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Die
vorliegende Erfindung betrifft 4-Amino-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dionderivate,
die in der 6-Position und/oder an der Aminogruppe substituiert sind,
sowie deren Ester oder Ether und deren Tautomere und Stereoisomere
und deren Salze, Verfahren zu deren Herstellung, pharmazeutische
Zusammensetzungen, sowie ihre Verwendung als Arzneimittel und ihre
Verwendung als Farbstoffe und Lacke.
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Die
Suche nach neuen therapeutischen Wirkstoffen wurde in den letzten
Jahren durch ein besseres molekulares Verständnis der Signalwege
unterstützt, die von extrazellulären Signalen,
z. B. Hormonen, Zytokinen und Morphogenen, oder anderen Stimuli,
z. B. ultravioletter Strahlung, bakteriellem Endotoxin und anderen
Stressfaktoren, ausgelöst werden und die deren Wirkungen
in einem bestimmten Organ bzw. an den ent sprechenden Organzellen
vermitteln. Eine wichtige Gruppe von Enzymen, die an solchen Signalwegen
teilnehmen und der Signalweiterleitung und Verstärkung
dienen, sind die Proteinkinasen. Hemmstoffe dieser Enzym-Klasse
haben sich als therapeutische Wirkstoffe inzwischen etabliert.
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Proteinkinasen
katalysieren einen Phosphoryltransfer von einem Nukleotid-Trisphosphat
zu einem Proteinakzeptor. Zumeist werden mehrere Proteine als Substrate
akzeptiert. Die Proteinakzeptoren sind entweder selbst in den Signalweg
integriert oder vermitteln die Wirkung des Signalwegs an einer zellulären
oder extrazellulären Zielstruktur. Auf diese Weise kann
ein extrazellulärer Stimulus eine oder mehrere Reaktionen hervorrufen,
die mit der Zelldifferenzierung, dem Zellwachstum, der Migration,
der Kontrolle von Proteinsynthese und -sekretion, der Stoffwechseltätigkeit
und anderen zellulären Leistungen verbunden sind.
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Viele
Erkrankungen gehen auf eine Fehlsteuerung in den genannten Signaltransduktionswegen
zurück. Häufig sind Proteinkinasen mit abnormal
veränderter Aktivität und/oder Menge für
diese Fehlsteuerungen verantwortlich. Zu solchen Krankheiten gehören
beispielsweise Autoimmunkrankheiten, Entzündungskrankheiten,
Stoffwechselkrankheiten, Organ-Erkrankungen wie Knochenkrankheiten,
kardiovaskuläre Krankheiten, neurologische und neurodegenerative
Erkrankungen, Asthma und hormonbedingte Krankheiten. Immer dann, wenn
die Fehlsteuerung auf eine vorübergehend oder dauerhaft
erhöhte Aktivität von Proteinkinasen zurückgeht,
können Inhibitoren dieser Proteinkinasen zu einer Linderung
der Folgen bzw. einer Heilung beitragen. In Anbetracht der Verflechtungen
verschiedener Signalwege (Cross-talk) und der zentralen Stellung
von Proteinkinasen in diesen Netzwerken muss jedoch immer damit
gerechnet werden, dass neben der/den erwünschten Wirkung(en)
auch unerwünschte Nebenwirkungen auftreten und den Einsatz
dieser Inhibitoren erheblich einschränken oder unmöglich
machen. Vor diesem Hintergrund ist es wichtig, solche Inhibitoren
von Proteinkinasen bereitzustellen, die ein differenziertes Wirkungsspektrum
aufweisen, das erwünschte Wirkungen umfasst und unerwünschte
bzw. gefährliche Wirkungen ausschließt. Es liegt
in der Natur der Sache, dass ein solches Wirkungsspektrum durch
verschiedene Eigenschaften und Wirkmechanismen des jeweiligen Inhibitors
erreicht werden kann. Hierin eingeschlossen ist die Möglichkeit,
dass der in Frage kommende Inhibitor nicht nur eine, sondern gegebenenfalls
zwei oder mehrere Proteinkinasen mit unterschiedlicher Effizienz
zu hemmen vermag.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, die aus dem Stand der Technik
bekannten Nachteile der bekannten Proteinkinase-Inhibitoren zu überwinden.
Diese Aufgabe wird durch die anspruchsgemäßen Verbindungen,
deren Herstellungsverfahren, pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend
die anspruchsgemäßen Verbindungen sowie deren
Verwendung als Arzneimittel gemäß den vorliegenden
unabhängigen Ansprüchen gelöst. Vorteilhafte
Ausführungen werden in den abhängigen Ansprüchen
gegeben.
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4-Amino-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dionderivate,
deren Ester, Ether und Amide oder Tautomere und Stereoisomere oder
deren Salze sind bis auf
4-(2-Hydroxyethyl)-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-Amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-(N-(2-Aminoethyl))-aminol,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-(N-(N-Morpholino))-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-(N-(3-Aminopropyl))-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-Cyclohexylamino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-(N-Piperindino)-1,3,8-trihydrσxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-(N'N'-2-Dimethylaminoethyl)-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-(3'-(N'-Benzoyl)-aminopropyl)-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-(3'-(N'-(2''-Carboxy)-benzoylaminopropyl))-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-(N'-3-Acetylaminopropyl)-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4,6-Dihydroxy-2-methyl-8a,9,10,11-tetrahydro-8-oxa-11a-aza-pentaleno[1,2-a]anthracen-5,12-dion
7,9-Dihydroxy-11-methyl-1,2,3,4,4a,5,14,14a-octahydro-naphto[2,3-a]phenazin-8,13-dion)
nicht
bekannt.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind somit die neuen Verbindungen der
allgemeinen Formel 1
oder deren Tautomere, wobei
R1,
R2, R3 ausgewählt sind aus der Gruppe H, Alkyl, Cycloalkyl,
Aryl, Acyl, Glycosyl und/oder Kombinationen hiervon;
R4 ausgewählt
ist aus der Gruppe Alkyl, Aryl, Heteroalkyl, Heteroaryl, Aminomethyl,
Hydroxymethyl, Carbonyl, Carboxyl, Carboxyamidyl, Monohalogenylmethyl,
Dihalogenylmethyl, Trihalogenylmethyl, N-Alkylaminomethyl, N,N-Dialkylaminomethyl,
Morpholinomethyl, cyclisches N-Alkylaminomethyl, Trialkylammoniummethyl;
R5,
R6 ausgewählt sind aus der Gruppe H, Alkyl, Acyl, Cycloalkyl,
Heterocycloalkyl, Hydroxyalkyl, Halogenylalkyl, Ureido, Guanidino,
Thioureido, Aminoalkyl und/oder Kombinationen hiervon;
R7,
R8, R9 ausgewählt sind aus der Gruppe H, Alkyl, Aryl, Heteroalkyl,
Heteroaryl, Aminomethyl, Hydroxymethyl, Carbonyl, Carboxyl, Carboxyamidyl,
Monohalogenylmethyl, Dihalogenylmethyl, Trihalogenylmethyl und/oder
Kombinationen hiervon;
mit der Maßgabe, dass
4-(2-Hydroxyethyl)-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion,
4-Amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion,
4-(N-(2-Aminoethyl))-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methyl anthracen-9,10-dion,
4-(N-(N-Morpholino))-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion,
4-(N-(3-Aminopropyl))-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion,
4-Cyclohexylamino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion,
4-(N-Piperindino)-1,3,8-trihydroxy-6-methylarithracen-9,10-dion,
4-(N'N'-2-Dimethylaminoethyl)-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraoen-9,10-dion,
4-(3'-(N'-Benzoyl)-aminopropyl)-amino-1,3,8-trihudroxy-6-methylanthracen-9,10-dion,
4-(3'-(N'-(2''-Carboxy)-benzoyiaminopropyl))-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion,
4-(N'-3-Acetylaminopropyl)-amino-1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracen-9,10-dion,
4,6-Dihydroxy-2-methyl-8a,9,10,11-tetrahydro-8-oxa11a-aza-pentaleno-[1,2-a]anthracen-5,12-dion
und
7,9-Dihydroxy-11-methyl-1,2,3,4,4a,5,14,14a-octahydro-naphto-[2,3-a]phenazin-8,13-dion)
ausgenommen
sind.
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Unter
dem Begriff "Alkyl" ist lineares oder verzweigtes gesättigtes
oder ungesättigtes Alkyl zu verstehen.
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Unter
dem Begriff „Aryl" ist mono- oder bicyclisches, aromatisches
Aryl, insbesondere substituiertes Benzol zu verstehen.
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Unter
dem Begriff „Heteroalkyl" ist gesättigtes und
ungesättigtes Alkyl, unterbrochen durch Sauerstoff-, Stickstoff-
und Schwefelatome, insbesondere Piperidin, Morpholin oder Piperazin
zu verstehen.
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Unter
dem Begriff „Heteroaryl" ist mono- oder bicyclisches Aryl,
unterbrochen durch Sauerstoff-, Stickstoff- und Schwefelatome zu
verstehen.
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Unter
dem Begriff „Cycloalkyl" sind Fünf-, Sechs- oder
Siebenringe, insbesondere Cyclohexyl zu verstehen.
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Unter
dem Begriff „Acyl" ist aliphatisches oder aromatisches
Acyl, insbesondere Acetyl und Benzoyl zu verstehen.
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Unter
dem Begriff „Halogen" ist Fluor, Chlor, Brom, Jod, insbesondere
Fluor zu verstehen.
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Neben
den vorstehend genannten Bedeutungen können die Reste R1,
R5, R6 auch aromatische, aliphatische, heteroaliphatische und heteroaromatische
Brücken untereinander bedeuten. Als Beispiel hierfür dient
die Verbindung der Formel 1a:
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Als
Beispiele für Verbindungen der allgemeinen Formel 1 seien
des Weiteren genannt:
4-Methylamino-1,3,8-trihydroxy-methylanthracen-9,10- dion
4-N-(3-Hydroxypropyl)-amino-1,3,8-trihydroxy-[9,10]-6-methylanthracen-9,10-dion
(D und L)
4-Morpholino-1,3,8-triacetoxy-6-methylanthracen-9,10-dion
4-Amino-1,3,8-trihydroxy-[9,10]-6-amino
methylanthracen-9,10-dion.
