RU2267329C2 - Method for treating diseases accompanied with alterations of qualitative and/or quantitative composition of blood extra-cellular dna (variants) - Google Patents
Method for treating diseases accompanied with alterations of qualitative and/or quantitative composition of blood extra-cellular dna (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2267329C2 RU2267329C2 RU2004108059/14A RU2004108059A RU2267329C2 RU 2267329 C2 RU2267329 C2 RU 2267329C2 RU 2004108059/14 A RU2004108059/14 A RU 2004108059/14A RU 2004108059 A RU2004108059 A RU 2004108059A RU 2267329 C2 RU2267329 C2 RU 2267329C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- dna
- mice
- diseases
- treatment
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения заболеваний, сопровождающихся качественными или количественными изменениями внеклеточной ДНК крови, а именно злокачественных опухолей или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, а также заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток.The invention relates to medicine and veterinary medicine and can be used to treat diseases accompanied by qualitative or quantitative changes in extracellular blood DNA, namely malignant tumors or infections caused by bacteria, fungi and protozoa, or atherosclerosis, or diabetes mellitus, or diseases associated with the reaction delayed-type hypersensitivity, as well as diseases caused by mutations in somatic cell genes.
Перечисленные заболевания согласно современным знаниям представляют собой крайне неоднородные и различающиеся между собой по этиологии и патогенезу болезненные процессы. В соответствии с этими представлениями и лечение этих заболеваний осуществлялось совершенно различными методами. Так, основным способом лекарственного лечения онкологических заболеваний является химиотерапия, см. Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 16th Edition.According to modern knowledge, the listed diseases are extremely heterogeneous and painful processes that differ in etiology and pathogenesis. In accordance with these ideas, the treatment of these diseases was carried out by completely different methods. So, the main method of drug treatment of cancer is chemotherapy, see Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 16 th Edition.
Основным способом лечения заболеваний, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, является антибиотико- и химиотерапия, см. Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 16th Edition.The main method for treating diseases caused by bacteria, fungi and protozoa is antibiotic and chemotherapy, see Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 16 th Edition.
Основным способом лекарственного лечения атеросклероза является терапия препаратами группы статинов, подавляющих синтез холестерина в организме, см. New Concepts and Paradigms in Cardiovascular Medicine: The Noninvasive Management of Coronary Artery Disease, K. Lance Gould, THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE, Volume 104, June 22, 1998, 2s-17s.The main method of drug treatment of atherosclerosis is therapy with statin drugs that suppress cholesterol synthesis in the body, see New Concepts and Paradigms in Cardiovascular Medicine: The Noninvasive Management of Coronary Artery Disease, K. Lance Gould, THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE, Volume 104, June 22, 1998, 2s-17s.
В основе лекарственного лечения сахарного диабета лежат три основных подхода - заместительная терапия препаратами инсулина, лекарственная терапия, направленная на улучшение секреции инсулина поджелудочной железой, лекарственная терапия, направленная на повышение чувствительности тканей к инсулину или ускорение утилизации тканями глюкозы, см. Pharmacological Management of Diabetes: Recent Progress and Future Perspective in Daily Drug Treatment, Gerard Emilien et.al., Pharmacol. Ther. Vol.81, No.1, pp.37-51, 1999.The treatment of diabetes mellitus is based on three main approaches: replacement therapy with insulin preparations, drug therapy aimed at improving the secretion of insulin by the pancreas, drug therapy aimed at increasing tissue sensitivity to insulin or accelerating tissue utilization of glucose, see Pharmacological Management of Diabetes: Recent Progress and Future Perspective in Daily Drug Treatment, Gerard Emilien et.al., Pharmacol. Ther. Vol. 81, No.1, pp. 37-51, 1999.
Основой терапии аллергических заболеваний, связанных с реакциями гиперчувствительности IV типа, является иммуносупрессивная или иммуномодулирующая терапия, см. Therapeutic Immunosupression, ed. A.W.Thomson, Ser.Immunology and Medicine vol.29, Kluwer Acad.Publishers, Dordrecht, 2001.The basis for the treatment of allergic diseases associated with type IV hypersensitivity reactions is immunosuppressive or immunomodulating therapy, see Therapeutic Immunosupression, ed. A. W. Thomson, Ser. Immunology and Medicine vol. 29, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 2001.
Заболевания, развивающиеся вследствие мутаций генов соматических клеток и сопровождающиеся развитием соматического мозаицизма, вовсе не имеют средств этиологической терапии, осуществляется лишь симптоматическое лечение (Youssoufian H., Pyeritz RE. Mechanisms and Consequences of Somatic Mosaicism in Humans, Nature Reviews Genetics, 2002; 3:748-758).Diseases developing as a result of mutations in somatic cell genes and accompanied by the development of somatic mosaicism have no etiological treatment at all, only symptomatic treatment is carried out (Youssoufian H., Pyeritz RE. Mechanisms and Consequences of Somatic Mosaicism in Humans, Nature Reviews Genetics, 2002; 3: 748-758).
