DE102008030023A1

DE102008030023A1 - Arzneimittel zur Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit

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Publication number: DE102008030023A1
Application number: DE102008030023A
Authority: DE
Inventors: Mehrdad Dr. Ghashghaeinia; Kamran Dr. med. Ghoreschi; Martin Prof. Dr. Röcken; Florian Prof. Dr. Lang; Thomas Philipp Dr. Wieder
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Ghashghaeinia Mehrdad Dr De; Mehrdad Ghashghaeinia De
Priority date: 2008-06-16
Filing date: 2008-06-16
Publication date: 2009-12-17
Also published as: WO2010003528A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit sowie ein Verfahren zur Prophylaxe und Behandlung einer solchen Krankheit, in dem das neue Arzneimittel eingesetzt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit sowie ein Verfahren zur Prophylaxe und Behandlung einer solchen Krankheit, in dem das neue Arzneimittel eingesetzt wird.
Parasitäre Infektionen beim Menschen werden durch Protozoen bzw. Protista und Würmer verursacht. Zu den wichtigsten durch Parasiten ausgelösten Krankheiten des Menschen zählen Malaria, Trypanosomiasis bzw. Schlafkrankheit und Filariose.
Malaria ist eine Tropenkrankheit, die in etwa 100 Ländern endemisch auftritt. Etwa 40% der Weltbevölkerung lebt in Malaria-Gebieten. Nach Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation WHO erkranken weltweit jährlich etwa 500 Millionen Menschen. Bis zu 2,7 Millionen Menschen sterben an der Infektion, etwa die Hälfte davon sind Kinder unter fünf Jahren.
Malaria wird von einzelligen Parasiten der Gattung Plasmodium hervorgerufen. Bislang kennt man vier Erreger, die für den Menschen gefährlich sind, nämlich Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale und Plasmodium malariae. Die Krankheit wird durch den Stich einer weiblichen Stechmücke der Gattung Anopheles übertragen, die den Zwischenwirt darstellt.
Die Symptome der Malaria sind hohes, wiederkehrendes bis periodisches Fieber, Schüttelfrost, Beschwerden des Magen- und Darmtrakts und Krämpfe. Besonders bei Kindern kann die Krankheit rasch zu Koma und Tod führen.
Malaria wird derzeit vorwiegend chemotherapeutisch behandelt. Zu den bekanntesten Antimalariamitteln zählen Chloroquin und Mefloquin. Zu diesen Wirkstoffen sind jedoch zahlreiche Resistenzen beschrieben worden. Die im Falle von Resistenzen häufig verwendeten Antimalariamittel Atovaquon-Proguanil (Malarone^®), Doxycyclin, Artemether-Lumefantrin (Coartem^®) weisen eine höhere Wirksamkeit gegen den Erreger aus, zeichnen sich jedoch auch durch starke Nebenwirkungen aus.
Trypanosomiasis, auch als Schafkrankheit bezeichnet, ist eine durch Trypanosomen ausgelöste Tropenerkrankung, die von der Tsetsefliege übertragen wird. Die Schlafkrankheit kommt mit einem schwer erfassbaren regionalen Verteilungsmuster im gesamten Tropengürtel Afrikas vor. Insgesamt sind nach Schätzungen der WHO mehr als 500.000 Menschen betroffen. Durch die instabile politische Situation in vielen dieser Regionen hat die Erkrankungsrate in den letzten Jahren zugenommen.
Die Erkrankung verläuft in drei Stadien: Einige Wochen nach der Infektion kommt es zu Fieber, Schüttelfrost, Ödemen, Lymphknotenschwellung sowie Hautausschlag und Juckreiz. Im zweiten Stadium nach einigen Monaten stehen Symptome des Nervensystems im Vordergrund: Verwirrtheit, Koordinations- und Schlafstörungen sowie Krampfanfälle. Im Endstadium kommt es zu einem Dämmerzustand, der der Krankheit ihren Namen gegeben hat.
Die Therapie der Schlafkrankheit erfolgt ebenfalls vorwiegend chemotherapeutisch, in einem frühen Stadium bspw. durch die Gabe von Suramin oder Pentamidin. Diese Arzneimittel wirken jedoch nicht auf Erreger, die sich im zentralen Nervensystem befinden, da sie die Bluthirnschranke nicht überwinden. In einem späteren Stadium wird Melarsoprol oder Eflornithin verabreicht. Beide Medikamente wirken zwar gegen Erreger im zentralen Nervensystem, sind jedoch neurotoxisch.
Filariose ist eine Krankheit, die in Säugetieren durch parasitische Fadenwürmer ausgelöst wird. Zu den Erregern gehören bspw. Wuchereria bancrofti, Brugia malayi und Loa loa. Diese Erkrankung befällt jährlich über 150 Millionen Menschen und in drei Kontinenten sind über eine Milliarde Menschen dadurch bedroht.
Die meisten Filariosen werden durch Insekten übertragen. Die lymphatische Filariose wird durch den Stich von Anopheles-Mücken übertragen, die als Zwischenwirt dienen. Die Würmer dringen in das Lymphsystem des Wirtes ein und vermehren sich dort. Wenn die Erkrankung chronisch wird, entstehen an den Lymphen schwere Ödeme.