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Als
besonders bevorzugte Verbindung ist 4-[N-(2-Aminoethyl)-amino]-1,3,8-trihydroxy-anthracen-9,10-dion
zu nennen.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Herstellung der anspruchsgemäßen Verbindungen
und deren Tautomeren und Stereoisomeren sowie deren Salze. Das Verfahren
beruht auf einer direkten Aminierung in Position 4 von 1,3,8-Trihydroxy-[9,10]-anthrachinonderivaten
der allgemeinen Formel 2:
wobei R1, R2, R3, R4, R7,
R8 und R9 die für die Formel 1 angegebenen Bedeutungen
besitzen und R1 und R2 bevorzugt Wasserstoff darstellen, wobei die
Aminierung mittels einem entsprechend substituierten Amin in Gegenwart
von Luftsauerstoff und/oder durch Erwärmen und/oder durch
Stehenlassen erfolgt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungs gemäßen
Verfahrens werden keinerlei Katalysatoren zugesetzt.
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Als
Lösungsmittel kommen die für die Aminierungsreaktion
eingesetzten Amine selbst, DMF, DMSO, Wasser oder mit den vorstehend
genannten Lösungsmittel vergleichbare Lösungsmittel
in Frage.
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Als
substituierte Amine die für die erfindungsgemäße
Aminierung der Verbindungen der allgemeinen Formel 2 geeignet sind,
sind primäre und sekundäre Amine zu nennen.
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An
der Aminogruppe nicht substituierte Verbindungen der allgemeinen
Formel 1 können durch Zugabe von Oxidationsmitteln, wie
z. B. Schwermetallsalze, insbesondere Salzen von Kupfer und Cer,
zur basischen Lösung von Verbindungen der allgemeinen Formel
2 oder durch direkte Zugabe von diesen Oxidationsmitteln zum vorstehend
beschriebenen Ansatz hergestellt werden. Darüber hinaus
können an der Aminogruppe nicht substituierte Verbindungen
der allgemeinen Formel 1 auch durch Erwärmen bzw. längeres
Aussetzen des Ansatzes oder der basischen Lösung an der
Luft oder durch Verwendung von Aminen mit Allyl- oder Benzylresten an
der Aminogruppe hergestellt werden.
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Als
basische Lösung der Verbindungen der allgemeinen Formel
1 ist das jeweilige primäre oder sekundäre Amin
direkt oder in dem angegebenen Lösungsmittel anzusehen.
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Der
Reaktionsverlauf wird mittels üblichen Dünnschichtchromatographischen
Verfahren verfolgt.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Er findung stellt
der sich dem Aminierungsschritt anschließende Neutralisationsschritt
mittels einer starken Säure, wie z. B. Schwefel- oder Salzsäure
und gegebenenfalls Extraktions- bzw. Filtrationsschritt der ausgefallenen
Produkte dar.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen oder deren pharmazeutisch
verwendbaren Salze sind zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen
geeignet. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können
eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Verbindungen
allein oder in Kombination mit entsprechenden Träger- und
Hilfsstoffen enthalten. Die Menge der erfindungsgemäßen
Verbindungen, die mit dem Trägermaterial in Form einer
Einzeldosis kombiniert werden können, wird in Abhängigkeit
von dem behandelten Organismus/Patient und der speziellen Art der
Verabreichung variiert. Bevorzugter Weise sind die erfindungsgemäßen
pharmazeutischen Zusammensetzungen durch einen solchen Gehalt an
einer oder mehreren der erfindungsgemäßen Verbindungen
gekennzeichnet, dass eine Dosis von zwischen 0,01 und 150 mg/kg
Körpergewicht/Tag der erfindungsgemäßen
Verbindung an den Patienten, der diese Zusammensetzung erhält,
abgegeben wird. Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen
können die üblichen pharmazeutischen Träger-
und Hilfsstoffe, wie z. B. flüssige Träger zur
Herstellung von Lösungen, Suspensionen und Emulsionen sowie
pharmazeutisch verträgliche Exzipienten verwendet werden.
Flüssige Träger schließen zum Beispiel Wasser,
Salzlösungen, pharmazeutisch verträgliche organische
Lösungsmittel, pharmazeutisch verträgliche Öle
oder Fette und dergleichen sowie Gemische aus zwei oder mehreren
davon ein. Der flüssige Träger kann andere geeignete
pharmazeutisch verträgliche Zusätze, wie Lösungsvermittler,
Emulgatoren, Nährstoffe, Puffer, Konservierungsmittel,
Suspendiermittel, Verdickungsmittel, Viskositätsregulatoren,
Stabilisatoren und dergleichen enthalten. Geeignete organische Lösungsmittel
schließen zum Beispiel einwertige Alkohole, wie Ethanol,
und mehrwertige Alkohole, wie Glykole, ein. Geeignete Öle
schließen zum Beispiel Sojabohnenöl, Kokosnussöl,
Olivenöl, Safloröl, Baumwollsamenöl und
dergleichen ein. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Exzipienten
schließen Verarbeitungsmittel und Arzneistoffabgabemodifikatoren
und -verstärker, wie zum Beispiel Calciumphosphat, Magnesiumstearat,
Talk, Monosaccharide, Disaccharide, Stärke, Gelatine, Cellulose, Methylcellulose,
Natriumcarboxymethylcellulose, Dextrose, Lactose, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin,
Polyvinylpyrrolidinon, niedrig schmelzende Wachse, Jonenaustauscherharze
und dergleichen, sowie beliebige Kombinationen hiervon ein. Andere
geeignete pharmazeutisch verträgliche Exzipienten sind
in „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack
Pub. Co., New Jersey (1991), beschrieben, welches durch
Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Offenbarung ist.
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Die
Arzneimittel können beispielsweise enteral, parenteral,
topisch oder peroral verabreicht werden. Geeignete Verabreichungsarten
sind zum Beispiel oral, subkutan, transdermal, transmukosal, intravenös,
intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, subdural, rektal
und iontophoretisch.
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Die
erfindungemäßen Arzneimittel bzw. pharmazeutischen
Zusammensetzungen werden in der Regel in einer Dosis von zwischen
0.01 bis 150 mg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht. Es sollte
darüber hinaus verständlich sein, dass die spezielle
Dosierung für den jeweiligen Patienten in Abhängigkeit
von einer Viel zahl von Faktoren zu ermitteln ist, einschließlich
der Aktivität der speziell verwendeten Verbindung, dem
Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand,
dem Geschlecht, der Ernährung, der Zeit der Verabreichung,
der Ausscheidungsrate, der Arzneimittelkombination und der Schwere
der zu behandelnden Krankheit.
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In
Abhängigkeit von den speziellen Zuständen oder
Krankheiten, die behandelt oder denen vorzubeugen ist, können
auch zusätzlich therapeutische Wirkstoffe, die normalerweise
zur Behandlung oder zur Vorbeugung dieses Zustandes verabreicht
werden, in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
enthalten sein.
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Die
Applikationsformen können in der pharmazeutischen Praxis
mit den allgemein bekannten und üblichen Verfahren hergestellt
werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen weisen hohe Farbintensität
und Farbechtheit auf. Sie sind in vielen bekannten und üblichen
Lösungsmitteln lösbar und können so als
Farbstoffe und Lacke eingesetzt werden.
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Weiterer
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der
erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen
Formel 1 als Arzneimittel, bevorzugt deren Verwendung zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Inhibierung von Proteinkinasen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen weisen zum Teil
hohe Affinitäten zu Proteinkinasen wie Caseinkinase 1,
Caseinkinase 2, Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK3), Cyclin-abhängigen
Kinasen (CDKs) und anderen Kinasen auf.
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Die
Casein Kinase 1 (CK1) Familie umfasst mehrere Isoformen (bei Säugern
7 Mitglieder), die von verschiedenen Genen kodiert werden. Im Allgemeinen
sind die Isoformen konstitutiv aktiv. Zu den zellulären
Funktionen gehören: die Regulation von Aspekten des Membrantransports,
der Zellteilung, des circadianen Rhythmus und der nukleären
Lokalisation. Wichtige Interaktionen positiver und negativer Art
wurden sowohl für den Wnt-Signalweg als auch den Hedgehog-Signalweg
gefunden (Price MA. Genes Dev. 2006; 20: 399–410).
Dieses unterschiedliche Spektrum macht es schwierig, die Auswirkungen
einer Hemmung der CK1 vorherzusagen. Eindeutigere Assoziationen
wurden für CK1-delta und Morbus Alzheimer gefunden, wo
diese CK1-Isoform an der Hyperphosphorylierung von Tau beteiligt
ist. Außerdem gibt es Befunde, dass mehrere CK1-Isoformen
mit speziellen Tumoren assoziiert und dort überaktiv sind.
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Casein
Kinase 2 (CK2) ist eine hochkonservierte, ubiquitär in
allen Eukaryoten exprimierte Protein-Serin/Threonin-Kinase. Die
CK2 spielt eine große Rolle bei der Proliferation, Apoptose,
Differenzierung und onkogenen Transformation von Zellen. Die essentielle
Bedeutung der CK2 für das Überleben von Zellen
wird durch substantielle Hinweise auf eine Suppression der Apoptose
von Zellen durch diese Proteinkinase noch unterstrichen. Ferner
ist CK2 ein positiver Regulator des Wnt-Signalweges, dessen Überaktivität
häufig zur Tumorentwicklung beiträgt. Diese Befunde
sind besonders unter dem Blickwinkel bedeutsam, dass CK2 bei fast allen
bislang untersuchten Tumoren einen höheren Aktivitätsspiegel
aufwies (Unger et al., Cur. Cancer Drug Targets 2004; 4:
77–84). Auch die transgene Überexpression
der CK2 in lymphoiden Zelllinien und solchen des weiblichen Brustdrüsengewebes
prädispo nieren zur Transformation. Daraus leitet sich ab,
dass Inhibitoren der CK2 als potentielle Kandidaten für
die Behandlung von Krebserkrankungen angesehen werden können.
