact translocations necessary to generate meaningful fusion proteins, then specific PCRs can be well established. A disadvantage of this method is the poor definition of the translocation points, if these translocation points are not well defined. Due to the limited reaction range of the PCR reaction, it is difficult to establish a functioning PCR, since there is no method that is accurate enough to screen the translocation fusion regions beforehand. The elaboration of appropriate, individual PCRs is therefore time-consuming and costly, since many primers are necessary in order to approach the exact translocation point. Further methods for MRD diagnostics include the quantitative determination of possible malignant-specific gene expression patterns. The disadvantage consists in the malignant cell specificity of the expression of many genes, which can not be exactly calculated, in comparison with the healthy, surrounding tissues and a consequent significant uncertainty factor, especially with low malignant cell numbers. Detection of minimal amounts of malignant cells is also of great interest in the initial diagnosis of malignant disease to detect initial, minimal infiltration of other tissues (e.g., bone marrow or lymph nodes) or minimal amounts of peripheral blood circulating malignant cells. This proof can have a direct influence on the necessary, planned therapy and thus the chances of recovery of the individual patient. Likewise, it is of interest whether minimal amounts of malignant cells are contained in stem cell or bone marrow preparations that can be used for a possible autologous transplantation / retransfusion of the diseased indivudual.
Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren anzugeben, welches eine malignomzellspezifische und patientenindividuelle Erkennung von Tumorzellen erlaubt.The object of the invention is to provide a method which allows malignoma cell-specific and patient-specific detection of tumor cells.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren welches es ermöglicht malignomzellspezifische und patientenindividuelle Diagnostika (Proben oder Sonden) für Malignomzellen bereitzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es vorteilhaft absolut malignomzellspezifische und patientenidividuelle DNA Sequenzen basengenau zu detektieren und diese für diagnostische Anwendungen, z. B. in einem hoch sensitiven PCR Assay (AFS-PCR) zu verwenden.According to the invention, the object is achieved by a method which makes it possible to provide malignoma cell-specific and patient-specific diagnostics (samples or probes) for malignant cells. The method according to the invention advantageously makes it possible to detect absolutely malignom cell-specific and patient-specific DNA sequences with base accuracy and to use them for diagnostic applications, eg. B. in a highly sensitive PCR assay (AFS-PCR) to use.
Die Erfindung baut dabei auf der Erkenntnis auf, dass viele Malignome amplifizierte Genomabschnitte (ampGA) enthalten. Unter ampGA werden Bereiche des Genoms (eine bestimmte DNA-Sequenz) verstanden, welche in mehr als zwei Kopien pro haploidem Genom (häufig 4 bis über 120) in einer Zelle vorliegen. Diese ampGA liegen in sogenannten „Amplikons” meist in streng hintereinander aufgereihter Form (repetitiv) vor. Ein Amplikon ist somit das Gesamtgebilde, das aus den vielen Kopien eines (oder mehrerer unterschiedlicher) Genomabschnittes aufgebaut ist. Falls mehrere genomische Abschnitte amplifiziert sind können diese in unterschiedlichen Formen aneinander fusioniert sein, so dass z. T. sehr komplexe Amplikons entstehen. Die Amplikons können in separaten, kleinen, zirkulären DNA Strukturen, den sogenannten „Double-minute Chromosomen (dMin)” vorliegen, oder an unterschiedlicher Stelle wieder als sogenannte „Homogenously staining regions (HSRs)” in das Genom reintegriert sein. In Malignomen sind häufig Genomabschnitte amplifiziert, die Onkogene enthalten (z. B. MYCN in humanen Neuroblastomen, c-myc in Brustkrebs, AURKA in Blasenkarzinomen, etc.). Der genetische Inhalt der amplifizierten Bereiche spielt für die vorliegende Erfindung und die Etablierung einer AFS-PCR allerdings keine Rolle.The invention is based on the finding that many malignancies contain amplified genome segments (ampGA). By ampGA are meant regions of the genome (a particular DNA sequence) present in more than two copies per haploid genome (often 4 to more than 120) in a cell. These ampGA are in so-called "amplicons" usually in a stringed one behind the other lined up form (repetitive). An amplicon is thus the overall structure made up of the many copies of one (or more different) genome section. If several genomic sections are amplified they may be fused together in different forms, so that z. T. very complex amplicons arise. The amplicons can be present in separate, small, circular DNA structures, the so-called "double-minute chromosomes (dMin)", or reintegrated at different sites as so-called "homogenously staining regions (HSRs)" into the genome. In malignancies, genome segments that contain oncogenes (eg MYCN in human neuroblastomas, c-myc in breast cancer, AURKA in bladder carcinomas, etc.) are frequently amplified. However, the genetic content of the amplified regions is immaterial to the present invention and the establishment of AFS PCR.