Die Filariose wird in der Regel mit Wurmmitteln behandelt. Da sich die Parasiten jedoch nicht wie beim üblichen Wurmbefall im Darm, sondern im Falle der lymphatischen Filariose im langsam zirkulierenden Lymphsystem befinden, ist die Behandlung sehr reich an Nebenwirkungen.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Arzneimittel zur Behandlung von durch Parasiten verursachten Krankheiten bereitzustel len, mit dem die Nachteile aus dem Stand der Technik gelindert oder vorzugsweise verhindert werden. Insbesondere soll ein solches Arzneimittel bereitgestellt werden, bei dem eine Resistenzentwicklung nicht zu befürchten ist. Ferner soll ein solches Arzneimittel bereitgestellt werden, das einfach und kostengünstig herzustellen ist.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Dimethylfumarat (DMF) und deren Derivate gelöst.
Dimethylfumarat weist die Formel CH₃COOCH=CHCOOCH₃ auf. Die CAS-Nummer lautet 624-49-7. Dimethylfumarat hat ein Molekulargewicht von 144,13.
Die von den Erfindern erstmals erkannte Wirkung von DMF war überraschend und nicht zu erwarten. So wird nämlich DMF bislang im Stand der Technik in völlig anderem Zusammenhang beschrieben.
DMF findet sich beispielsweise als Wirkstoff in dem Arzneimittel Fumaderm^®, das zur Behandlung von Psoriasis d. h. der Schuppenflechte eingesetzt wird.
In der US 7,320,999 wird die Verwendung von DMF zur Behandlung von Multipler Sklerose vorgeschlagen.
In der WO 00/30622 wird die Verwendung von DMF zur Behandlung von Host-Versus-Graft-Reaktionen und von Autoimmunerkrankungen vorgeschlagen.
In der US 2007/0027076 wird die Verwendung von DMF zur Behandlung von Herzinsuffizienz und Asthma vorgeschlagen.
Die Verwendung von DMF zur Behandlung bzw. Prophylaxe von durch Parasiten verursachten Krankheiten ist im Stand der Technik bislang nicht beschrieben.
DMF ist bereits als Arzneimittel zugelassen, nämlich zur Behandlung von Psoriasis. Es gibt also bereits grundsätzlich langjährige Erfahrungen mit dieser Substanz. Es bedarf deshalb auch keines größeren logistischen Aufwandes, um das Arzneimittel Bedürftigen bereitzustellen.
Ferner liegen bereits Ergebnisse toxikologischer und pharmakologischer Untersuchungen zu DMF vor. Diese können bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittels genutzt werden, so dass dieses für die neue Indikation kostengünstig herstellbar ist.
Die Erfinder schlagen mit der Bereitstellung von DMF zur Behandlung oder Prophylaxe einer durch Parasiten verursachten Krankheit erstmals ein Therapiekonzept vor, bei dem sich der Wirkstoff, d. h. DMF, nicht direkt gegen den Parasiten richtet, sondern in zelluläre Mechanismen der Wirtszellen, insbesondere der Erythrozyten, eingreift. Nach Erkenntnissen der Erfinder ist deshalb auch eine Resistenzentwicklung der Parasiten nicht zu befürchten.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass trotz des Eingriffs in den Metabolismus der Wirtszelle durch DMF der Wirt selbst nicht geschädigt wird sondern ausschließlich der Parasit. Die Erythrozytenparameter von mit DMF behandelten Probanden waren gegenüber denen von unbehandelten Probanden nahezu unverändert.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Unter ”Derivaten von DMF” werden Abkömmlinge von DMF verstanden, die durch chemische Modifikationen an DMF gebildet werden. Diese Modifikationen an DMF können sich vorteilhaft auf die Stabilität der Verbindung, ihre Freisetzung im Organismus etc. auswirken. Die erfindungsgemäße Wirkung bleibt bei den Derivaten jedoch weitgehend unverändert oder wird durch die Modifizierung sogar verstärkt.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die durch Parasiten verursachte Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Malaria, Trypanosomiasis und Filariose.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel zur Behandlung und Prophylaxe solcher Krankheiten angepasst wird, die zu den wichtigsten durch Parasiten verursachten Krankheiten zählen und für die bislang keine zufriedenstellenden Therapiekonzepte beschrieben sind.
Weiter ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Parasiten der Gattung Plasmodium, weiter bevorzugt der Art Plasmodium falciparum und/oder Plasmodium berghi angehören.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel derart angepasst wird, dass es sich konkret gegen die Erreger richtet, die häufig für eine Erkrankung an Malaria verantwortlich sind. So konnten die Erfinder in ihren Experimenten exemplarisch an den beiden genannten Plasmodium-Arten die erfindungsgemäß erkannte Wirkung von DMF demonstrieren.
Weiter ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das Arzneimittel einen weiteren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit geeigneten Wirkstoff aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass so ein Kombinationspräparat bereitgestellt wird, welches neben DMF bzw. einem Derivat hiervon zusätzlich einen Wirkstoff aufweist, der im Stand der Technik derzeit in der Therapie der Malaria, Trypanosomiasis und Filariose Einsatz findet. Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Arzneimittels kann durch eine sich ergebende synergistische Wirkung nochmals verstärkt werden.