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Cyclin-abhängige
Kinasen (CDKs) sind Serin/Threonin-Proteinkinasen, die aus einer
regulatorischen Untereinheit (z. B. Cyclin A, B1, B2, D1, D2, D3
und E) und einer katalytischen Untereinheit (z. B. CDK1, CDK2, CDK4,
CDK5 und CDK6) zusammengesetzt sind. Jedes verschiedene Kinase/Cyclin-Paar
spielt bei der Regulation des Zellzyklus eine Rolle, indem spezifisch
die verschiedenen Phasen des Zellzyklus gesteuert werden. Während
die Cycline im Verlauf des Zellzyklus phasengebunden zu- und wieder
abnehmen, ist die Menge der katalytischen Untereinheiten weitgehend
konstant. Da die Aktivität der katalytischen Untereinheiten
von der Assoziation mit den Cyclinen abhängt, sind die
CDKs nur in entsprechenden Phasen des Zellzyklus aktiv.
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Die
CDKs sind ganz allgemein mit Erkrankungen verbunden, bei denen die
Kontrolle der Zellproliferation gestört ist. Dabei kann
die Zellproliferation als Konsequenz des Durchlaufens des Zellzyklus
betrachtet werden, was wiederum von den aktiven CDKs gesteuert wird.
Beispielsweise ist der Zellzyklus in vielen Tumoren erhöht
oder beschleunigt, was für das Tumorwachstum nicht unerheblich
ist.
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MAP(Mitogen-Aktivierte
Protein-)Kinasen sind Serin/Threonin-Kinasen und bilden eine eigenständige Familie,
zu der u. a. die ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases),
die JNK (Jun N-terminal kinase), die p38 Kinase und ERK5 gehören.
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Die
ERKs werden durch Wachstumsfaktoren, wie HGF (hepatocyte growth
factor) und Mitogene aktiviert. Hingegen sind die Kinasen JNK und
p38 in die Signalwege von Cytokinen (wie TNF-alpha oder Interleukin-1)
eingebunden; sie reagieren aber auch auf andere Signale wie Hitzeschock,
UV-Strahlung oder Hyperosmolarität.
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Die
ERKs sind im phosphorylierten Zustand besonders aktiv. An der Phosphorylierung
sind sogenannte „upstream"-Kinasen beteiligt. Darunter
befinden sich die MAP-Kinase-Kinase (MAPKK oder MEK-1) und die Raf-Kinase
aus dem Ras/Raf-Signalweg, der zumeist onkogene Signale vermittelt.
Auch erhöhte Spiegel von ERK selbst können an
der onkogenen Entwicklung beteiligt sein, wie dies für
manche Arten von Brustkrebs nachgewiesen werden konnte. Aktivierte
ERK2 wird auch mit der Proliferation von Endothelin-stimulierten
glatten Muskelzellen der Atemwege in Verbindung gebracht, was auf
eine Beteiligung dieser Kinase bei Asthma schließen lässt.
Die Hemmung von ERKs und/oder Raf ist deshalb nicht nur unter dem
Gesichtspunkt der Tumorprävention bzw. -therapie erwägenswert.
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Die
p38 Kinase (oder auch Stress-Aktivierte Proteinkinase, SAPK) kommt
in 4 Isoformen vor, die in ihrer Gewebeverteilung, Regulation, etc.,
differieren. Die p38 Kinase wird durch Phosphorylierung mittels
anderer Kinasen (insbesondere MAPK Kinasen (MKKs), wie MKK3, MKK4
und MKK6) aktiviert. Sie phosphoryliert ihrerseits u. a. verschiedene
Ser/Thr-Proteinkinasen, Transkriptionsfaktoren und Zellzyklus-Regulatoren. Neben
einer Beteiligung bei Entzündungsvorgängen und
anderen umweltbedingten Stressreaktionen wird der p38 Kinase neuerdings
ein starker antiproliferativer Einfluss und eine Tumorsuppressor-Funktion
zugeschrieben. So sind beispielsweise der Transkriptionsfaktor p53
und das CDK-Inhibitor-Protein p16INK4A zwei downstream-Effektoren
von p38 Kinase, die an der Wachstumshemmung beteiligt sind. In vielen
Tierexperimenten wurde durch konditionalen knock-out von p38 die
Tumorinzidenz in verschiedenen Geweben drastisch erhöht.
Eine Hemmung von p38 ist daher nur in wenigen Fällen erstrebenswert.
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Glycogen-Synthase
Kinase-3 (GSK-3) ist eine Serin/Threonin-Proteinkinase, deren Aktivität
durch eine Reihe extrazellulärer Stimuli, wie Insulin,
Wachstumsfaktoren, Zellspezifikationsfaktoren und Zelladhäsion
inhibiert wird. GSK-3 kommt in zwei Formen (GSK-3alpha und GSK-3β)
vor, die von zwei hoch homologen Genen kodiert werden. Beide Isoformen
sind in ruhenden Zellen konstitutiv aktiv.
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GSK-3β ist
an verschiedenen Erkrankungen beteiligt, zu denen Diabetes, neurodegenerative
Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Erkrankungen
des ZNS (Zentralnervensystem), wie manisch-depressive Psychose,
Hypertrophie von Kardiomyozyten, chronische Entzündungen
gehören. Diese Erkrankungen sind verbunden mit der abnormalen
Arbeitsweise verschiedener zellulärer Signalwege, bei denen GSK-3
eine Rolle spielt. GSK-3 phosphoryliert zahlreiche Substrate, die
an der Regulation von wichtigen Zellfunktionen beteiligt sind bzw.
diese modulieren. Zu diesen Proteinen gehören die Enzyme
Glycogensynthase und ATP Citrat-Lyase, das Mikrotubuli-assoziierte
Protein (Tau), die Proteine Axin und β-Catenin, die Transkriptionsfaktoren
c-Jun, c-Myc, CREB und viele andere. Auf diese Weise ist GSK-3 an
vielen verschiedenen Aspekten der Zellphysiologie und Zellfunktion
beteiligt.
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Als
ein Beispiel hierfür sei die Beteiligung der GSK-3 an der
Insulin-Wirkung im Bereich des Kohlenhydratstoffwechsels angeführt.
Insulin bewirkt über die Aktivierung von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen
(RTKs) die Inaktivierung der GSK-3. Da die GSK-3 die Glykogensynthase
phosphoryliert und damit inaktiviert, wird nach Insulin-Einwirkung
diese Phosphorylierung gestoppt, die Glykogensynthase durch Phosphatasen
dephosphoryliert und die Synthese von Glykogen aktiviert. In gleicher
Weise werden auch noch andere Insulin-abhängige Ereignisse,
etwa der Glucose-Transport im Muskel, positiv beeinflusst. Die Folge
aller dieser Ereignisse ist die für Insulin bekannte Erniedrigung
des Blutglucose-Spiegels.
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Bei
Diabetes Typ II sind verschiedene Schritte dieses Mechanismus so
verändert, dass Insulin nicht den notwendigen Beitrag zur
Homöostase des Blutzucker-Spiegels leisten kann. Insbesondere
wurde berichtet, dass die GSK-3 im Muskel überexprimiert
oder auf Grund anderer Ursachen überaktiv ist. GSK-3-Inhibitoren
können daher bei Diabetes Typ I und Typ II sowie bei Diabetes-assoziierten
Folgeerkrankungen, z. B. diabetischer Neuropathie, diabetischer
Retinopathie, Raucherfuß, relevante Therapeutika darstellen.
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Ein
weiteres Beispiel ist die Vermittlung der Wirkung von Wnt-Faktoren.
Wnt-Faktoren sind Morphogene, die eine wichtige Rolle bei der Embryogenese,
des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung, der Organgenese und
der Tumorgenese spielen. Kürzlich ist bekannt geworden,
dass Wnt-Faktoren auch bei der Stoffwechselregulation in der Leber
als Masterregulatoren mitwirken, insbesondere beim Ammoniakstoffwechsel (Gebhardt
et al., Progr. Histochem. Cytochem. 2007; 41: 201–266).
Die Wirkung von Wnt-Faktoren kann über verschiedene Signalwege
vermittelt werden. Im sog. „kanonischen Signalweg" lösen
Wnt-Faktoren eine Aktivierung von β-Catenin aus, das hierbei
im Zellkern die Rolle eines Transkriptionsfaktors übernimmt.
Für diese Aktivierung spielt der sog. „Destruction-Komplex"
für β-Catenin, der außer β-Catenin
und den beiden „Gerüst"-Proteinen Axin und APC
(Adenomatous polyposis coli) noch GSK-3 enthält, eine Rolle.
In diesem quarternären Komplex wird β-Catenin
normalerweise durch die GSK-3 phosphoryliert und damit dem proteolytischen
Abbau zugeführt. Als Folge der Bindung von Wnt-Faktoren
an deren Rezeptoren an der Plasmamembran kommt es zu einem Zerfall
des Destruction-Komplexes und einer Inaktivierung der GSK-3, was
das Auftreten und die Stabilisierung von freiem, nicht-phosphoryliertem β-Catenin
im Zytoplasma zur Folge hat. Das freie β-Catenin kann dann
in den Zellkern wandern und dort in Kooperation mit anderen Transkriptionsfaktoren, z.
B. TCF/LEF, die Expression verschiedener Gene aktivieren. Da zu
diesen Zielgenen viele Gene gehören, deren Produkte an
der Regulation (hier Aktivierung) des Zellzyklus beteiligt sind,
führt die Aktivierung von β-Catenin in den betroffenen
Geweben häufig zu Fehlregulationen des Zellwachstums und
zur Entwicklung von Tumoren.
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Ein
wesentliches Charakteristikum von Morbus Alzheimer ist die Bildung
von intrazellulären neurofibrillären „Tangles",
die hyperphosphoryliertes Tau (Tubulin-assoziiertes Protein) enthalten.
GSK-3 ist eine der wichtigsten Kinasen, die für die Hyperphosphorylierung
an abnormalen Stellen von Tau verantwortlich sind.
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Eine
Hemmung der GSK-3 kann diese Hyperphosphorylie rung in vitro unterbinden.
Ferner phosphoryliert die GSK-3 das Enzym Pyruvat-Dehydrogenase,
das ein Schlüsselenzym des Glykolyse-Stoffwechselweges
ist, und inaktiviert es dadurch. Als Folge wird die Synthese von
Acetyl-CoA herabgesetzt. Acetyl-CoA wird jedoch für die
Synthese von Acetylcholin, einem Neurotransmitter mit kognitiven
Funktionen, gebraucht. GSK-3-Inhibitoren kommen daher als Therapeutika
in Frage, die das Fortschreiten von Morbus Alzheimer verlangsamen,
wenn nicht sogar unterbinden können.
