-
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bestimmen mindestens
eines Messwerts auf der Basis von Einzelmolekülereignissen
von gleichartigen Markermolekülen in einer Probe.
-
Mit
Markermolekülen sind hier einerseits Moleküle
wie beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe gemeint, mit denen andere
Moleküle wie beispielsweise Proteine in einer Zelle oder
Partner einer chemischen Reaktion markierbar sind, um die markierten
Moleküle mit Messverfahren zu beobachten, bei denen die Markermoleküle
und damit die markierten Moleküle nicht jedoch unmarkierte
Moleküle sichtbar sind. Mit Markermolekülen sind
hier andererseits aber auch beobachtete Moleküle wie beispielsweise
fluoreszente Proteine (FP) gemeint, die bereits aufgrund ihrer Struktur
eine Markierung in dem voranstehenden Sinne umfassen und deshalb
nicht mehr durch ein weiteres Molekül markiert werden müssen.
Darüber hinaus sind mit Markermolekülen auch von
Markermolekülen eingegangene Komplexe gemeint, wobei das
Messsignal von der Art des eingegangenen Komplexes, beispielsweise
dem Abstand oder der relativen Orientierung der Konstituenten, abhängen kann.
Ein typisches Beispiel wäre die Untersuchung von Bindungsverhalten
mittels sogenannter FREI-Paare
-
Mit
einem Messwert auf der Basis von Einzelmolekülereignissen
ist ein solcher Messwert gemeint, der auf einer Änderung
des Zustands und/oder des Orts einzelner Markermoleküle
basiert, wobei sich diese Änderung des Zustands in einer Änderung des
Messsignals bemerkbar macht, die häufig diskreter Natur
ist. Bei einem Fluoreszenzfarbstoff als Markermolekül ist
mit der Änderung des Zustands nicht allein die Anregung
des Fluoreszenzfarbstoffs oder dessen Wiederabregung bei der Emission
von Fluoreszenzlicht und mit der diskreten Änderung des
Fluoreszenzlichts nicht die Aussendung eines einzelnen Photons gemeint.
Vielmehr geht es bei einem Fluoreszenzfarbstoff darum, eine Vielzahl
von Photonen des Fluoreszenzlichts als Messsignal zu empfangen und Änderungen
dieses Messsignals zu beobachten.
-
Dass
der mindestens eine Messwert unter bestimmten Bedingungen auf der
Basis von Einzelmolekülereignissen nicht bestimmbar ist,
bedeutet in dieser Beschreibung, dass er zumindest nicht hinreichend
bestimmbar ist. Dies heißt zum Beispiel, dass er unter
diesen Bedingungen nur viel schlechter als unter anderen Bedingungen
auf der Basis von Einzelmolekülereignissen bestimmbar ist.
-
STAND DER TECHNIK
-
Durch
Markieren von interessierenden Molekülen mit einem Fluoreszenzfarbstoff
als Markermolekül und Analysieren von Fluoreszenzlicht
von dem Fluoreszenzfarbstoff als Messsignal können viele räumliche
und temporäre Parameter von Molekülverteilungen
bestimmt werden. Fluoreszenzlichtdetektion ist so empfindlich, dass
sie selbst die Detektion einzelner Moleküle ermöglicht.
Verschiedene erfolgreiche experimentelle Techniken, wie die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie
(FCS) und die Fluoreszenz-Intentsitäts-Verteilungsanalyse
(FIDA) sowie die Multiparameter-Fluoreszenzdetektion (MFD) basieren
hierauf. Eine Übersicht über diese Techniken,
die als Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie bezeichnet
werden, gibt C. Eggeling et al.: "Multi-Parameter Fluorescence
Detection at the Single-Molecule Level: Techniques and Applications"
in 2. BIOSENSOR SYMPOSIUM, Tübingen 2001.
-
Die
Techniken der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie erfordern
jedoch, dass einerseits nicht gleichzeitig zu viele und andererseits
nicht nur einzelne Moleküle zu dem Messsignal beitragen. Dies
ist das gleichbedeutend mit sehr niedrigen Konzentrationen der fuoreszent
markierten Moleküle in oder sogar unterhalb des nanomolaren
Bereichs. Diese Voraussetzung hat bislang die anderweitig sehr vielversprechende
Anwendung auf Systeme ausgeschlossen, in denen höhere molekulare
Konzentrationen, beispielsweise im mikromolaren Bereich, erforderlich
sind. Weil z. B. Bindungsreaktionen mit geringer Affinität Überschusskonzentrationen der
möglichen Bindungspartner bei minimalen Mengen des Bindungsprodukts
erfordern und weil enzymatische Reaktionen oft für hohe
Substratkonzentration optimiert sind, können auf Einzelmolekülereignissen
basierende Experimente wie beispielsweise FCS, FIDA und andere Methoden
der Fluoreszenzfluktuationsanalyse in diesen Fällen nicht
angewendet werden.
-
Es
sind verschiedene Versuche unternommen worden, diesen Nachteil der
Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie zu überwinden.
Hierzu zählt das Verkleinern des Messbereichs, d. h. im
dreidimensionalen Fall des Messvolumens, um die Anzahl der gleichzeitig
detektierten fluoreszierenden Markermoleküle auch bei höherer
Konzentration klein genug zu halten. Dazu ist der Messbereich sowohl
in direktem Kontakt mit der Probe im speziellen durch Nahfeldoptiken
(SNOM, TIRF), mechanische Einschränkung des Messvolumens
(z. B. durch Wellenleiterstrukturen) als auch rein optisch, beispielsweise durch
Kombination mit der STED-Mikroskopie, bis unter die Beugungsgrenze
herab eingegrenzt worden. Damit einher geht aber die Einschränkung
auf durch das Experiment festgelegte Probengeometrien und/oder eine
potentielle Verfälschung des Messwerts. Zudem ist der für
die Realisierung dieser Ansätze zu betreibende Aufwand
sehr groß.
-
Ein
anderer Ansatz ist es, nur einen Teil der interessierenden Moleküle
mit den Markermolekülen zu markieren. Hierbei besteht jedoch
die Gefahr, dass sich die markierten Moleküle hinsichtlich
des interessierenden Messwerts anders verhalten als die unmarkierten
Moleküle, was die Interpretation des Messwerts erschwert.