Dabei ist es bevorzugt, wenn der weitere Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Desipramin, Chloroquin, Mefloquin, Atovaquin, Proguanil, Artemether, Lumefantrin, Doxycyclin, Primaquin, Artemisinin, Artesunat, Arteflene, Artemotil, Dihydroartemisinin, Arteether, Halofantrin, Amodiaquin, Sulfadoxin, Pyrimethamin, Tafenoquin, Atovaquon, Fosmidomycin, Suramin, Pentamidin, Melarsoprol, Eflornithin, Doxycyclin, Diethylcarbamazinecitrat, Albendazol, Ivermectin.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass als weiterer Wirkstoff in dem Kombinationspräparat ein solcher Verwendung findet, der im Markt ausreichend zur Verfügung steht und ggf. bereits zugelassen ist. Das Kombinationspräparat kann dadurch relativ kostengünstig hergestellt werden.
So konnten die Erfinder mittels Experimenten demonstrieren, dass eine Kombination aus DMF und Desipramin, einem zugelassenen Arzneimittel, nicht nur additive sondern synergistische inhibierende Wirkungen auf die Parasitenvermehrung zeigt.
Es versteht sich, dass das Arzneimittel erfindungsgemäß einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweisen kann.
Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfassend beschrieben, beispielsweise in Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, Kibbe et al. (2000), Handbook of pharmaceutical excipients, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. Der Inhalt der vorgenannten Publikationen ist Gegenstand der vorliegenden Offenbarung.
DMF lässt sich erfahrungsgemäß gut und stabil in Tabletten formulieren. Das Arzneimittel wird deshalb erfindungsgemäß vorzugsweise oral eingenommen, bspw. in Form einer Tablette.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit bei einem Lebewesen, das die Verabreichung von Dimethylfumarat (DMF) und deren Derivate in ein Lebewesen umfasst.
Das Verfahren weist folgende Schritte auf: (1) Bereitstellung von Dimethylfumarat (DMF) und/oder deren Derivate, (2) Verabreichung von DMF und/oder deren Derivate in ein zu behandelndes Lebewesen, vorzugsweise einen Menschen, und (3) ggf. Wiederholung der Schritte 1 und 2.
Die Eigenschaften, Merkmale und Vorteile, die für die erfindungsgemäße Verwendung bzw. das Arzneimittel beschrieben sind, gelten mutatis mutandis für das erfindungsgemäße Verfahren.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben, aus denen weitere Merkmale und Vorteile ergeben. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren. In denen ist folgendes dargestellt:
1 zeigt die apoptotischen Wirkungen von DMF auf Erythrozyten.
2 zeigt die Aufhebung der durch DMF in Erythrozyten induzierten apoptotischen Wirkungen durch Zugabe des Antioxidans NAC.
3 zeigt, dass die Wirkungen von DMF auf die Erythrozyten durch einen zusätzlichen Stressfaktor additiv verstärkt werden.
4 zeigt die Wirkungen von DMF im Hinblick auf den ATP- und GSH-Haushalt der Erythrozyten.
5 zeigt die Auswirkungen von Antioxidantien auf die DMF-induzierte Eryptose und GSH-Depletion.
6 zeigt die Auswirkungen von DMF auf den Calciumhaushalt der Erythrozyten.
7 zeigt in der Fluoreszenzmikroskopie, dass die DMF-induzierte Eryptose nicht mit einer Hämolyse der Erythrozyten assoziiert ist.
8 zeigt die Auswirkungen von DMF auf die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).
9 zeigt, dass DMF das Wachstum und die DNA-Amplifizierung von Plasmodium falciparum in humanen Erythrozyten in vitro inhibiert.
10 zeigt, dass DMF die Proliferation von Plasmodium falciparum in humanen Erythrozyten in vitro inhibiert.
11 zeigt, dass DMF die Proliferation von Plasmodium berghei in Mäusen in vivo inhibiert.
12 zeigt, dass DMF eine vollständige Heilung von über 60% der von Plasmodium berghei-infizierten Experimentalmäuse in vivo.
Ausführungsbeispiele
1. Material und Methoden
1.1 Erythrozyten und Lösungen
Über die Blutspendezentrale Tübingen wurden Erythrozytenkonzentrate von 50 gesunden Freiwilligen mit verschiedenen Blutgruppen erhalten. In den jeweiligen Experimenten wurden, sofern nicht anders angegeben, Aliquote der Erythrozytenkonzentrate bei 0,3% Hämatokritwert entweder direkt verwendet, oder bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Die Experimente wurden bei 37°C in Ringerlösung durchgeführt, die Folgendes enthielt (in mM): 125 NaCl, 5 KCl, 1 MgSO₄, 32 N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES)/NaOH, 5 Glucose, 1 CaCl₂, pH 7,4. Für die Energiedepletion wurde die Glucose in der Ringerlösung weggelassen. Sofern angegeben, wurden das Ca⁺⁺-Ionophor Ionomycin (0,1 μM), N-Acetyl-L-cystein (NAC) (1 mM) und Dimethylfumarat (DMF) (7–140 μM) zugegeben. Die Substanzen wurden in Endkonzentrationen von 0,2% Dimethylsulfoxid (DMSO) (Ionomycin, DMF) gelöst. NAC wurde in bidestilliertem Wasser mit Endkonzentrationen des Lösungsmittels von 0,2% gelöst. Ionomycin, NAC und DMF wurden von Sigma (Taufkirchen, Deutschland; DMF: #47967) bezogen.