Основной проблемой химиотерапии наиболее распространенных онкологических заболеваний считается ее малая эффективность и высокая токсичность (Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 16th Edition).The main problem of the most common chemotherapy of oncological diseases is considered its low effectiveness and high toxicity (Merck Manual of Diagnosis and Therapy; 16 th Edition).
Основной проблемой антибиотикотерапии бактериальных инфекций считается проблема лекарственной резистентности. Циркуляция резистентных к антибиотическим средствам штаммов бактерий и их новообразование в процессе лечения (например, вследствие формирования в организме больного биопленок) являются основной причиной неэффективной терапии (The use and resistance to antibiotics in the community. Cizman M, Int J Antimicrob Agents, 2003, Apr 21: pp.297-307). Общепризнанно, что проблема антибиотикорезистентности микроорганизмов в настоящее время носит характер глобальной угрозы (Mechanisms of antimicrobial resistance: their clinical relevance in the new millennium. Sefton A.M., Drugs, 2002, vol.62:557-66) и требует разработки новых антибиотических препаратов с оригинальными механизмами антибактериального воздействия и новых неантибиотических способов воздействия на инфекционный процесс. В частности, при лечении инфекции, вызванной резистентными к пенициллиновым и цефалоспориновым антибиотикам грамм-положительными кокками, используется антибиотик Ванкомицин. К основным его недостаткам относятся рост количества ванкомицин-резистентных штаммов в циркуляции; высокая токсичность; относительно узкий спектр активности препарата (The threat of vancomycin resistance. PerlTM, Am J Med, 1999, May, 106:26S-37S).The main problem of antibiotic therapy of bacterial infections is the problem of drug resistance. The circulation of antibiotic-resistant bacterial strains and their neoplasm during treatment (for example, due to the formation of biofilms in the patient's body) are the main cause of ineffective therapy (The use and resistance to antibiotics in the community. Cizman M, Int J Antimicrob Agents, 2003, Apr 21: pp. 297-307). It is generally recognized that the problem of antibiotic resistance of microorganisms is currently a global threat (Mechanisms of antimicrobial resistance: their clinical relevance in the new millennium. Sefton AM, Drugs, 2002, vol. 62: 557-66) and requires the development of new antibiotic drugs with original mechanisms of antibacterial effects and new non-antibiotic methods of influencing the infectious process. In particular, in the treatment of infection caused by penicillin and cephalosporin antibiotic-resistant gram-positive cocci, the antibiotic Vancomycin is used. Its main disadvantages include the increase in the number of vancomycin-resistant strains in the circulation; high toxicity; a relatively narrow spectrum of drug activity (The threat of vancomycin resistance. PerlTM, Am J Med, 1999, May, 106: 26S-37S).
В связи с перечисленным является актуальной задача поиска метода антибактериальной терапии эффективного, малотоксичного, активного в отношении широкого спектра бактерий, в том числе резистентных к антибиотическим препаратам.In connection with the above, the urgent task of finding a method of antibacterial therapy is effective, low toxicity, active against a wide range of bacteria, including those resistant to antibiotic drugs.