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Auch
andere Erkrankungen des ZNS, wie das manischdepressive Syndrom (bipolar
disorder), scheinen mit der Aktivität der GSK-3 verbunden.
Dies lässt sich daraus schließen, dass sowohl
Lithiumchlorid, als auch Valproate, die schon seit vielen Jahren
für die Behandlung dieser Erkrankung eingesetzt werden,
beide Inhibitoren der GSK-3 sind. Offenbar führt die Hemmung
der GSK-3 zu einer Normalisierung (Erhöhung) der Resistenz
von Neuronen gegenüber excitotoxischen Einflüssen
von Glutamat. Solche Einflüsse sind ursächlich
an der Genese von Morbus Alzheimer, Morbus Huntington, Morbus Parkinson,
Demenz (auch durch AIDS verursacht), Amyotropher lateraler Sklerose
und multipler Sklerose beteiligt. Lithiumchlorid hat den Nachteil, dass
es nur ein schmales therapeutisches Fenster besitzt und bei Überdosierung
zu Lithium-Intoxikation führt.
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Die
Glutamat-induzierte neuronale Excitotoxizität ist auch
an der Ausbildung anderer neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt,
insbesondere von solchen, die durch akute Schädigung des
Gehirns zustande kommen. Hierzu gehören die zerebrale Ischämie,
traumatische Läsionen und bakterielle Infektionen. GSK-3 ist
auch am Hirnschlag beteiligt.
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Ein
weiteres Gebiet, auf dem GSK-3 von Bedeutung ist, betrifft das Immunsystem.
Der Transkriptionsfaktor NF-AT spielt bei der Aktivierung der Immunantwort
eine wichtige Rolle. Nach Phosphorylierung durch die GSK-3 wird
NF-AT aus dem Zellkern ausgeschleust, wodurch die Aktivierung zum
Erliegen kommt. GSK-3-Inhibitoren führen deshalb zu einer
Aktivierung der Immunantwort oder verlängern dieselbe.
In der gleichen Weise wird die immunstimulatorische Aktivität
verschiedener Zytokine erhöht oder verlängert.
Dieser Effekt kann für eine Verbesserung der Immuntherapie
mittels Zytokinen eingesetzt werden.
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Viele
lebenswichtige Funktionen der Zelle werden von der PKA (Protein-Kinase
A) beeinflusst. Hierzu gehören Proliferation und Differenzierung,
aber auch viele normale zelluläre Funktionen, wie Energie-Stoffwechsel,
Kontraktilität und Motilität, Sekretionsvorgänge,
etc. PKA ist ein tetrameres Enzym, mit zwei katalytischen und zwei
regulatorischen Untereinheiten. Der wichtigste Aktivator der PKA
ist zyklisches AMP (cAMP), dessen Synthese von vielen G-gekoppelten
Rezeptoren nach Bindung der jeweiligen Liganden angestoßen wird.
Das cAMP bindet an die regulatorischen Untereinheiten der PKA, welche
daraufhin von den katalytischen Untereinheiten abdissoziieren und
diese als aktive Monomere freigeben.
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Auf
Grund des breiten Spektrums an Funktionen trägt die PKA
bei Überaktivierung zu vielen Krankheitsbildern bei. Hierzu
zählen auch onkogene Wirkungen. So wird die erhöhte
Expression der alpha-Form der katalytischen Untereinheit (C-alpha)
mit der Entwicklung und Metastasierung von Melanomen in Verbindung gebracht.
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Aus
der vorstehenden beispielhaften Auswahl von Proteinkinasen und deren
Funktionalität wird ersichtlich, dass die abnormale Aktivierung
dieser Kinasen Ursache oder wesentliche, den Schweregrad mitbestimmende
Begleiterscheinung vieler Erkrankungen in unterschiedlichen Organen
ist.
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Obwohl
bis heute verschiedene Proteinkinase-Inhibitoren synthetisiert wurden
und einige bereits ein klinisches Einsatzgebiet gefunden haben,
besteht weiterhin ein großer Bedarf an solchen Inhibitoren
hinsichtlich einer gezielten therapeutischen Beeinflussung von komplexen
Krankheitsbildern. Vor dem Hintergrund, dass viele Proteinkinasen
in die Regulation des Wachstums und der Apoptose eingebunden sind,
ist es insbesondere notwendig, sicherzustellen, dass solche Inhibitoren,
die beispielsweise zur Therapie von Stoffwechselerkrankungen oder
neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden sollen, nicht
in demselben oder in anderen Organen zur Ausbildung oder Förderung
von Neoplasien führen. Umgekehrt können solche
Inhibitoren besonders wirksame Anti-Krebs-Therapeutika mit kurativen
oder zumindest lebensverlängernden Eigenschaften darstellen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen
Formel 1 zeigen ein Wirkungsspektrum, das diese Forderungen erfüllt.
Darüber hinaus besitzen die Vertreter der erfindungsgemäßen
Verbindungsklasse (wie unten an Beispielen gezeigt wird) ein erstaunlich
hohes anti-onkogenes Potenzial, das sich dominant gegenüber
anderen wachstumsfördernden Einflüssen derselben
Moleküle durchsetzt.
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Die
nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden
Erfindung, ohne sie hierauf zu beschränken.
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Material und Methoden
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Stammlösungen der erfindungsgemäßen
Verbindungen
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Von
den erfindungsgemäßen Verbindungen wurden Stammlösungen
von 20 mM in DMSO hergestellt und lichtabgeschirmt bei 4°C
gelagert.
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1. Zellfreie Proteinkinase-Assays
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1.1 Casein Kinase I
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Der
Proteinkinase-Assay für Casein Kinase I(CK I, CK1) erfolgte
in einem Testvolumen von 20 μl. Der Testpuffer enthielt
25 mM Tris-HCl, pH 7,4; 10 mM MgCl2·6H2O; 3,75 μM ATP; 6,8 Einheiten Casein
kinase 1(rekombinante CK1-delta der Ratte von Calbiochem); 2 mg/ml
Rinderserum Albumin und 0,2 μCi[y-32P]-ATP. Der
Test wurde an Hand des Promega-Protokolls für die CK1 durchgeführt.
Nach einer Präinkubation von 10 min bei 30°C wurde
die Reaktion durch Zugabe von 20 μM des synthetischen PKCK1
Peptid-Substrats gestartet. Das CK1 Peptid-Substrat (RRKDLHDDEEDEAMSITA)
wurde von Sigma-Aldrich, Taufkirchen, geliefert. Eine Kontrolle
ohne Substrat und eine DMSO-Kontrolle ohne Inhibitor wurde stets
mitgeführt. Die Testansätze wurden nach 10 min
Inkubation bei 30°C durch Zugabe von 90 μl einer
10 mM Lösung von Orthophosphorsäure abgestoppt.
Aliquots von 40 μl wurden auf P81 Phosphozellulose-Filterblättchen
aufgetragen und diese 5 Mal je 5 min unter ständigem Schwenken
in 1% Phosphorsäure gewaschen. Dann wurden die Blättchen
getrocknet und im Flüssig-Szintillationszähler
(Tri-carb 2500TR) vermessen.
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1.2 Casein Kinase II
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Der
Phosphorylierungsassay für Caseinkinase II (CK II, CK2)
wurde nach dem Protokoll von Sarno [Sarno S, Moro S, Meggio
F, Zagotto G, DalBen D, Ghibellini P, Battistutta R, Zanotti G,
Pina LA. Toward the rational design of Protein kinase Casein kinase-2
inhibitors. Pharmacol. Therap. 2002; 93: 159–168]
durchgeführt. Der Puffer bestand aus 100 mM Tris-HCl, pH
7,4; 20 mM MgCl2·6H2O;
100 mM NaCl; 50 mM KCl; 0,1 mM Natriumorthovanadat; 3,75 μM
ATP; 20 μM Caseinkinase-2 Peptidsubstrat; 2 mg/ml Rinderserum
Albumin und 0,2 μCi[y-32P]-ATP.
Das CK2 Peptid-Substrat (RRREEETEEE) wurde von Upstate Biotechnology,
geliefert. Der Test wurde durch Zugabe von Casein kinase 2 (humane
rekombinante CK2, Calbiochem) gestartet. Der gesamte Testablauf
folgte ansonsten den Angaben bei der CK1.
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1.3 Glykogensynthase Kinase 3beta
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Der
Phosphorylierungsassay für Glykogensynthase Kinase 3beta
(GSK-3β) wurde wie folgt durchgeführt: Der Puffer
bestand aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 5 mM MgCl2·6H2O; 1 mM NaF; 1 mM PMSF; 1 mM Natriumorthovanadat;
3,75 μM ATP; 2 mg/ml Rinderserum Albumin; 5 Einheiten GSK-3β (rekombinante
GSK-3β des Kaninchens von New England Biolabs) und 0,2 μCi
[y-32P]-ATP. Das GSK-3β Peptid-Substrat
(KRREILSRR-PS(PO)YR) wurde vom der Peptid-Unit des Interdisziplinären
Zentrums für Klinische Forschung (IZKF) Leipzig, hergestellt.
Der Test wurde durch Zugabe des Substrats (20 μM) gestartet.
Der gesamte Testablauf folgte ansonsten den Angaben bei der CK1.
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1.4 Kurvenfitting und Ermittelung der
EC50-Werte
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Für
die Bestimmung der EC50-Werte wurden Konzentrationen
der Verbindungen zwischen 0,05 μM und 100–200 μM
eingesetzt. Die Messwerte wurden mit der Software Origin auf einem
Personalcomputer gefittet und damit auch der EC50-Wert
berechnet.