1.2 FACS-Analyse
Um die Apoptose der roten Blutzellen (RBC), d. h. die Eryptose zu evaluieren, wurde eine Durchflusszytometrieanalyse durchgeführt, wie beschrieben in Andree et al. (1990). Erythrozytenkonzentrate (0,3% Hämatokrit) wurden mit verschiedenen Konzentrationen von DMF behandelt. Nach der Inkubation wurden 100 μl der Zellen in Annexinbindepuffer gewaschen, der folgendes enthielt (in mM): 125 NaCl, 10 HEPES (pH 7,4) und 5 CaCl₂. Die Erythrozyten wurden mit Annexin-Fluos (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) bei einer 1:35-Verdünnung gefärbt und vorsichtig auf einem Vortex-Mischer gemischt. FITC-Annexin-V ist in der Lage, an Phosphatidylserin (PS) zu binden, das bei der Apoptose auf der Außenseite der Plasmamembran exponiert wird. Nach einer 20-minütigen Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) wurden die Proben 1:5 verdünnt, vorsichtig gemischt, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, und mittels Durchflusszytometrieanalyse vermessen (FACS-Calibur von Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland). Die Zellen wurden durch Vorwärts-Scatter (FSC) analysiert und die Annexinfluoreszenzintensität wurde im FL-1 mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm gemessen.
1.3 Messung von freiem intrazellulärem Ca⁺⁺
Freies zytosolisches Ca⁺⁺ wurde durch Verwendung des Fluoreszenz Ca⁺⁺-Indikators Fluo3/AM gemessen; Andrews et al. (2002). Erythrozyten (0,3% Hämatokrit), suspendiert in 6 ml Fluo3/AM-Puffer, enthaltend (in mM) 123 NaCl, 5 KCl, 1 MgSO₄, 25 HEPES (pH 7,4), 10 Glucose, 10 Natriumpyrovat und 2 CaCl₂, wurden mit 10 μl Fluo3/AM (Calbiochem, Bad Soden, Deutschland) einer Stammlösung (2,0 mM in DMSO) geladen. Die Zellen wurden bei 37°C für 20 min unter Schütteln und lichtgeschützt inkubiert. Weitere 12 μl Fluo3/AM wurden hinzugegeben, die Inkubation erfolgte für weitere 40 min ohne Schütteln. Fluo3/AM beladene Erythrozyten wurden bei 1500 rpm für 5 min bei 22°C zentrifugiert. Überschüssige Farblösung wurde entfernt, indem die Erythrozyten zweimal mit Fluo3/AM-Puffer und einmal mit Ringerlösung gewaschen wurden. Für die Durchflusszytometrie wurden Fluo3/AM beladenen Erythrozyten in Ringerlösung (0,1% Hämatokrit) resuspendiert, enthaltend DMF (140 μM), den Calciumionophor Ionomycin (0,1 μM), als Positivkontrolle den Vehikel allein. Nach der Inkubation für verschiedene Zeiträume bei 37°C wurde die Ca⁺⁺-abhängige Fluoreszenzintensität im Fluoreszenzkanal FL-1 gemessen. Da keinerlei Veränderungen in den zytosolischen Ca⁺⁺-Konzentrationen der Erythrozyten, die mit DMF für bis zu 6 h behandelt wurden, festgestellt wurden (Daten nicht gezeigt), wurden die Zellen zuerst mit DMF für 48 h vorbehandelt, zentrifugiert und dann in Fluo3/AM-Puffer resuspendiert, wie oben beschrieben. Um festzustellen, ob sowohl die DMF- als auch vehikelbehandelten Erythrozyten die gleiche Fluo3/AM-Ladekapazität haben, wurde zusätzlich Ionomycin als interne Kontrolle verwendet.
1.4 Bestimmung der intrazellulären ATP-Konzentration
Zur Bestimmung der ATP-Konzentrationen wurde ein Firefly-Luciferase-Assay verwendet; Lang et al. (2004). Luciferase und ATP wurden in lyophilisierter Form erhalten (ATP Bioluminescence Assay Kit HS II: Roche Diagnostics). Erythrozytenkonzentrate (5% Hämatokrit) wurden für 24 und 48 h bei 37°C mit Standard-Ringerlösung mit und ohne 70 μM DMF inkubiert. Für die ATP-Depletion (als Positivkontrolle), wurde Glucose (5 μM) in der Standard-Ringerlösung weggelassen. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal in PBS bei 3600 rpm für 5 min bei 4°C gewaschen, und in 700 μl destilliertem Wasser lysiert (50 μl). Die Proteine wurden durch 500 μl des chaotrophen Reagens Perchlorsäure (6%) präzipitiert. Nach der Inkubation für 10 min auf Eis und der Zentrifugation für 10 min bei 14000 rpm bei 4°C wurde ein Aliquot des Überstandes (400 μl) durch die Zugabe von 45 μl gesättigter KHCO₃-Lösung neutralisiert. Das Präzipitat wurde dann durch Zentrifugation bei 10000 rpm bei 4°C für 8 min entfernt. Das Aliquot aus dem Überstand wurde 20-fach mit Ringerlösung (pH 7,8) verdünnt und 100 μl dieses Extraktes wurden verwendet. Für die Analyse von ATP wurden 100 μl Ringerlösung (pH 7), Probenextrakt oder ATP-Standardlösung in Polysterolteströhrchen gegeben, gefolgt von der Zugabe von 40 μl Luciferaselösung. Das Lumineszenzsignal wurde in einem Luminometer (Berthold Biolumat LB9500; Bad Wildbad, Deutschland) gemäß der Angaben des Herstellers gemessen. Die ATP-Konzentrationen werden in % der Ringer-behandelten Kontrollen ausgedrückt.