Проблемы антибиотико- и химиотерапии инфекций, вызываемых грибами и простейшими, носят в основном тот же характер, что и проблемы антибиотикотерапии бактериальных инфекций; например, при лечении широко распространенным антигрибковым агентом амфотерицином (Antifungal drug resistance to azoles and polyenes. Mar Masia Canuto et.al., The Lancet Infectious Diseases, Volume 2, Issue 9, 1 September 2002, Pages 550-563; A systematic review of the antifungal effectiveness and tolerability of amphotericin В formulations, Jane P. Barrett et.al., Clinical Therapeutics, Volume 25, Issue 5, May 2003, Pages 1295-1320).The problems of antibiotic and chemotherapy of infections caused by fungi and protozoa are basically the same as the problems of antibiotic therapy of bacterial infections; for example, when treated with the widespread antifungal agent amphotericin (Antifungal drug resistance to azoles and polyenes. Mar Masia Canuto et.al., The Lancet Infectious Diseases,
Атеросклероз представляет собой системное заболевание, сопровождающееся формированием специфических атеросклеротических бляшек в стенках крупных и средних артерий. В зависимости от места появления, стадии развития и величины атеросклеротических бляшек заболевание имеет различные клинические проявления (ишемическая болезнь сердца, инсульт и др.). Лекарственному и хирургическому лечению подвергаются именно проявления системного атеросклероза на уровне того или иного органа. Атеросклероз как системное заболевание не имеет способов лекарственного лечения. Наиболее распространенным способом профилактики, замедляющим прогрессирование заболевания, является терапия ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглютарил коэнзим A(HMGCoA) редуктазы (Ловастатин, Парвастатин и др.), приводящая к подавлению синтеза эндогенного холестерина и ускорению клиренса липопротеинов низкой плотности из плазмы крови, что замедляет развитие атеросклероза (New Concepts and Paradigms in Cardiovascular Medicine: The Noninvasive Management of Coronary Artery Disease, K. Lance Gould, THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE, Volume 104, June 22, 1998, 2s-17s). Недостатками подобного лечения являются серьезные побочные эффекты (A safety look at currently available statins., Moghadasian MH, Expert Opin Drug Saf, 2002, Sep 1: pp.269-74) и ограниченная эффективность (Statins: balancing benefits, efficacy and safety., Clearfield MB, Expert Opin Pharmacother, 2002, May 3: pp.469-77).Atherosclerosis is a systemic disease, accompanied by the formation of specific atherosclerotic plaques in the walls of large and medium arteries. Depending on the place of occurrence, stage of development and magnitude of atherosclerotic plaques, the disease has various clinical manifestations (coronary heart disease, stroke, etc.). It is the manifestations of systemic atherosclerosis at the level of one or another organ that are subjected to drug and surgical treatment. Atherosclerosis as a systemic disease does not have methods of drug treatment. The most common prevention method that slows down the progression of the disease is the treatment with 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMGCoA) reductase inhibitors (Lovastatin, Parvastatin, etc.), which inhibits the synthesis of endogenous cholesterol and accelerates the clearance of low density lipoproteins from blood plasma, which slows the development of atherosclerosis (New Concepts and Paradigms in Cardiovascular Medicine: The Noninvasive Management of Coronary Artery Disease, K. Lance Gould, THE AMERICAN JOURNAL OF MEDICINE, Volume 104, June 22, 1998, 2s-17s). The disadvantages of this treatment are serious side effects (A safety look at currently available statins., Moghadasian MH, Expert Opin Drug Saf, 2002, Sep 1: pp. 269-74) and limited effectiveness (Statins: balancing benefits, efficacy and safety., Clearfield MB, Expert Opin Pharmacother, 2002, May 3: pp. 469-77).
Основной причиной инвалидизации и смерти больных при сахарном диабете 1 и 2 типа являются осложнения, связанные с развитием микро- и макроангиопатий. Считается, что достижение эффективного метаболического контроля (поддержание нормального уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина в физиологических границах в течение длительного времени) препятствует развитию осложнений. Инсулинотерапия, в том числе интенсивная, является методом выбора в ситуациях, когда не удается достичь метаболического контроля с помощью других лекарственных средств (Outpatient insulin therapy in type 1 and type 2 diabetes mellitus: scientific review, DeWitt DE, Hirsch IB, JAMA, 2003, May 289: pp.2254-64). Однако даже при интенсивных режимах терапии риск развития осложнений, в том числе фатальных, остается высоким (Cause-specific mortality in a population with diabetes: South Tees Diabetes Mortality Study., Roper NA, et.al., Diabetes Care, 2002, Jan 25: pp.43-8). В связи с перечисленным является актуальной и общепризнанной задача поиска новых средств для терапии сахарного диабета 1 и 2 типа, в том числе способных предупреждать развитие осложнений.The main cause of disability and death in patients with
Одним из наиболее широко применяемых в клинической практике способов, применяемых для лечения состояний, связанных с реакциями гиперчувствительности замедленного типа, является введение пептида Циклоспорина А, см. Therapeutic Immunosupression, ed. A.W.Thomson, Ser.Immunology and Medicine vol.29, Kluwer Acad.Publishers, Dordrecht, 2001. К широко известным недостаткам этого способа относятся серьезные побочные эффекты - нефротоксичность, гипертензия и высокий риск развития инфекций (Cyclosporine: mechanisms of action and toxicity, Graham RM, Cleve Clin J Med, 1994, Jul-Aug 61: pp.308-13). Другой проблемой является потеря эффективности при длительном применении препарата, что проявляется, например, в увеличении вероятности отторжения трансплантата (Renal transplantation, past, present and future, Ponticelli C, et.al. J Nephrol, 1999, Jul-Aug 12, Suppl 2:S105-10).One of the most widely used methods in clinical practice for treating conditions associated with delayed hypersensitivity reactions is the administration of the Cyclosporin A peptide, see Therapeutic Immunosupression, ed. AW Thomson, Ser. Immunology and Medicine vol. 29, Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, 2001. Well-known disadvantages of this method include serious side effects - nephrotoxicity, hypertension and a high risk of infection (Cyclosporine: mechanisms of action and toxicity, Graham RM, Cleve Clin J Med, 1994, Jul-Aug 61: pp. 308-13). Another problem is the loss of effectiveness with prolonged use of the drug, which manifests itself, for example, in an increased likelihood of transplant rejection (Renal transplantation, past, present and future, Ponticelli C, et.al. J Nephrol, 1999, Jul-Aug 12, Suppl 2: S105-10).