Der oder die ampGA sind bei jedem Malignom und damit auch bei jedem Patienten unterschiedlich groß und haben dementsprechend unterschiedliche telomerseitige und centromerseitige Grenzen. Ein Amplikon enthält zwischen 4 bis zu > 120 Kopien der ampGA. Die Amplikon-Fusionsstellen (AFS) sind die Sequenzabschnitte innerhalb eines Amplikons, an denen die Kopien der ampGA aufeinander folgen. D. h. die Amplikon-Fusionsstelle (AFS) ist die Stelle in der Sequenz eines Amplikons, an der auf das letzte Nukleotid eines ampGA wieder das erste Nukleotid des nächsten ampGA folgt. Dadurch entsteht über diese AFS eine DNA Sequenzfolge (Fusionsbereich), die in keiner Zelle zu finden ist, die diese ampGA nicht enthält. Der Fusionsbereich ist der Sequenzbereich (bevorzugt mit einer Länge von 30 bis 300 Nukleotiden), welcher die AFS umgibt und diese beinhaltet. Da es sich bei Tumorerkrankungen vornehmlich um klonale Erkrankungen handelt, sind die AFS und damit die Fusionsbereiche in jeder Malignomzelle aber nicht in gesunden Zellen zu finden. Die AFS und damit die Fusionsbereiche sind in jedem Malignom unterschiedlich und damit absolut malignomspezifisch und patientenindividuell. The or the ampGA are different in each malignancy and thus also in each patient and therefore have different telomerseitigen and centromeric boundaries. An amplicon contains between 4 to> 120 copies of the ampGA. The amplicon fusion sites (AFS) are the sequence segments within an amplicon where the copies of the ampGA follow one another. Ie. the amplicon fusion site (AFS) is the site in the sequence of an amplicon where the last nucleotide of an ampGA is followed by the first nucleotide of the next ampGA. This creates a sequence of DNA sequences (fusion region) that can not be found in any cell that does not contain this ampGA. The fusion region is the sequence region (preferably 30 to 300 nucleotides in length) surrounding and including the AFS. Since tumor diseases are predominantly clonal diseases, the AFS and thus the fusion regions in each malignant cell are not found in healthy cells. The AFS and thus the fusion areas are different in each malignancy and therefore absolutely malignom-specific and patient-specific.
Die Insertionsstellen an denen ein Amplikon potentiell wieder in das Genom reintegriert ist, sind zwar genauso spezifisch und patientenindividuell, wie die AFS der hintereinander geschalteten DNA Abschnitte, jedoch lassen diese sich nur schwer identifizieren, da diese nur einmal in der Zelle vorliegen. Die AFS liegen jedoch in mehreren Kopien vor, so dass durch Bestimmung der telomer- und centromerseitigen Grenzen der ampGA mittels CGH und Tiling-Array auf die AFS gescreent werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht einerseits die Herstellung eines Diagnostikums zur spezifischen Detektion von Malignomzellen eines Individuums und anderseits die darauf aufbauende Bereitstellung eines malignomzellspezifischen und patientenindividuellen Nachweisverfahrens.Although the insertion sites at which an amplicon is potentially reintegrated into the genome are indeed as specific and patient-specific as the AFS of the DNA segments connected in series, they are difficult to identify because they are present only once in the cell. However, the AFS are available in multiple copies, so that by determining the telomere and centromeric boundaries of the ampGA can be screened for the AFS using CGH and tiling array. On the one hand, the method according to the invention makes it possible to produce a diagnostic agent for the specific detection of malignant cells of an individual and, on the other hand, to provide a malignoma cell-specific and patient-specific detection method based thereon.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch folgende Schritte aus:
- a.) Hochauflösende Darstellung amplifizierter Genomabschnitte (ampGA) in einer isolierten Tumorprobe mittels Fine-Tiling Array, bevorzugt nach Detektion des/der ampGA durch Gesamtgenomanalyse, bevorzugt durch CGH (Comparative Genomic Hybridization), falls diese nicht schon zuvor bekannt sind,
- b.) Vervielfältigung, bevorzugt per PCR und anschließende Sequenzierung der Fusionsbereiche,
- c.) Bereitstellen einer Probe (eine Sonde oder ein Primerpaar) welche es erlaubt, spezifisch den Fusionsbereich zu detektieren oder zu amplifizieren,
- d.) bevorzugt Anwendung des Primerpaars in einer PCR (nachfolgend AFS-PCR), bevorzugt einer Realtime PCR, welche den Fusionsbereich bevorzugt überlappt und vorteilhaft die Möglichkeit der anschließenden relativen Quantifizierung der Zellen mit entsprechenden Amplikons bietet.
- a.) High-resolution representation of amplified genome segments (ampGA) in an isolated tumor sample by means of a fine-tiling array, preferably after detection of the ampGA by total genome analysis, preferably by CGH (Comparative Genomic Hybridization), if these are not already known,
- b.) amplification, preferably by PCR and subsequent sequencing of the fusion regions,
- c.) providing a sample (a probe or a primer pair) which allows to specifically detect or amplify the fusion region,
- d.) preferably use of the primer pair in a PCR (hereinafter AFS-PCR), preferably a real-time PCR, which preferably overlaps the fusion region and advantageously offers the possibility of subsequent relative quantification of the cells with corresponding amplicons.
