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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur automatisierten Vorbereitung von Proben für eine Messung mit Hilfe eines Biosensor-Systems und auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Das Verfahren umfasst, dass Substratlösungen durch Verdünnung aus konzentrierten, zeitlich stabilen Lösungen hergestellt werden und dass einer wässrigen Probe Chlor entzogen wird, durch einen Schritt Ansäuern der wässrigen Probe und durch einen Schritt Entgasen der wässrigen Probe, mit einem Schritt Einstellen des pH-Wertes der wässrigen Probe, und wobei ein Mischen und ein Entgasen gleichzeitig erfolgen.
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Bei der Messung von Wasserproben, insbesondere Trinkwasserproben werden Enzyme verwendet, um Verschmutzungen festzustellen und zu analysieren. Die Wasserproben sind häufig gechlort, um ohne Krankheitserreger vom Wasserwerk zum Endverbraucher zu gelangen. Chlor hat die Eigenschaft Enzyme zu hemmen. Dies kann dazu führen, dass bei Analysen von Wasserproben mit Hilfe von Enzymen letztere so stark durch Chlor gehemmt sind, dass Verschmutzungen des Wassers nicht mehr messbar sind.
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Für eine kontinuierliche Wasseranalytik ist ein kontinuierliches Messsystem notwendig. Dies kann nur durch eine Automatisierung der Messung realisiert werden. Eine Entchlorung ist dabei ebenfalls vollautomatisch vor einer Messung durchzuführen, wobei die zur Messung notwendigen Substanzen nicht bzw. möglichst wenig geschädigt werden dürfen. Die zur Messung notwendigen Substanzen müssen lagerstabil bevorratet werden und bei der Messung mit der notwenigen Konzentration zugegeben werden. Häufig sind die in der Bioanalytik verwendeten Reagenzien jedoch in der für die Messung benötigten Konzentration und in dem für die Messung benötigten Lösungsmittel nicht lagerstabil über lange Zeiträume wie z. B. über Wochen. Deshalb müssen im Stand der Technik die Reagenzien frisch per Hand vor jeder Messung angesetzt werden und dem automatischen Messsystem zugeführt werden.
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Enzymaktivitäten können z. B. in Laborgeräten elektrochemisch mit Hilfe von Paraaminophenylacetat gemessen werden. Paraaminophenylacetat in wässrigen Lösungen ist nicht lagerstabil und zerfällt innerhalb von Stunden. Die wässrige Lösung von Paraaminophenylacetat mit der richtigen Konzentration muss deshalb kurz vor einer Messung frisch angesetzt.
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Automatische Entchlorungssysteme arbeiten in der Regel auf der Basis von Aktivkohlefiltern. Diese können sich jedoch bei hohen Chlorkonzentrationen im Wasser schnell verbrauchen und sind in der Anschaffung relativ teuer. Methoden zum Entchloren über Ansäuern sind bekannt, jedoch erfolgt im Stand der Technik ein Ansäuern der Proben per Hand.
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Aufgabe des erfindungsgemäßen Verfahrens zur automatisierten Vorbereitung von Proben für eine Messung mit Hilfe eines Biosensor-Systems und der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist es, eine automatische, möglichst einfache, kostengünstige und zuverlässige Entchlorung zu ermöglichen und ein automatisches, frisches, möglichst einfaches, kostengünstiges und zuverlässiges Ansetzen von für eine Messung notwendigen Lösungen zu erlauben. Dabei ist eine Gasblasenbildung zu reduzieren oder ganz zu verhindern, da Gasblasen bei z. B. elektrochemischen Messungen die Ergebnisse verfälschen oder eine Messung unmöglich machen können.
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Die angegebene Aufgabe wird bezüglich des Verfahrens zur automatisierten Vorbereitung von Proben für eine Messung mit Hilfe eines Biosensor-Systems mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und bezüglich der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 12 gelöst.