Таким образом, для лечения заболеваний, сопровождающихся изменениями качественного и/или количественного состава внеклеточной ДНК крови, применяется широкий спектр различных способов, имеющих схожие недостатки:Thus, for the treatment of diseases accompanied by changes in the qualitative and / or quantitative composition of extracellular blood DNA, a wide range of different methods are used that have similar disadvantages:
1) токсичность;1) toxicity;
2) развитие побочных эффектов;2) the development of side effects;
3) низкая эффективность терапии.3) low effectiveness of therapy.
Между тем, в реальной клинической практике рассматриваемые заболевания часто сопутствуют одно другому. Так, например, терапия иммуносупрессивными препаратами при заболеваниях, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, многократно повышает риск развития инфекционных заболеваний (Recent advances in the diagnosis and management of infection in the organ transplant recipient. Tolkoff-Rubin NE, Rubin RH; Semin Nephrol, 2000, Mar 20:148-63); атеросклероз является частым осложнением диабета (Diabetes and atherosclerosis: epidemiology, pathophysiology and management. Beckman JA, Creager MA, Libby P; JAMA, 2002, May 287:2570-81), и при этом часто его развитию сопутствует системный инфекционный процесс (Infection and atherosclerosis: potential roles of pathogen burden and molecular mimicry, Epstein SE, Zhu J, Bumett MS, Zhou YF, Vercelotti G, Hajjar D, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, Jun 20: 1417-20); ряд форм диабета развивается вследствие развития реакции гиперчувствительности замедленного типа (Evidence of islet cell autoimmunity in elderly patients with type 2 diabetes, Pietropaolo M, Barinas-Mitchell E, Pietropaolo SL, Kuller LH, Trucco M, Diabetes, 2000, Jan 49:32-8), или на фоне инфекционного процесса (Systemic diseases caused by oral infection. Li X, Kolltveit KM, Tronstad L, Olsen I, Clin Microbiol Rev 2000 Oct 13:547-58) и, в свою очередь, приводит к высокому риску развития инфекций (Diabetes and the risk of infection-related mortality in the U.S., Bertoni AG, Saydah S, Brancati FL, Diabetes Care, 2001, June, 24:6 1044-9).Meanwhile, in real clinical practice, the diseases under consideration often accompany one another. For example, therapy with immunosuppressive drugs for diseases associated with a delayed hypersensitivity reaction, significantly increases the risk of developing infectious diseases (Recent advances in the diagnosis and management of infection in the organ transplant recipient. Tolkoff-Rubin NE, Rubin RH; Semin Nephrol, 2000, Mar 20: 148-63); atherosclerosis is a common complication of diabetes (Diabetes and atherosclerosis: epidemiology, pathophysiology and management. Beckman JA, Creager MA, Libby P; JAMA, 2002, May 287: 2570-81), and often its development is accompanied by a systemic infection process (Infection and atherosclerosis: potential roles of pathogen burden and molecular mimicry, Epstein SE, Zhu J, Bumett MS, Zhou YF, Vercelotti G, Hajjar D, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, Jun 20: 1417-20); a number of forms of diabetes develop as a result of the development of a delayed-type hypersensitivity reaction (Evidence of islet cell autoimmunity in elderly patients with
В настоящее время отсутствуют какие-либо способы, которые позволяли бы лечить указанные выше заболевания в комплексе. В связи с этим отсутствует возможность принять какое-либо известное техническое решение за прототип настоящего изобретения.Currently, there are no methods that would allow to treat the above diseases in combination. In this regard, there is no opportunity to take any well-known technical solution for the prototype of the present invention.
В основу всех вариантов настоящего изобретения положено решение задачи создания высокоэффективного и малотоксичного способа лечения злокачественных опухолей, инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, атеросклероза, сахарного диабета, заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток.All variants of the present invention are based on the solution of the problem of creating a highly effective and low-toxic method for treating malignant tumors, infectious diseases caused by bacteria, fungi and protozoa, atherosclerosis, diabetes mellitus, diseases associated with a delayed hypersensitivity reaction, diseases caused by mutations in somatic cell genes.
