DE102007031417A1 - Hyaluronate lyase with a histidine tag e.g. useful in pharmaceutical formulations and medical products - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft Hyaluronatlyase mit erhöhter Wirksamkeit, insbesondere für die Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen und Medizinprodukten für intrakorporale und extrakorporale Anwendungen. Die Hyaluronatlyase besitzt eine maximale spezifische Aktivität von 650.000 IU/mg und ist frei von Streptokokken-Toxinen. Sie wird nicht durch im Serum vorhandene natürliche Inhibitoren des α-I-Typs gehemmt, wirkt als ein verbessertes Hyaluronsäure spaltendes „spreading enzyme" und weist eine besonders hohe Aktivität auf, Calcium-enthaltende Ablagerungen aus ihrer Bindung an die Gewebe freizusetzen.The Invention relates to hyaluronate lyase with increased efficacy, in particular for the production of pharmaceutical formulations and medical devices for intracorporeal and extracorporeal Applications. Hyaluronatlyase has a maximum specificity Activity of 650,000 IU / mg and is free of streptococcal toxins. It is not caused by natural inhibitors present in the serum α-I type, acts as an improved hyaluronic acid splitting "spreading enzyme" and has a special high activity on, calcium-containing deposits release their binding to the tissues.
Hyaluronsäure hydrolysierende Enzyme, wie beispielsweise die aus Rinder-Testes gewonnene Hyaluronidase (Hylase Dessau®, RIEMSER Arzneimittel AG Greifswald-Insel Riems, Germany), werden zur Verbesserung der Gewebepenetration von Arzneimitteln und in der Ophthalmologie angewendet.Hyaluronic acid hydrolyzing enzymes, such as derived from bovine testes hyaluronidase (Hylase Dessau ®, RIEMSER Arzneimittel AG Greifswald-Insel Riems, Germany) are used to improve the tissue penetration of drugs and in ophthalmology.
Körpereigene Hyaluronsäure ist vermutlich einer der Faktoren im Organismus, der für die erhöhte Anreicherung von calciumhaltigen schwerlöslichen Verbindungen und Komplexen wie Calciumcarbonate und Calciumphosphate in kalkaufnehmenden (»kalkaffinen«) Körpergeweben sowie in Hohlräumen verantwortlich ist, indem sie das in allen Körperflüssigkeiten vorhandenen Calcium fixiert und so seine Ausfällung fördert. Besonders häufig tritt diese Anreicherung, die viele physiologische Vorgänge beeinträchtigt, bei älteren Individuen von Mensch oder Tier auf.Endogenous Hyaluronic acid is probably one of the factors in the organism, for the increased accumulation of calcium-containing sparingly soluble compounds and complexes such as calcium carbonates and calcium phosphates in calcareous ("lime-affine") Body tissues as well as being responsible in cavities, by having that in all body fluids Fixed calcium and thus promotes its precipitation. Particularly frequent occurs this enrichment, which many physiological Processes impaired, older ones Individuals of humans or animals.
Die calciumhaltigen Ablagerungen enthalten meistens Carbonate und Phosphate und werden vereinfachend als Kalk bezeichnet. Kalkauflagerungen treten krankhaft bei Nekrosen, z. B. bei Tuberkulose-Herden in der Lunge, bei alten Thromben als Venensteine, in degenerierten Geweben mit herabgesetzter Funktion und Ernährung wie z. B. als Spätfolge der Arteriosklerose, in Form von Mikroverkalkungen, in fibrinösen Ergüssen, als Kapsel um Gewebeparasiten und Tumore oder als Steinbildung auf.The Calcium-containing deposits mostly contain carbonates and phosphates and are referred to simplifying as lime. Kalkauflagerungen occur pathologically in necrosis, z. B. in tuberculosis herds in the Lungs, with old thrombi as vein stones, in degenerated tissues with reduced function and nutrition such. B. as Late onset of atherosclerosis, in the form of microcalcifications, in fibrinous effusions, as a capsule around tissue parasites and tumors or as a stone formation.
Vermutet wird eine Beteiligung von erst vor kurzem entdeckten sogenannten Nanobakterien, welche Calcium-haltige Kapseln bilden. Erkrankungen, wie Sklerodermie, Dermatomyosis, Nephrocalcinose sowie okklusive Gefäßkrankheiten, sollen mit der Bildung von Calcium-Ablagerungen in Zusammenhang stehen.Supposed becomes a participation of only recently discovered so-called Nanobacteria, which form calcium-containing capsules. diseases like scleroderma, dermatomyosis, nephrocalcinosis as well as occlusive Vascular diseases are said to be associated with the formation of calcium deposits being related.
Bei Diabetikern tritt als häufige Begleiterscheinung das metabolische Syndrom auf, welches u. a. zu Arteriosklerose mit typisch verstärkten Calcium-Ablagerungen führt. Eine Ursache der Arteriosklerose ist hierbei die Störung des Fettstoffwechsels, die zur erhöhten Ablagerung von fetthaltigen Plaques führt. Auf der Oberfläche der Plaques kommt es in einem späten Stadium zu Auflagerungen von Calcium-haltigen Verbindungen, welche die Plaqueoberfläche fast hermetisch gegen plaquelösende Prozesse versiegeln.at Diabetics come as a frequent side effect of the metabolic Syndrome on which u. a. to arteriosclerosis with typically reinforced Calcium deposits leads. A cause of atherosclerosis Here is the disorder of lipid metabolism, the increased deposition of fatty plaques. On the surface of the plaques it comes in a late Stadium to deposits of calcium-containing compounds, which the plaque surface is almost hermetic against plaque dissolving Seal processes.
Das Chondrokalzinose-Syndrom, auch als Pseudogicht bezeichnet, geht mit exsudativ-arthritischen Erscheinungen einzelner Gelenke einher; es kommt zu Verkalkungen des Gelenkknorpels in Form von Ablagerung des Dihydrates von Calciumpyrophosphat, das in gelöster Form auch in der Gelenkflüssigkeit zusammen mit dem Polysaccharid Hyaluronsäure vorliegt. Die akute Pseudogicht mit arthritischen Attacken ist mit starken Schmerzen und Bewegungseinschränkungen verbunden.The Chondrocalcinosis syndrome, also known as pseudogout, goes associated with exudative-arthritic manifestations of individual joints; It comes to calcifications of articular cartilage in the form of deposition of the dihydrate of calcium pyrophosphate dissolved in Form also in the synovial fluid together with the polysaccharide Hyaluronic acid is present. The acute pseudogout with arthritic Attacks is associated with severe pain and restricted mobility connected.
Die Kalkgicht umfasst als Sammelbegriff weitere, den Bewegungsapparat betreffende, mit Kalkablagerung einhergehende Krankheiten, z. B. Calcinosis circumscripta, eine lokalisierte Ablagerung als kleine Knötchen in subkutanen Geweben und Muskeln, oder Tendofascitis calcarea rheumatica, für die bei Weichteilrheumatismus die in Sehnen- und Faszienansätzen auftretenden, später verkalkenden Rheumaknötchen typisch sind.The Kalkgicht includes as a collective term more, the musculoskeletal system concerning lime-scale associated diseases, e.g. B. Calcinosis circumscripta, a localized deposit as a small nodule in subcutaneous tissues and muscles, or Tendofascitis calcarea rheumatica, for those in soft tissue rheumatism those in tendon and fascia approaches occurring, calcifying Rheumaknötchen typical are.