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Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur automatisierten Vorbereitung von Proben für eine Messung mit Hilfe eines Biosensor-Systems und der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, gehen aus den jeweils zugeordneten abhängigen Unteransprüchen hervor. Dabei können die Merkmale des Hauptanspruchs mit Merkmalen der Unteransprüche und/oder Merkmale von Unteransprüchen untereinander kombiniert werden.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur automatisierten Vorbereitung von Proben für eine Messung mit Hilfe eines Biosensor-Systems, werden Substratlösungen durch Verdünnung aus konzentrierten, zeitlich stabilen Lösungen hergestellt. Einer wässrigen Probe wird des Weiteren Chlor entzogen, durch einen Schritt Ansäuern der wässrigen Probe und durch einen Schritt Entgasen der wässrigen Probe, mit einem Schritt Einstellen des pH-Wertes der wässrigen Probe. Ein Mischen und ein Entgasen erfolgt dabei jeweils gleichzeitig.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine vollautomatische biochemische Messung kontinuierlich oder intervallmäßig über längere Zeiträume hinweg ermöglicht. Die Substanzen können in hoch konzentrierten, zeitlich stabilen Lösungen gelagert werden, und werden erst kurz vor der Messung frisch vollautomatisch angesetzt, z. B. durch Mischen bzw. verdünnen mit Hilfe von wässrigen Lösungen. Einer zu untersuchenden Probe wird Chlor automatisiert entzogen, durch Ansäuern und Entgasen. Teure Kohlefilter können so eingespart werden und eine kontinuierliche Arbeitsweise über längere Zeiträume kann sichergestellt werden. Ein gleichzeitiges Mischen und Entgasen jeweils der Probe beim Entgasen und der Substratlösung beim Verdünnen erlauben einen einfachen Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens und eine schnelle, kostengünstige und einfache Durchführung des Verfahrens.
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Dabei können ein Mischen und ein Entgasen jeweils in ein und derselben Mischstrecke erfolgen, welche einen porösen Schlauch in einer evakuierten Kammer umfasst. Über den porösen Schlauch kann z. B. Chlor aus der Probe oder Luft aus zu mischenden Substratlösungen in die Kammer in evakuiertem Zustand abgegeben werden. Eine Blasenbildung bei einer darauffolgenden Messung an der Probe mit einem Biosensor wird dadurch unterbunden. In nicht evakuierten Zustand kann wenn nötig auch eine Mischung von Lösungen ohne Entgasung erfolgen. Durch Verwendung ein und derselben Mischstrecke zum Mischen und Entgasen wird Zeit und Raum gespart bei der Probenvorbereitung und ein besonders effektives Entgasen ermöglicht durch Verwirbelungen beim Mischen.
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Eine erste Substratlösung kann durch Zusammenführen einer bestimmten Menge eines ersten Substrats und einer bestimmten Menge Messpuffer in der Mischstrecke erzeugt werden, insbesondere in einem Volumenverhältnis 1:20. Dabei entsteht ein erstes Mischprodukt, welches in einer ersten Speichereinrichtung gespeichert wird. Eine zweite Substratlösung kann durch Zusammenführen einer bestimmten Menge eines zweiten Substrats und einer bestimmten Menge Messpuffer anschließend in der Mischstrecke erzeugt werden, insbesondere in einem Volumenverhältnis 1:20. Dabei entsteht ein zweites Mischprodukt, welches in einer zweiten Speichereinrichtung gespeichert wird. Anschließend kann das erste und das zweite Mischprodukt in der Mischstrecke zu einer Substratlösung, insbesondere in einem Volumenverhältnis 1:5, zusammengeführt werden und in einer Speichereinrichtung gespeichert werden. Die Mischstrecke kann zwischen den Schritten jeweils mit Reinstwasser gespült und gereinigt werden. Die Verwendung nur einer Mischstrecke, welche je nach Bedarf eine Lösung entgasen oder nicht entgasen kann, erlaubt einen besonders einfachen Aufbau zur Durchführung des Verfahrens auf engstem Raum. Die geringe Zahl an zu verwendenden Teilen reduziert das Risiko der häufigen Wartung und erhöht die Zuverlässigkeit.
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Ein Zusammenführen von bestimmten Mengen an Flüssigkeiten in der Mischstrecke kann durch unterschiedliche Pumpgeschwindigkeiten erfolgen. Dabei können externe oder in den Zu- und Abflüssen integrierte Pumpen und Ventile zum Einsatz kommen, welche durch eine Steuer- oder Regeleinheit vollautomatisch nach einem vorbestimmten Programm gesteuert oder geregelt werden. Als Speichereinrichtungen können Speicherschleifen aus einem Schlauch hergestellt verwendet werden. Dies erlaubt einen einfachen, kostengünstigen und leicht zu reinigenden Aufbau.
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Substrate können Enzymsubstrate umfassen, insbesondere in wasserfreien Lösungsmitteln. Diese werden erst kurz vor der Messung oder zumindest in einem Zeitraum vor der Messung mit Lösungsmittel zu einer Lösung angesetzt, welcher die Stabilität der Enzymsubstrate sicherstellt. Die Lösung wird dann in einer Konzentration z. B. mit wässrigen, gepufferten Lösungsmittel angesetzt, in der die Lösung zur Messung benötigt wird.