Согласно первому варианту изобретения эта задача решается за счет того, что для лечения злокачественных опухолей, или инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или аллергических заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток, в кровь вводят агент, связывающий внеклеточную ДНК крови.According to the first embodiment of the invention, this problem is solved due to the fact that for the treatment of malignant tumors, or infectious diseases caused by bacteria, fungi and protozoa, or atherosclerosis, or diabetes mellitus, or allergic diseases associated with a delayed hypersensitivity reaction, or diseases caused by mutations in somatic cell genes, an agent that binds extracellular blood DNA is injected into the blood.
Согласно второму варианту изобретения эта задача решается за счет того, что в кровь вводят фермент, изменяющий химическую структуру внеклеточной ДНК крови.According to a second embodiment of the invention, this problem is solved due to the fact that an enzyme is introduced into the blood that alters the chemical structure of the extracellular DNA of the blood.
Согласно третьему варианту изобретения эта задача решается за счет того, что в кровь вводят агент, стимулирующий синтез или активность эндогенной дезоксирибонуклеазы, или агент, стимулирующий синтез антител, связывающих внеклеточную ДНК крови.According to a third embodiment of the invention, this problem is solved by introducing into the blood an agent that stimulates the synthesis or activity of endogenous deoxyribonuclease, or an agent that stimulates the synthesis of antibodies that bind extracellular blood DNA.
Развитие указанных заболеваний сопровождается качественными и количественными изменениями внеклеточной ДНК крови, однако в известных заявителю источниках отсутствуют знания о генетическом репертуаре внеклеточной ДНК крови больных при рассматриваемых заболеваниях, биологической роли внеклеточной ДНК крови при рассматриваемых заболеваниях и возможном терапевтическом эффекте ее связывания или модификации для лечения этих заболеваний.The development of these diseases is accompanied by qualitative and quantitative changes in extracellular blood DNA, however, sources known to the applicant lack knowledge on the genetic repertoire of extracellular blood DNA of patients with the diseases under consideration, the biological role of extracellular blood DNA in the diseases under consideration, and the possible therapeutic effect of its binding or modification for the treatment of these diseases .
Как установили заявители, внеклеточная ДНК крови больных при рассматриваемых заболеваниях содержит уникальный по своему качественному и количественному составу репертуар генов и регуляторных генетических элементов, резко отличающийся от репертуара ДНК, описанного в геноме человека. В отличие от внутриклеточной ДНК внеклеточная ДНК крови больных рассматриваемыми заболеваниями содержит в основном уникальные гены человека. Установлено наличие бактериальной внеклеточной ДНК и внеклеточной ДНК грибов в составе матрикса биопленок и в плазме крови инфицированного человека.According to the applicants, the extracellular DNA of the blood of patients with the diseases under consideration contains a unique in its qualitative and quantitative composition repertoire of genes and regulatory genetic elements, which differs sharply from the DNA repertoire described in the human genome. In contrast to intracellular DNA, extracellular blood DNA of patients with the diseases under consideration contains mainly unique human genes. The presence of bacterial extracellular DNA and extracellular DNA of fungi in the biofilm matrix and in the blood plasma of an infected person has been established.
Установлено, что внеклеточная ДНК крови, включая внеклеточную ДНК бактерий, грибов и паразитов при рассматриваемых заболеваниях, способствует их развитию.It has been established that extracellular DNA of blood, including extracellular DNA of bacteria, fungi and parasites in the diseases under consideration, contributes to their development.
Установлено, что связывание и модификация внеклеточной ДНК крови, а также стимуляция синтеза или активности эндогенных биополимеров, связывающих, или разрушающих, или модифицирующих химический состав, и/или конформацию, и/или полимерность внеклеточной ДНК крови без ее разрушения, при рассматриваемых заболеваниях приводит к лечебному эффекту.It has been established that the binding and modification of extracellular blood DNA, as well as the stimulation of the synthesis or activity of endogenous biopolymers that bind, or destroy, or modify the chemical composition and / or conformation and / or polymerization of extracellular blood DNA without its destruction, leads to therapeutic effect.
Указанные выше новые свойства заявленного изобретения, базирующиеся на принципиально новых представлениях о роли внеклеточной ДНК плазмы крови в развитии рассматриваемых заболеваний, позволяют сделать вывод о соответствии заявленного способа критерию «изобретательский уровень».The above new properties of the claimed invention, based on fundamentally new ideas about the role of extracellular DNA of blood plasma in the development of the diseases under consideration, allow us to conclude that the claimed method meets the criterion of "inventive step".
Заявленный способ реализуется следующим образом.The claimed method is implemented as follows.
Материалы и методы.Materials and methods.