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2. Zellbasierte Testverfahren für
Glykogensynthase-Aktivität und Glykogen-Synthese
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2.1 Isolation und Kultivierung von Ratten-Hepatocyten
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Hepatocyten
wurden aus Sprague-Dawley Ratten (250–350 g Körpergewicht)
isoliert, die im Medizinisch-Experimentellen Zentrum der Universität
Leipzig artgerecht und in Einklang mit den Ethik-Richtlinien der Universität
Leipzig für die Versuchstierhaltung gezüchtet
und gehalten wurden. Die Isolation erfolgte mit der Collagenase-Perfusionstechnik,
die bei Gebhardt [Gebhardt, R. (1997) Antioxidative and
protective properties of extracts from leaves of the artichoke (Cynara
Scolymus L.) against hydroperoxideinduced oxidative stress in cultured
rat hepatocytes. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144, 279–286.]
beschrieben ist. Nach der Isolation und Reinigung durch differentielle
Zentrifugation wurden die Hepatocyten in Williams Medium E (mit
2 mM Glutamin und 100 units/ml Penicillin/Streptomycin) unter Zusatz
von 10% FCS suspendiert und in einer Zelldichte von 125.000 Zellen/cm2 in collagen-beschichteten Kulturschalen
(oder Mult-Well Platten) ausgesät. Die Kultivierung erfolgte
im Brutschrank bei 37°C in einer Atmosphäre mit
5% Kohlendioxid in Luft. Nach 2 h wurde das Medium auf serumfreies
Kulturmedium gewechselt. Weitere Wechsel folgten im Abstand von
jeweils 24 h. Details der Kultivierung sind in Gebhardt, R.
and Beck, H. (1996) Differential inhibitory effects of garlic-derived organosulfides
an cholesterol biosynthesis in primary rat hepatocyte cultures.
Lipids 31, 1269–1276, beschrieben.
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2.2 Inkubation der Hepatocytenkulturen
mit den erfindungsgemäßen Verbindungen
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Um
die Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen
auf die Glykogensynthese zu bestimmen, wurden dem serumfreien Kulturmedium
2 h oder 26 h nach dem Absetzen der Zellen verschiedene Aliquots der
Stammlösung der erfindungsgemäßen Verbindungen
in DMSO zugesetzt, so dass Endkonzentrationen von 0,5 μM
bis 200 μM erreicht wurden. Die Inkubationszeiten variierten
von wenigen Minuten bis zu Tagen und sind in den Tabellen und Abbildungslegenden
der Figuren angegeben.
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2.3 Präparation von Zelllysaten
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Die
Glykogensynthase-Aktivität wurde in speziellen Zelllysaten
bestimmt. Hepatocyten wurden mit eiskalter Saline gewaschen und
mit 200 μL Lysepuffer (50 mM Tris-HCL, pH 7,4; 0,27 M Sucrose;
1 mM Natriumortho-vanadat, pH 10; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 10 mM Natrium-β-Glycerophosphat;
50 mM NaF; 5 mM Natriumpyrophosphat; 1% (x/v) Triton X-100 und 0,1%
(v/v) 2-Mercapto-ethanol) ver setzt. Die Zellen wurden abgeschabt,
durch Beschallung (Sonopuls, Bandelin, Berlin, Germany) homogenisiert,
bei 15000 g für 10 min zentrifugiert und die Überstände
bei –20°C gelagert.
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2.4 Glykogensynthase Assay
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Die
Aktivität der Glykogensynthase wurde nach der Vorschrift
von Cross et al. [Cross DE, Watt PW, Shaw M, Vanderkaay
J, Downes CP, Holder JC, Cohen P (1997) Insulin activates Protein
kinase B, inhibits glycogen synthase kinase-3 and activates glycogen
synthase by rapamycin-insensitive pathways in skeletal muscle and
adipose tissue. FERS Lett. 406; 211–215] bestimmt.
Kurz, 45 μL Zelllysat wurden zu 90 μL Testpuffer
(67 mM Tris-HCL, pH 7,5; 89 mM UDP-Glucose; 6,7 mM EDTA; 5 mM Dithiothreitol;
13 mg/mL Glykogen) gegeben, der 1 μCi Uridindiphospho-[6-3H]-D-Glucose enthielt. Die Inkubation erfolgte
in An- oder Abwesenheit von 20 mM Glucose-6-Phosphat bei 37°C.
Nach 30 min wurde die Reaktionsmischung auf Filterpapier gespottet
und sofort 3 Mal in 66% Ethanol für 20 min gewaschen. Die
Filter wurden zuletzt in Aceton getaucht, luftgetrocknet und der
Szintillationsmessung zugeführt. Die Glykogensynthase-Aktivität
wurde als Quotient der Aktivität in Ab- und in Anwesenheit
von Glucose-6-Phosphat berechnet.
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2.5 Bestimmung der Glykogen-Synthese
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2.5.1 Enzymatische Bestimmung
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Der
Glykogengehalt von Hepatocyten, die in An- und Abwesenheit von Glucose
(5 mM), Insulin (10–6 M) und den
Testverbindungen (Endkonzentrationen: 0,1 μM bis 200 μM)
kultiviert wur den, wurde nach der Vorschrift von Bergmeyer [Bergmeyer
H. U., Editor, Methoden der Enzymatischen Analyse, Verlag Chemie,
Weinheim, 1974] bestimmt.
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2.5.2 Radioaktive Bestimmung
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Die
Glykogen-Synthese wurde wie folgt gemessen: Zellen wurden für
60 min mit Insulin oder den Test-Verbindungen (in DMSO) inkubiert.
Anschließend wurden 2 μCi [14C]Glucose
zum Kulturmedium zugegeben und die Inkubation für 120 min
fortgesetzt. Das Medium wurde abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und
mit 150 μL 20% (w/v) KOH für 1 h bei 37°C
extrahiert. Dann wurden 90 μL Carrier-Glykogen (1 mg/mL) und
540 μL Ethanol zugegeben und das Glykogen über
Nacht bei –20°C präzipitiert. Das Präzipitat
wurde bei 1000 g für 20 min abzentrifugiert, resuspendiert
und in Szintillationsfläschchen überführt.
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2.6 Glutaminsynthetase Assay
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Die
Bestimmung der Glutaminsynthetase (GS) wurde nach den Angaben von
Gebhardt und Williams [Gebhardt R, Williams GM. (1986) Amino
acid transport in established adult rat liver epithelial cell lines.
Cell Biol. Toxicol. 2: 9–20.] durchgeführt.
Kultivierte Hepatocyten wurden in Ranks-Puffer mit einem Gummiwischer abgeschabt
und mittels Beschallung homogenisiert (Sonopuls, Bandelin, Berlin,
Germany). Für den GS Aktivitäts-Test wurden 100 μl
des Homogenats verwendet und die Absorption des Reaktionsprodukts
bei 540 nm gemessen. Die Protein Konzentration wurde mit dem Bradford
Assay gemessen [M. M. Bradford. (1976) A rapid and sensitive
method for the quantification of microgram quantities of Protein
utilizing the principle of Protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:
248–253.] und die spezifische GS Aktivität
in mU/mg angegeben.
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2.7 Bestimmung des ATP-Gehalts
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Der
ATP-Gehalt von Hepatocyten wurde mit dem CellTiter-Glo assay (Promega,
Mannheim) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt
[Gaunitz F, Heise K (2003) HTS compatible assay for antioxidative agents
using primary cultured hepatocytes. Assay Drug Dev. Technol. 1:
469–477].
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3. Aktivierung von β-Catenin
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Gewöhnlich
stellt die Aktivierung von β-Catenin eine bekannte Antwort
auf eine Hemmung der GSK3β dar. Dies hat damit zu tun,
dass GSK3β einerseits ein Teil des sogenannten „Destruction-Komplexes"
von β-Catenin ist, andererseits direkt für die
Phosphorylierung von β-Catenin verantwortlich ist, welche
den Abbau einleitet.
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Die
Aktivierung von β-Catenin wurde in 293 Zellen an Hand der
Zunahme des freien Pools von β-Catenin ermittelt. Da β-Catenin
im Kern zusammen mit dem Transkriptionsfaktor TCF/LEF (T-cell-factor/Lymphoidenhancing
binding factor) für die Transkription von sogenannten TCF-responsiblen
Genen verantwortlich ist, wurde die Expression eines wichtigen Zielgens,
des Axin2, mittels RT-PCR bestimmt. Ein weiteres Zielgen, die Glutaminsynthetase,
wurde an Hand ihrer Aktivität bestimmt. Außerdem
wurde ein Reportergen- Assay nach transienter Transfektion von TOP-flash
und FOP-flash in HuH7 Hepatomzellen zum Nachweis des aktivierten β-Catenins
verwendet.
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3.1 Zellkultur von 293 Zellen, C17-2 Zellen,
HuH7 Zellen und HepG2 Zellen
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Humane
293 embryonale Nierenzellen (ATCC # CRL-1658) und murine NIH3T3
Fibroblasten, die Wnt3a exprimieren [Kispert A, Vainio S,
McMahon AP (1998) Wnt-4 is a mesenchymal signal for epithelial transformation
of metanephric mesenchyme in the developing kidney. Development
125: 4225–4234.] wurden nach den Angaben von (Aoki
et al. [Aoki M, Hecht A, Kruse U, Kemler R, Vogt PK (1999)
Nuclear endpoint of Wnt signalling: neoplastic transformation induced
by transactivating lymphoid enhancing factor 1. Proc. Natl. Acad.
Sci USA 96: 139–144.] kultiviert. Die murine,
neurale stammzell-ähnliche Zelllinie C17-2 [Snyder
EY, Deitcher DL, Walsh C, Arnold-Aleda S, Hratwieg EA, Cepko CL
(1992) Multipotent neural cell lines can engraft and participate
in development of mouse cerebellum. Cell 68: 33–51]
wurde in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 10% fetales
Kälberserum, 5% Pferdeserum, 2 mM Glutamin und 100 units/ml
Penicillin/Streptomycin bei 37°C und 5% CO2 gehalten.
Um Wnt3a-konditioniertes Medium zu erhalten, wurden 2.5 × 105 NIH3T3-Wnt3a Zellen in 75 cm2 Flaschen
mit 10 ml Medium ausgesät. Vier Tage nach dem Einsäen
wurde das Medium gegen frisches Medium ausgetauscht. Eine zweite
Charge konditionierten Mediums wurde sieben Tage nach dem Aussäen
gewonnen. Beide Proben wurden vereint und bei 4°C bis zur
Verwendung gelagert.