Als
eine der möglichen Ursachen für die Immobilisierung
der calciumhaltigen Verbindungen wird u. a. neben den zu Grunde
liegenden ursächlichen Erkrankungen ein höherer
Plasmalevel von Glycosaminoglycanen, insbesondere von Hyaluronsäure,
angegeben. Hyaluronsäure soll als polyanionische makromolekulare Verbindung
mit einer hohen Molmasse und ihrer Neigung, eine hydrophile gel-ähnliche
Matrix zu bilden, über ihre freie Valenzen am Calciumion
reagieren (
Bei
Hämodialyse-Patienten wird die Bildung von calciumhaltigen
Ablagerungen ebenfalls mit einem erhöhten Serumlevel von
Hyaluronsäure als Ursache für das in dieser Patientengruppe
häufige Auftreten des Carpal-Tunnel-Syndroms der menschlichen
Hand und Schulterschmerzen diskutiert (
Weitere
wissenschaftliche Untersuchungen weisen neben Hyaluronsäure
und anderen Glucosaminoglycanen auch auf eine Bedeutung der Amyloidfibrillen
bei der Bildung von Ablagerungen bei Hämodialysepatentienten
hin (
Auch
bei der Ausbildung von rheumatoider Arthritis könnten erhöhte
Hyaluronsäurekonzentrationen von Bedeutung sein (
Bekannt
ist auch, dass phosphat-gepufferte künstliche Tränen,
die Hyaluronsäure enthalten, zur Ausbildung von kristallinen
Calcium-Ablagerungen führen können (
Einige Nachteile der aus tierischen Gewebe gewonnenen Hyaluronidase aus Rindertestes (EC 3.2.1.35), die unter anderem mit der Gefahr der Übertragung infektiösen Materials zusammenhängen, können mit mikrobiellen Hyaluronatlyasen umgangen werden. Letztgenannte gehören nicht zur Enzymklasse der Hydrolasen sondern zu den Lyasen.Some Disadvantages of hyaluronidase derived from animal tissue Bovine test (EC 3.2.1.35), inter alia, with the risk of transmission can be related to infectious material bypassed microbial hyaluronate lyases. The latter belong not to the enzyme class of the hydrolases but to the lyases.
Mikrobielle
Hyaluronatlyase (EC 4.2.2.1) wird in Form der intrakorporalen Applikation
bei Mensch und Tier zur Reduzierung und Beseitigung der Folgen des
Herzinfarktes (
Das bei allen aufgeführten Anwendungsbeispielen eingesetzte Enzym wird aus submersen Kulturen von Streptococcus agalactiae, Streptokokken der serologischen Gruppe B gewonnen, die in Fermentoren kultiviert werden.The used in all listed application examples Enzyme is derived from submerged cultures of Streptococcus agalactiae, Streptococci of the serological group B obtained in fermentors be cultivated.
Die
Eignung der so hergestellten mikrobiellen Hyaluronatlyase als Substitut
für eine aus Tierhoden gewonnenen Hyaluronidase wurde durch
vergleichende Untersuchungen bestätigt (
Da
der Wildstamm der Art Streptococcus agalactiae auch nach Optimierung
der Fermentation mit 160 bis 800 IU Hyaluronatlyase/ml nur geringe
Hyaluronatlyase-Aktivitäten bildet und geringe Restmengen
von Streptokokken-Toxinen, wie den CAMP- Faktor, ein porenbildendes
Toxin, das hämolytisch wirkt und nicht mit Sicherheit ausgeschlossen
werden kann, ist die pharmazeutische bzw. technische Anwendung dieses
Enzyms nur eingeschränkt möglich. Um die Verfügbarkeit
der mikrobiellen Hyaluronatlyase zu verbessern und um über entsprechende
Enzymmengen in hoher Reinheit zu verfügen, wurde das Hyaluronatlyase-Gen
in einen geeigneten Produzenten transformiert und expremiert. Eine
rekombinante Hyaluronatlyase (rHyalB) ist in E. coli exprimiert
worden. rHyal B ist, wie die Streptokokken-Hyaluronatlyase (EC 4.2.2.1),
ein Enzym, welches Hyaluronsäure durch ß-Eliminierung
unter Bildung ungesättigter Spaltprodukte spaltet. Der
rekombinante Stamm wurde entsprechend der von
Das
Enzym kann unter Anwendung der in
Bei
vergleichenden Untersuchungen zur Inhibition nativer Hyaluronatlyase
und der rekombinanten Hyaluronatlyase wurde gefunden, dass rHyal
B einen Unterschied zu der nativen Hyaluronatlyase aus dem ursprünglichen
Produzenten Streptococcus agalactiae aufweist. So ist die inhibitorische
Wirkung ausgewählter Flavonoide pflanzlicher Herkunft auf
rHyal B deutlich geringer als bei dem nativen Enzym aus Streptococcus agalactiae
(
Die Dekorporierung der calciumhaltigen Ablagerungen in Mensch und Tier stellt eine Maßnahme dar, mit der akute Beschwerden gelindert sowie die Qualität von Transplantations- und Implantationsmaterial verbessert werden können. Ein direktes Auflösen der weitgehend aus anorganischen Material bestehenden, an den pathologisch veränderten Gewebegrenzen vorhandenen Calcium-Depots durch biochemische Maßnahmen, wie beispielsweise die Einwirkung von hydrolysierenden Enzymen, ist jedoch auf Grund der generellen Schwerlöslichkeit kaum möglich. Auch größere Verschiebungen des pH-Wertes, um die Löslichkeit der Calcium-Ablagerungen zu erhöhen, sind aus physiologischen Gründen nicht möglich. Allerdings führten chemische Maßnahmen, wie der Einwirkung von Chelatkomplexbildnern, zu Teilerfolgen; es treten jedoch auch nicht kontrollierbare Nebenwirkungen darunter Niereninsuffizienzen auf. Bei koronaren, peripheren und celebraren Durchblutungsstörungen konnten deutliche Verbesserungen beobachtet werden. Angina pectoris-Beschwerden nahmen an Häufigkeit und Intensität ab. Bei Claudicatio intermittens wurden die Beinschmerzen gemildert. Die Gehstrecke erhöhte sich und die Gangräne bildeten sich ganz bzw. teilweise zurück. Bei diabetische Angiopathien und Retinophatien konnte ebenfalls eine gesundheitliche Besserung erreicht werden.The Decorating the calcium-containing deposits in humans and animals represents a measure that relieves acute discomfort as well as the quality of transplantation and implantation material can be improved. A direct dissolution largely consisting of inorganic material, to the pathological altered tissue boundaries existing calcium depots by biochemical measures, such as the action of hydrolyzing enzymes, but is due to the general low solubility hardly possible. Also larger shifts of the pH to the solubility of the calcium deposits for physiological reasons are not possible. However, chemical measures such as the action of chelating agents, to partial successes; it However, there are also uncontrollable side effects Renal insufficiencies on. For coronary, peripheral and celebratory circulatory disorders Significant improvements could be observed. Angina pectoris complaints decreased in frequency and intensity. With claudication intermittently, the leg pain was alleviated. The walking distance increased and the gangrene formed completely or partially back. In diabetic angiopathies and Retinopathies also achieved a health improvement become.
Allgemein ist von großem Nachteil, dass es bei medizinischen Anwendungen von körperfremden Proteinen, einschließlich Enzymen, zu allergischen Reaktionen kommen kann. Deshalb wäre es erstrebenswert, bei den Anwendungen der Hyaluronatlyase die allergische Dosis möglichst gering zu halten, indem so wenig Fremdprotein wie möglich bei gleichzeitig hoher therapeutischer Wirkung auf Mensch oder Tier übertragen wird. In der Praxis ist allerdings die enzymatische Aktivität der Hyaluronatlyase beschränkt (spezifischen Aktivität hochgereinigter nativer Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae nach ihrer Endreinigung ca. 400.000 IU/mg), so dass in nachteiliger Weise entsprechend höhere enzymatische Wirkstoffmengen zum Einsatz gebracht werden müssen.Generally is of great disadvantage that it is used in medical applications foreign proteins, including enzymes, allergic reactions can occur. That's why it would be desirable, in the applications of hyaluronate lyase the allergic Keep dose as low as possible by using so little foreign protein as possible with simultaneous high therapeutic effect is transmitted to humans or animals. In practice is however, the enzymatic activity of hyaluronate lyase limited (specific activity of highly purified native hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae after her Final cleaning about 400,000 IU / mg), so that in a disadvantageous way accordingly higher levels of enzymatic drug used Need to become.