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Das Ansäuern der wässrigen Probe kann durch Zusammenführen von wässriger Probe und Salzsäure HCl in der Mischstrecke erfolgen. Insbesondere ein Mischen mit einem Verhältnis 1:10 von 1 M HCl mit der wässrigen Probe kann erfolgen.
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Das Entgasen der wässrigen Probe kann durch eine Druckverringerung in der Umgebung der Mischstrecke, insbesondere auf einen Druck im Bereich von 100 mbar erfolgen. Durch die Druckerniedrigung und die Verwendung eines porösen Schlauchs kann das abzuführende Gas in die Umgebung des Schlauchs gut entweichen und abgeführt werden.
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Der Schritt Einstellen des pH-Wertes der wässrigen Probe kann einen Schritt Neutralisieren der wässrigen Probe durch Mischen mit einer alkalischen Lösung umfassen. Insbesondere kann eine alkalische Lösung mit puffernden Substanzen dazu verwendet werden, und dabei ein gewünschter pH-Wert für eine Messung mit dem Biosensor-System eingestellt werden.
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In einem Schritt des Verfahrens kann ein Gemisch umfassend die wässrige Probe und in einem folgenden Schritt ein Gemisch umfassend die Substratlösung einem Biosensor des Biosensor-Systems zugeführt werden.
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Bei einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Durchführen des zuvor beschriebenen Verfahrens weist die Mischstrecke wenigstens zwei Zuflüsse und wenigstens einen Abfluss auf und ist aus einem porösen Schlauch aufgebaut. Insbesondere kann ein Silikon-Schlauch verwendet werden, welcher von einer evakuierbaren Kammer umgeben ist. Poröse Silikonschläuche sind kostengünstig käuflich erwerbbar und ein Aufbau der Vorrichtung mit einer evakuierbaren Kammer führt zu einem einfachen, verschleißarmen, zuverlässigen und kostengünstigen Aufbau.
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Die evakuierbare Kammer kann bei einem gleichzeitigen Mischen und Entgasen in einem ersten, evakuierten Zustand sein. Bei einem Mischen ohne Entgasung kann die evakuierbare Kammer in einem zweiten Zustand sein, bei welchem die Kammer in ihrem Inneren Normaldruck aufweist.
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Für die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens, ergeben sich die vorstehend erwähnten, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur automatisierten Vorbereitung von Proben für eine Messung mit Hilfe eines Biosensor-Systems verbundenen Vorteile.
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Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung mit vorteilhaften Weiterbildungen gemäß den Merkmalen der abhängigen Ansprüche werden nachfolgend anhand der einzigen Figur näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
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Es zeigt:
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1 einen Schnitt durch eine Mischstrecke bestehend aus einem porösen Schlauch in einer evakuierbaren Kammer.
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In 1 ist ein erfindungsgemäßer Aufbau einer Vorrichtung 1 zum Durchführen des Verfahrens zur automatisierten Vorbereitung von Proben für eine Messung mit Hilfe eines Biosensor-Systems dargestellt. Eine Mischstrecke 2 ist aus einem porösen Schlauch 3 in einer evakuierbaren Kammer 4 aufgebaut. An der Kammer können z. B. der Einfachheit halber nicht dargestellte Vakuumpumpen angeschlossen sein. Der poröse Schlauch 3 weist einen ersten und einen zweiten Zufluss 5, 6 auf, welche fluidisch mit der Mischstrecke 2 verbunden sind. Zwei unterschiedliche Lösungen können jeweils über einen Zufluss 5, 6 der Mischtrecke 2 zugeführt werden und in dieser gemischt werden. Über einen Abfluss 7 kann die gemischte Lösung der Mischstrecke 2 entnommen werden.
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Die Zuflüsse 5, 6 und der Abfluss 7 können jeweils durch einen nicht porösen Silikonschlauch realisiert sein. Pumpen und Ventile sind der Einfachheit halber in 1 nicht dargestellt, können aber für den Flüssigkeitstransport und dessen Steuerung bzw. Regelung vorgesehen sein. Pumpen können z. B. Kolbenpumpen umfassen, bei welchen Flüssigkeit „aufgezogen” wird. Alternativ können auch andere Pumpen wie z. B. Kreiselpumpen, Membranpumpen und Schlauchpumpen verwendet werden. Die Zuflüsse 5, 6 und der Abfluss 7 können jeweils mit einer Speicherstrecke verbunden sein, insbesondere einer spiralförmigen Speicherstrecke, in welcher Flüssigkeit gespeichert werden kann. Das zu speichernde Flüssigkeitsvolumen bestimmt dabei die zu verwendende Länge und den Durchmesser der Speichereinrichtung, z. B. in Form der Länge und des Durchmessers eines Schlauches. Die Fluidik kann so ausgeführt sein, dass Gemische aus dem Abfluss 7 in einer Speicherstrecke wie z. B. der spiralförmigen Speicherstrecke gespeichert werden können, welche mit einem Zufluss 5 oder 6 verbunden ist. Gemische aus dem Abfluss 7 können ebenfalls in einer zweiten Speicherstrecke gespeichert sein, welche mit dem anderen Zufluss 6 oder 5 verbunden ist. Dadurch können zwei gespeicherte Gemische in der Mischstrecke gemischt werden. Ein analoger Aufbau mit mehr individuell ansteuerbaren Speichereinrichtungen ist ebenfalls möglich.