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Die
HuH7 Zellen (humane Hepatom-Zelllinie) wurden im gleichen Medium
wie die C17-2 Zellen kultiviert (10 ml/75 cm2 Gewebekulturflasche),
jedoch ohne Zusatz von Pferdeserum. Nach Erreichen der Konfluenz
wurden die Zellen mit Accutase abgelöst und im Verhältnis
1:3 gesplittet.
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HepG2
Hepatoblastomzellen wurden wie die C17-2 Zellen in supplementiertem
DMEM kultiviert wie bei Gebhardt [Gebhardt, R. (2002) Inhibition
of cholesterol biosynthesis in HepG2 cells by artichoke extracts is
reinforced by glucosidase pretreatment, Phytotherap. Res. 16: 368–372]
beschrieben. Die Zellen wurden jede Woche nach Erreichen der Konfluenz
passagiert. Zur Aufbewahrung wurden die Zellen in flüssigem
Stickstoff eingefroren.
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3.2 Transiente Transfektion von HuH-7
Zellen
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Für
die Transfektion wurden die Zellen mit 2,5 × 105 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte ausgesät,
für 24 h kultiviert und anschließend mit 0,5 μg
Plasmid DNA (TOP-flash und FOP-flash) unter Verwendung von Jet-PEI
als Transfektionsreagens transfiziert. Einzelheiten der Transfektion
finden sich bei [Gaunitz F., Heise K., Gebhardt R. (2004)
A Silencer Element in the First Intron of the Glutamine Synthetase
Gene Regresses Induction by Glucocorticoids, Mol. Endocrinol. 18,
63–69 (Epub 2003 Oct 16)]. Ein erneuter Medienwechsel erfolgte
4 h nach der Transfektion. Nach 24 h wurde das Medium gewechselt
und die Testverbindungen bzw. eine äquivalente Menge DMSO
(Kontrolle) dem frischen Medium zugesetzt. Die Messung der Luciferaseaktivität
der Reportergene wurde wie beschrieben durchgeführt [Werth,
M., Gebhardt, R. and Gaunitz, F. (2006) Hepatic expression of glutamine
synthetase is controlled by STAT5 and TCF transcription factors.
Hepatology 44, 967–75].
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3.3 RNA Isolation, cDNA Synthese und RT-PCR
-
Gesamt-RNA
der Zellen wurde mit dem NucleoSpin RNA II Kit nach den Angaben
des Herstellers (Macherey und Nagel) isoliert. Die Oligo dT-geprimte
Synthese von cDNA wurde mit 1 μg Gesamt-RNA und der Superscript
II Reverse Transkriptase (Invitrogen) durchgeführt. Ein
Zwanzigstel jeder cDNA Probe diente als Template in Polymerase-Kettenreaktionen
mit Primern gegen murines Axin 2 (Forward Primer, 5'-TCCCCACCTTG
AATGAAGAA-3' reverser Primer: 5'-TGGTGGCTGGTGCAAAGA-3') und Glycerinaldehyde-3-phosphate
Dehydrogenase (GAPDH; forward Primer: 5'-ACCACAGTCCAT-GCCAT-CACT-3',
reverser Primer: 5'-GTCCAC-CACCCTGTTGCTGTA-3'). Axin2 Sequenzen
wurden mit 32 Zyklen amplifiziert, die jeweils aus 15 sec bei 96°C,
30 sec bei 56°C und 45 sec bei 72°C bestanden.
GAPDH-Sequenzen wurden mit 20 Zyklen dieser Art amplifiziert. Ein
Zehntel jeder PCR-Reaktion wurde in 0,5-fachem Tris/Borat/EDTA-Puffer unter
nicht-denaturierten Bedingungen auf ein 8% Polyacrylamid Gel aufgetragen
und die Banden durch Färbung mit Ethidiumbromid visualisiert.
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3.4 Expression und Reinigung der Glutathione
S-transferase-Fusionsproteine
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Expressionsvektoren
für Glutathione-S-transferase (GST) and GST-Fusionsproteine
mit den β-Catenin Aminosäureresten 536–781
und dem cytoplasmischen Schwanz von E-Cadherin (GST-ECT) wurden
beschrieben [Aberle H, Schwartz H, Hoschuetzky H, Kemler
R (1996) Single amino acid substitutions in Proteins of the armadillo
gene family abolish their binding to alpha-catenin. J. Biol. Chem.
271: 1520–1526; Hecht A, LitterstCM, Huber 0, Kemler R
(1999) Funcional characterization of multiple transactivating elements
in beta-catenin, some of which interact with the TATA-binding Protein
in vitro. J. Biol. Chem. 274: 18017–18025]. Ein
Konstrukt zur Expression von GST-S-Catenin 400–781 wurde
durch Insertion eines Stuf/NotI Restrictions-fragments von pGEX4T1-ß-Catenin
(Aberle et al., 1996, s. o.) in die SmaI und Not
I Schnittstellen von pGEX4T1 (Amersham Pharmacia). GST-Fusionsproteine
wurden in E. coli BL21 exprimiert und mit Glutathione-Sepharose
wie beschrieben gereinigt (Aberle et al., 1996,
s. o.) außer bei GST-ß-Catenin 400–781,
das nicht an Glutathione-Sepharose gebunden wird und deshalb als
bakterielles Rohlysat verwendet wurde.
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3.5 Präparation von Zelllysaten,
Affinitäts-Präzipitation von β-Catenin
und Western blotting
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Protein-Extracte
wurden durch Lyse der Zellen mit eiskaltem IPN150 Puffer (50 mM
Tris/HCl H 7,6; 5 mM MgCl2, 0.1% NP-40,
150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM Na-Vanadate, 1 mM NaFluorid, 1 mM
PMSF und einer kompletten Mischung von Protease-Inhibitoren (Roche
Applied Science)) gewonnen. Während der 30-minütigen
Lyse wurde gelegentlich gemischt. Anschließend wurden die
Proben bei 20,000 × g für 10 min zentrifugiert
und die Proteinkonzentrationen des klaren Überstandes bestimmt
(DC protein assay, BioRad). Um den Gehalt an β-Catenin
und hypophosphorylierten Formen von β-Catenin bestimmen
zu können, wurden entsprechende Zelllysate mit 20 μg
Gesamtprotein mittels SDS-PAGE auf 10%-igem Gel getrennt. Vor dem
Beladen wurden jeder Probe eine Mischung von jeweils 2,5 ng von
zwei GST-Fusionsproteinen zugegeben, die die Aminosäure-Reste
400–781, bzw. 536–781 des β-Catenins
enthielten. Diese Kalibrator-Proteine dienten dazu, die Wirksamkeit
der Western Blot Technik zu überwachen und erlaubten die
Normalisierung der Ergebnisse nach Quantifizierung mit dem LumiImager
und der Lumi-Analyst Software (Roche Applied Science). Nach dem
Transfer auf Nitrocellulose-Membranen wurden die Western Blots sequentiell
mit den primären Antkörpern, dem anti-β-Catenin
(clone 14, BD Pharmingen; clone 8E7, Upstate Biotechnology) und
dem anti-β-tubulin (clone DM 1A, Sigma Aldrich), sowie
den passenden horseradish peroxidase-markierten Sekundärantikörpern
(Jackson ImmunoResearch Laboratories) inkubiert. Die Antikörper/Antigen-Komplexe
wurden mittels Chemilumineszenz visualisiert (ECL System, Amersham
Pharmacia).
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Für
die Affinitätsreinigung des freien cytoplasmatischen Pools
von β-Catenin wurden 1 μg GST oder GST-Fusionsproteine,
12,5 μl Glutathion-Sepharose Beads, und Zelllysat mit einem
Proteingehalt von 500 μg vermischt. Das Reaktionsvolumen
wurde auf 500 μl mit IPN 150-Puffer eingestellt und die
Reaktionsansätze über Nacht bei 4°C und
ständigem Schütteln inkubiert. Nach in tensivem
Waschen mit IPN 150-Puffer wurde das auf der Glutathion-Sepharose
zurückgehaltene Material mit SDS-PAGE Ladepuffer eluiert,
auf SDS-PAGE (10% Gel) getrennt und mittels Western blotting wie
oben beschrieben, analysiert.
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4. Molecular Docking
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4.1 Verwendete Strukturen
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Die
molekularen Docking-Studien wurden auf der Basis der Kristallstrukturen
der CK I im Komplex mit dem ATP-kompetitiven Inhibitor IC261 (pdb
entry leh4), von CK II im Komplex mit dem Inhibitor Emodin (pdb entry
lf0q) und GSK-3 im Komplex mit AR-A014418 (pdb entry lq5k) durchgeführt.
Die Inhibitoren (vgl. 1), Ionen und alle Moleküle
des Lösungsmittels wurden vom Protein entfernt. Alle Proteinmoleküle
wurden der Energie-Minimierung mittels Amber89 force field, das
in M0E2004 implementiert ist, unterzogen.
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Die
Moleküle der erfindungsgemäßen Verbindungen
wurden mit dem molecular modelling-Programm Spartan 5.0 modelliert,
das für alle Quantenmechanischen Berechnungen verwendet
wurde. Die Ligandenladungen, abgeleitet von ihrem elektrostatischen
Potential, wurden auf dem AM1-Niveau minimiert, dann wurden alle
relevanten Torsionswinkel freigegeben.
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4.2 Automatisches Docking
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Die
Docking-Berechnungen wurden mit Autodock 3.0 innerhalb einem Benutzer-definierten
dreidimensionalen Kubus mit 100 × 100 × 100 Å Kantenlänge für
Ck1 und 90 × 90 × 90 Å Kantenlänge
für CK2 und GSK-3, der jeweils auf die co-kristallisierten
Inhibitoren zentriert war, durchgeführt. Mit einem vorgegebenen Gridabstand
von 0.375 Å wurden mögliche Enzym-Substrat-Bindungsstellen
ermittelt. Die Evaluierung beruhte auf 50 unabhängigen
Docking-Durchläufen für jeden Liganden, die auf
einem Lamarck'schen genetischen Algorithmus basierten, der von zufällig
gewählten Protein-Substrat Konstellationen ausging und
mittels energetischen Evaluierungen iteriert wurde. Bis zu 300 Iterationen
einer lokalen Suche mit einer Frequenz von 0,1 wurden angewandt.