1.5 Glutathionmessungen
GSH bezieht sich auf die reduzierte Form von Glutathion und GSSG auf das oxidierte Disulfid-Dimer. GSx bezieht sich auf die Tripeptideinheit mit unspezifiziertem Oxidationsstatus (GSH-Äquivalente) und wurde in einer Mikrotiterplatte gemäß der Techniken von Dringen und Hamprecht (1996) quantifiziert, in dem die Methode verwendet wurde, die ursprünglich von Tietze (1969) beschrieben wurde. Die Proben (Zellextrakte) und Standards wurden mit genau der gleichen Methode behandelt. Die Proben und Standards wurden auf Eis gehalten, bis diese in die Mikrotiterplatte gegeben wurden. 10 μl der Zelllysate oder Standards, enthaltend 0–100 prol von GSx/10 μl, wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten überführt und mit 90 μl Wasser verdünnt, so dass sich eine Endkonzentration von 0,1% Sulfosalicylsäure ergab. Nach der Zugabe von 100 μl Reaktionsmischung [0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) enthalten 1 mM EDTA, 0,3 mM 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), 0,4 mM NADPH und 1 U/ml Glutathionreduktase] wurde die Zunahme der Extinktion bei 405 nm in 30 s-Intervallen über einen Bereich von 5 min unter Verwendung eines Mikrotiterlesegerätes (Thermo Electron Corporation, Multiskan EX, Finnland) detektiert. Die Glutathiongehalte wurden evaluiert, indem eine Kalibrierungskurve verwendet wurde, die mit Standardproben erstellt wurde. Glutathiondisulfid wurde quantifiziert nach der Derivatisierung von reduziertem Gutathion mit 2-Vinylpyridin (2VP), um GSH zu konjugieren, bevor das verbleibende GSSG vermessen wurde; Griffith (1980). Kurz zusammengefasst, 130 μl des proteinfreien Überstandes wurden mit 5 μl unverdünntem 97%-igem 2VP gemischt und mit 0,2 M Tris-Base (Sigma-Ultra) auf pH 5 eingestellt; Griffith (1985). Standardmengen von GSSG wurden auf die gleiche Art und Weise behandelt. Nach einer 1-ständigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden 10 μl der 2VP behandelten Proben, wie oben beschrieben, gemessen, indem eine Kalibrierungskurve verwendet wurde, die zwischen 0 und 100 prol von GSSG pro Vertiefung erstellt wurde. Die Extinktion bei 405 nm wurde über einen Zeitraum von 5 min in 30 s-Intervallen verfolgt. Unter diesen experimentellen Bedingungen wurde die Fraktion des GSx- Gehaltes, der als GSSG gefunden wird, nicht detektiert. Die Erythrozytenkonzentrate (0,4% Hämatokrit) wurden mit variierenden Konzentrationen von DMF behandelt. Nach 24-ständiger Inkubation wurde 1 ml der Zellen zweimal mit PBS gewaschen und wie oben beschrieben untersucht.
1.6 Messung der Inhibition des Parasitenwachstums und der DNA-Amplifikation in vitro
Der Stamm BinH von Plasmodium falciparum wurde aus der Kryokonservierung heraus kontinuierlich kultiviert, in humanen Erythrozyten gehalten und auf das Ringstadium durch Sorbitolbehandlung synchronisiert, vgl. Tanneur et al. (2006). Das Kulturmedium bestand aus RPMI 1640, versetzt mit 0,5% serumfreien AlbuMax II (Gibco, Karlsruhe, Deutschland), 25 mM HEPES/NaOH (pH 7,4), 2 mM Glutamin und 20 μg pro ml Gentamycin. Die Parasiten wurden in einem Gefäß in einer Gasumgebung mit etwa 3% O₂, 6% CO₂ und 91% N₂ bei 37°C kultiviert. Stammlösungen von Dimethylfumarat (DMF) wurden in DMSO (Applichem, Deutschland) hergestellt und in vollständigem Kulturmedium auf Endkonzentrationen von 1 bis 140 μM verdünnt. Der Wirkstoff wurde dann zu Sorbitol synchronisierten Parasitkulturen, die sich ausschließlich im Ringstadium befinden, in 96-Vertiefungen-Platten (200 μl Aliquote, 0,5–1% Parasitämie und 1% Endhämatokrit) hinzugegeben. Die Wachstumsinhibition für verschiedene DMF-Konzentrationen wurde bestimmt, indem die Parasitämie in der behandelten Kultur mit der in der Kontrollkultur (ohne DMF) auf der gleichen Platte zum Zeitpunkt 0 und nach 48 h durch Durchflusszytometrie verglichen wurde. Um die DNA/RNA-Amplifizierung abzuschätzen, wurden die Parasitenkulturen im Ringstadium synchronisiert und nach 6-ständiger Kultivierung, nahe an dem Parasitenentwicklungsstadium, re-synchronisiert, aliquotiert (200 ml Aliquote, 10% Parasitämie und 2% Hämotokrit), und für weitere 16 h in Gegenwart oder Abwesenheit von DMF-Konzentrationen (1 bis 140 μM) inkubiert. Die Parasitämie wurde durch den prozentualen Anteil von RBCs definiert, gefärbt mit dem DNA/RNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff Syto 16 (30 nM Endkonzentration; Molecular Probes, Göttingen, Deutschland). Die DMF-Konzentration, die 50% Inhibition verursacht (IC₅₀) wurde aus den Konzentrations-Wirkungs-Kurven erhalten. Die DMSO-Konzentration in den Kulturen lag in keinem Fall höher als 0,2 und beeinflusste nicht das Parasitenwachstum.