Darüber hinaus sind im Serum auch Enzyminhibitoren vorhanden, welche dazu führen, dass die wirksame Dosis weiter erhöht werden muss, um der Inhibition entgegenzuwirken. Der Einsatz größerer Mengen an Wirkstoffen, um diese enzymatische Aktivität zu erhöhen bringt aber wiederum die bereits vorgenannten Nachteile.About that In addition, enzyme inhibitors are present in the serum, which in addition cause the effective dose to continue to increase must be to counteract the inhibition. The use of larger Amounts of active ingredients to this enzymatic activity but in turn brings the already mentioned disadvantages.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, auf möglichst einfache Weise eine erhöhte und langzeitstabile enzymatische Wirkung der Hyaluronatlyase zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen und Medizinprodukten ohne störende Nebenwirkungen zu erreichen.Of the The invention is therefore based on the object, as far as possible simple way an increased and long-term stable enzymatic Effect of hyaluronate lyase for the production of pharmaceutical Formulations and medical devices without disturbing side effects to reach.
Mit verbesserten enzymatischen Eigenschaften soll insbesondere auch das Problem der Entfernung der gegen Auflöseprozesse sehr resistenten inter- und intrakorporalen Calciumdepots gelöst werden, indem die Auflagerungen und Einlagerungen in den Geweben auf möglichst wirksame, aber schonende Weise entfernt werden bzw. andere Maßnahmen zur Dekorporierung unterstützt werden.With improved enzymatic properties should in particular also the problem of removal of dissolution processes very much resistant inter- and intracorporeal calcium deposits be, by the deposits and inclusions in the tissues be removed in the most effective but gentle way or other measures for Dekorporierung supported become.
Die generell von Streptokokken gebildeten Streptokokken-Toxine, wie die Hämolysine Streptolysin O und S, der CAMP-Faktor, die Neuraminidase oder auch enzymatisch inaktive aber immunogen wirksame Verunreinigung, welche die Bildung von kreuzreaktiven Antikörpern induzieren, die ihrerseits mit dem Herzmuskelgewebe reagieren können, sollen mit vollständiger Sicherheit in einer verbesserten Hyaluronatlyase auszuschließen sein.The streptococcal toxins generally formed by streptococci, such as the hemolysins streptolysin O and S, the CAMP factor, the neuraminidase or enzymatically inactive but immunogenic effective Ver Purification, which induces the formation of cross-reactive antibodies, which in turn can react with the myocardial tissue, should be ruled out with complete certainty in an improved hyaluronate lyase.
Entgegen
der bereits beschriebenen anerkannten Meinung von
Erfindungsgemäß werden
die Histidyl-Reste nach der Enzymherstellung nicht wieder von der
Hyaluronatlyase abgespalten (vgl. (
Es
wurde außerdem gefunden, dass das rekombinante Enzym mit
dem erfindungsgemäß weiter gebundenen His-Tag
nicht durch die im Serum vorhandenen Inhibitoren des Inter-Alpha
Typs (vgl.
Die auf diese Weise überraschend mit dem weiterhin an das Molekül gebundenen His-Tag bewirkten Möglichkeiten zur Verbesserung der Enzymeigenschaften der Hyaluronatlyase waren der Fachwelt nicht bekannt.The in this way, surprisingly with the continue to the molecule bound His-tag provided opportunities for improvement The enzyme properties of hyaluronate lyase were not known to the experts known.
Es wird deshalb vorgeschlagen, die mit diesen verbesserten Enzymeigenschaften ausgestattete His-Tag enthaltene Hyaluronatlyase in pharmazeutischen Formulierungen, anstelle der bisher vorgeschlagenen nativen Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae einzusetzen. Obwohl bevorzugt die rekombinante Hyaluronatlyase mit sechs zusammenhängenden Histidylgruppen, auch als His-Tag bezeichnet, erfindungsgemäß als Bestandteil von pharmazeutischen Formulierungen und Medizinprodukten vorgeschlagen wird, erstreckt sich die Erfindung prinzipiell auf alle Hyaluronatlyasen, die einen His-Tag-Rest enthalten, der aus mindestens einem oder mehreren bis zu zwölf Histidylgruppen besteht. Es kann vermutet werden, dass die mit der Anwesenheit von einem C-terminalen His-Tag, bestehend aus genau sechs miteinander verbundenen Histidylgruppen, zusammenhängende Eigenschaftsverbesserung nicht zwangsläufig zu optimalen Eigenschaften des Enzyms führt.It Therefore, it is proposed that with these improved enzyme properties equipped His-tag containing hyaluronate lyase in pharmaceutical Formulations, instead of the previously proposed native hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae. Although preferred is recombinant hyaluronate lyase with six related histidyl groups, also known as His tag referred to, according to the invention as part of pharmaceutical formulations and medical devices In principle, the invention extends to all hyaluronate lyases, containing a His-tag residue consisting of at least one or several up to twelve histidyl groups. It can be suspected that with the presence of a C-terminal His tag consisting of exactly six interconnected histidyl groups, coherent property improvement is not necessarily leads to optimal properties of the enzyme.
Die Poly-Histidyl-Gruppe kann somit je nach bestimmungsmäßiger Verwendung aus zwei bis sechs und auch mehr Histidyl-Resten bestehen.The Poly-histidyl group may thus vary depending on the intended Use of two to six and also more histidyl residues exist.
Sehr vorteilhaft für die Anwendung der rekombinanten Hyaluronatlyase ist außerdem, dass die biotechnische Herstellung durch Fermentation zu etwa 50 bis 500fach höheren Enzymausbeuten führt und auch bei Anwendung von wenigen Reinigungsschritten ein hoch gereinigtes Enzym erhalten wird, welches darüber hinaus frei von anderen Proteinen und vor allem Streptokokken-Toxinen ist.Very advantageous for the application of recombinant hyaluronate lyase is also that the biotechnical production by Fermentation to about 50 to 500 times higher enzyme yields leads and also when using a few cleaning steps a highly purified enzyme is obtained, which in addition free from other proteins and especially streptococcal toxins.
Darüber hinaus wurde überraschend gefunden, dass die den His-Tag enthaltende Hyaluronatlyase calciumhaltige Ablagerungen im Gewebe durch Spaltung der adhärenten Bindungen mit dem darunter liegendem Gewebe wesentlich schneller freisetzt als Streptokokken-Hyaluronatlyase. Es erfolgt hierbei keine Auflösung der Calciumdepots, sondern sie werden zu frei beweglichen Calcium-haltigen Feststoffen, die einem möglichen Abbau über andere enzymatische Prozesse wieder zugänglich sind.About that In addition, it was surprisingly found that the His tag containing Hyaluronatlyase calcium-containing deposits in the tissue by splitting the adherent bonds with the underneath lying tissue releases much faster than streptococcal hyaluronate lyase. There is no dissolution of the calcium deposits, but they become freely mobile calcium-containing solids that a possible degradation via other enzymatic Processes are accessible again.