В первом варианте в качестве агента, связывающего ДНК, использовали антитела против ДНК, выделяемые из крови больных системной красной волчанкой по методике Shuster A.M. (Shuster A.M. et.al., Science, v.256,1992, pp.665-667). Подобные анти-ДНК антитела способны связывать ДНК.In the first embodiment, antibodies against DNA isolated from the blood of patients with systemic lupus erythematosus according to the method of Shuster A.M. were used as a DNA binding agent. (Shuster A.M. et.al., Science, v. 256.1992, pp. 665-667). Similar anti-DNA antibodies are capable of binding DNA.
Во втором варианте в качестве агента, модифицирующего ДНК, использовали бактериальную Sss I Метилазу (CpG Methylase), (NewEngland Biolabs). В экспериментах Sss I Метилазу включали в состав малых однослойных липосом (SUV) в соотношении 1u фермента на 1 мкг липидов (энзаймосомы), а также фермент лигазу Т4 (Fermentas).In the second embodiment, bacterial Sss I Methylase (CpG Methylase), (NewEngland Biolabs) was used as a DNA modifying agent. In the Sss I experiments, methylase was included in the composition of small unilamellar liposomes (SUVs) in the ratio of 1u enzyme per 1 μg of lipids (enzymesosomes), as well as T4 ligase enzyme (Fermentas).
В третьем варианте в качестве агента, стимулирующего синтез и/или активность эндогенных биополимеров, связывающих, или разрушающих, или модифицирующих химический состав, и/или конформацию, и/или полимерность внеклеточной ДНК крови без ее разрушения, использовали анти G-f актин антитела (Calbiochem). G-Актин является ингибитором активности эндогенной ДНКазы I. Связывание актина антителами увеличивает активность эндогенной ДНКазы I.In the third embodiment, anti-Gf actin antibodies (Calbiochem) were used as an agent that stimulates the synthesis and / or activity of endogenous biopolymers that bind, or destroy, or modify the chemical composition and / or conformation and / or polymerization of extracellular blood DNA without its destruction. . G-Actin is an inhibitor of the activity of endogenous DNase I. The binding of actin to antibodies increases the activity of endogenous DNase I.
ДНК плазмы крови выделяли следующим образом: свежую (не более 3-4 часов после забора) плазму крови с добавленным антикоагулянтом (цитрат натрия) откручивали на подушке из Ficoll-PlaquePlus (Amersham-Pharmacia) при 1500g 20 минут при комнатной температуре. Плазму (1/2 от всего количества) аккуратно отбирали, не задевая остаток клеток на подушке фиколла, и откручивали при 10000g 30 минут, чтобы избавиться от обломков клеток и дебриса. Супернатант отбирали, не затрагивая осадок, добавляли до 1% саркозила, до 50 мМ трис-HCl, рН 7,6, до 20 мМ ЭДТА, до 400 мМ NaCl и равный объем смеси фенол-хлороформ 1:1. Полученную эмульсию инкубировали при 65°С 2 часа, затем отделяли фенол-хлороформ центрифугированием при 5000g в течение 20 минут при комнатной температуре. Процедуру депротеинизации фенол-хлороформом повторяли идентичным способом трижды, после чего водную фазу обрабатывали хлороформом, затем диэтиловым эфиром. Отделение от органических растворителей производили центрифугированием при 5000g в течение 15 минут. К полученной водной фазе добавляли равный объем изопропанола и инкубировали в течение ночи при 0°С. После осаждения нуклеиновые кислоты отделяли центрифугированием при 0°С, 10000g в течение 30 минут. Осадок нуклеиновых кислот растворяли в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 7,6, 5 мМ ЭДТА, и наносили на подушку из ступенчатого хлористого цезия (1М, 2.5М, 5.7М) в центрифужной пробирке для ротора SW60Ti. Объем ДНК составлял 2 мл, объем каждой ступеньки CsCl - по 1 мл. Ультрацентрифугирование проводили в приборе L80-80 (Beckman) 3 часа при 250000g. ДНК отбирали с поверхности ступеньки 5.7 М по фракциям. Фракции диализировали 12 часов при 4°С. Наличие ДНК во фракциях определяли агарозным электрофорезом, с визуализацией ДНК бромистым этидием. Количество ДНК определяли спектрофотометрически (Beckman DU70) в кювете объемом 100 мкл, снимая спектр от 220 до 320 нм.Plasma DNA was isolated as follows: fresh (no more than 3-4 hours after collection) blood plasma with an added anticoagulant (sodium citrate) was unscrewed on a pillow of Ficoll-PlaquePlus (Amersham-Pharmacia) at 1500 g for 20 minutes at room temperature. Plasma (1/2 of the total amount) was carefully selected without touching the remainder of the cells on the Ficoll pillow, and unscrewed at 10,000 g for 30 minutes to get rid of cell debris and debris. The supernatant was collected without affecting the precipitate, up to 1% sarcosyl, up to 