Zudem muss vor dem Markierungsvorgang bekannt sein, welcher Prozentsatz
der Moleküle optimalerweise markiert werden soll und wie
eine solche Zielvorgabe auch erreicht wird. Im schlimmsten Fall
erfordert das viele Iterationen bis der optimale Wert erreicht ist.
-
Aus J.
Lippincott-Schwartz et al.: "Development and Use of Fluorescent
Proteinmarkers in Living Cells" in Science, Vol. 300, 4. April 2003,
S. 87 ff sind verschiedene Verfahren zum Verfolgen der
Diffusion bzw. der Bewegung von mit fluoreszenten Markermolekülen
markierten Molekülen bekannt. Bei einem als FRAP (Fluorescence
Recovery After Photobleaching) bezeichneten Verfahren wird die Erholung
der Fluoreszenz in einem Messbereich einer Probe beobachtet, nachdem
die anfänglich in dem Messbereich vorhandenen Markermoleküle
vollständig gebleicht wurden. Dieses Verfahren unterscheidet
sich von demjenigen nach den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs
1 dadurch, dass kein auf Einzelmolekülereignissen basierender Messwert
sondern der Verlauf der Fluoreszenz in dem betrachteten Messbereich
erfasst wird. Bei einem weiteren in diesem Dokument beschriebenen, FLIP
(Fluorescence Loss In Photobleaching) genannten Verfahren werden
die fluoreszenten Markermoleküle in einer Probe in einem
außerhalb des eigentlichen Messbereichs liegenden Bleichbereich gebleicht.
Auf die hieraus durch Diffusion der Markermoleküle auch
in dem Messbereich resultierende Abnahme der Fluoreszenz wird auf
die Diffusion der Markermoleküle bzw. der mit ihnen markierten
Moleküle rückgeschlossen. Auch hier basiert der
Messwert nicht auf Einzelmolekülereignissen. Dies gilt auch
für noch ein weiteres in dem Dokument beschriebenes Verfahren,
bei dem Markermoleküle, die anfänglich in einem
nicht fluoreszenten Zustand vorliegen, in einem Messbereich mit
einem optischen Signal in einen fluoreszenten Zustand überführt
werden, und dann beobachtet wird, wie die Fluoreszenz durch Wegdiffundieren
der aktivierten Markermoleküle aus dem Messbereich wieder
abnimmt. Außerdem wird in dem Dokument beschrieben, dass
die Probe in zeitlichen Abständen nach dem lokalen Aktivieren von
Markermolekülen in einen fluoreszenten Zustand fluoreszenzlichtmikroskopisch
abgebildet werden kann, um die räumliche Ausbreitung der
fluoreszenten Markermoleküle, d. h. ihre jeweilige räumliche Verteilung
zu erfassen. In dem Dokument wird auch die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
(FCS) als Verfahren zur Lokalisierung und Bestimmung des kinetischen
Verhaltens von markierten Proteinen angeführt. Hierbei
handelt es sich (s. o.) um ein Verfahren zum Bestimmen von Messwerten
auf der Basis von Einzelmolekülereignissen. Eine Anregungen
dahingehend, die beschriebenen phototaktivierbaren Proteine auch
für FCS-Untersuchungen einzusetzen, enthält das
Dokument jedoch nicht.
-
Die
Kinetik schaltbarer fluoreszenter Moleküle wurde in der
Vergangenheit häufig mit Methoden der Einzelmolekülspektroskopie
untersucht. Allerdings war hier die absolute Konzentration der Moleküle
immer von vorneherein so klein, dass die Messwerte unabhängig
vom Schaltzustand bestimmbar waren.
-
Bei
einem Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs
1, das in M. Moertelmaier et al.: "Thinning out clusters
while conserving stoichiometry of labeling" in Applied Physics Letters
87, 263903 (2005) beschrieben ist, wird die Konzentration
der aus einem Messbereich Fluoreszenzlicht aussendenden Markermolekülen
dadurch reduziert, dass zunächst alle Markermoleküle
innerhalb des Messbereichs durch Photobleichen permanent inaktiviert
werden, so dass sie überhaupt kein Fluoreszenzlicht mehr
aussenden. Die anschließend von außerhalb des
Messbereichs in den Messbereich eindiffundierenden, nicht gebleichten
Markermoleküle, weisen zumindest anfangs eine gegenüber
der absoluten Konzentration der gebleichten und nicht gebleichten
Markermoleküle in dem Messbereich soweit reduzierte Messkonzentration
auf, dass Einzelfluorszenzmikroskopietechniken angewendet werden
können. Eine optimale Messkonzentration für die jeweils
angewandte Technik der Einzelmolekülspektroskopie liegt
jedoch nur für einen kurzen Zeitraum vor, während
die Messkonzentration durch in den Messbereich eindiffundierende
fluoreszente Markermoleküle wieder kontinuierlich bis auf
die absolute Konzentration der in der jeweiligen Probe insgesamt verbliebenen
fluoreszenten Markermoleküle ansteigt. D. h., mit dem bekannten
Verfahren ist es nicht möglich, eine für das Bestimmen
des jeweils interessierenden Messwerts optimale Messkonzentration
der fluoreszierenden Markermoleküle in dem Messbereich
dauerhaft einzustellen. Da die Konzentration während der
Anstiegsphase ortsabhängig variiert, verkompliziert diese
Methode zusätzlich die Datenanalyse. Weil das Photobleichen
ein irreversibler Prozess ist, kann mit dieser Methode bei ortsfesten
Molekülen nur einmalig und bei langsamer Diffusion nur selten
ein kleiner, nicht notwendigerweise repräsentativer Anteil
der Markermoleküle gemessen werden.
-
Eine
dauerhaft optimale Messkonzentration kann auch nicht ohne Weiteres
dadurch erreicht werden, dass durch Photobleichen eines überwiegenden Anteils
aller in der jeweiligen Probe enthaltenen Markermoleküle
eine niedrige Messkonzentration der verbleibenden fluoreszenten
Markermoleküle eingestellt wird, weil das Photobleichen
ein irreversibler Prozess ist und sich die Konzentration der verbleibenden
fluoreszierenden Markermoleküle auch noch während
des Bestimmens des interessierenden Messwerts durch andere Prozesse
verringern und insbesondere die optimale Messkonzentration für
die Bestimmung des Messwerts während des Bestimmens des
Messwerts verschieben kann. Zudem beschränkt man sich hier
sogar bei ausreichend schneller Diffusion auf die einmalige Auswahl
eines nicht notwendigerweise repräsentativen Anteils der
Markermoleküle.