Die Probe ist entweder eine Nukleinsäuresonde, welche spezifisch mit dem Fusionsbereich durch komplementäre Basenpaarung hybridisiert. Eine solche Sonde hat bevorzugt eine Länge von 15 bis 35 Nukleotiden, bevorzugt 20 bis 30 Nukleotiden. Eine solche Sonde kann beispielsweise nach einer geeigneten Markierung in einem Southern- oder Northernblot oder in einer Realtime-PCR oder auch auf einem DNA-Array oder in Zellkulturexperimenten eingesetzt werden. Die Sonde kann nur dann an die DNA binden, wenn diese den malignomspezifischen Fusionsbereich (AFS) enthält. Alternativ ist die Probe ein Primerpaar, welches in einer PCR (Polymerasekettenreaktion) spezifisch den Fusionsbereich vervielfältigt. Dazu bindet bevorzugt der eine Primer jeweils spezifisch den Genomabschnitte links und der andere rechts des Fusionsbereichs. D. h. die Primer werden bevorzugt so designt, dass jeweils ein Primer im telomerseitigen und ein Primer im centromerseitigen Sequenzbereich des ampGA liegt. Eine PCR kann also nur zu einem Produkt führen, wenn diese Bereiche aneinander fusioniert sind. Bevorzugt überbrückt die PCR den Fusionsbereich, wobei ein Primer vollständig auf der einen Seite und der zweite Primer auf der anderen Seite des Fusionsbereichs bindet (
Eine weitere Möglichkeit zum Design einer malignomzellspezifischen AFS-PCR besteht in der Überbrückung von nicht amplifizierten Bereichen, die auf der Arraydarstellung wie Lücken innerhalb eines ampGA wirken. Hierbei handelt es sich nicht um wirkliche „Lücken”, sondern um nicht-amplifizierte Genomabschnitte, die zwischen zwei ampGA liegen. Es gibt sehr komplex aufgebaute Amplikons, in denen mehrere, verschiedene ampGA fusioniert sind, die damit eine übergeordnete Einheit darstellen, die dann wiederum repetitiv hintereinander fusioniert ist, um das Amplikon zu bilden. Hier besteht die Möglichkeit, dass die einzelnen ampGA in gleicher, oder in inverser Richtung miteinander fusioniert sind, d. h., dass zwei aufeinander folgende ampGA so angeordnet sind, dass an ampGA 1 in „Telomer → Centromer” Ausrichtung ampGA 2 in „Centromer → Telomer” Ausrichtung fusioniert ist. Dies kommt dadurch zustande, dass es sich bei genomischer DNA um einen Doppelstrang handelt, der sowohl in gleicher, als auch in inverser Richtung (dann allerdings mit vertauschten Strängen) aneinander fusioniert werden kann (vergleiche hierzu
In der PCR kann alternativ zu den spezifischen Primern oder zusätzlich eine Sonde eingesetzt werden, die spezifisch den Fusionsbereich bindet (z. B. für eine entsprechende Realtime-PCR). Alternativ kann einer der beiden Primer so gestaltet werden, dass er spezifisch den Fusionsbereich bindet. Die Bindung der Probe (Sonde und/oder Primer) erfolgt jeweils durch komplementäre Basenpaarung. Die Primer haben bevorzugt jeweils eine Länge von 15 bis 35 Nukleotiden, bevorzugt 18 bis 24 Nukleotiden. In the PCR alternative to the specific primers or in addition a probe can be used, which specifically binds the fusion region (eg for a corresponding real-time PCR). Alternatively, one of the two primers can be designed to specifically bind the fusion region. The binding of the sample (probe and / or primer) takes place in each case by complementary base pairing. The primers preferably each have a length of 15 to 35 nucleotides, preferably 18 to 24 nucleotides.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht vorteilhaft in kurzer Zeit, einen absolut malignomzellspezifischen und patientenindividuellen Genombereich (den Fusionsbereich mit der AFS) basengenau zu identifizieren und diesen mittels hochsensitiver PCR Verfahren, bzw. Verfahren, die eine Probe auf genau diesen Bereich legen, für die Verlaufsbeurteilung verschiedenster Malignome einzusetzen.The method according to the invention advantageously makes it possible in a short time to identify an absolutely malignom cell-specific and patient-specific genome area (the fusion area with the AFS) with the exact base and by means of highly sensitive PCR methods, or methods which place a sample in exactly this area, for the evaluation of various malignancies use.
Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist das Vorhandensein von amplifizierten Genomabschnitten. Diese können in einem vorbekannten, definierten Bereich liegen. Wenn über die mögliche Amplifikation noch nichts bekannt ist, erfolgt in Schritt a.) zunächst eine Gesamtgenomanalyse, bevorzugt durch Gesamtgenom-CGH(Comparative Genomic Hybridization)-Array, d. h. einem DNA-Chip der Proben für das gesamte Genom enthält. Ist der Genomabschnitt, in dem die Amplifikation vorkommt, bekannt oder durch die zuvor beschriebene Gesamtgenomanalyse ermittelt, wird der entsprechende Genomabschnitt bevorzugt in einer Fine-Tiling-CGH-Arrayuntersuchung hochauflösend abgegrenzt. Dazu erfolgt in Schritt b.) bevorzugt eine Hybridisierung mit einem sogenannten Tiling Array, d. h. einem DNA-Chip der Proben für einzelne Chromosomen oder Chromosomabschnitte enthält.The prerequisite for the method according to the invention is the presence of amplified genome segments. These can lie in a previously known, defined range. If nothing is yet known about the possible amplification, a total genome analysis, preferably by total genome CGH (Comparative Genomic Hybridization) array, is carried out in step a). H. a DNA chip containing samples for the entire genome. If the genome section in which the amplification occurs is known or determined by the total genome analysis described above, the corresponding genome section is preferably distinguished in a high-resolution manner in a fine-tiling CGH array examination. For this purpose, in step b.) Is preferably carried out a hybridization with a so-called tiling array, d. H. a DNA chip containing samples for single chromosomes or chromosome segments.
Durch die höhere Auflösung der Tiling-Array Untersuchung werden durch die genaue Beschreibung der telomer- und centromerseitigen Grenzen der ampGA auch die potentiellen AFS innerhalb des Amplikon ermittelt.Due to the higher resolution of the tiling-array examination, the exact description of the telomere and centromere-side limits of the ampGA also identifies the potential AFS within the amplicon.