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, up to 20 mM EDTA, up to 400 mM NaCl and an equal volume of 1: 1 phenol-chloroform mixture were added. The resulting emulsion was incubated at 65 ° C for 2 hours, then phenol-chloroform was separated by centrifugation at 5000g for 20 minutes at room temperature. The phenol-chloroform deproteinization procedure was repeated in the same way three times, after which the aqueous phase was treated with chloroform and then diethyl ether. Separation from organic solvents was carried out by centrifugation at 5000 g for 15 minutes. An equal volume of isopropanol was added to the resulting aqueous phase and incubated overnight at 0 ° C. After precipitation, nucleic acids were separated by centrifugation at 0 ° C, 10,000 g for 30 minutes. The nucleic acid precipitate was dissolved in a buffer containing 10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 5 mM EDTA, and applied onto a cushion of step cesium chloride (1 M, 2.5 M, 5.7 M) in a centrifuge tube for the SW60Ti rotor. The DNA volume was 2 ml, the volume of each step of CsCl - 1 ml. Ultracentrifugation was performed in an L80-80 (Beckman) instrument for 3 hours at 250,000 g. DNA was collected from the surface of the 5.7 M step in fractions. Fractions were dialyzed for 12 hours at 4 ° C. The presence of DNA in the fractions was determined by agarose electrophoresis, with visualization of DNA with ethidium bromide. The amount of DNA was determined spectrophotometrically (Beckman DU70) in a 100 μl cuvette, taking a spectrum from 220 to 320 nm.
Пример 1. Влияние разрушения, связывания и модификации внеклеточной ДНК на ее патогенные свойстваExample 1. The effect of the destruction, binding and modification of extracellular DNA on its pathogenic properties
Мыши С57В1 получили прививку высокометастатического или низкометастатического штамма опухоли LLC. На 9 день после перевивки животных усыпляли и собирали суммарную плазму крови мышей. Суммарная фракция внеклеточной ДНК крови после выделения хранилась при -20°С в фосфатном буфере.C57B1 mice were vaccinated with a high metastatic or low metastatic LLC tumor strain. On the 9th day after the inoculation, the animals were euthanized and the total blood plasma of mice was collected. The total fraction of extracellular blood DNA after isolation was stored at -20 ° C in phosphate buffer.
В эксперименте участвовало 7 групп мышей, привитых низкометастатическим штаммом LLC.The experiment involved 7 groups of mice inoculated with a low metastatic LLC strain.
Группа 1 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC.Group 1-6 mice with a low metastatic LLC strain inoculated.
Группа 2 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC+внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции внеклеточной ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворялись в 500 мкл свежей гепаринизированой крови).A group of 2-6 mice with a grafted low metastatic LLC strain + double intravenous (on the seventh and eighth day after transplantation) administration of the total extracellular DNA fraction of mice with a grafted high metastatic strain (0.05 μg of DNA was dissolved in 500 μl of fresh heparinized blood before administration).
Группа 3 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC+внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей плазмы). Перед введением образец ДНК подвергали фотохимической дезинфекции (добавление 1 мкМ метиленового синего с последующим облучением красным светом в течение 10 минут (~60000 Люкс).A group of 3-6 mice with a grafted low metastatic LLC strain + double intravenous (on the seventh and eighth day after transplantation) administration of the total DNA fraction of mice with a grafted high metastatic strain (0.05 μg of DNA was dissolved in 500 μl of fresh plasma before administration). Before the introduction, the DNA sample was subjected to photochemical disinfection (addition of 1 μM methylene blue, followed by red light exposure for 10 minutes (~ 60,000 Lux).
Группа 4 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC+внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей плазмы). Перед введением образец ДНК смешивали с 10 мкг анти-ДНК антител.A group of 4-6 mice with a grafted low metastatic LLC strain + double intravenous (on the seventh and eighth day after grafting) administration of the total DNA fraction of mice with a grafted high metastatic strain (0.05 μg of DNA was dissolved in 500 μl of fresh plasma before administration). Before administration, the DNA sample was mixed with 10 μg of anti-DNA antibodies.