-
Aus
der
WO 2006/127692
A2 ist ein Verfahren zum Bestimmen des Orts einzelner Markermoleküle
zwecks Abbilden einer Probe mit hoher Ortsauflösung bekannt.
Bei diesem Verfahren wird die Konzentration von Markermolekülen,
die sich in einem fluoreszenten Zustand befinden, gegenüber
einer absoluten Konzentration der Markermoleküle in dem fluoreszenten
und einem nicht fluoreszenten Zustand mit einem optischen Signal
auf einen solchen Wert eingestellt, dass die Position einzelner
Markermoleküle aufgrund des von ihnen emittierten Fluoreszenzlichts
mit über die Beugungsgrenze hinausgehender Ortsauflösung
bestimmt werden kann.
-
Der
Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die mit einem insbesondere optischen
Signal zwischen einem fluoreszenten und einem nicht fluoreszenten Zustand
schaltbar sind, zur Erhöhung der Ortsauflösung
beim Abbilden einer Probe wurde bereits zuvor in der
WO 2004/090617 A2 beschrieben.
-
In
K.
A. Lukyanov et al.: "Photoactivatable Fluorescent Proteins" in Nature
Reviews, Molecular Cell Biology, Vol. 6, November 2005, S. 885 ff wird eine Übersicht über
photoaktivierbare fluoreszente Proteine, die als Markermoleküle
eingesetzt werden können, gegeben.
-
AUFGABE DER ERFINDUNG
-
Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Bestimmen
mindestens eines Messwerts auf der Basis von Einzelmolekülereignissen
von gleichartigen Markermolekülen in einer Probe aufzuzeigen,
bei dem trotz einer für ein derartiges Bestimmen an sich
zu hohen absoluten Konzentration der Markermoleküle in
der Probe dennoch optimale Voraussetzungen für das Bestimmen
des Messwerts bereitgestellt werden können ohne die oben beschriebenen
Nachteile in Kauf nehmen zu müssen.
-
LÖSUNG
-
Die
Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen
des Patentanspruchs 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen
des neuen Verfahrens sind in den abhängigen Patentansprüchen
2 bis 25 beschrieben.
-
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Bei
dem neuen Verfahren werden die Markermoleküle entweder
zu einem im Vergleich zu ihrer absoluten Konzentration kleineren
Anteil aus ihrem nicht messbaren Zustand in ihren messbaren Zustand überführt,
in dem sie dann mit der gewünschten Messkonzentration vorliegen,
oder sie werden aus ihrem messbaren Zustand soweit in ihren nicht messbaren
Zustand überführt, bis sie nur noch mit ihrer
gewünschten Messkonzentration in dem messbaren Zustand
zurückbleiben. Dabei geht es in dem zweiten Fall der Erfindung
aber nicht um ein Bleichen oder einen anderen endgültigen
Ausschaltprozess der Markermoleküle. Vielmehr werden in
diesem zweiten Fall die Markermoleküle aus einer Gruppe von Markermolekülen
ausgewählt, die mit einer gewissen Übergangsrate
aus ihrem nicht messbaren in ihren messbaren Zustand übergehen.
Die Messkonzentration ergibt sich dann über ein dynamisches Gleichgewicht.
In beiden Fällen kann die Messkonzentration der Markermoleküle
zumindest in der Weise nachgeregelt werden, dass im ersten Fall
durch Erhöhen des Einstellsignals weitere Markermoleküle aus
ihrem nicht messbaren Zustand in ihren messbaren Zustand überführt
werden bzw. im zweiten Fall durch Reduzieren des Einstellsignals
die Übergangsrate der Markermoleküle aus ihrem
nicht messbaren in ihren messbaren Zustand genutzt wird, um die
Anzahl der in dem messbaren Zustand befindlichen Markermoleküle
anwachsen zu lassen. Umgekehrt ist im zweiten Fall eine Reduzierung
der Messkonzentration durch Erhöhung des Einstellsignals
möglich. Im ersten Fall ist gewöhnlich ein permanentes Einstellsignal
erforderlich, da zum Beispiel Markermoleküle das Messvolumen
verlassen oder aus ihrem messbaren in den nicht messbaren oder zum Beispiel
durch Bleichen in einen anderen, dauerhaften, nicht messbaren Zustand übergehen.
Dies kann entweder spontan oder durch ein weiters Signal passieren.
In jedem Falle kann dann durch eine Reduktion des Einstellsignals
der Anteil der Markermoleküle im Messvolumen, die sich
in einem messbaren Zustand befinden, reduziert werden.
-
Damit
kann, was besonders bevorzugt ist, die Messkonzentration in beiden
Fällen des erfindungsgemäßen Verfahrens
anhand des aus dem Messbereich erfassten Messsignals auf einen für
das Bestimmen des mindestens einen Messwerts optimalen Konzentrationswert
in dem definierten Messbereich eingeregelt werden. Der optimale
Konzentrationswert kann sich beispielsweise durch ein maximales
Signal zu Rauschen-Verhältnis oder die schnellstmögliche
Bestimmung des Messwertes mit einer gegebenen Genauigkeit auszeichnen.
-
Bei
dem neuen Verfahren ist es auch möglich, sich ändernde
Messbedingungen oder sich im oben erläuterten Sinne ändernde
optimale Konzentrationswerte der Messkonzentration zu berücksichtigen,
indem die Messkonzentration anhand des aus dem Messbereich erfassten
Messsignals fortlaufend, d. h. dynamisch, nachgeregelt wird.
-
Wie
bereits anhand der bei der Erfindung gegebenen Einflussmöglichkeiten
auf die Messkonzentration angedeutet wurde, kann zum Einregeln der Messkonzentration
das Einstellsignal verwendet werden. Es kann aber auch ein weiteres
Signal variabel eingesetzt werden, mit dem die Markermoleküle
entgegen der Hauptrichtung ihrer Überführung mit
dem Einstellsignal zurück in ihren anfänglichen
Zustand oder in einen weiteren nicht messbaren Zustand überführt
werden.