1.7 Messung des Parasitenwachstums und der Anti-Malaria-Wirkung von DMF in vivo
Der Anti-Malaria-Test wurde mit adulten 129 SVJ-Mäusen (Körpergewicht 20 ± 2 g) durchgeführt. Ein Aliquot (0,2 ml) enthaltend 4 × 10⁵ P. berghei wurde intravenös (Tag Null) in Gruppen von Experimental- und Kontrollmäusen (jeweils n = 6) injiziert. Die Experimentalmäuse wurden bei DMF-enthaltendem Wasser bei Dosen von 50 mg/kg Körpergewicht 10 Tage vor der Infektion für insgesamt 6 Wochen gehalten. Eine Heilung wurde definiert als Überleben bis zum 41. Tag nach der Behandlung (orale Dosierung). In den unbehandelten Kontrollmäusen stieg die Parasitämie regelmäßig auf 15% ab dem 14. Tag nach der Infektion. Nicht behandelte Kontrollmäuse starben üblicherweise an den Tagen 13 bis 15 nach der Infektion. Blutabstriche wurden 8 Tage nach der Parasiteninokulation täglich entnommen und die Mortalität wurde für weitere 4 Wochen überwacht. Über die gesamten Experimente erhielten die Tiere autoklaviertes Leitungswasser und Nahrung nach Belieben und wurden in einem klimatisierten Tierraum bei 22 bis 23°C gehalten.
1.8 Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
ROS wurden durch einen oxidativ-sensitiven Farbstoff, 5-(und 6-)-Chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetatacetylester (CM-H₂DCFDA; Molecular Probes, Eugene, OR) gemäß der Techniken von Turturro et al. (2007) mit einigen Veränderungen detektiert, indem die Methode verwendet wurde, die ursprünglich von Keston und Brandt (1965) und von Royall und Ischiropoulos (1992) beschrieben wurde. CM-H₂DCFDA, ein nicht- fluoreszierendes Molekül, das nach der Oxidation im Zytoplasma der Zellen fluoresziert, wird weitgehend verwendet, um oxidativen Stress zu messen. CM-H₂DCFDA wurde in DMSO gelöst, um eine 10 mM-Stammlösung zu erhalten. Vor der Beladung von Erythrozyten (0,3% Hämotokrit), wurde die Stammlösung im Dunkeln mit Ringerlösung gemischt, um eine CM-H₂DCFDA-Endkonzentration von 10 μM zu erhalten. Beladene Erythrozyten wurden bei 37°C für 40 min unter leichtem Schütteln und lichtgeschützt inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gespült, resuspendiert und in Ringerlösung enthaltend DMF (70 μM) oder Vehikel allein (DMSO als Negativkontrolle) inkubiert. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurde ein Aliquot (200 μl) von beladenen Erythrozyten entfernt, gewaschen, in Ringerlösung resuspendiert und die FACS-Analyse wurde direkt durchgeführt. Für H₂O₂-abhängige Oxidation von CM-H₂DCFDA wurde ein Aliquot (200 μl) von beladenen und Vehikelbehandelten Erythrozyten an 0,003% H₂O₂ exponiert. Die Fluoreszenzintensität wurde 7 min nach der Initiierung der Reaktion durch H₂O₂-Zugabe bestimmt. Diese Proben dienten als Positivkontrolle. Die mittlere Fluoreszenzintensität wurde durch Durchflusszytometrieanalyse auf einem FACS-Calibur von Becton Dickinson gemessen. In einem zweiten Ansatz wurden die Zellen zuerst mit DMF für 24 h vorbehandelt, zentrifugiert und in Ringerlösung resuspendiert und anschließend mit CM-H₂DCFDA beladen, wie zuvor beschrieben.
1.9 Fluoreszenzmikroskopie
Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen erfolgten gemäß Standardprotokollen.
2. Ergebnisse
2.1 DMF induziert Eryptose
Die Erfinder konnten nachweisen, dass eine 48-ständige DMF-Behandlung in den Erythrozyten eine sehr starke Eryptose verursacht; vgl. 1A Die Eryptose nimmt nach einer 24- sowie einer 48-ständigen Behandlung der Erythrozyten mit zunehmenden Konzentrationen sehr stark zu; vgl. 1B.
Die Zellschrumpfung der Erythrozyten wird nach einer 24-ständigen Inkubation mit zunehmenden Konzentrationen von DMF gesteigert; vgl. 1C.
Eine 70 μM Behandlung der Erythrozyten mit DMF verursacht mit fortschreitender Zeit (24 sowie 48 h) eine Zunahme der Zellschrumpfung; vgl. 1D (die 70 sowie 140 μM DMF-Konzentrationen entsprechen den Serum-Konzentrationen von DMF in Patienten mit Psoriasis).