Ferner wurde das Cluster mit der höchsten Bindungsenergie
analysiert, eine Suche nach sekundären Bindungsstellen
durchgeführt und die Cluster mit der höchsten
Population betrachtet.
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Beschreibung der Figuren
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1 zeigt
die allgemeine Struktur und Beispiele von 4-Amino-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dionderivaten.
Im Folgenden werden die für die jeweilige Verbindung in 1 genannten
Abkürzungen verwendet.
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2 zeigt
die konzentrationsabhängige Hemmung der Casein Kinase II
durch L4. Die Aktivität der Casein Kinase II (CK II, CK
2) in Abhängigkeit von der Konzentration von der Verbindung
L4 sowie der IC50-Wert wurde wie unter Methoden
1.2 angegeben bestimmt. Aufgetragen ist die Aktivität des
Enzyms gegenüber dem Peptidsubstrat in % der Aktivität
in Anwesenheit des Lösungsvermittlers DMSO. Dargestellt
sind Mittelwerte ± Standardabweichungen von 3 unabhängigen
Messungen.
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3 zeigt
die konzentrationsabhängige Hemmung der Glykogensynthase
Kinase 3β (GSK-3β) durch L4. Die Aktivität
der GSK-3β in Abhängigkeit von der Konzentration
von der Verbindung L13 sowie der IC50-Wert
wurde wie unter Methoden 1.3 angegeben bestimmt. Aufgetragen ist
die Aktivität des Enzyms gegenüber dem Peptidsubstrat
in % der Aktivität in Anwesenheit des Lösungsvermittlers
DMSO. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichungen
von 3 unabhängigen Messungen.
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4 zeigt
die konzentrationsabhängige Hemmung der Casein Kinase II
durch L13. Die Aktivität der Casein Kinase II (CK II, CK
2) in Abhängigkeit von der Konzentration von der Verbindung
L13 sowie der IC50-Wert wurde wie unter
Methoden 1.2 angegeben bestimmt. Aufgetragen ist die Aktivität
des Enzyms gegenüber dem Peptidsubstrat in % der Aktivität
in Anwesenheit des Lösungsvermittlers DMSO. Dargestellt
sind Mittelwerte ± Standardabweichungen von 3 unabhängigen
Messungen.
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5 zeigt
ein molekulares Docking von L4 an die Glykogensynthease Kinase 3β (GSK-3β).
(A) Ausschnitt der ATP-Bindungstasche der GSK-3β und die
Wechselwirkung mit den wichtigsten Aminosäureresten, (B)
Gesamtansicht der GSK-3β mit L4 (rot). Zur Durchführung
des Docking siehe Methoden 4.2.
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6 zeigt
den Vergleich der Beeinflussung des ATP-Spiegels von kultivierten
Hepatocyten durch die Derivate L1 und L4 bzw. bekannte Hemmstoffe
der GSK-3β. Kultivierte Hepatocyten wurden mit (A) den
Derivaten L1 und L4 oder (B) den Hemmstoffen TDZD-8 und SB216763
für 24 h inkubiert. Die Bestimmung des ATP-Gehalts erfolgte
wie unter 2.7 beschrieben. Alle angegebenen Hemmstoffe wurden in
DMSO gelöst einge setzt. Der ATP-Gehalt der DMSO-Kontrollen
wurde 100% gesetzt. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichungen
von 6 unabhängigen Messungen.
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7 zeigt
die Aktivierung der Glycogensynthase durch Insulin und verschiedene
GSK-3β-Inhibitoren in kultivierten Hepatocyten. Kultivierte
Hepatocyten wurden für 90 min in Gegenwart von Insulin
(Ins, 10–7 M) oder den Hemmstoffen Lithiumchlorid (Li,
30 mM), L4 (10 μM) und SB216763 (SB, 10 μM) bzw.
in der Kombination von Insulin mit L4 (IL4) und SB216763 (ISB) inkubiert.
Kontrollkulturen (Co) enthielten den Lösungsvermittler
DMSO in gleicher Konzentration. Anschließend wurden die
Zellen lysiert und die Aktivität der Glykogensynthase wie
unter 2.4 angegeben gemessen. Die Ergebnisse sind als Vielfache
der Aktivität der Kontrollzellen angegeben. Dargestellt
sind Mittelwerte + Standardabweichungen von 3 unabhängigen
Messungen. *, signifikant verschieden vom Kontrollwert, P < 0,01; **, signifikant
verschieden vom Kontrollwert, P < 0,001.
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8.
zeigt den Einfluss von Insulin und verschiedenen Hemmstoffen der
GSK-3β auf die Glykogen-Synthese in Hepatocyten. Kultivierte
Hepatocyten wurden in Gegenwart von Insulin (Ins, 10–7
M) oder den Hemmstoffen LiCl (Li, 50 mM), L4 (10 μM) und
SB216763 (SB, 10 μM) bzw. in der Kombination von Insulin
mit L4 (IL4) und SB216763 (ISB) inkubiert. Kontrollkulturen (Co)
enthielten den Lösungsvermittler DMSO in gleicher Konzentration.
Nach 60 min wurde [14C]Glucose zugegeben
und die Zellen für weitere 90 min inkubiert. Anschließend
wurden die Zellen homogenisiert und die Glykogen-Synthese wie unter
2.5.2 angegeben gemessen. Dargestellt sind Mittelwerte + Standardabweichungen
von 3 unabhängigen Messungen. *, signifikant verschieden
vom Kontrollwert, P < 0,001;
**, signifikant verschieden vom Kontrollwert, P < 0,01.
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9 zeigt
die Abhängigkeit der Glykogen-Synthese von der Konzentration
der GSK-3β Inhibitoren L4 und SB216763. Kultivierte Hepatocyten
wurden wie in 8 in Gegenwart von den Hemmstoffen
L4 (10 μM) und SB216763 (SB, 10 μM) inkubiert
und mit [14C]Glucose behandelt. Anschließend
wurden die Zellen homogenisiert und die Glykogen-Synthese wie unter
2.5.2 angegeben gemessen. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichungen
von 3 unabhängigen Messungen als Vielfache des Kontrollwertes.
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10 zeigt
den Einfluss von Insulin und verschiedenen Hemmstoffen der GSK-3β auf
den Glykogen-Gehalt von kultivierten Hepatocyten. Hepatocyten wurden
für 24 h in Gegenwart von Insulin (Ins, 10–7 M) und
den Hemmstoffen L4 (10 μM) und SB216763 (SB, 10 μM)
inkubiert. Die Inkubation erfolgte in normalem Kulturmedium (11
mM Glucose) oder mit Zusatz von 5 mM Glucose (16 mM Glucose). Anschließend
wurden die Zellen homogenisiert und der Glykogen-Gehalt wie unter
2.5.1 angegeben bestimmt. Der Glykogen-Gehalt von Kontrollkulturen
in Normalmedium (Co) wurde 100% gesetzt. Dargestellt sind Mittelwerte
+ Standardabweichungen von 3 unabhängigen Messungen. *
signifikant verschieden vom entsprechenden Kontrollwert, P < 0,01; ** P < 0,05.
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11 zeigt
die Dosis-abhängige Stimulation von (A) aktivem und (B)
gesamtem β-Catenin in HEK 293 Zellen durch verschiedene
GSK3β-Inhibitoren. Kultivierte HEK 293 Zellen wurden 48
h nach dem Absetzen mit den Inhibitoren Lid (10–160 mM),
L4 (2,5–160 μM) und SB216763 (2,5–40 μM)
behandelt. Nach 3 h wurden die Zellen geerntet und lysiert. (A)
Der freie Pool von Z-Catenin wurde durch GST-ECT Fishing und anschließendem
Western blotting wie unter 3.5 beschrieben bestimmt. (B) Um die Änderungen
des gesamten zellulären Spiegels von β-Catenin
zu bestimmen, wurde zu jedem Lysat eine Mischung von GST-Fusionsproteinen
zugegeben (s. Methoden 3.4 und 3.5). Jeder Ansatz wurde auf 2 Lanes
aufgetragen. Die Durchführung der Blots und der Nachweis
mit anti-β-Catenin ist im Methodenteil unter Punkt 3.5
beschrieben. Der Teil (C) der Abbildung zeigt die Ladungskontrolle
zu (B) mit Reaktion gegen alpha-Tubulin.
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12 zeigt
die Induktion der Axin-Transkription durch Wnt3a oder GSK3β-Inhibitoren.
Vierundzwanzig Stunden nach dem Absetzen wurden C17-2 Zellen mit
den Inhibitoren SB216763 (5 und 20 μM; Lanes 3,4), mit
L4 (10, 40 und 60 μM; Lanes 5–7) sowie mit Wnt3a-konditioniertem
Medium (verdünnt 1:1 oder unverdünnt; Lanes 8,9)
inkubiert. Kontrollzellen (C, Lane 2) erhielten DMSO (0,4%). Nach
6 h wurden die Zellen geerntet und Gesamt-RNA präpariert
(s. Methoden 3.3). Die Iranskript-Spiegel von Axin2 und der GAPDH
Kontrolle wurden durch semiquantitative RT-PCR bestimmt.
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13 zeigt
das GST-ECT-fishing zur Bestimmung des freien Pools von β-Catenin
in C17-2 Zellen. Vierundzwanzig Stunden nach dem Absetzen wurden
C17-2 Zellen mit den Inhibitoren SB216763 (20 μM), mit L4
(40 μM) oder mit Wnt3a-konditioniertem Medium (Wnt3a CM)
inkubiert. Kontrollzellen waren entweder unbehandelt (untr.), enthielten
DMSO (0,4%) oder wurden mit mock konditioniertem Medium (cont. CM)
inkubiert. Nach 3 h wurden die Zellen geerntet und Lysate hergestellt.
Das GST-ECT fishing und die Western Blot Analyse (o beres Panel)
wurde wie in 11 durchgeführt. Parallel
wurde der Gesamtgehalt von β-Catenin in den Lysaten wie
in 11 angegeben bestimmt (unteres Panel).
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14 zeigt
die Induktion der Glutaminsynthetase (GS) durch GSK-3β Inhibitoren.