-
In
dem zweiten Fall der Erfindung, in dem die Markermoleküle
aus einer Gruppe von Markermolekülen ausgewählt
werden, die mit einer Übergangsrate aus ihrem nicht messbaren
in ihren messbaren Zustand übergehen, kann diese Übergangsrate spontan,
d. h. eine thermisch induzierte, Übergangsrate sein. Es
kann sich aber auch um eine durch ein anderes Signal induzierte Übergangsrate
handeln. Konkret kann dazu ein nur diese Übergangsrate
beeinflussendes zusätzliches Signal eingesetzt werden.
Häufig wird diese Übergangsrate, soweit sie nicht
spontan ist, bei dem neuen Verfahren jedoch durch ein zum Bestimmen
des mindestens einen Messwerts eingesetztes Signal induziert. Hierbei handelt
es sich beispielsweise um Anregungslicht zum Anregen von Fluoreszenzlicht
als Messsignal von den Markermolekülen.
-
Weil
bei dem neuen Verfahren ein Messwert bestimmt wird, der einen anderen
Parameter als den Ort oder die Orientierung der Markermoleküle
in dem Messbereich betrifft, kann das neue Verfahren so durchgeführt
werden, dass beim Bestimmen des mindestens einen Messwerts das Messsignal
von den Markermolekülen unabhängig davon ausgewertet
wird, von wo innerhalb des Messbereichs es stammt oder welcher Orientierung
der Markermoleküle in dem Messbereich es entspricht.
-
Konkret
kann der Messbereich auf einen den Messbereich nicht räumlich
auflösenden Detektor für das Messsignal abgebildet
werden.
-
Der
Messwert auf der Basis von Einzelmolekülereignissen wird
bei dem neuen Verfahren typischerweise durch eine Methode bestimmt,
die der Einzelmolekülspektroskopie zuzuordnen ist. Von
besonderem Interesse sind dabei Methoden der Fluktuationsanalyse.
Insbesondere ist das neue Verfahren zur Anwendung bei Methoden der
Fluktuationsanalyse wie zum Beispiel FCS und FIDA und bei verschiedenen
Spielarten der MFD geeignet.
-
Wie
sich bereits anhand der mehrfachen Verweise auf Fluoreszenzlicht
von den Markermolekülen andeutete, betrifft die Erfindung
insbesondere fluoreszente Markermoleküle, wobei das Messsignal
von den Markermolekülen emittiertes Fluoreszenzlicht ist.
Die Prinzipien der vorliegenden Erfindung sind jedoch auch auf anders
messbare Markermoleküle unmittelbar anwendbar.
-
Zu
den Messwerten, die gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren bestimmt werden können, zählen insbesondere
die Folgenden:
- – Eine Lebensdauer
eines Zustands der Markermoleküle. Hierbei kann es sich
um einen angeregten Zustand der Markermoleküle handeln.
Dieser angeregte Zustand kann, muss aber nicht ein fluoreszenter
Zustand sein, aus dem die Markermoleküle unter Aussendung
des als Messsignal verwendeten Fluoreszenzlichts in einen anderen
Zustand übergehen.
- – Eine Übergangswahrscheinlichkeit und/oder eine Übergangsrate
der Markermoleküle in einen Zustand.
- – Eine Variation eins Absorptions- oder Emissionsspektrums
bei den Markermolekülen. Derartige Variationen können
z. B. auf Änderungen der chemischen oder physikalischen
Umgebungen der Markermoleküle oder auf eine eingegangene Bindung
oder Änderung der Konformation hinweisen.
- – Ein Verhältnis zwischen Signalstärken
des Messsignals bei mehreren Fluoreszenzlichtwellenlängen
der Markermoleküle oder -molekülkomplexe. Dadurch
kann z. B. eine Änderung des Emissionsspektrums oder auch
der Abstand oder Bindungszustand zweier oder mehrerer Moleküle, zwischen
denen es zu Energietransfer, zum Beispiel durch FREI, kommt, bestimmt
werden.
- – Eine Signalstärke oder Helligkeit der Markermoleküle,
die ebenfalls einen Hinweis auf unterschiedliche chemische oder
physikalische Umgebungen der Markermoleküle sein kann und
beispielsweise anzeigt, ob bestimmte Markermoleküle leichter
(als andere) auf anderem Weg als durch die Aussendung von Fluoreszenzlicht
aus ihrem fluoreszenten Zustand herausgelangen können.
- – Ein Zeitverlauf eines Messsignals von den Markermolekülen,
womit insbesondere ganz allgemein Messwerte im Bereich der Fluktuationsanalyse
gemeint sind.
- – Eine Aufenthaltsdauer der Markermoleküle
in dem Messbereich, die einen speziellen Messwert bei Fluktuationsanalyse
darstellt und z. B. als Maß für die Diffusions-
oder Flussgeschwindigkeiten in der Probe verwendet werden kann.
- – Eine Aufenthaltshäufigkeit der Markermoleküle, insbesondere
verglichen mit einer Aufenthaltshäufigkeit anderer Markermoleküle
in dem Messbereich. Das neue Verfahren ist, obwohl es sich auf das
Bestimmen eines Messwerts zu gleichartigen Markermolekülen
bezieht, nicht dahingehend eingeschränkt, dass nicht auch
Messwerte zu anderen Markermolekülen in demselben Messbereich
bestimmt werden können. Insbesondere eignet es sich zur
präzisen Bestimmung relativer Konzentrationen innerhalb
des Messbereichs.
- – Eine Aufteilung der Markermoleküle auf mehrere
anhand des Messsignals unterscheidbare Unterzustände ihres
messbaren Zustands, wobei die Unterzustände das in dem
messbaren Zustand von den Markermolekülen erhältliche
Messsignal variieren.
-
Bei
dem neuen Verfahren können die Markermoleküle
in der Probe beweglich sein, wie dies dem Prinzip der Fluktuationsanalyse
entspricht, wobei der Messbereich relativ zu der Probe festliegt.
-
Umgekehrt
kann aber auch der Messbereich relativ zu der Probe bewegt werden,
um insbesondere bei in der Probe fixierten Markermolekülen
der Fluktuationsanalyse ähnliche Methoden zum Bestimmen
von Messwerten anwenden zu können, oder Messwerte in verschiedenen
Bereichen der Probe zu erhalten.
-
Viele
erfindungsgemäße Verfahren zum Bestimmen von Messwerten
auf der Basis von Einzelmolekülereignissen verlangen nicht,
dass das Messsignal tatsächlich jeweils einzelnen oder
gar bestimmten Markermolekülen zugeordnet werden kann.