In Schritt b.) wird der in Schritt a.) ermittelte Fusionsbereich sequenziert. Dazu erfolgt bevorzugt zunächst eine Vervielfältigung des Fusionsbereichs. Bevorzugt wird dazu eine konventionelle PCR über den in Schritt a.) ermittelten Fusionsbereich gelegt. Bevorzugt nach Erhalt eines spezifischen PCR-Fragmentes wird der Fusionsbereich durch Sequenzierung basengenau beschrieben. Nach ggf. notwendiger Optimierung der den Fusionsbereich übergreifenden PCR bzgl. Sensitivität und Anwendbarkeit für semiquantitative Verfahren (z. B. Real-Time PCR) erhält man eine patientenindividuelle und 100% malignomzellspezifische PCR. Je nach Aufbau des Amplikons kann die PCR dabei auch mehrere (z. B. sehr kurze) ampGA und damit ggf. mehrere Fusionsbereiche überbrücken, zwischen denen auch nicht amplifizierte Bereiche liegen können.In step b.), The fusion range determined in step a.) Is sequenced. For this purpose, a duplication of the fusion region preferably takes place first. For this purpose, a conventional PCR is preferably applied via the fusion region determined in step a.). Preferably after obtaining a specific PCR fragment, the fusion region is described by sequencing. After possibly necessary optimization of the PCR across the fusion range with regard to sensitivity and applicability for semiquantitative methods (eg real-time PCR), a patient-specific and 100% malignoma-cell-specific PCR is obtained. Depending on the structure of the amplicon, the PCR can also bridge several (eg, very short) ampGAs, and thus possibly several fusion regions, between which non-amplified regions may also lie.
Das Bereitstellen der Probe in Schritt c.) erfolgt basierend auf der in Schritt b.) erhaltenen Sequenz des Fusionsbereichs. Dies kann durch manuelles Primer bzw. Sondendesign oder auch computergestützt mit Programmen erfolgen (wie z. B. Beacon DesignerTM, Premier Biosoft, Palo Alto CA, USA oder PrimerQuest, Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA).The provision of the sample in step c.) Is based on the sequence of the fusion region obtained in step b.). This can be done by manual priming or computer-aided programming (such as Beacon Designer ™ , Premier Biosoft, Palo Alto CA, USA or PrimerQuest, Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA).
Der Begriff Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung umfasst neben Desoyribonukleinsäuren (DNA) und Ribonukleinsäuren (RNA) auch alle anderen linearen Polymeren in denen die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) oder Uracil (U) (oder andere kamplementär zu verwendenden, modifizierten Basen) in entsprechender Abfolge angeordnet sind, insbesondere Nukleinsäuren mit verändertem Rückgrat oder 3' oder 5'-Terminus, wie z. B. einem Phosphothioat-, Phosphoramidat- oder O-Methyl-derivatisierten Rückgrat, Peptid-Nukleinsäuren (PNA), und locked nucleic acids (LNA) oder gemischtem Rückgrat. Der Begriff „modifizierter 3' oder 5' Terminus” umfasst dabei sowohl Modifikationen, die der Stabilisierung dienen als auch das Anbinden von Markern. Beispiele für Marker sind Enzyme, Farbstoff oder Fluoreszenzfarbstoffe, Radionukleotide, sowie Haptene, wie z. B. Digoxigenin oder Biotin. Bei den Enzymen wird der Nachweis meist über eine von dem Enzym katalysierte Farbbildungsreaktion geführt. Farbige oder fluoreszierende Moleküle können direkt photometrisch oder fluorometrisch nachgewiesen werden. Hapten-Liganden werden meist mit einem entsprechenden enzym- oder farbstoffmarkierten Rezeptor, der eine Affinität für den Liganden hat, in Kontakt gebracht und darüber nachgewiesen.The term "nucleic acids" in the sense of the invention encompasses not only desoyribonucleic acids (DNA) and ribonucleic acids (RNA) but also all other linear polymers in which the bases adenine (A), cytosine (C), guanine (G) and thymine (T) or uracil (U ) (or other complementary to be used, modified bases) are arranged in a corresponding sequence, in particular nucleic acids with altered backbone or 3 'or 5'-terminus, such as. A phosphothioate, phosphoramidate or O-methyl derivatized backbone, peptide nucleic acids (PNA), and locked nucleic acids (LNA) or mixed backbone. The term "modified 3 'or 5' terminus" includes both modifications that serve to stabilize as well as the attachment of markers. Examples of markers are enzymes, dyes or fluorescent dyes, radionucleotides, and haptens such. B. digoxigenin or biotin. In the case of the enzymes, detection is usually carried out via a color-forming reaction catalyzed by the enzyme. Colored or fluorescent molecules can be directly detected photometrically or fluorometrically. Hapten ligands are usually contacted with and exposed to a corresponding enzyme- or dye-labeled receptor that has an affinity for the ligand.
Die mit dem erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Probe kann vorteilhaft (beispielsweise in einer semiquantitaiven PCR) zur Detektion von Malignomzellen in unterschiedlichen Gewebe, wie z. B. dem Tumor selbst (TU), potentiellen Metastasen (M), Knochenmark (KM) und peripherem Blut (pB), aber auch in Kärperflüssigkeiten wie Aszites, Pleuraerguss, Liquor, Urin (interessant z. B. bei Blasenkarzinom) oder auch Stuhl eingesetzt werden.The sample obtained by the method according to the invention can advantageously (for example in a semiquantitative PCR) for the detection of malignant cells in different tissues, such. B. the tumor itself (TU), potential metastases (M), bone marrow (BM) and peripheral blood (pB), but also in body fluids such as ascites, pleural effusion, cerebrospinal fluid, urine (interesting for example in bladder carcinoma) or stool be used.
Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die damit erhaltenen Proben ermöglichen vorteilhaft, die hochspezifische Detektion von Malignomzell-DNA und damit Malignomzellen. Das Verfahren ist absolut malignomzell- und patientenspezifisch und hochsensitiv. Es ermöglicht die qualitative Detektierung und Quantifizierung von Malignomzell-DNA und Malignomzellen. Damit kann z. B. nach einer Malignombehandlung (z. B. durch Resektion, Chemotherapie und/oder Strahlentherapie) überprüft werden, ob tatsächlich alle Malignomzellen entfernt wurden Die Erfindung liefert daher einen wichtigen Beitrag für die Initial- und Verlaufsdiagnostik im Rahmen diverser Malignomerkrankungen, bei denen Amplifikationen von Genomabschnitten vorliegen. The method according to the invention or the samples obtained therewith advantageously permit the highly specific detection of malignant cell DNA and thus malignant cells. The procedure is absolutely malignomzell- and patient-specific and highly sensitive. It enables the qualitative detection and quantification of malignant cell DNA and malignant cells. This can z. B. after a malignant treatment (eg., By resection, chemotherapy and / or radiotherapy) are checked whether all malignant cells were indeed removed The invention therefore provides an important contribution to the initial and historical diagnostics in the context of various malignancies in which amplifications of Genome sections are present.
Die erfindungsgemäße hochspezifische Detektion von Malignomzellen ermöglicht auch den Nachweis oder Ausschluss von Metastasen oder einer Minimal Residue Disease (MRD). Eine andere wichtige Anwendung ist die Knochenmarkstransplantation, insbesondere die autologe Knochenmarkstransplantation. Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die damit erhaltenen Proben ermöglichen vorteilhaft, zu überprüfen, oh die dem Patienten entnommen Knochenmark-/Stammzellpräparate Malignomzellen enthalten, bevor sie nach der Malignombehandlung (Hochdosischemotherapie mit/ohne Ganzkörperbestrahlung) dem Patienten zurückgegeben werden.The highly specific detection of malignant cells according to the invention also enables the detection or exclusion of metastases or a minimal residual disease (MRD). Another important application is bone marrow transplantation, especially autologous bone marrow transplantation. The method according to the invention and the samples obtained therewith advantageously make it possible to check whether the bone marrow / stem cell preparations taken from the patient contain malignant cells before they are returned to the patient after the malignant treatment (high-dose therapy with / without whole-body irradiation).
Die einzelnen bevorzugten Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens werden näher durch das Schema in
Ein Malignom ist eine Erkrankung, bei der Zellen des Körpers autonom und grenzüberschreitend, teilweise destruierend wachsen und ohne Behandlung zum Tod des Organismus führen können. Diese beinhalten Erkrankungen des blutbildenden Systemes (Leukämien und Lymphome) sowie Erkrankungen, die aus Zellen aller anderen Organen hervorgehen können (solide, bösartige Tumore). Der Begriff Malignom umfasst alle bösartigen Neoplasien, insbesondere Leukämien, Lymphome und solide maligne Tumore. Im Folgenden wird die die Erfindung am Beispiel der in humanen Neuroblastomen amplifizierten Region des Chromosomes 2 (Chr. 2p24-25) näher erläutert. Die Erfindung ist jedoch auf alle Formen maligner Erkrankungen, die ampGA aufweisen, anwendbar, unabhängig von der Sequenz und der Lokalisation der ampGA innerhalb des Gesamtgenomes. Für viele Malignome sind ampGA bekannt (z. B. MYCN in Neuroblastomen, c-myc, HER-2 und ERBB2 in Brustkarzinomen; c-myc und MYCN in Medulloblastomen; c-myc, AR (Androgen Rezeptor) und PIK3CA, in Prostatakarzinomen etc.). In transformierten Zellen finden sich zudem häufig ampGA, die nicht regelmäßig bei diesen Erkrankungen vorkommen und, anders als z. B. beim Neuroblastom, somit keine Aussage über eine prognostische Bedeutung per se zulassen (z. B. Magenkarzinom). Alle diese ampGA können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren als diagnostisches Werkzeug benutzt werden, um hochselektiv Malignomzellen identifizieren zu können. Die Erfindung ist grundsätzlich auf alle Malignome anwendbar, welche amplifizierte Genomabschnitte enthalten. Diese können, müssen aber kein spezifisches Gen (wie MYCN, AURKA oder andere) enthalten. Der genetische Inhalt des ampGA und die Frage, ob die Amplfikation dieses Bereiches eine prognostische Relevanz für das entsprechende Malignom besitzt oder nicht, spielen in der Erfindung keine Rolle. Auch die die Ausdehnung und Struktur des ampGA sind von geringer Relevanz. Weitere Beispiele für Malignome die häufig amplifizierte Genomabschnitte enthalten sind Leukämien, Lungen- und Magenkarzinome.A malignancy is a disease in which the cells of the body grow autonomously and cross-border, sometimes destructive and can lead to the death of the organism without treatment. These include diseases of the hematopoietic system (leukemias and lymphomas) as well as diseases that can arise from cells of all other organs (solid, malignant tumors). The term malignancy includes all malignant neoplasms, especially leukemias, lymphomas and solid malignant tumors. The invention is explained in more detail below using the example of the region of
Mit Hilfe der Erfindung kann z. B. ein initialer Knochenmarkbefall eines Malignomes bzw. in peripherem Blut zirkulierende Malignomzellen äußerst sensitiv diagnostiziert werden. Malignomzellen können in Körperflüssigkeiten wie Liquor, Urin, Aszites, Pleuraflüssigkeit, Gelenkergüssen oder Stuhl nachgewiesen werden. Des weiteren kann in definierten Verlaufskontrollen eine Aussage über ein quantitatives Ansprechen der Erkrankung auf die Therapie gemacht werden (Tumorzellnachweis in Knochenmark oder Tumorrestgewebe, Lokalrezidivdiagnostik (Primärtumorlokalisation, Metastasen, Lymphknoten)). Eine weitere Anwendungsmöglichkeit besteht in dem äußerst sensitiven Nachweis von Tumorzellen in patienteneigenen Stammzell-/Knochenmarkpräparaten vor einer eventuell notwendigen autologen Stammzell-/Knochenmarktransplantation z. B. im Rahmen einer Hochdosis-Chemotherapie.With the help of the invention z. B. an initial bone marrow infestation of a malignancy or in peripheral blood circulating malignant cells are diagnosed extremely sensitive. Malignant cells can be detected in body fluids such as cerebrospinal fluid, urine, ascites, pleural fluid, articular effusions or stool. Furthermore, a statement about a quantitative response of the disease to the therapy can be made in defined follow-up controls (tumor cell detection in bone marrow or tumor residual tissue, local recurrent diagnosis (primary tumor localization, metastases, lymph nodes)). Another application is the extremely sensitive detection of tumor cells in the patient's own stem cell / bone marrow preparations before any necessary autologous stem cell / bone marrow transplantation z. As part of a high-dose chemotherapy.