Diese
Art der Entfernung der Calciumdepots mit Hyaluronatlyasen wurde
bisher ebenfalls nicht beschrieben und ermöglicht so gänzlich
neue Behandlungsmethoden für die Entfernung von Calciumdepots. Möglicher
Weise ist dieser Effekt auch auf die Anwesenheit des His-Tag im
Enzym zurückzuführen. Der His-Tag ist sehr wahrscheinlich
der Grund für die besondere Affinität zu den Calciumdepots,
die, wie die Ergebnisse erkennen lassen, über Hyaluronsäure
und andere Glycosaminoglycane als bindende Matrix an die Gewebe
gebunden sind. Ähnlich wie die Bindung der rekombinanten
Hyaluronatlyase an zweiwertige Metall-Chelate wird sie an die calciumhaltigen
Ablagerungen gebunden und das Enzym wird dabei in unmittelbarer
Nähe der bindenden Matrix konzentriert. Parallel zur Freisetzung
der Calcium-enthaltenden Ablagerungen wird Uronsäure freigesetzt,
die ein Abbauprodukt der hochmolekularen Hyaluronsäure
darstellt (siehe auch
Es wird deshalb die Verwendung von die erfindungsgemäße Hyaluronatlyase enthaltenden Formulierungen alleine oder zusammen bzw. in einem direkten zeitlichen Zusammenhang mit Formulierungen, welche Chelatkomplex bildenden Agentien wie Na2-EDTA enthalten, vorgeschlagen, um Calcium-Ablagerungen aus Geweben, von Gewebegrenzen und aus Körperhöhlen mit hoher Wirkung zu entfernen und möglichst schnell wieder aufzulösen. Das Enzym bewirkt dabei die unmittelbare Freisetzung der Calcium-haltigen Feststoffe, während ein Komplexbildner zu ihrer Auflösung führen soll. Die Hyaluronatlyase wird als Spüllösung oder als Injektionsmittel eingesetzt.It is therefore proposed to use the hyaluronate lyase-containing formulations of the present invention, alone or in conjunction with or in direct temporal relation with formulations containing chelating agent-forming agents, such as Na 2 -EDTA, to remove calcium deposits from tissues, tissue borders and body cavities high effect to remove and dissolve as quickly as possible. The enzyme causes the immediate release of the calcium-containing solids, while a complexing agent should lead to their dissolution. Hyaluronate lyase is used as a rinsing solution or as an injection agent.
Die vorgeschlagene Hyaluronatlyase mit erhöhter enzymatischer Wirksamkeit kann vorteilhaft aus Kulturen eines rekombinanten Escherichia coli-Stammes, bevorzugt aus Kulturen des ampicillinresistenten Stammes Escherichia coli TG1 (pHYB307), als rekombinantes Enzym, aufwandgering und kostengünstig hergestellt werden. Der Stamm wird unter Verwendung des Plasmids pHYB307 konstruiert und bildet als rekombinanter Mikrorganismus ein im Zytosol gelöstes transgenes Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Hyaluronatlyase. Er wurde unter der Bezeichnung DSM 15473 am 03.03.2003 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (Braunschweig) hinterlegt.The proposed hyaluronate lyase with increased enzymatic Efficacy may be beneficial from cultures of a recombinant Escherichia coli strain, preferably from cultures of the ampicillin-resistant strain Escherichia coli TG1 (pHYB307), as a recombinant enzyme and manufactured inexpensively. The trunk is under Using the plasmid pHYB307 constructed and forms as a recombinant Microorganism is a cytosol-solubilized transgenic protein with the enzymatic activity of a hyaluronate lyase. He was under the name DSM 15473 on 03.03.2003 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) (Braunschweig) deposited.
In flüssigen pharmazeutischen Formulierungen kann das rekombinante Enzym in Aktivitäten zwischen 10 IU/ml und 107 IU/ml als wässrige isotonische Lösung vorhanden sein. Zusätzlich können diese noch an sich bekannte Stabilisatoren und Hilfsstoffe enthalten. Das rekombinante Enzym kann außerdem in den Formulierungen in fester, bevorzugt durch Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung gewonnener Form, vorliegen. Die Konzentration kann hierbei zwischen 101 und 107 IU betragen. Durch Auflösen in wässrigen isotonischen und in der Regel gepufferten Lösungen wird aus dem Feststoff entweder eine intrakorporal, bevorzugt parenteral als Injektionspräparat, oder extrakorporal applizierbare flüssige pharmazeutische Formulierung hergestellt.In liquid pharmaceutical formulations, the recombinant enzyme may be present in activities between 10 IU / ml and 10 7 IU / ml as an aqueous isotonic solution. In addition, these may still contain per se known stabilizers and auxiliaries. The recombinant enzyme may also be present in the formulations in solid form, preferably by freeze-drying or spray-drying. The concentration may be between 10 1 and 10 7 IU. By dissolution in aqueous isotonic and generally buffered solutions, the solid is prepared either from an intracorporeal, preferably parenteral, injection preparation or extracorporeally administrable liquid pharmaceutical formulation.
Es ist auch möglich, die Enzymlösung mit Hilfe eines Treibgases zu fein verteilten Flüssigkeitstropfen als Aerosol zu vernebeln.It it is also possible to use the enzyme solution with the help of a Propellant gas to finely distributed liquid droplets as an aerosol to fog up.
In den Unteransprüchen sind weitere Verwendungen der erfindungsgemäßen Hyaluronatlyase aufgeführt.In The dependent claims are further uses of the invention Hyaluronate lyase listed.
Über den His-Tag kann das rekombinante Enzym in den Formulierungen und Medizinprodukten auch in an sich bekannter Weise an Metallchelate, wie beispielsweise Nickelchelate, gebunden vorliegen.about the His tag can be the recombinant enzyme in the formulations and Medical devices also in a conventional manner to metal chelates, such as nickel chelates, bound.
Die Hyaluronatlyase kann in den pharmazeutischen Formulierungen, Medizinprodukten als alleiniger Wirkstoff vorhanden sein, mit dem beispielsweise Bindegewebe wie Haut-, Narben- oder Knorpelgewebe strukturell teilweise abgebaut werden, um eine Erweichung oder partiellen Abbau der Bindegewebestrukturen zu erreichen.The Hyaluronate lyase can be used in pharmaceutical formulations, medical devices be present as the sole active ingredient, with the example Connective tissue such as skin, scar or cartilage tissue structurally partial degraded to a softening or partial degradation of connective tissue structures too to reach.
Die rHyal B enthaltenden pharmazeutischen Formulierungen oder Medizinprodukte können darüber hinaus auch ein oder mehrere Wirkstoffe enthalten, deren Penetration in Gewebe durch die Wirkung der Hyaluronatlyase erleichtert wird.The rHyal B containing pharmaceutical formulations or medical devices In addition, one or more active substances can also be used contain their penetration into tissue by the action of hyaluronate lyase is relieved.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung werden Hyaluronatlyase enthaltende Formulierungen, bevorzugt als sterile Flüssigformulierungen, zur Reinigung von mit Hyaluronsäure oder hyaluronsäurehaltigen mukoiden Schleimen verunreinigten Oberflächen, beispielsweise von chirurgischen Instrumenten oder Implantaten, eingesetzt. Besonders von hochmolekularer Hyaluronsäure mit Molmassen größer als 500 kD ist bekannt, dass sie an Oberflächen schwer entfernbare Filme bildet.In Another embodiment of the invention is hyaluronate lyase containing formulations, preferably as sterile liquid formulations, for purifying hyaluronic acid or hyaluronic acid-containing mucoid Slime contaminated surfaces, such as from surgical instruments or implants. Especially of high molecular weight hyaluronic acid with molecular weights greater 500kD is known to be hard on surfaces makes removable films.
Die Verwendung der His-Tag-haltigen Hyaluronatlyase zur Freisetzung von in Geweben und an Gewebegrenzen immobilisierten Calciumdepots bzw. von Ablagerungen Calciumhaltiger Verbindungen wurde bereits genannt. Solche Calcium-Ablagerungen sind Symptome bzw. Ursache der ihnen zugrunde liegenden Erkrankungen, wie das Chondrokalzinose-Syndrom, Calcinosis circumscripta, Tendofascitis calcarea rheumatica, Akrocalcinosis oder Myositis ossificans. Allgemeine Gewebestörungen, wie Dystrophie, Degenerationen und Nekrosen, Hyperkalzämie in verkäsenden Tuberkuloseherden, fibrinöser Ergüssen, Steinbildung, Verkalkungen bei Atherosklerose, Bildung von Kapseln durch Gewebeparasiten oder Kalkablagerung in Tubuli, Sammelrohren sowie Interstitium sind potenzielle Indikationsgebiete. Chalicosis, Kalkgicht, Kalkinfarkt, Kalkinfiltrationen, Kalkmetastasen wie Kalkablagerung an atypischen Orten, beispielsweise in der Unterhaut, Lunge, Niere, bei Hyperkalzämie infolge erhöhter Calciummobilisierung, z. B. bei Osteomalazie, bei Hyperparathyreoidismus, chronischer Niereninsuffizienz mit Phosphatretention, der Hyperphosphatämie, bei Vitamin-D-Intoxikation, dem Milch-Alkali-Syndrom sowie bei Kalkpanzerhaut und Panzerherz sind ebenfalls mögliche Applikationsgebiete des erfindungsgemäßen Enzyms.The use of the His-tag containing hyaluronate lyase for the release of calcium deposits or deposits of calcium-containing compounds immobilized in tissues and at tissue borders has already been mentioned. Such calcium deposits are symptoms or cause of their underlying diseases, such as chondrocalcinosis syndrome, calcinosis circumscripta, Tendofascitis calcarea rheumati ca, acrocalcinosis or myositis ossificans. General tissue disorders, such as dystrophy, degeneration and necrosis, hypercalcaemia in caseative tuberculosis herds, fibrinous effusions, calcifications, atherosclerosis calcifications, formation of capsules by tissue parasites or calcification in tubules, collecting tubes and interstitium are potential indications. Chalicosis, calcification, calcification, lime infiltrations, lime metastases such as calcification at atypical sites, for example in the subcutaneous, lung, kidney, hypercalcemia due to increased calcium mobilization, z. B. in osteomalacia, in hyperparathyroidism, chronic renal failure with phosphate retention, hyperphosphatemia, in vitamin D intoxication, the milk-alkali syndrome, as well as in Kalkkanzerhaut and Panzerherz are also possible applications of the enzyme of the invention.