Vielmehr stammt es insbesondere in der Fluktuationsanalyse typischerweise
von einem Kollektiv von Markermolekülen, das sogar eine
gewisse Größe aufweisen muss, um optimale Bedingungen
für das Bestimmen des Interessierenden Messwerts bereitzustellen.
So wird bei dem neuen Verfahren die Messkonzentration typischerweise
auf einen Wert eingestellt, der mindestens zweimal so groß ist
wie der Kehrwert der Abmessungen des Messbereichs, der bei dem neuen
Verfahren in der Regel räumlich nicht oder nur durch die
endliche Größe des Messbereichs aufgelöst
wird. Vorzugsweise wird die Messkonzentration sogar auf einen Wert
eingestellt, der mindestens fünfmal so groß ist,
wie der Kehrwert der Abmessungen des Messbereichs.
-
Wie
schon im Zusammenhang mit den Möglichkeiten, die Messkonzentration
auf einen optimalen Konzentrationswert einzustellen, angedeutet
wurde, kann neben dem Einstellsignal ein Rückführsignal
eingesetzt werden, das sich von dem Einstellsignal unterscheidet
und mit dem die Markermoleküle entgegen der Hauptrichtung
ihrer Überführung mit dem Einstellsignal zurück
in ihren anfänglichen Zustand überführt
werden. Die Messkonzentration wird dann dynamisch durch das Verhältnis
der Intensitäten des Einstellsignals und des Rückführsignals
eingestellt. Auch wenn dabei die Messkonzentration konstant gehalten
wird, zählen zu ihr immer andere Markermoleküle.
Dies ist ein grundsätzlicher Unterschied zu Verfahren,
bei denen der Hauptanteil der Markermoleküle irreversibel
gebleicht wird, um die Messung zu ermöglichen. Bei vielen
erfindungsgemäßen Messmethoden ist darüber
hinaus eine direkte Zuordnung des Messsignals zu bestimmten Markermolekülen,
die bei dem in der
WO
2006/127692 A2 beschriebenen Verfahren von entscheidender
Bedeutung ist, nicht erforderlich.
-
Bereits
im Zusammenhang mit der Möglichkeit des Einregelns der
Messkonzentration wurde ein Ausschaltsignal angedeutet, mit dem
die Markermoleküle aus ihrem messbaren Zustand in einen
weiteren, permanent nicht messbaren Zustand überführt werden
können. Dieses Ausschaltsignal kann im Rahmen des natürlichen
Bleichens von Markermolekülen auch durch ein Abfragesignal,
d. h. z. B. durch Anregungslicht für fluoreszente Markermoleküle
bereitgestellt werden.
-
Das
Einstellsignal und/oder das Rückführsignal und/oder
das Ausschaltsignal ist vorzugsweise ein physikalisches Signal und
dabei insbesondere ein optisches, akustisches oder thermisches Signal. Mit
einem optischen Signal ist jedwedes elektromagnetische Signal gemeint.
Ein thermisches Signal kann bereits durch die tatsächliche
Temperatur der Probe bereitgestellt werden.
-
Die
erwähnten einzelnen Signale, zu denen neben dem Einstellsignal,
dem Rückführsignal und dem Ausschaltsignal auch
ein Abfragesignal gehört, mit dem die Markermoleküle
zur Abgabe des Messsignals angeregt werden, können paarweise
oder sogar zu dritt durch dasselbe physikalische Signal bereitgestellt
werden. So kann das Einstellsignal, das einen Teil der Markermoleküle
aus einem nicht fluoreszenten in einen fluoreszenten Zustand überführt, gleichzeitig
das Abfragesignal, d. h. ein Anregungssignal zum Anregen der Markermoleküle
zur Emission von Fluoreszenzlicht sein und als Ausschaltsignal wirken,
indem es die Markermoleküle letztlich in einen weiteren
permanent nicht messbaren Zustand bleicht. Auch das Abfragesignal
und das Rückführsignal können ein und
dasselbe Signal sein.
-
Es
kann von Vorteil sein, mindestens ein Signal aus der Gruppe des
Einstellsignals, des Rückführsignals, des Ausschaltsignals
und des Abfragesignals mit einer Modulation über die Zeit
auf die Probe aufzubringen. Ein solches Vorgehen dient zum Beispiel
dazu, die Empfindlichkeit des neuen Verfahrens beim Bestimmen des
interessierenden Messwerts durch Ausnutzung einer zeitlichen Korrelation
zwischen dem Messsignal und dem Abfragesignal zu erhöhen.
Eine zeitliche Variation des Einstellsignals und anderer Signale,
die die Messkonzentration beeinflussen, kann aber auch zur Einstellung
des optimalen Konzentrationswerts für die Messkonzentration
genutzt werden, indem dabei die Einflüsse auf den Messwert
beobachtet werden. Häufig wird mit der zeitlichen Variation
der jeweiligen Signale aber vorwiegend der Zweck der Diskriminierung
der anderen Signale von dem interessierenden Messsignal an einem
Detektor verfolgt.
-
Insbesondere
das Einstellsignal, aber auch jedes andere Signal aus der Gruppe
des Einstellsignals, des Rückführsignals, des
Ausschaltsignals und des Abfragesignals kann zudem mit einer strukturierten
räumlichen Verteilung auf die Probe aufgebracht werden.
Mit der strukturierten räumlichen Verteilung des Einstellsignals
kann beispielsweise der Messbereich definiert werden, indem nur
in diesem Messbereich überhaupt ein Konzentrationswert
der Markermoleküle in dem messbaren Zustand eingestellt
wird. Der Messbereich kann aber auch durch das Abfragesignal, das
Rückführsignal oder den Detektor für
die Detektion des Messsignals festgelegt werden.
-
In
diesem Zusammenhang kann es von besonderem Vorteil sein, eines der
eingesetzten Signale in Form einer Zwei- oder Mehr-Photonen-Wechselwirkung
aufzubringen.
-
Eine
weitere Möglichkeit einer räumlichen Strukturierung
insbesondere des Einstellsignals, aber auch des Rückführ-
oder Ausschaltsignals, kann darin bestehen, dass es außerhalb
des Messbereichs auf die Probe aufgebracht wird, so dass nur die
durch den Bereich dieses Signals in den Messbereich diffundierenden
Markermoleküle von dem Signal beeinflusst sind. So kann
ein Ring oder eine Schale aus dem Einstellsignal um den Messbereich gelegt
werden.