Die Erfindung wir nachfolgend anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.The invention will be explained in more detail below with reference to figures and exemplary embodiments, without being limited thereto.
Die prinzipielle Vorgehensweise des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Etablierung einer Amplikon-Fusionsstellen-PCR wird anhand zweier primärer, humaner Neuroblastomzellinien beschrieben, die eine Amplifikation des genomischen Bereiches um MYCN aufweisen. Da das Vorhandensein der Amplifikation des genomischen Berreiches um MYCN in beiden Zellinien bekannt ist konnte die DNA gleich auf einem Tiling-Array hybridisiert werden, der den genomischen Bereich um das MYCN-Gen entsprechend hoch auflöst.The basic procedure of the method according to the invention for the establishment of an amplicon fusion site PCR is described on the basis of two primary, human neuroblastoma cell lines which have an amplification of the genomic range around MYCN. Since the presence of MYCN amplification of the genomic region in both cell lines is known, the DNA could be hybridized equally on a tiling array correspondingly high in the genomic region around the MYCN gene.
Zellen und ZellkulturCells and cell culture
Für die Untersuchung wurden die humanen Neuroblastomzelllinien „IMR32” (DSMZ No. ACC 165) und „KELLY” (DSMZ No. ACC 355) mit vorbekannter MYCN Amplifikation, sowie die humane Neuroblastomzellinie SH-EP (keine DSMZ No. vorhanden) ohne MYCN Amplifikation in Kultur genommen. Die Zellen wurden unter Standardzellkulturbedingungen kultiviert (5% CO2, 37°C, RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, Penicillin [100 U/ml], Streptomycin [100 μg/ml] und Glutamin [2 mmol/L]). Vitale, in Teilung befindliche Zellen wurden bei Erreichen einer Konfluenz von ca. 80% trypsinisiert, geerntet und abzentrifugiert und bis zur DNA Isolation bei –20°C gelagert.For the investigation, the human neuroblastoma cell lines "IMR32" (DSMZ No. ACC 165) and "KELLY" (DSMZ No. ACC 355) with previously known MYCN amplification and the human neuroblastoma cell line SH-EP (no DSMZ No.) without MYCN amplification were used taken in culture. The cells were cultured under standard cell culture conditions (5% CO2, 37 ° C, RPMI medium with 10% fetal calf serum, penicillin [100 U / ml], streptomycin [100 μg / ml] and glutamine [2 mmol / L]). Vital, in dividing cells were trypsinized when reaching a confluency of about 80%, harvested and centrifuged and stored at -20 ° C until DNA isolation.
DNA IsolationDNA isolation
Dazu wurde mittels eines Säulenaufreinigungsverfahrens die genomische DNA aus jeweils 5 × 106 Zellen isoliert (QIAGEN DNA-Blood an Tissue Kit; nach Anleitung des Herstellers). Die DNA-Konzentration und -Qualität wurden photospektrometrisch gemessen (Nanodrop, Fa. Amersham). Ausgangsbedingung für eine Arrayhybridisierung war eine DNA-Konzentration von 250 ng/μl, eine DNA Gesamtmenge von 5 μg DNA und eine 280/260 nm Ratio von 1,85–1,95 (Angaben der Firma ImaGenes, Berlin).For this purpose, the genomic DNA was isolated from each 5 × 10 6 cells by means of a column purification method (QIAGEN DNA Blood to Tissue Kit, according to the manufacturer). The DNA concentration and quality were measured by spectrophotometry (Nanodrop, Amersham). The initial condition for array hybridization was a DNA concentration of 250 ng / μl, a DNA total amount of 5 μg DNA and a 280/260 nm ratio of 1.85-1.95 (data from ImaGenes, Berlin).