Durch ihre die vorteilhafte Herstellung kann die rekombinante Hyaluronatlyase auch für solche Anwendungen eingesetzt werden, bei denen die aufwendig herzustellende Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae zu kostenaufwendig ist. Es werden bei der Fermentation innerhalb von 40 Stunden pro Liter Kulturlösung zwischen 100 Millionen IU bis 300 Millionen IU erhalten bzw. eine bis zu 500fach größere Aktivität als bei einer optimierten Fermentation des Wildstammes Streptococcus agalactiae, erreicht.By Their advantageous manufacture can be the recombinant hyaluronate lyase also be used for such applications in which the elaborately produced hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae too expensive. It will be within the fermentation of 40 hours per liter of culture solution between 100 million IU receive up to 300 million IU or up to 500 times larger Activity as in an optimized fermentation of the wild strain Streptococcus agalactiae, reached.
Vorteilhaft ist weiterhin, dass auch die thermodynamische Stabilität der rekombinanten Hyaluronatlyase entscheidend größer ist als die der nativen Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae. So beträgt der Aktivitätsverlust bei sprühgetrockneten Trockenpräparaten der rekombinanten Hyaluronatlyase mit zugesetzten Stabilisatoren nach 6 Monaten unter Aufbewahrung bei Temperaturen zwischen 4°C und 10°C nur 10% bis 15% während die Aktivität der Hyaluronatlyase aus Streptocooccus agalactiae bei gleichen Bedingungen innerhalb von 4 Monaten bereits um 70% vermindert ist. Die erfindungsgemäße Hyaluronatlyase bzw. solche enthaltende Formulierungen und Medizinprodukte können daher über eine längere Zeit stabil aufbewahrt werden.Advantageous is that even the thermodynamic stability of recombinant hyaluronate lyase significantly larger is that of native hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae. So is the loss of activity in spray-dried Dry preparations of recombinant hyaluronate with added stabilizers after 6 months under storage Temperatures between 4 ° C and 10 ° C only 10% to 15% during the activity of hyaluronate lyase out Streptocooccus agalactiae in equal conditions within 4 months already reduced by 70%. The inventive Hyaluronate lyase or formulations containing it and medical devices can therefore be stable for a long time be kept.
Alle vorgenannten und sich als zweckmäßig erweisenden Eigenschaften stehen vermutlich im Zusammenhang mit der Anwesenheit des His-Tag-Restes im Protein. Generell könnte das Faltungsverhalten des Proteins verändert sein oder die im Protein vorhandene höhere Hydrophobizität, die durch den stark hydrophob wirkenden His-Tag-Rest hervorgerufen wird, könnte für diese Eigenschaften verantwortlich sein. Das Verhalten deutet entweder auf eine schwächere Bindung der Inhibitoren an das rekombinanten Enzym hin oder es erfolgt eine verstärkte Substratbindung des Enzyms an Hyaluronsäure. Obwohl der His-Tag mit einer Molmasse von 0,825 kD nur zu geringen Unterschieden im Molekulargewicht im Vergleich zu der Molmasse der nativen Hyaluronatlyase mit etwa 116 kD führt, sind durch Anwesenheit des His-Tag jedoch deutliche Unterschiede der Enzymwirkung zu erkennen. Möglicher Weise führt die Anwesenheit der basischen Histidylreste bei physiologischen pH-Werten zu einer positiven Ladung auf dem Enzymmolekül. Die positive Ladung könnte die Bindungsaffinität zu der vielfach negativ geladenen polyanionischen Hyaluronsäure verstärken.All aforementioned and prove to be expedient Properties are probably related to the presence of the His tag residue in the protein. In general, the folding behavior could of the protein or that existing in the protein higher hydrophobicity caused by the highly hydrophobic His tag rest may be evoked for this Properties be responsible. The behavior either indicates to a weaker binding of the inhibitors to the recombinant Enzyme down or there is an increased substrate binding of the enzyme to hyaluronic acid. Although the His-day with a Molar mass of 0.825 kD only to small differences in molecular weight compared with the molar mass of native hyaluronate lyase with about 116 kD are, however, by the presence of the His tag to recognize clear differences in the enzyme effect. potential Way leads the presence of the basic histidyl residues at physiological pHs to a positive charge on the Enzyme molecule. The positive charge might be the binding affinity to the often negatively charged polyanionic hyaluronic acid strengthen.
Die Erfindung soll anhand nachfolgender. Ausführungsbeispiele näher erläutert werden, ohne jedoch den Schutzumfang auf diese zu beschränken:The Invention is based on the following. embodiments be explained in more detail, but without the scope of protection to limit to this:
Ausführungsbeispiel 1:Embodiment 1
Reinigung der HyaluronatlyasePurification of hyaluronate lyase
Das Plasmid pHyal 301 wird durch Elektroporation in den Mikroorganismus E. coli eingebracht. Danach wird der Stamm in einem 40 L-Fermenter fermentiert. Anschließend wird die Biomasse durch Zentrifugation gesammelt und die gesammelte Biomasse aufgeschlossen.The Plasmid pHyal 301 is converted into the microorganism by electroporation E. coli introduced. Thereafter, the strain is in a 40 L fermenter fermented. Subsequently, the biomass is removed by centrifugation collected and the collected biomass unlocked.