-
Wenn
das Einstellsignal hingegen innerhalb des Messbereichs auf die Probe
aufgebracht wird, kann es bevorzugt sein, wenn es über
dem Messbereich eine konstante Intensität aufweist, um
nicht die Interpretation des gewonnenen Messwerts zu erschweren.
-
Zur
Erhöhung der Messgeschwindigkeit können die Markermoleküle
bei dem neuen Verfahren in mehreren getrennten Messbereichen in
der Probe parallel gemessen werden. Hierzu kann ein die verschiedenen
Messbereiche räumlich auflösender Detektor für
die Detektion des Messsignals eingesetzt werden.
-
Vorteilhafte
Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen,
der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung
genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer
Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ
oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend
von erfindungsgemäßen Ausführungsformen
erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere
den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer
Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu
entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen
der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche
ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen
der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt.
Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen
dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese
Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche
kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen
aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen
der Erfindung entfallen.
-
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
-
Die
Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher
erläutert und beschrieben.
-
1 zeigt
einen prinzipiellen Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung
einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens.
-
2 zeigt
die Funktionsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens
in einem ersten Fall, in dem mit einem Einstellsignal von einer
Vielzahl von Markermolekülen nur wenige aus einem nicht
messbaren Zustand in einen messbaren Zustand überführt werden.
-
3 zeigt
einen gegenüber 2 umgekehrten Fall, in dem mit
einem Einstellsignal eine Vielzahl von Markermolekülen
bis auf wenige aus einem messbaren Zustand in einen nicht messbaren Zustand überführt
wird.
-
4 illustriert
die Abhängigkeit der relativen Anzahl von Markermolekülen
im fluoreszierenden Zustand von dem Einstellsignal für
verschiedene schaltbare Fluoreszenzfarbstoffe als Markermoleküle gemäß dem
in 2 skizzierten Fall.
-
5 skizziert
verschiedene räumliche Lagen des Einstellsignals gegenüber
einem Messbereich, aus dem ein Messsignal empfangen wird, bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren; und
-
6 dokumentiert
eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
bei der die Anzahl von Markermolekülen Rhodamin 110 (Rh110)
in nanomolarer Konzentration trotz eines großen Überschusses an
anderen Markermolekülen dronpa-M159S mit Hilfe der Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie
bestimmt wurde, obwohl sich die Messsignale von dronpa-M159S und
Rh110 beispielsweise durch Farbfilter nicht trennen lassen.
-
FIGURENBESCHREIBUNG
-
Die
in 1 dargestellte Vorrichtung 1 entspricht
bis auf die Vielzahl der auf eine Probe 2 aufbringbaren
Signale 3 bis 6 einer Vorrichtung, wie sie typischerweise
auch für herkömmliche Fluktuationsanalysen eingesetzt
wird. Hier nicht einzeln hervorgehobene Markermoleküle
in der Probe 2 werden in dem Fokalbereich eines Objektivs 8 mit
einem Abfragesignal 3 beleuchtet. Durch dasselbe Objektiv 8 gelangt
in Gegenrichtung ein Messsignal 10 von den Markermolekülen
auf einen Detektor 11. Bei dem Messsignal handelt es sich
in vielen Fällen um Fluoreszenzlicht, das von Markermolekülen
im Fokus des Objektivs 8 aufgrund einer Anregung durch
das Abfragesignal 3 emittiert wird. Mit Hilfe einer konfokalen Anordnung
des Detektors 11 oder einer davor angeordneten Blende oder
durch die Abmessungen eines Probenbehälters wird der Messbereich,
aus dem das Messsignal 10 registriert wird, auf einen kleinen räumlichen
Bereich, typischerweise ein sogenanntes "beugungsbegrenztes" Detektionsvolumen
eingeschränkt. Um die Konzentration der Markermoleküle, von
denen das Messsignal 10 erhalten wird, auf eine Messkonzentration
zu begrenzen, die kleiner als die absolute Konzentration der Markermoleküle
ist und eine Bestimmung von Messwerten auf der Basis von Einzelmolekülereignissen
erlaubt, sind die weiteren Signale 4 bis 6 vorgesehen.
Ein Einstellsignal 4 schaltet die Markermoleküle
hier aus einem nicht fluoreszenten, d. h. nicht messbaren, Zustand
in einen fluoreszenten, d. h. messbaren, Zustand. Im Gegenzug dazu
schaltet ein Rückführsignal 5 die Markermoleküle
in ihren anfänglichen Zustand zurück; und ein
Ausschaltsignal 6 dient dazu, die Markermoleküle in
einen weiteren Zustand zu überführen, in dem sie permanent
nicht mehr fluoreszent, d. h. nicht mehr messbar, sind. Die Strahlengänge
der Signale 3 bis 6 und des Messsignals 10 werden
durch optische Bauteile 7, bei denen es sich zum Beispiel
um dichroitische Spiegel handeln kann zusammengeführt bzw. getrennt.
Zusätzlich können in jeden Strahlengang zum Beispiel
Phasenplatten 9 eingebracht werden, um das jeweilige Signal
in der Probe räumlich zu modulieren. Mit Hilfe einer durch
einen Doppelpfeil angedeuteten Scaneinrichtung 12 erfolgt
eine Relativverschiebung der Probe 2 gegenüber
dem Objektiv 8, um die Probe 2 mit dem Messbereich
abzutasten. Alternativ kann natürlich auch in die Strahlengänge eine
Scaneinrichtung eingebracht werden, die den Messbereich relativ
zum Objektiv 8 und der Probe 2 verschiebt. Um
mit dem Detektor 11 tatsächlich nur das interessierende
Messsignal 10 zu registrieren, kann dieser neben seiner
konfokalen Anordnung zeitaufgelöst betrieben werden, so
dass er z. B. das durch einen Puls des Abfragesignals 3 ausgelöste Fluoreszenzlicht
in Form des Messsignals 10 empfängt, nicht aber
Reflektionen des Abfragesignals 3 und auch keine reflektierten
Anteile der ebenfalls gepulsten weiteren Signale 4 bis 6.