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Der poröse Schlauch 3 der Mischstrecke 2 ist von einer evakuierbaren Kammer 4 umgeben. Durch z. B. Vakuumpumpen wird die Kammer 4 auf einen Druck im Bereich von 100 mbar evakuiert und Gas der Flüssigkeit im porösen Schlauch 3 kann durch die Wandung des Schlauches 3 diffundieren, getrieben durch den Druckunterschied des Drucks im Schlauch 3 und in der evakuierten Kammer 4. Dabei wird die Flüssigkeit im Schlauch 3 entgast. Bei Mischung von Flüssigkeiten in der Mischstrecke 2 ohne Entgasung kann die Kammer 4 im Inneren auf Normaldruck gebracht werden, z. B. durch Abschalten der Vakuumpumpen. Statt Vakuumpumpen können je nach Bedarf auch Ultra-Hochvakuumpumpen oder andere Pumpen eingesetzt werden, je nachdem welche Druckverhältnisse in der Kammer 4 benötigt werden.
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Der Abfluss 7 ist fluidisch mit einem Biosensor-System verbunden. Flüssigkeiten, welche in der Mischstrecke gemischt und entgast wurden, werden ausgehend vom Abfluss 7 zu einem Biosensor transportiert und dort vermessen. Der Biosensor kann z. B. ein elektrochemisches Sensor-Array umfassen, welches in einer Durchflusszelle integriert ist. Die Entgasung der Flüssigkeit steigert dabei die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der elektrochemischen Messung, da sich keine Gasblasen über den Sensoren festsetzen können und die Messung verfälschen bzw. unmöglich machen können.
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In einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Bildung und Mischung von zwei Substratslösungen, die in unterschiedlichen Lösungsmitteln bevorratet sind, ein erstes Substrat und ein zweites Substrat jeweils in einem Kompartement einer Kartusche gelagert. Dabei liegt das erste Substrat in einer Konzentration vor, welche dem hundertfachen einer gewünschten Konzentration für eine Messung entspricht. Das zweite Substrat liegt in einer Konzentration vor, welche dem 25 fachen einer gewünschten Konzentration für die Messung entspricht.
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In einem ersten Schritt werden 250 μl Messpuffer und 34 μl des ersten Substrats jeweils einer Speicherstrecke zugeführt. Die beiden Lösungen werden in einem Verhältnis 1:20 durch unterschiedliche Pumpgeschwindigkeiten der Mischstrecke 2 jeweils über den Zufluss 5 und 6 zugeführt. In der Mischstrecke 2 werden die beiden Lösungen zu einem ersten Mischprodukt mit einem Volumen von 200 μl gemischt und über den Abfluss 7 einer Speicherstrecke, welche in Form einer schlauchförmigen Speicherschleife vorliegt, zugeführt und dort zwischengespeichert.
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In einem zweiten Schritt werden 250 μl Messpuffer und 30 μl des zweiten Substrats jeweils einer Speicherstrecke zugeführt. Die beiden Lösungen werden in einem Verhältnis 1:20 durch unterschiedliche Pumpgeschwindigkeiten der Mischstrecke 2 jeweils über den Zufluss 5 und 6 zugeführt. Dabei werden 240 μl Messpuffer mit 720 μl/min und 20 μl Substrat mit 60 μl/min der Mischstrecke 2 zugeführt. In der Mischstrecke 2 werden die beiden Lösungen zu einem zweiten Mischprodukt gemischt und über den Abfluss 7 einer Speicherstrecke, welche in Form einer schlauchförmigen Speicherschleife vorliegt, zugeführt und dort zwischengespeichert.
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In einem dritten Schritt werden das erste und das zweite Mischprodukt jeweils über den Zufluss 5 und 6 der Mischstrecke 2 durch unterschiedliche Pumpgeschwindigkeiten in einem Verhältnis 1:5 zugeführt und in der Mischstrecke 2 gemischt. Es entsteht eine Substratslösung, welche über den Abfluss 7 einer Speicherstrecke zugeführt werden kann und in dieser gespeichert werden kann. Die Substratslösung kann bei einer Messung mit dem Biosensor-System verwendet werden.