Arrayarray
Die DNA wurde zusammen mit einer Kontroll-DNA (DNA eines gesunden, humanen, gleichgeschlechtlichen Individuums) auf den entsprechenden Arrayslide hybridisiert. Die Färbung der Proben DNA erfolgte mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5, die Färbung der Kontroll DNA erfolgte mit Cy3. Das Arraydesign und die Arrayhybridisierung erfolgte als Auftragsleistung bei der Firma ImaGenes (Berlin, Deutschland). Auf dem Arrayslide wurden DNA-Oligonukleotide (16–20 Basen Länge) des zu untersuchenden Bereiches geprintet. Die Auflösung errechnet sich dabei aus der möglichen Anzahl der zu hybridisierenden Oligonukleotide und der gewünschten Ausdehnung des zu untersuchenden Bereiches. In unserem Fall wurde ein Arrayslide mit 384.599 DNA-Oligonukleotide bestückt. Die Ausdehnung des zu untersuchenden Bereiches auf Chromosom 2p (inclusive der Kontrollbereiche) umfasste 24.913.401 Basen. Daraus ergibt sich eine Auflösung unseres Array von durchschnittlich 65 Basen Abstand zwischen 2 aufeinander folgenden DNA-Oligonukleotide. Zu Beachten ist dabei, dass in Bereichen des Genomes mit hochspezifischen Sequenzfolgen (z. B. für Gene kodierendes Euchromatin) die spezifischen DNA-Oligonukleotide in einer höheren Auflösung (kleinerer Abstand zueinander) designt werden können. In Bereichen des Genomes, in denen z. B. längere Repeatfolgen vorkommen ist die Auflösung entsprechend niedriger. Die Ergebnisse der Arrayhybridisierung der beiden Zelllinien-DNAs sind in
PrimerdesignPrimerDesign
Die Angabe der exakten Position der auf den Array geprinteten Oligonukleotide ermöglicht es per Datenbanksuche (z. B. BLAT – The BLAST-Like Alignment Tool, Genome Res 12: 4 656–664. http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) die Sequenzen der telomerseitigen und zentromerseitigen Grenzen des ampGA zu erhalten. Die jeweils ersten und letzten 1000 Basen des auf dem Array als ampGA dargestellten Bereiches wurden in eine Textdatei kopiert und so aneinandergereiht, dass jeweils an das Ende eines ampGA ein neuer Anfang des nächsten ampGA folgt. Damit wird virtuell der Fusionsbereich simuliert, in dem, in gleichgerichteter Orientierung, die amplifizierte Sequenz wieder aufeinander folgt. Diese Amplikonfusionsstelle (AFS) und damit der Fusionsbereich sind absolut spezifisch für das Tumorzellgenom und in keiner anderen Zelle zu finden, da ausschließlich die Tumorzellen die Amplifikation des exakt gleichen Bereiches aufweisen. Der so ermittelte Fusionsbereich dient nun zum Primerdesign für die nachfolgenden AFS-PCR Reaktionen. Die Primer werden so designt, dass jeweils ein Primer im telomerseitigen und ein Primer im centromerseitigen Sequenzbereich des ampGA liegt. Eine PCR kann also nur zu einem Produkt führen, wenn diese Bereiche aneinander fusioniert sind. Ein Beispiel bietet das MYCN-Amplikon der KELLY Zellinie (
PCRPCR
Die PCR zur Validierung der virtuellen Fusionsbereiche erfolgte unter folgenden Bedingungen: QIAGEN-HotStarTaq Plus PCR Mastermix 12,5 μl, DNA der entsprechenden Zellinie/Tumor 200 ng, je 2 amplikonspezifische Primer oder 2 Kontrollprimer (je [25 pMol]), DMSO 1,5 μl, Aqua-dest. ad 25 μl.
Cyclerbedingungen: 5 Minuten initiale Denaturierung bei 95°C, anschließend 38 Zyklen mit 20 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 20 Sekunden Annealing bei 57°C, 60 Sekunden Elongation bei 72°C, danach Abkühlen auf 4°C bis zum Auftragen auf des Agarosegel.
Agarosegelelektrophorese in 1%–3% Agarosegel (je nach Produktlänge). Anschließend Färbung der Gele mit Ethidiumbromid. Die Banden wurden unter UV Durchleuchtung sichtbar gemacht und dokumentiert (
Cycler conditions: 5 minutes initial denaturation at 95 ° C, then 38 cycles with 20 seconds denaturation at 95 ° C, 20 seconds annealing at 57 ° C, 60 seconds elongation at 72 ° C, then cooling to 4 ° C until applied to the agarose gel.
Agarose gel electrophoresis in 1% -3% agarose gel (depending on product length). Subsequently staining the gels with ethidium bromide. The bands were visualized and documented under UV fluoroscopy (
Isolation der DNA der PCR BandenIsolation of the DNA of the PCR bands
Im Anschluß wurden die PCR-Fragmente unter UV-Durchleuchtung aus dem Agarosegel ausgeschnitten und mit dem QIAGEN DNA Gel Extraktion Kit nach Herstellerangaben isoliert.Subsequently, the PCR fragments were excised from the agarose gel under UV transillumination and isolated with the QIAGEN DNA Gel Extraction Kit according to the manufacturer's instructions.
Sequenzierungsequencing
Die Sequenzierung der PCR-Fragmente erfolgte von beiden Seiten mit den entsprechenden, zuvor in der PCR eingesetzten Primern. (Einsatz in die Reaktion: 20 ng/100 bp DNA-Fragment, je 10 pmol Primer). Ansatz der Sequenzierreaktion mit dem „ABI Prism BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Cycle Seq. Kit” von Applied Biosystems. Reaktionsablauf unter Bedingungen nach Angaben des Herstellers. Als Sequenzer wurde ein „16 Capillary Sequenzer Genetic Analyzer 3100” von Applied Biosystems benutzt.The sequencing of the PCR fragments was carried out from both sides with the corresponding primers previously used in the PCR. (Use in the reaction: 20 ng / 100 bp DNA fragment, 10 pmol each primer). Sequencing Reaction Approach Using the ABI Prism BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Cycle Seq. Kit "by Applied Biosystems. Reaction process under conditions according to the manufacturer. The sequencer used was a "16 Capillary Sequencer Genetic Analyzer 3100" from Applied Biosystems.