Das Einstellsignal 4, das Ausschaltsignal 6, das
Abfragesignal 3 und das Rückführsignal 5 können
entweder gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge und dabei auch überlappend
eingestrahlt werden. Insbesondere kann das Messsignal oder die Messsignale
auch durch geeignete Farbfilter selektiert werden.
-
Konkret
kann das Abfragesignal 3 ganz oder teilweise auch die Funktion
des Einstellsignals 4 oder des Rückführsignals 5 übernehmen,
indem es nicht nur das Messsignal 10 hervorruft, sondern
auch die Markermoleküle in der einen oder anderen Richtung zwischen
ihrem messbaren Zustand und ihrem nicht messbaren Zustand überführt.
In diesem Fall kann dann, wenn die Überführungsrate
aufgrund des Abfragesignals 3 für die Einstellung
der gewünschten Messkonzentration der Markermoleküle
in dem Messbereich ausreichend ist, auf ein zusätzliches Einstellsignal 4,
Rückführsignal 5 oder Ausschaltsignal 6 verzichtet
werden. In einfachsten Fall ist nur ein Abfragesignal 3 notwendig,
das alle Funktionen übernimmt. Vielfach wird neben dem
Abfragesignal 3 aber mindestens ein weiteres Signal benötigt,
das eine andere Wellenlänge als das Abfragesignal 3 aufweist. Es
können auch alle Signale unterschiedlich sein.
-
Mit
der in 1 gezeigten Vorrichtung können reaktionskinetische
Konstanten, interne Übergangsraten, Diffusions- und Flussgeschwindigkeiten, Bindungsaffinitäten
und die statistischen Verteilungsfunktionen von Lebensdauer, Helligkeiten
und anderen Molekülparametern mittels des Messsignals 10 auf
der Basis von Einzelmolekülereignissen gemessen werden.
Kombiniert man die Anordnung mit mehreren Detektionskanälen
des Detektors 11, z. B. für unterschiedliche spektrale
Bereiche des als Messsignal 10 detektierten Lichts, können
zusätzlich z. B. auch FREI-Effizienzen gemessen werden.
-
Die
angedeutete Scaneinrichtung 12 erlaubt es auch, Fluktuationsmessungen
an ruhenden Proben 2, d. h. an Proben 2 mit ortsfesten
Markermolekülen durchzuführen oder Unterschiede
des Messignals 10 aus verschiedenen Bereichen der Probe 2 zu erfassen.
Die Vorrichtung 1 kann auch so erweitert werden, dass die
Markermoleküle in mehreren Messbereichten parallel, d.
h. gleichzeitig gemessen werden. Hierzu können mehrere
separate Detektoren 11 oder ein räumlich unterteilter
Detektor mit einzelnen getrennten Detektionsbereichen für
die unterschiedlichen Messbereiche eingesetzt werden. Der Aufbau der
Vorrichtung 1 kann dann einer speziellen Ausführungsform
eines so genannten Video-Mikroskop entsprechen. Entscheidend ist
jedoch, dass die Zeitauflösung des Detektors ausreicht,
um die gewünschte Methode der Parameterbestimmung auch
anwenden zu können. Hierfür kommen beim gegenwärtigen Stand
der Technik insbesondere so genannte EMCCD- und CMOS-Kameras, letztere
in der Regel kombiniert mit einem Bildverstärker, in Frage.
-
2 skizziert
die Wirkung des Einstellsignals 4 auf Markermoleküle 13 in
einem Messbereich 14. Die Markermoleküle sind
in der linken Hälfte von 2 sämtlich
in einem nicht messbaren Zustand, in dem sie auf das Abfragesignal 3 gemäß 1 hin kein
Messsignal 10 abgeben. Durch das Einstellsignal 4 wird
ein kleiner Anteil der Markermoleküle 13 in einen
messbaren Zustand überführt, was in der rechten
Hälfte von 2 dadurch angedeutet ist, dass dort
zwei Markermoleküle 13 mit einem "x" markiert sind.
In der umgekehrten Richtung wirkt das Rückführsignal 5,
d. h. es überführt die Markermoleküle 13 aus
ihrem messbaren Zustand in ihren nicht messbaren Zustand. Alternativ
oder zusätzlich ein Ausschaltsignal 6 Gmäß 1 eingesetzt
werden, dass Markermoleküle 13 in einen permanent
nicht messbaren Zustand überführt (nicht abgebildet).
Die Überführungsraten aufgrund des Einstellsignals 4 und
des Rückführsignals 5 soweit ggf. des
Ausschaltsignals 6 bestimmen im Zusammenspiel mit allen
weiteren, eventuell vorhandenen und durch andere Signale induzierten
oder spontanen Übergangsraten, den Anteil der Markermoleküle 13,
die sich in dem messbaren Zustand befinden. Dieser Anteil kann durch
die Intensitäten der Signale 4 und 5 so
eingestellt werden, dass eine optimale Messkonzentration der Markermoleküle 13 in
dem messbaren Zustand vorliegt, um einen bestimmten Messwert auf
der Basis von Einzelmolekülereignissen zu bestimmen.
-
3 skizziert
einen anderen Fall des neuen Verfahrens, bei dem die Markermoleküle 13 mit
dem Einstellsignal 4 aus ihrem anfänglichen messbaren Zustand
(links in 3) innerhalb des Messbereichs 14 im
Wesentlichen in ihren nicht messbaren Zustand (rechts in 3) überführt
werden, so dass nur wenige Markermoleküle 13 in
dem messbaren Zustand verbleiben. Mit diesem geringen Anteil der messbaren
Markermoleküle 13 wird aber gerade die gewünschte
Messkonzentration für die Bestimmung des interessierenden
Messwerts auf der Basis von Einzelmolekülereignissen erreicht.
Das Rückführsignal 5 überführt
die Markermoleküle 13 im Gegenzug zurück
in ihren messbaren Zustand. Dabei kann das Rückführsignal 5 überflüssig
sein, wenn beispielsweise ein spontaner Übergang der Markermoleküle 13 aus
ihrem nicht messbaren Zustand in ihren messbaren Zustand mit relevanter Übergangsrate
erfolgt.