Zum Aufschluss wird die Biomasse mit der 3-fachen Menge 0,05 M Acetatpuffer pH 7,4 versetzt. Die Gesamtmenge vor dem Aufschluss beträgt 2000 ml. Diese Suspension wird im Gaulin-Homogenisator zweimal bei 500 bar aufgeschlossen. Danach werden die unlöslichen Bestandteile des Zellaufschlusses durch Fällung entfernt. In der klaren Lösung werden 220 g/L Ammoniumsulfat gelöst. Der entstehende Niederschlag wird abzentrifugiert und der klare Überstand mit 200 g Phenylsepharose versetzt, die zuvor mit 40 %iger Ammoniumsulfatlösung equilibriert worden ist. Anschließend wird die Phenylsepharose auf einer Fritte abgetrennt, mit 1000 ml Tris-gepufferter 40 %iger Ammoniumsulfatlösung gewaschen und danach die erste Elution mit 500 ml Tris-gepufferter 10 %iger Ammoniumsulfatlösung durchgeführt. Für die zweite Elution wird mit 200 ml 0,02 M Tris-HCl-Puffer pH 7,5 eluiert. Die dritte Elution erfolgt mit 200 ml 10% ethanolischem Tris-HCl-Puffer pH 7,5. Die Aktivität in allen Fraktionen wird bestimmt und die Fraktion mit der höchsten Aktivität durch Zugabe von Ammoniumsulfat gefällt (500 g/l). Nach 1 h wird zentrifugiert, der Niederschlag gesammelt und in 0,02 M Phosphatpuffer pH 7,2 gelöst und gegen den gleichen Puffer so lange dialysiert, bis die Leitfähigkeit identisch ist. Danach wird die Lösung auf eine Ni-Chelat-Sepharose-Säule aufgetragen, mit 0,05 M Imidazolpuffer, pH 7,5 gewaschen und anschließend die Hyaluronatlyase mit einem steigenden Imidazolgradienten bei 0,25 M Imidazol eluiert. Zur Endreinigung wird eine Affinitätschromatografie an Aminophenyloxaminsäure-Sepharose durchgeführt. Die gereinigte rHyal B hatte eine spezifische Aktivität von 650.000 IU/mg.For digestion, the biomass is mixed with 3 times the amount of 0.05 M acetate buffer pH 7.4. The total amount before digestion is 2000 ml. This suspension is digested twice in the Gaulin homogenizer at 500 bar. Thereafter, the insoluble components of cell digestion are removed by precipitation. In the clear solution, 220 g / L of ammonium sulfate are dissolved. The resulting precipitate is centrifuged off and the clear supernatant with 200 g of phenyl Sepharose, which has been previously equilibrated with 40% ammonium sulfate solution. Subsequently, the phenylsepharose is separated on a frit, washed with 1000 ml of Tris-buffered 40% ammonium sulfate solution and then the first elution with 500 ml Tris-buffered 10% ammonium sulfate solution. For the second elution, 200 ml of 0.02 M Tris-HCl buffer pH 7.5 are eluted. The third elution is carried out with 200 ml of 10% ethanolic Tris-HCl buffer pH 7.5. The activity in all fractions is determined and the fraction with the highest activity is precipitated by adding ammonium sulfate (500 g / l). After 1 h, it is centrifuged, the precipitate collected and dissolved in 0.02 M phosphate buffer pH 7.2 and dialyzed against the same buffer until the conductivity is identical. Thereafter, the solution is applied to a Ni chelate-Sepharose column, washed with 0.05 M imidazole buffer, pH 7.5, and then the hyaluronate lyase eluted with an increasing imidazole gradient at 0.25 M imidazole. For final purification, affinity chromatography on aminophenyloxamic acid-Sepharose is performed. The purified rHyal B had a specific activity of 650,000 IU / mg.
Ausführungsbeispiel 2:Embodiment 2:
Bestimmung der spezifischen Aktivität der HyaluronatlyaseDetermination of specific activity the hyaluronate lyase
Die Bestimmung der spezifischen Aktivität von Hyaluronatlyase sowie von rHyal B erfolgt, indem in einer Elisa-Platte 50 μl eines 0,1 M Acetatpuffers pH 6,0 vorgelegt werden. Von der zu bestimmenden Hyaluronatlyaselösung werden direkt oder nach Vorverdünnung 50 μl entnommen und eine geometrische Verdünnungsreihe angelegt. Dazu werden 50 μl einer Hyaluronsäurelösung gegeben, die 0,3 mg Hyaluronsäure/ml in 0,1 M Acetatpuffer pH 6.0 enthält und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 200 μl Cetyltrimethylammoniumbromidlösung (2,5 g CTA/100 ml 2 %ige NaOH) hinzugefügt und nach 10 Minuten bei 600 nm vermessen. Die reziproke Verdünnung bei der 50% der Hyaluronsäure abgebaut werden, multipliziert mit dem Faktor 5 ergibt die enzymatische Aktivität der Hyaluronatlyasen in internationalen Einheiten (IU).The Determination of the specific activity of hyaluronate lyase and rHyal B by adding 50 μl in an Elisa plate a 0.1 M acetate buffer pH 6.0 are presented. From the to be determined Hyaluronate lyase solution will be used directly or after pre-dilution 50 μl removed and a geometric dilution series created. For this purpose, 50 .mu.l of a Hyaluronsäurelösung given 0.3 mg hyaluronic acid / ml in 0.1 M acetate buffer pH 6.0 and for 30 minutes at 37 ° C incubated. Subsequently, 200 μl of cetyltrimethylammonium bromide solution (2.5 g CTA / 100 ml 2% NaOH) and after 10 Measure minutes at 600 nm. The reciprocal dilution in which 50% of hyaluronic acid are broken down, multiplied with the factor 5, the enzymatic activity of the Hyaluronate lyases in International Units (IU).
Ausführungsbeispiel 3:Embodiment 3
Bestimmung der inhibierenden Wirkung des im Serum enthaltenen α-I-InhibitorsDetermination of the inhibitory effect of contained in the serum α-I inhibitor
Die inhibierende Wirkung des im Serum enthaltenen α-I-Inhibitors gegenüber den Hyaluronatlyasen wird bestimmt, indem auf einer ELISA-Platte 50 μl der entsprechenden Hyaluronatlyase-Lösung vorgelegt werden, die 20 IU Hyaluronatlyase/ml in 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 enthält. Dazu werden 10 μl einer unverdünnten oder vorverdünnte Serumprobe gegeben und für 10 Minuten inkubiert. Anschließend werden 50 μl einer Hyaluronsäurelösung hinzugefügt, die 0,3 mg Hyaluronsäure/ml in 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 enthält und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 200 μl Cetyltrimethylammoniumbromidlösung (CTA), bestehend aus 2,5 g CTA/100 ml in 2 %ige NaOH gelöst, hinzugefügt und nach 10 Minuten bei 600 nm die Trübung (A) vermessen. Darüber hinaus werden auch Vergleichsproben vermessen, die anstelle der Hyaluronatlyaselösung 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 enthielten. Die Inhibition wird nach dem Ausdruck berechnet. Das Serum weist hierbei keine inhibitorische Aktivität gegenüber rHyal B auf.The inhibitory effect of the α-I inhibitor contained in the serum against the hyaluronate lyases is determined by initially charging 50 μl of the corresponding hyaluronate lyase solution containing 20 IU hyaluronate lyase / ml in 0.1 M acetate buffer pH 6.0 on an ELISA plate contains. Add 10 μl of undiluted or prediluted serum sample and incubate for 10 minutes. Subsequently, 50 μl of a hyaluronic acid solution containing 0.3 mg hyaluronic acid / ml in 0.1 M acetate buffer pH 6.0 are added and incubated for 30 minutes at 37 ° C. Subsequently, 200 .mu.l Cetyltrimethylammoniumbromidlösung (CTA), consisting of 2.5 g CTA / 100 ml dissolved in 2% NaOH, added and measured after 10 minutes at 600 nm, the turbidity (A). In addition, comparative samples were also measured which contained 0.1 M acetate buffer pH 6.0 instead of the hyaluronate lyase solution. The inhibition is after the expression calculated. The serum in this case has no inhibitory activity against rHyal B.
Ausführungsbeispiel 4:Embodiment 4
Herstellung einer sterilen LösungPreparation of a sterile solution
Eine hochreine konzentrierte Lösung der Hyaluronatlyase rHyal B wird mit soviel Kochsalzlösung verdünnt, dass die entstandene Lösung 0,9% Kochsalz und 50.000 IU/ml rHyl B enthält.A high-purity concentrated solution of hyaluronate lyase rHyal B is diluted with enough saline that the resulting solution 0.9% saline and 50,000 IU / ml rHyl B contains.
Die Lösung wird durch einen Sterilfilter mit einer Porenweite von 0,2 μm sterilfiltriert. Von dieser Lösung wird unter sterilen Bedingungen je 1 ml in Ampullen gefüllt. Die Ampullen werden unter Sterilbedingungen gefriergetrocknet und unter sterilen Bedingungen geschlossen. Vor der Injektion werden 1 ml steriles destilliertes Wasser zugegeben.The Solution is through a sterile filter with a pore size 0.2 μm sterile filtered. From this solution under sterile conditions, each 1 ml is filled into ampoules. The ampoules are freeze-dried under sterile conditions and closed under sterile conditions. Before the injection will be 1 ml of sterile distilled water was added.