Design von Primern für eine Realtime PCR Design of primers for a real-time PCR
Nach Sequenzierung der PCR Fragmente ist die basengenaue Fusionsstelle (AFS) des entsprechenden Amplikons identifiziert. Es können nun Primer designt werden, die zu einem PCR-Produkt führen, das die exakte AFS überbrückt. (Entsprechend der Kriterien für eine Realtime PCR sollte das Produkt 100–200 bp Länge nicht überschreiten Daher ist die Sequenzierung des Fusionsbereichs mit der genauen Fusionsstelle (AFS) für das RT-Primer Design obligat.)After sequencing of the PCR fragments, the base-specific fusion site (AFS) of the corresponding amplicon is identified. It is now possible to design primers that lead to a PCR product that bridges the exact AFS. (According to the criteria for a real-time PCR, the product should not exceed 100-200 bp length Therefore, the fusion of the fusion site with the exact fusion site (AFS) is obligatory for the RT primer design.)
Durchführung der Realtime PCRRealtime PCR implementation
Die PCR zur Validierung der virtuellen Fusionsbereiche erfolgte unter folgenden Bedingungen: QIAGEN-HotStarTaq Plus PCR Mastermix 12,5 μl, SYBR-Green-I [0,5x] (Molecular Probes), DNA der entsprechenden Zellinie/Tumor 200 ng, je 2 amplikonspezifische Primer oder 2 Kontrollprimer (Inhibin-beta-B) (je 25 pmol), Formamid 0,3 μl, DMSO 1,5 μl, Aqua-dest. ad 25 μl. Cyclerbedingungen: 5 Minuten initiale Denaturierung bei 95°C, anschließend 38 Zyklen mit 20 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 20 Sekunden Annealing bei 57°C, 30 Sekunden Elongation bei 72°C, danach Abkühlen auf 4°C. Der SYBR-Green Ansatz für die Realtime AFS-PCR wurde gewählt, da mit Hilfe einer anschließenden Schmelzkurvenanalyse eine qualitative Aussage über die Spezifität des PCR Produktes gemacht werden kannPCR for the validation of the virtual fusion regions was carried out under the following conditions: QIAGEN-HotStarTaq Plus PCR master mix 12.5 μl, SYBR-Green-I [0.5 ×] (Molecular Probes), DNA of the corresponding cell line / tumor 200 ng, 2 each amplicon-specific Primer or 2 control primers (inhibin-beta-B) (25 pmol each), formamide 0.3 ul, DMSO 1.5 ul, aqua dest.
Testung der Sensitivität des Verfahrens (Zell-Verdünnungsreihe)Testing the sensitivity of the procedure (cell dilution series)
Mittels der etablierten Realtime PCR wurde anhand einer Verdünnungsreihe von Tumorzellen die Sensitivität des Verfahrens ermittelt. Tumorzellen der entsprechenden Neuroblastomzellinien mit MYCN Amplifikation (KELLY und IMR-32) wurden in Zellen einer Neuroblastomzellinie ohne MYCN Amplifikation (SH-EP) mit annähernd identischem DNA Gehalt/Zelle verdünnt. Dabei wurden folgende Verdünnungsstufen hergestellt: Eine Tumorzelle auf 10 Kontrollzellen (1/10), Eine Tumorzelle auf 100 Kontrollzellen (1/102) und im Weiteren (1/103), (1/104), (1/105), (1/106). Von jeder MYCN amplifizierten Tumorzellinie wurden drei unabhängige Verdünnungsreihen angelegt. Aus diesen Zellverdünnungsschritten wurde von jeweils 2 × 106 Zellen genomische DNA isoliert. Von der isolierten DNA wurden 200 ng in eine Realtime AFS-PCR eingesetzt. Als Positivkontrolle diente DNA der spezifischen, MYCN amplifizierten Zelllinie (IMR32, KELLY). Als Negativkontrolle diente DNA der nicht MYCN amplifizierten Kontrollzelllinie (SH-EP). Jede Verdünnungsreihe wurde im Triplikat untersucht. Die Ergebnisse sind in relative AFS-Kopienzahl in Bezug auf die Positivkontrolle dargestellt (
Testung der Spezifität des Verfahrens
Die Spezifität der AFS-PCR wurde überprüft, indem die AFS spezifischen Primer mit DNA der jeweiligen amplifizierten Zellinien und weiteren Kontrollzellinien/Geweben eingesetzt wurden. Dabei können AFS spezifische PCR-Fragmente nur aus DNA der entsprechenden Zellinien generiert werden (
Testung der Spezifität des Verfahrens
Die Spezifität der AFS wird anhand einer Untersuchung von DNA aus 40 primären, MYCN amplifizierten Neuroblastomen dargestellt (
Testung der Spezifität des Verfahrens für die Verlaufskontrolle Testing the specificity of the procedure for the follow-up
Von 4 Tumoren lag ausreichend Material von Tumorgewebe aus einem zugehörigen Rezidiv vor. Aus diesem Material wurde wie zuvor beschrieben DNA isoliert und auf einen gleich designten Array hybridisiert. Die Grenzen der ampGA entsprechen exakt denen der entsprechenden Primärtumoren (
Von einigen Tumoren wurde DNA aus zugehörigen Blut- und Knochenmarkproben sowie aus Tumormaterial von Rezidivtumoren isoliert. Die individuellen AFS-PCRs wurden mit diesen DNAs durchgeführt. In einigen Fällen konnte damit das Vorhandensein von Tumorgenom in diesen Proben und damit der Beweis der Praktikabilität der Methode für die Verlaufskontrollen in der klinischen Praxis dargestellt werden (
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