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Eine Wasserprobe kann anschließend in der Mischstrecke 2 entchlort werden. Die integrierte Entchlorung basiert auf einer Anssäuerung der Wasserprobe, um das Gleichgewicht von in Hypochlorid und Chlorid dissoziiertem Chlor auf der einen Seite und Chlor auf der anderen Seite, in Richtung Chlor zu verschieben. OCl– + Cl– + 2H+ ⇌ Cl2 + H2O
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Dazu werden 180 μl Wasserprobe einer ersten Speicherstrecke zugeführt und in dieser gespeichert. Einer zweiten Speicherstrecke werden 32 μl 1 M HCl zugeführt und in dieser ebenfalls gespeichert. Die erste Speicherstrecke ist mit dem ersten Zufluss 5 verbunden und die zweite Speicherstrecke ist mit dem zweiten Zufluss 6 verbunden. über den ersten und zweiten Zufluss 5, 6 werden die beiden Lösungen Wasserprobe und HCl in einem Verhältnis von 10:1 durch Pumpen von 132 μl Wasserprobe und 18 μl HCl der Mischstrecke 2 zugeführt. Die beiden Lösungen werden in der Mischstrecke 2 zu einer Probenlösung gemischt und gleichzeitig findet in der Mischstrecke 2 eine Entgasung der Probenlösung statt. Die Entgasung erfolgt durch eine Reduzierung des Drucks der die Mischstrecke 2 umgebenden Kammer 4 auf z. B. 100 mbar. Dabei kann bei der Ansäuerung der Wasserprobe entstehendes Chlor als Gas durch den porösen Schlauch 3 in die Kammer 4 entweichen und wird z. B. durch die mit der Kammer 4 verbundenen Vakuumpumpen aus der Kammer 4 abgepumpt. Die entchlorte Probenlösung wird über den Abfluss 7 in eine Speicherstrecke gepumpt.
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Die Speicherstrecke ist mit dem Zufluss 5 oder 6 verbunden. Die entchlorte Probenlösung aus der Speicherstrecke kann über den Zufluss 5 oder 6 der Mischstrecke 2 zugeführt werden, wobei über den anderen Zufluss 6 oder 5 eine alkalische Lösung der Mischstrecke 2 zugeführt wird, und beide Lösungen gemischt werden. Die alkalische Lösung kann sowohl eine puffernde Substanz als auch andere, für die biochemische Messung notwendige Reagenzien enthalten. Die Konzentration der ursprünglich verwendeten puffernden Substanz und Reagenzien kann in einem Bereich liegen, bei welchem eine Mischung von Probenlösung und alkalischer Lösung mit einem gewünschten pH-Wert und einer gewünschten Salzkonzentration entsteht. Die Mischung von Probenlösung und alkalischer Lösung wird über den Abfluss 7 entweder einer Speicherstrecke zugeführt oder direkt zur Messung mit Hilfe des Biosensor-Systems z. B. einer Durchflusszelle mit elektrochemischen Biosensor-Array zugeführt.
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Die derart vorbereitete Probenlösung kann anschließend mit Hilfe des Biosensor-Systems auf die Anwesenheit und Konzentration von krankheitserregenden Verunreinigungen untersucht werden. Dazu können Vergleichsmessungen mit Hilfe eines elektrochemischen Sensor-Arrays zwischen der Probenlösung und der Substratlösung dienen.
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Das beschriebene Verfahren zur automatisierten Vorbereitung von Proben für eine Messung mit Hilfe eines Biosensor-Systems und die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bieten den Vorteil, dass sie vollautomatisch, autark ohne häufige Kontrolle, über längere Zeit hinweg z. B. an schlecht zugänglichen Orten durchgeführt werden können. Eine Echtzeitanalyse von z. B. Trinkwasser, welche ohne kostenintensive Laboruntersuchungen auskommt, und direkt in Wasserversorgungssysteme eingebaut werden kann, wird dadurch ermöglicht. Die für die automatische Vorbereitung der Proben notwendigen Chemikalien können langzeitstabil z. B. in einer Kartusche gelagert werden, welche nur noch in regelmäßigen Abständen von z. B. Monaten ausgetauscht werden muss. Das Ansetzen von frischen Lösungen, mit für die Messungen verwendeten Konzentrationen kann zeit-, platz- und kostensparend in einer Mischstrecke 2 erfolgen.