In 1E wird gezeigt, dass unterschiedliche DMF-Konzentrationen (7–140 μM) keineswegs eine hämolytische Wirkung auf den Erythrozyten haben. Mit anderen Worten: Die Zellmembran-Integrität wird auf keinen Fall von DMF beeinträchtigt. Das deutet darauf hin, dass die DMF-Wirkung auf die Erythrozyten eine mechanistische und nicht eine mechanische Wirkung ist.
2.2 Antioxidantien inhibieren vollständig die in Erythrozyten durch DMF induzierten Wirkungen
sEine N-Acetyl-L-Cystein (NAC)-Vorbehandlung hebt die eryptotische Wirkung von DMF vollständig auf; vgl. 2A und 2B.
NAC hebt die DMF-induzierte Zellschrumpfung in den Erythrozyten vollständig auf; vgl. 2C.
2.3 Stressfaktoren verstärken die in Erythrozyten durch DMF induzierten Wirkungen
In 3A ist gezeigt, dass eine Glukose-Depletion (gekennzeicht als – DMF) in den Erythrozyten die Eryptose auslöst und eine Kombination von DMF-Behandlung und Glukose-Depletion in den Erythrozyten eine verstärkte (additive) Eryptose verursacht.
Sinn und Zweck dieses Versuches war, zu zeigen, dass ein von vornherein gestresster Erythrozyt, z. B. ein von Parasiten befallener Erythrozyt, unter Einwirkung von DMF, als einen weiteren zusätzlichen Stressfaktor, kein geeigneter Wirt für einen Parasit sein kann.
In 3B werden die 2A gezeigten Ergebnisse hinsichtlich der Annexin-Bindung in anderer Form dargestellt.
Eine Glukose-Depletion trägt sehr stark zur Zellschrumpfung bei und DMF kann eine Glukose-Depletion-bedingte Zellschrumpfung nicht mehr erhöhen; vgl. 3C. Denn eine Zelle, hier der Erythrozyt, kann nicht unbegrenzt schrumpfen. Und wenn eine einzige Substanz die maximale Zellschrumpfung bewirkt, hier die Glukose-Depletion nach 24-ständiger Inkubation, kann eine weitere Substanz, hier DMF, die ebenso eine Zellschrumpfung bewirkt, nicht mehr für eine weitere Zellschrumpfung sorgen.
2.4 Auswirkungen von DMF auf den ATP- und GSH-Haushalt der Erythrozyten
DMF beeinträchtigt keineswegs den ATP-Haushalt der Erythrozyten; vgl. 4A. Als Positivkontrolle wurden die Erythrozyten unter dem Einfluss einer Glukose-Depletion untersucht, die zu einem massiven ATP-Verlust in den Erythrozyten führt.
DMF kann eine massive Glutathion-Depletion in den Erythrozyten verursachen; vgl. 4B.
Das Resultat aus 4 lässt die Schlussfolgerung zu, dass die DMF-induzierte Eryptose den ATP-Energiehaushalt der Erythrozyten nicht beeinträchtigt.
2.5 Auswirkungen von Antioxidantien auf die DMF-induzierte Eryptose und GSH-Depletion
Hier wurden die Daten aus der 2A–C übernommen. Es ist gezeigt, dass NAC die DMF-induzierte Eryptose vollständig hemmen kann; vgl. 5A bis 5C.
In 5D ist gezeigt, dass eine parallele Messung der Eryptose und des Glutathion-Levels aus einem einzigen Experiment dasselbe Resultat ergibt wie zuvor in zwei verschiedenen Experimenten in 2A–B sowie 4B beobachtet.
2.6 Auswirkungen von DMF auf den Calciumhaushalt der Erythrozyten
In 6A ist gezeigt, dass DMF einen massiven Ca⁺⁺-Einstrom in die Erythrozyten induziert, der über 500% über dem von Kontroll-Erythrozyten ohne DMF-Behandlung liegt. Ein Ca⁺⁺-Einstrom in den Erythrozyten ist unmittelbar mit der Eryptose assoziiert.
In 6B ist der zeitabhängige Ca⁺⁺-Einstrom in die Erythrozyten gezeigt.
Die DMF-bedingte Erythrozyten-Schrumpfung hat keinen Einfluß auf die Fluo3/AM-Ladekapazität, da sowohl die DMF- als auch vehikelbehandelten Erythrozyten die gleiche Fluo3/AM-Ladekapazität aufweisen; vgl. 6C. Mit anderen Worten: der massive Ca⁺⁺-Einstrom in die Erythrozyten ist DMF-spezifisch.
2.7 Die DMF-induzierte Eryptose ist nicht mit einer Hämolyse der Erythrozyten assoziiert
In der 7 ist anhand von Fluoreszenz-Mikroskopie-Daten qualitativ gezeigt, dass unter Einwirkung von DMF die Zellmembranintegrität der Erythrozyten vollständig erhalten bleibt und die DMF-induzierte Eryptose nicht auf eine mechanische Schädigung der Erythrozyten-Membran zurückzuführen ist. Dadurch wird die quantitative Aussage des Hämoglobin-Release-Assays aus der 2E qualitativ bestätigt.