-
4 zeigt
für verschiedene aus dem Stand der Technik grundsätzlich
bekannte schaltbare Fluoreszenzfarbstoffe deren relative Anzahl
in ihrem messbaren, d. h. fluoreszierenden Zustand in Abhängigkeit
von der Intensität des Einstellsignals 4 gemäß 2,
das sie in ihren messbaren Zustand überführt. Den
Daten gemäß 4 liegt
ein Einstellsignal in Form von UV-Licht der Wellenlänge
von 405 nm zugrunde. Das Abfragesignal 3 gemäß 1 ist
in diesem Fall blaues Licht der Wellenlänge 488 nm. Die relative
Anzahl an messbaren Markermolekülen wurde mit Hilfe der
Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie anhand der FIDA-Methode unter
Registrieren des Fluoreszenzlichts als Messsignal 10 mit
einem Punktdetektor bestimmt.
-
5A skizziert einen Fall, in dem der von dem
Einstellsignal 4 erfasste Bereich den gesamten Messbereich 14,
der von dem Abfragesignal 3 erfasst wird, abdeckt und über
diesen hinausgeht. Das Einstellsignal 4 bestimmt damit
unmittelbar die Messkonzentration der in dem Messbereich 14 in
ihrem messbaren Zustand vorliegenden Markermoleküle.
-
5B skizziert den Fall, in dem das Einstellsignal 4 neben
dem Messbereich 14 aufgebracht wird, in dem das Messsignal
mit dem Abfragesignal 3 generiert wird. In diesem Fall
hat das Einstellsignal 4 nur einen indirekten, von der
Diffusion der Markermoleküle abhängigen Einfluss
auf die Messkonzentration der in ihrem messbaren Zustand in dem
Messbereich 14 befindlichen Markermoleküle.
-
5C skizziert den Fall, dass mit Hilfe
eines diffraktiven Elements (einer sogenannten Phasenmaske) in dem
Strahl des Einstellsignals 4 ein Ring aus dem Einstellsignal 4 um
den Messbereich 14 herumgelegt wird. Vorausgesetzt, die
Markermoleküle bewegen sich in geeigneter Weise, zum Beispiel
durch Diffusion, kann so die Messung in einem Bereich erfolgen,
in dem kein Einstellsignal 4 auf die Probe fällt.
Eine Trennung des Abfragesignals 3 bzw. der Generierung
des Messsignals von dem Einstellsignal 4 kann auch durch
einen zeitlichen Versatz zwischen dem Einstellsignal 4 und
dem Abfragesignal 3 bewirkt werden. D. h., die eigentliche
Messung erfolgt erst einige Zeit nach der Einstellung der gewünschten
Messkonzentration der Markermoleküle in dem Messbereich 14.
-
In 5D ist eine räumliche Modulation
des Einstellsignals 4 skizziert. Hierdurch kann beispielsweise
der Bereich des Abfragesignals 3 in mehrere diskrete Messbereiche 14 unterteilt
werden oder der Effekt von Diffusion und Kinetik getrennt werden.
In Kombination mit einem räumlich auflösenden
Detektor oder mehrer Detektoren kann diese Anordnung auch zur gleichzeitigen
Messung in mehreren Messbereichen 14 verwendet werden.
-
In
einem konkreten Beispiel, dessen Ergebnisse in 6 skizziert
sind, wurde die Konzentration des Markermoleküls Rhodamin110
(Rh110) im Beisein eines großen Überschusses eines
anderen Markermoleküls dronpa-M159S, dessen Messsignal
z. B. durch Farbfilter nicht von dem des Markermoleküls Rh110
unterschieden werden kann, gemessen. Indem nur ein geringer Teil
der absoluten Konzentration der dronpa-Moleküle in ihren
messbaren Zustand geschaltet wurde, lag die Messkonzentration der dronpa-Moleküle
in der Größenordnung der Konzentration der Rhodamin-Moleküle.
So konnte mittels Fluoreszenzfluktuationsanalyse eine Variation
der Rhodaminkonzentration bei konstanter viel höherer absoluter
dronpa-Konzentration aufgelöst werden. Diese Messung simuliert
z. B. die Messbedingungen bei Bindungsereignissen mit niedriger
Affinität.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren kann auch zum Beobachten
von Protein-Protein-Wechselwirkung verwendet werden, wobei ein Protein
mit einem FREI-Donor und ein Protein mit einem FREI-Akzeptor markiert
ist. Das Abfragelicht regt den Donor an. Falls eine Bindung stattgefunden
hat, fluoresziert aber mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit der
Akzeptor (nicht der Donor), da aufgrund der Bindung ein Energieübertrag
vom Donor auf den Akzeptor stattfinden kann. Die Wahrscheinlichkeit
des Energieübertrags ist gleichzeitig ein Maß für
die Entfernung und relative Orientierung von Donor und Akzeptor.
Indem der Donor mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
auf eine geeignete Messkonzentration eingeschaltet wird, kann in
jedem beugungslimitierten Punkt einer Probe als Messbereich ein
Histogramm der Entfernungen aufgestellt werden, indem in jedem solchen
Punkt sehr häufig immer genau ein FREI-Paar (oder ein einzelner
Donor/Akzeptor) abgefragt wird und dabei entweder seine Lebensdauer oder
die relative Fluoreszenz von Akzeptor und Donor bestimmt wird.
-
- 1
- Vorrichtung
- 2
- Probe
- 3
- Abfragesignal
- 4
- Einstellsignal
- 5
- Rückführsignal
- 6
- Ausschaltsignal
- 7
- optisches
Element
- 8
- Objektiv
- 9
- Phasenplatte
- 10
- Messsignal
- 11
- Detektor
- 12
- Scaneinrichtung
- 13
- Markermolekül
- 14
- Messbereich
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 2006/127692
A2 [0013, 0031]
- - WO 2004/090617 A2 [0014]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - C. Eggeling
et al.: "Multi-Parameter Fluorescence Detection at the Single-Molecule
Level: Techniques and Applications" in 2. BIOSENSOR SYMPOSIUM, Tübingen
2001 [0005]
- - J. Lippincott-Schwartz et al.: "Development and Use of Fluorescent
Proteinmarkers in Living Cells" in Science, Vol. 300, 4. April 2003,
S. 87 ff [0009]
- - M. Moertelmaier et al.: "Thinning out clusters while conserving
stoichiometry of labeling" in Applied Physics Letters 87, 263903
(2005) [0011]
- - K. A. Lukyanov et al.: "Photoactivatable Fluorescent Proteins"
in Nature Reviews, Molecular Cell Biology, Vol. 6, November 2005,
S. 885 ff [0015]