Ausführungsbeispiel 5:Embodiment 5:
Herstellung einer Mg-Ionen enthaltenen sterilen InjektionslösungPreparation of a Mg ion contained sterile solution for injection
Hochreine konzentrierte Lösung von Hyaluronatlyase rHyal B, die 650.000 IU/ml enthält, wird mit einer Lösung von Magnesiumnikotinat und Magnesiumadipinat (Magnesium compositum "Scharffenberg") so verdünnt, dass die entstehende Lösung pro ml 25 mg Magnsiumnikotinat und 88 mg Magnesiumadipinat und 100.000 IU Hyaluronatlyase rHyal B enthält.high purity concentrated solution of hyaluronate lyase rHyal B, the 650,000 IU / ml is mixed with a solution of magnesium nicotinate and magnesium adipate (Magnesium compositum "Scharffenberg") so diluted so that the resulting solution per ml 25 mg of magnesium nicotinate and 88 mg of magnesium adipate and 100,000 IU Hyaluronate lyase contains rHyal B.
Ausführungsbeispiel 6:Embodiment 6:
Herstellung einer langzeitstabilen HyaluronatlyaselösungPreparation of a long-term stable hyaluronate lyase solution
Die Lösung einer hochreinen Hyaluronatlyase rHyal B wird mit einer Lösung von Kochsalz und Eieralbumin in der Weise verdünnt, dass die entstehende Lösung Hyaluronatlyase rHyal B in einer Konzentration von 10.000.000 IU/ml, 0,9% Kochsalz und 1% an Eieralbumin enthält.The Solution of a high-purity hyaluronate lyase rHyal B is used with a solution of saline and egg albumin in the way diluted that the resulting solution hyaluronate lyase rHyal B at a concentration of 10,000,000 IU / ml, 0.9% saline and 1% egg ovalbumin.
Ausführungsbeispiel 7:Embodiment 7:
-
Wässrige hydrophile Zubereitung für topisch
dermale Anwendungen, bestehend aus
- Harnstoff (DAB 10), Urea: 10.00%
- Hyaluronatlyase rHyal B (5.000 IU/cm3): 1.30%
- Lanette (R) N (emulgierender Cetylstearylalcohol (DAB 10): 9.00%
- Paraffinum subliquidum (visköses Paraffin): 10.50%
- Vaselinum album (weiße Vaseline): 10.50%
- Aqua bidestillata: 100.00%
- Urea (DAB 10), urea: 10.00%
- Hyaluronate lyase rHyal B (5,000 IU / cm 3 ): 1.30%
- Lanette (R) N (emulsifying cetylstearyl alcohol (DAB 10): 9.00%
- Paraffinum subliquidum (viscous paraffin): 10.50%
- Vaselinum album (white petrolatum): 10.50%
- Aqua bidestillata: 100.00%
Ausführungsbeispiel 8:Embodiment 8:
-
Antibiotikum enthaltende topisch dermal anwendbare Formulierung,
bestehend aus
- Unguentum Oxytetracyclini: 1% L/W (SR)
- Oxytetracyclinum hydrochloricum: 1.00%
- Natrium aceticum: 0.36%
- Mucilago hydroxyethylcellulosi 8% ASR: 10.00%
- Unguentum emulsificans aquosum NSR: 50.00%
- Hyaluronatlyase rHyal B (1500 IU/cm3): 1.30%
- Aqua conservata ASR: 100.00%
- Unguentum Oxytetracycline: 1% L / W (SR)
- Oxytetracycline hydrochloricum: 1.00%
- Sodium aceticum: 0.36%
- Mucilago hydroxyethylcellulosi 8% ASR: 10.00%
- Unguentum emulsificans aquosum NSR: 50.00%
- Hyaluronate lyase rHyal B (1500 IU / cm 3 ): 1.30%
- Aqua conservata ASR: 100.00%
Ausführungsbeispiel 9:Embodiment 9:
Nachweis der Entfernung von Calcium Ablagerungen auf GewebeEvidence of the removal of calcium deposits on tissue
Ein 0.8-cm langes Stück einer arteriosklerotischen Arteria femoralis superficialis menschlicher Herkunft, welches makroskopisch sichtbare massive arteriosklerotische Plaques mit stark calcifinierten Ablagerungen im inneren Lumen aufwies, wird bei 37°C für 72 h unter leichtem Umschwenken in 2 ml 0.05 M Phosphat-Puffer, pH 7.0, der Hyaluronatlyase rHyal B in einer Aktivität von 10.000 IU/ml und zur Verhinderung mikrobiellen Wachstums 0.45 μl/ml Proclin 300 (Supelco, Belefonte, PA, USA) enthält, inkubiert. Die Kontrolle wird nur mit Puffer und Proclin 300 behandelt. Die Inkubationen werden durch Waschen mit destilliertem Wasser beendet. Danach werden die Gefäßabschnitte mit 7% gepufferter Formaldehydlösung versetzt, anschließend mit Ethanol (2 × 70%, 2 × 96%, 2 × 99%) dehydriert und in Paraffinwachs eingebettet. 4-μm starke Schnitte werden auf adhäsive Objektträger (Superfrost plus, Menzel, Germany) übertragen, deparaffiniert und rehydriert (2 × Xylole, 2 × 99% Ethanol, 2 × Ethanol 70%, destilliertes Wasser). Die Objektträger werden mit Haematoxylin-Eosin (HE), mit Elastica van Gieson (EvG) nach von Kossa angefärbt und mikrophotographisch (Olympus Stereomicroskop, Olympus Digital Camera Camedia C3030, DP-Soft 3.0 Imaging Software) dokumentiert. Die nicht mit Hyaluronatlyase rHyal B behandelten Gefäßabschnitte weisen intensiv violett gefärbte Auflagerungen von Calciumdepots auf den im Gefäßlumen vorhandenen Plaques auf. Bei den mit Hyaluronatlyase rHyal B behandelten Gefäßabschnitten sind die violettangefärbten Calciumdepot-Ablagerungen vollständig verschwunden.One 0.8 cm long piece of arteriosclerotic arteria femoralis superficialis of human origin, which macroscopically visible massive arteriosclerotic plaques with strongly calcified Deposits in the inner lumen, is at 37 ° C for 72 h with gentle swirling in 2 ml of 0.05 M phosphate buffer, pH 7.0, the hyaluronate lyase rHyal B in one activity of 10,000 IU / ml and to prevent microbial growth 0.45 μl / ml Proclin 300 (Supelco, Belefonte, PA, USA), incubated. The control is only treated with buffer and Proclin 300. The Incubations are terminated by washing with distilled water. Thereafter, the vessel sections are buffered with 7% Formaldehyde solution added, then with ethanol (2 x 70%, 2 x 96%, 2 x 99%) dehydrated and embedded in paraffin wax. 4 μm thick cuts are placed on adhesive slides (superfrost plus, Menzel, Germany), deparaffinated and rehydrated (2x xylenes, 2x99% ethanol, 2x ethanol 70%, distilled water). The slides are with Haematoxylin eosin (HE), with Elastica van Gieson (EvG) after Kossa stained and photomicrographic (Olympus stereomicroscope, Olympus Camedia C3030 Digital Camera, DP-Soft 3.0 Imaging Software) documented. Those not treated with hyaluronate lyase rHyal B. Vessel sections have intense purple colored deposits of calcium deposits on those present in the vessel lumen Plaques on. For vascular sections treated with hyaluronate lyase rHyal B. the purple colored calcium deposit deposits are complete disappeared.