2.8 Auswirkungen von DMF auf die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
Hier wird gezeigt, dass DMF die ROS-Bildung, z. B. H₂O₂ (Wasserstoffperoixd)-Bildung, in den Erythrozyten induziert; vgl. 8. Es ist erwiesen, dass ROS-Bildung in den Erythrozyten die Eryptose auslöst.
2.9 DMF inhibiert vollständig das Wachstum von Plasmodium falciparum in Erythrozyten in vitro
In 9 ist gezeigt, dass DMF das Wachstum von in kontinuierlich kultiviertem, in humanen Erythrozyten gehaltenem und auf das Ringstadium durch Sorbitolbehandlung synchronisiertem Palsmodium flaciparum (Pf) vollständig hemmen kann.
Mit anderen Worten: Unter DMF-Behandlung bekommt der Parasit keine Gelegenheit zu wachsen, da der doppelt gestresste Erythrozyt, durch die Plasmodium-Infektion und DMF-Behandlung, nicht mehr als ein geeigneter Wirt für die Parasitenvermehrung dienen kann. Vermutlich kann sich dieser Erythrozyt allerhöchstens nur notdürftig am Leben halten oder stirbt vollständig ab. Eine Vermehrung ist jedoch nicht möglich.
2.10 DMF inhibiert die DNA-Amplifizierung von Plasmodium falciparum in Erythrozyten in vitro
In 10 ist gezeigt, dass DMF die DNA-Amplifizierung von in kontinuierlich kultiviertem, in humanen Erythrozyten gehaltenem und auf das Ringstadium durch Sorbitolbehandlung synchronisiertem Palsmodium flaciparum (Pf) vollständig hemmen kann.
Mit anderen Worten: Unter DMF-Behandlung bekommt der Parasit keine Gelegenheit sein Genom zu amplifizieren, da der doppelt gestresste Erythrozyt, durch die Plasmodium-Infektion und DMF-Behandlung, nicht mehr als ein geeigneter Wirt für den Parasitvermehrung dienen kann. Dieser Erythrozyt kann sich, wenn überhaupt, höchstens selbst notdürftig am Leben halten.
2.11 DMF inhibiert die Proliferation von Plasmodium berghei in Mäusen in vivo
In 11 ist gezeigt, dass eine zehntägige Vorbehandlung der SVJ129-Mäuse mit DMF (50 mg/Körpergewicht in kg) vor der Infizierung mit Plasmodium berghei und die darauffolgende kontinuierliche Behandlung der Experimentalmäuse mit DMF über insgesamt sechs Wochen eine massive Abnahme der Parasitämie in den Experimentalmäusen bewirkt. Im Gegensatz dazu, starben alle Kontrollmäuse (ohne DMF-Behandlung) unter ständiger Erhöhung der parasitämie nach spätestens zwei Wochen.
Mit anderen Worten: DMF bewirkt eine massive Abnahme der Parasitämie in vivo.
2.12 DMF begünstigt eine vollständige Heilung von über 60% der von Plasmodium berghei-infizierten Experimentalmäuse in vivo
In 12 ist gezeigt, dass eine zehntägige Vorbehandlung der SVJ129-Mäuse mit DMF (50 mg/Körpergewicht in kg) vor der Infizierung mit Plasmodium berghei und die darauffolgende kontinuierliche Behandlung der Experimentalmäuse mit DMF über insgesamt sechs Wochen eine massive Heilung (über 60%) der Experimentalmäuse unter gleichzeitig starker Abnahme der Parasitämie bewirkt, während 100% der Kontrollmäuse (Mäuse ohne DMF-Behandlung) spätestens nach zwei Wochen unter ständiger Erhöhung der Parasitämie starben.
Mit anderen Worten: DMF bewirkt eine massive Abnahme der Parasitämie und damit assoziierte Heilung der Experimentalmäuse in vivo, die mit dem Plasmodium berghei infiziert wurden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- US 7320999 [0018]
- WO 00/30622 [0019]
- US 2007/0027076 [0020]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Bauer et al. (1999) [0038]
- Kibbe et al. (2000) [0038]
- Andree et al. (1990) [0058]
- Andrews et al. (2002) [0059]
- Lang et al. (2004) [0060]
- Griffith (1980) [0061]
- Tanneur et al. (2006) [0062]
- Turturro et al. (2007) [0064]
- Keston und Brandt (1965) [0064]
- Royall und Ischiropoulos (1992) [0064]

Claims

Verwendung von Dimethylfumarat (DMF) und deren Derivate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Malaria, Trypanosomiasis, Filariose.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Parasiten der Gattung Plasmodium angehören.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Parasiten der Art Plasmodium falciparum und/oder Plasmodium berghei angehören.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel einen weiteren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit geeigneten Wirkstoff aufweist.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Desipramin, Chloroquin, Mefloquin, Atovaquon, Proguanil, Artemether, Lumefantrin, Doxycyclin, Primaquin, Artemisinin, Artesunat, Arteflene, Artemotil, Dihydroartemisinin, Arteether, Halofantrin, Amodiaquin, Sulfadoxin, Pyrimethamin, Tafenoquin, Atovaquon, Fosmidomycin, Suramin, Pentamidin, Melarsoprol, Eflornithin, Doxycyclin, Diethylcarbamazinecitrat, Albendazol, Ivermectin.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer durch Parasiten verursachten Krankheit bei einem Lebewesen, das die Verabreichung von Dimethylfumarat (DMF) und deren Derivate umfasst.