HepG2 Zellen wurden 48 h in Gegenwart der GSK-3β Inhibitoren
(A) LiCl und (B) SB216763 bzw. L4 kultiviert. Anschließend
wurde im Zellhomogenat die Aktivität der Glutaminsynthetase
(GS) bestimmt (s. Methoden 2.6). Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichungen
von 3 unabhängigen Messungen bezogen auf die DMSO-Kontrolle (100%). Tabelle 1 Vergleich der IC50-Werte von Emodin und
4-Amino-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dionderivaten für
die Hemmung von ausgewählten Proteinkinasen
| Substanz | CK
I | CK
II (μM) | GSK3β | CDK |
| Emodin | 14,1 | 0,3 | 16,5 | 11,6 |
| L4 | 7,6 | 3,9 | 0,6 | 94,3 |
| L7 | 1,8 | 1,9 | 1,7 | 15,8 |
| L10 | 21,4 | 4,8 | 4,6 | 20,4 |
| L13 | 28,7 | 0,7 | 31,9 | 62,7 |
-
Ergebnisse
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen sind Inhibitoren
von Proteinkinasen, die jeweils ein unterschiedliches, molekülspezifisches
Spektrum von Hemmwirkungen zeigen. Beispiele hierfür sind
4-Amino-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dion (L1), 4-[N-(2-Aminoethyl) amino]-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dion (L4),
4-[N-(2-Dimethylaminoethyl)-amino]-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dion
(L10), 4-[N-(3-Aminopropyl)-amino]-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dion
(L7), 4-{N-[3-(Acetamido)propyl]-amino}-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dion
(L14), 4-{N-[3-(Benzamido)propyl]-amino}-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dion
(L16), 4-{N-[3-(Phthalsäuremonoamido)propyl]-amino}-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dion
(L13) (Strukturformeln S. 1). Wie
Tabelle 1 zeigt, unterscheidet sich das Hemmspektrum der Verbindungen
L4, L7, L10 und L13 gegenüber den Proteinkinasen Caseinkinase
I (CKI), Caseinkinase II (CKII), Glykogensynthase-kinase-3 (GSK-3)
und Cyclin-abhängiger Kinase (CDK) wesentlich von dem des
bekannten Naturstoffs Emodin (1,3,8-Trihydroxyanthracen-9,10-dion).
Insbesondere zeigt L4 eine ausgeprägte Hemmung von GSK-3
(3) bei gleichzeitiger Insensitivität
gegenüber CDK (Tabelle 1) und p38 (EC50-Wert:
157 ± 6 μM). Auch untereinander sind die Hemmspektren
von L4, L7, L10 und L13 sehr verschieden (Tabelle 1). So zeigt L4
eine schwächere Hemmung von CK II (2) als beispielsweise
L13 (4). Aus diesen unterschiedlichen Hemmspektren gegenüber
Proteinkinasen kann geschlossen werden, dass die erfindungsgemäßen
Verbindungen völlig unterschiedlich in komplexe physiologische
und pathophysiologische Prozesse eingreifen.
-
Die
Unterschiede in der Hemmwirkung bzw. der Affinität gegenüber
Proteinkinasen werden auch durch Docking-Studien an Kinasestrukturmodellen
verdeutlicht. 5 zeigt beispielhaft das Docking
der Verbindung L4 an die Glykogensynthasekinase-3 bzw. deren ATP-Bindungsstelle,
die durch diese Untersuchungen als bevorzugtes Bindungszentrum der
4-Amino-1,3,8-trihydroxyanthracen-9,10-dion-Derivate bestätigt
wird.
-
Wesentlich
für die Verwendung der erfindungsgemäßen
Verbindungen als Arzneimittel ist eine geringe Toxizität
gegenüber Zellen. Erstaunlicherweise haben viele der erfindungsgemäßen
Verbindungen eine relativ niedrige Cytotoxizität wie sich
aufgrund gängiger Vitalitätsassays wie dem MTT-Test
zeigt. So liegt etwa der EC50-Wert für den kompletten Zelltod
für die Verbindungen L4, L7, L10, L14, und L16 über
Konzentrationen von 300–400 μM, also in einem
Bereich jenseits der Löslichkeitsgrenze. Um in dieser Beziehung
genauere Aussagen über die Beeinflussung der Zellphysiologie
und -vitalität machen zu können, wurde die konzentrationsabhängige
Beeinflussung des ATP-Gehalts von Hepatocyten bestimmt. 6 zeigt
die Wirkungen von L1 und L4 im Vergleich mit bekannten Inhibitoren
der GSK-3. L4 zeigt dabei ein ähnliches Wirkprofil wie
der GSK-3-Inhibitor TDZD und ist etwas stärker als der
Inhibitor SB216763. Interessanterweise wurde festgestellt, dass
L4 insgesamt wesentlich weniger cytotoxisch gegenüber Hepatocyten
ist als SB261763, was verdeutlicht, dass ein Abfall des ATP-Spiegels
nicht automatisch zum Tod von Zellen führt, sondern physiologisch
in Grenzen verkraftet werden kann.
-
Aus
dem Spektrum der physiologischen und pathophysiologischen Wirkungen
der erfindungsgemäßen Verbindungen sei hier ein
Beispiel detailliert vorgestellt. Es handelt sich um die Insulin-mimetische
Wirkung der Verbindung L4 an Hepatocyten-Populationen. Die 7–10 zeigen,
dass die Hemmung der GSK-3β durch L4 tatsächlich ähnliche
Einflüsse auf den Glykogenstoffwechsel von Hepatocyten
hat, wie dies für Insulin, ebenfalls über einen
Mechanismus der GSK-3-Hemmung, gefunden wird. 7 zeigt
zunächst die Aktivierung des Enzyms Glykogensynthase in
kultivierten Hepatocy ten. Glykogensynthase ist normalerweise ein
Substrat der GSK-3 und wird durch Phosphorylierung inaktiviert.
Eine Hemmung der GSK-3 durch Insulin, Lithiumchlorid, L4 oder SB216763
führt deshalb zur Aktivierung des Glykogensynthase (7).
Interessanterweise können L4 und SB216763 sogar synergistisch
zu Insulin wirken. 8 zeigt, dass sich dieser Einfluss auch
in einer erhöhten Glykogensynthese in den Hepatocyten niederschlägt. 9 zeigt
die Konzentrationsabhängigkeit dieser Wirkung von L4 im
Vergleich mit dem bekannten Inhibitor SB216763. Während
jedoch bei SB261763 die Wirkung oberhalb von 10 μM nachlässt,
aktiviert L4 auch noch in höheren Konzentrationen. 10 zeigt
schließlich, dass als Folge dieser Prozesse der Glykogenspiegel
der Hepatocyten in einem Zeitraum von 24 h ansteigt. Dabei scheint
L4 besonders bei höheren Konzentrationen von Glucose wirksam
zu sein, wie dies physiologisch auch bei Insulin beobachtet wird
(10).
-
Obwohl
Insulin bekanntermaßen zu einer Hemmung der GSK-3 führt,
ist es doch ein herausragendes Charakteristikum der Hormonwirkung,
dass diese Hemmung nicht zu einer Aktivierung des β-Catenin
Signalwegs führt. Von einem geeigneten Insulin-Mimetikum
muß deshalb erwartet werden, dass eine Aktivierung des β-Catenin
Signalwegs, der mit hoher Wahrscheinlichkeit zu krebsartigen Veränderungen
der Zellen führen würde, nicht oder nur sehr schwach
hervorgerufen wird. Um diesen wichtigen Aspekt zu untersuchen, wurden
unterschiedliche Bestimmungen zur Aktivierung des β-Catenin
Signalwegs durchgeführt. Dabei wurde L4 mit anderen GSK-3-Inhibitoren
verglichen. Beispielhafte Ergebnisse sind in 11-14 dargestellt.
Zunächst wurde gezeigt, dass L4 zwar wie andere GSK-3-Inhibitoren
(LiCl und SB261763) zwar zu einem Anstieg von β-Catenin
in den Zellen führt, jedoch im Gegensatz zu den Inhibitoren
LiCl und SB261763 nicht zu einer Erhöhung des aktivierten β-Catenin
(11). 12 zeigt, dass das Ausbleiben
der Aktivierung von β-Catenin (insbesondere das Ausbleiben
von aktiviertem β-Catenin im Zellkern) bei Exposition der
Zellen mit L4 die Konsequenz nach sich zieht, dass auch keine Zielgene
(hier das Axin2-Gen) exprimiert werden. SB216763 führt hingegen
zu einer Steigerung der Expression von Axin2, wie dies auch für
den physiologischen Aktivator des β-Catenin Signalwegs,
dem Wnt3a, gefunden wurde. Wiederum wird durch GST-ECT fishing bestätigt,
dass in Gegenwart von L4 wesentlich weniger β-Catenin aktiviert
wird wie durch SB261763 oder Wnt3a (13). Noch
eindrucksvoller ist die Tatsache, dass ein weiteres Gen, die Glutaminsynthetase
(GS), in HepG2 Zellen zwar von den bekannten GSK-3-Inhibitoren LiCl
und SB261763 induziert wird, jedoch nicht durch L4. Da die Glutaminsynthetase
ein Zielgen des β-Catenin Signalweges ist, das ganz besonders
mit dem Tumorwachstum, insbesondere von hepatozellulären
Leberkarzinomen, assoziiert ist (Gebhardt R, Baldysiak-Figiel
A, Krügel V, Ueberham E, Gaunitz F. (2007) Hepatocellular
expression of glutamine synthetase: an indicator of morphogen actions
as master regulators of zonation in adult liver. Prog Histochem
Cytochem. 41, 201–66.), ist dies ein unschätzbarer
Vorteil der Verbindung L4. Aufgrund vorstehender Ausführungen
stellen die erfindungsgemäßen Verbindungen Insulin-Mimetika
dar, die etwa bei Diabetes Typ II, eingesetzt werden können.
-
Desgleichen
zeigen die vorstehenden Ergebnisse, dass die GSK-3-abhängige
Phosphorylierung des Protein Tau durch L4 unterbunden werden kann,
ohne dabei für andere, bekannte GSK-3-Inhibitoren gefundene
ungünstige Nebenwirkungen hervorzurufen. Folglich eignen
sich die erfindungsgemäßen Verbindungen des L4-Typs
auch als therapeutisch interessante Verbindungen für Tauopathien
und andere neurologische Störungen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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