In einer anderen Versuchsausführung, die wesentlich in der gleichen Vorgehensweise durchgeführt wurde, wird die Wirkung der Streptokokken-Hyaluronatlyase (10.000 IU/ml) mit der Wirkung der rekombinanten Hyaluronatlyase rHyal B (10.000 IU/ml) unter identischen Bedingungen miteinander verglichen. Der Versuch wurde jedoch bereits nach 12 Stunden beendet. Die Auflagerungen waren bei dem mit dem rekombinanten Enzym durchgeführten Versuch vollständig frei von Calcium-haltigen Ablagerungen, während bei dem Kontrollversuch mit der Streptokokken-Hyaluronatlyase gefärbte Auflagerungen die Anwesenheit von Calcium-Ablagerungen anzeigen.In another experimental design, essential in the same procedure is performed, the effect streptococcal hyaluronate lyase (10,000 IU / ml) with effect of the recombinant hyaluronate lyase rHyal B (10,000 IU / ml) under identical Conditions compared. However, the attempt has already been made finished after 12 hours. The Auflagerungen were at the with the recombinant enzyme experiment completely free of calcium-containing deposits, while in the Control trial stained with streptococcal hyaluronate lyase Deposits indicate the presence of calcium deposits.
Ausführungsbeispiel 10:Embodiment 10:
Entfernung von Hyaluronsäure enthaltende Ablagerungen auf GewebenRemoval of hyaluronic acid containing deposits on tissues
Zur Lokalisation der Hyaluronsäure auf den im Kryostat tiefgefrorenen Abschnitten werden diese mit 1:50 verdünnten biotinylierten Hyaluronsäure-Bindungsprotein (HBP, Calbiochem, Merck, Germany) in 10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, pH 7.5 für 12 h bei 4°C inkubiert. Nach drei Waschprozeduren mit physiologischen Phosphatepuffer (PBS) werden die Abschnitte mit einem makromolekularen Komplex bestehend aus Avidin and biotinylierter Peroxidase, welche Biotin-Bindungsseiten enthält (ABC-Elite, Vector Laboratories, Burlingame, CA) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Abschnitte mit einer Lösung von 1.5 μM 3.3'-Diaminobenzidin, 10 mmol/l H2O2 und 0.05 M Tris-HCl Puffer (pH 7.6) bei 25°C 10 min inkubiert.For the localization of the hyaluronic acid on the frozen sections in the cryostat these are incubated with 1:50 diluted biotinylated hyaluronic acid binding protein (HBP, Calbiochem, Merck, Germany) in 10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, pH 7.5 for 12 h at 4 ° C. After three washings with physiological phosphate buffer (PBS), the sections are incubated with a macromolecular complex consisting of avidin and biotinylated peroxidase containing biotin-binding sites (ABC-Elite, Vector Laboratories, Burlingame, CA) for 30 min at room temperature. The sections are then incubated with a solution of 1.5 μM 3.3'-diaminobenzidine, 10 mmol / l H 2 O 2 and 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.6) at 25 ° C. for 10 min.
Nach Counterstaining in 5% Harris Haematoxylin für 5 min werden die Gefrierschnitte mit Ethanol dehydriert, in Xylol überführt und mit Canadabalsam befestigt. Negative Kontrollen werden in HEPES-Puffer mit 1% BSA anstatt mit HBP inkubiert. Eine deutliche braune Färbung auf den im Volumen des Gefäßes vorhanden Plaques zeigt die Anwesenheit bzw. das Fehlen der Hyaluronsäure nach Inkubation mit rekombinanter Hyaluronatlyase an rHyal B.To Counterstaining in 5% Harris hematoxylin for 5 min the frozen sections dehydrated with ethanol, converted to xylene and attached with Canada balsam. Negative controls are in HEPES buffer incubated with 1% BSA instead of HBP. A clear brown color on the plaques present in the volume of the vessel shows the presence or absence of hyaluronic acid after incubation with recombinant hyaluronate lyase on rHyal B.
Ausführungsbeispiel 11:Embodiment 11:
Freisetzung von Uronsäure aus Geweben durch Abbau von Hyaluronsäure mit rHyal BRelease of uronic acid Tissues by degradation of hyaluronic acid with rHyal B
Der
Abbau von Hyaluronsäure mit Hyaluronatlyase rHyal B wurde
anhand der zeitlichen Freisetzung von Uronsäure verfolgt.
Dazu wurden 0,3 cm lange Stücke der Intima der Arteria
carotis communis, die durch Nekropsie aus humanen Geweben eines
Patienten mit vaskularen Obstruktionen gewonnen wurde, in vitro
der enzymatische Wirkung von rHyal B ausgesetzt und die dabei frei
werdenden Uronsäuren in Abhängigkeit von der Zeit
bestimmt (
Dazu
wurden die Intima-Stücke in physiologischem Phosphat-Puffer,
pH 7.0, der 10.000 IU/ml Hyaluronatlyase rHyal B und 0.45 μl/ml
Proclin 300 (Supelco, Belefonte, PA, USA) enthielt, 96 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Die beim enzymatischen Abbau der Hyaluronsäure
entstehende freie Glucuronsäure wurde chemisch über
die Uronsäure bestimmt. (
Ausführungsbeispiel 12:Embodiment 12:
Mobilisierung von festen Material aus GewebenMobilization of solid material tissues
Bestimmung des durch Einwirkung rekombinanter Hyaluronatlyase aus arteriosklerotischen Gefäßen freigesetzten festen Materials. 0,8 cm lange Stücke einer arteriosklerotischen Arteria femoralis superficialis, die einem an Gangrän leidenden diabetischen Patienten entnommen wurden, werden mit einer Lösung inkubiert, die rekombinante Hyaluronatlyase (10.000 IU/ml) in einem physiologischen Phosphatpuffer (pH 7.0), der außerdem 0.45 μl/ml Proclin 300, enthält, für 72 Stunden bei 37°C unter langsamen Schütteln auf einem (Thermomixer 5436, Eppendorf, BRD) inkubiert. Das freigesetzte Sediment wird gesammelt und das Trockengewicht durch Trocknen bei 105°C bestimmt. Es wird bei Anwesenheit des Enzyms 11 mg, bei Nichtanwesenheit 3 mg eines festen Materials freigesetzt.determination by the action of recombinant hyaluronate lyase from atherosclerotic Vessels released solid material. 0.8 cm long pieces of an arteriosclerotic femoral artery superficialis, which is a diabetic suffering from gangrene Patients are removed are incubated with a solution the recombinant hyaluronate lyase (10,000 IU / ml) in a physiological Phosphate buffer (pH 7.0), which also contains 0.45 μl / ml Proclin 300, contains, for 72 hours at 37 ° C with slow shaking on a (Thermomixer 5436, Eppendorf, Germany). The released sediment is collected and the dry weight determined by drying at 105 ° C. It is in the presence of the enzyme 11 mg, in the absence 3 mg of a solid material released.
Ausführungsbeispiel 13:Embodiment 13:
Immobilisierung von Hyaluronatlyase an eine anorganische MaterialoberflächeImmobilization of hyaluronate lyase an inorganic material surface
Zur kovalenten Bindung von Hyaluronatlyase an die Oberfläche von Magnetit-Partikeln mit einem Durchmesser von 1 μm werden 1 g silanisierte mikroporöse Magnetit-Partikel werden in 3 ml einer wässrigen Lösung von 1% Glutaraldehyd 10 min suspendiert. Die Partikel werden solange mit Wasser gewaschen, bis nichtumgesetztes Glutaraldehyd vollständig entfernt ist. Nach Waschen mit 10 ml wurden 2 ml Phosphat-Puffer (pH 7,0) zugesetzt, die 400.000 IU Hyaluronatlyase rHyal B enthielt. Nach 2 Stunden wurde das Magnetit mit 0.1 M NaHCO3 Lösung (pH 7.5) gewaschen, mit 1 M Glycinlösung behandelt und erneut gewaschen. Es wurden etwa 11.000 IU/g immobilisiert.For the covalent attachment of hyaluronate lyase to the surface of 1 μm diameter magnetite particles, 1 g of silanized microporous magnetite particles will be dissolved in 3 mL of an aqueous Solution of 1% glutaraldehyde suspended for 10 min. The particles are washed with water until unreacted glutaraldehyde is completely removed. After washing with 10 ml, 2 ml of phosphate buffer (pH 7.0) containing 400,000 IU of hyaluronate lyase B was added. After 2 hours, the magnetite was washed with 0.1 M NaHCO 3 solution (pH 7.5), treated with 1 M glycine solution and washed again. About 11,000 IU / g were immobilized.
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