Группа 5 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей гепаринизированной крови). Перед введением в образец добавляли 1 мкг фрагмента А растительного токсина Рицина и инкубировали 1 час при 37°С. Рицин является представителем семейства RIP (белки, инактивирующие рибосомы) токсинов, широко используемых для создания иммунотоксинов. Кроме способности инактивировать рибосомы, эти белки обладают способностью деаденилировать ДНК. Для реализации токсического эффекта каталитическая единица А токсинов RIP II типа должна быть доставлена в клетку субъединицей В. В отсутствие субъединицы В цепь А не токсична, однако полинуклеотид-аденингликозидазная активность цепи А может быть использована для инактивации ДНК, циркулирующей в плазме.A group of 5-6 mice with a grafted low metastatic LLC strain + intravenous twofold (on the seventh and eighth day after grafting) administration of the total DNA fraction of mice with a grafted high metastatic strain (0.05 μg of DNA was dissolved in 500 μl of fresh heparinized blood before administration). Before introducing into the sample, 1 μg of Ricin plant toxin fragment A was added and incubated for 1 hour at 37 ° C. Ricin is a member of the RIP family (ribosome inactivating proteins) of toxins that are widely used to create immunotoxins. In addition to the ability to inactivate ribosomes, these proteins have the ability to deadenylate DNA. To realize the toxic effect, the catalytic unit A of RIP type II toxins must be delivered to the cell by subunit B. In the absence of subunit B, chain A is not toxic, however, the polynucleotide adeninglycosidase activity of chain A can be used to inactivate DNA circulating in plasma.
Группа 6 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC + внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей гепаринизированой крови). Образец ДНК перед введением подвергался ферментативному метилированию (I.Muiznieks et.al., FEBS Letters, 1994, v.344, pp.251-254).A group of 6-6 mice with a grafted low metastatic LLC strain + intravenous twofold (on the seventh and eighth day after grafting) administration of the total DNA fraction of mice with a grafted high metastatic strain (0.05 μg of DNA was dissolved in 500 μl of fresh heparinized blood before administration). The DNA sample was enzymatically methylated prior to administration (I. Muiznieks et.al., FEBS Letters, 1994, v. 344, pp. 251-254).
Группа 7 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC+внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции внеклеточной ДНК мышей, привитых низкометастатическим штаммом LLC.Group 7 - 6 mice with a low metastatic LLC strain inoculated + double intravenous (on the seventh and eighth day after transplantation) administration of the total extracellular DNA fraction of mice inoculated with a low metastatic LLC strain.
Группа 8 - 6 мышей с привитым низкометастатическим штаммом LLC+внутривенное двукратное (на седьмой и восьмой день после перевивки) введение суммарной фракции ДНК мышей с привитым высокометастатическим штаммом (0,05 мкг ДНК перед введением растворяли в 500 мкл свежей гепаринизированой крови. Образец ДНК перед введением инкубировали в присутствии 100U лигазы 30 минут при 37°С.A group of 8–6 mice with a grafted low metastatic LLC strain + intravenous twofold (on the seventh and eighth day after grafting) administration of the total DNA fraction of mice with a grafted high metastatic strain (0.05 μg DNA was dissolved in 500 μl of fresh heparinized blood before administration. DNA sample before the introduction was incubated in the presence of 100U ligase for 30 minutes at 37 ° C.
Оценивали количество метастатических узлов в легких на 15 день после перевивки.The number of metastatic nodes in the lungs was evaluated on
Результаты эксперимента приведены в таблице 1.The experimental results are shown in table 1.
Таким образом, внеклеточная ДНК крови мышей с высокозлокачественным штаммом опухоли усиливает метастазирование менее злокачественной опухоли. Связывание и модификация внеклеточной ДНК крови препятствуют этому согласно заявляемому способу.Thus, the extracellular DNA of the blood of mice with a high-grade tumor strain enhances the metastasis of a less malignant tumor. The binding and modification of extracellular DNA of the blood prevents this according to the claimed method.
Пример 2. Влияние связывания и модификации на патогенность внеклеточной ДНК больного атеросклерозом и диабетомExample 2. The effect of binding and modification on the pathogenicity of the extracellular DNA of a patient with atherosclerosis and diabetes
Бета-клетки эмбриональной поджелудочной железы человека и эндотелиальные клетки аорты человека использовали для формирования первичной клеточной культуры. Через 24 часа после пассажа в экспериментальных сериях в клеточные культуры добавляли внеклеточную ДНК, выделенную из плазмы больного тяжелой формой диабета 2 типа и системным атеросклерозом (0,0025 мкг ДНК на 1 мл культуральной среды).Human embryonic pancreatic beta cells and human aortic endothelial cells were used to form the primary cell culture. 24 hours after passage in the experimental series, extracellular DNA isolated from the plasma of a patient with
В первой экспериментальной серии дополнительно в культуру добавляли анти-ДНК-антитела в концентрации 5 мкг/мл.In the first experimental series, anti-DNA antibodies were added to the culture at a concentration of 5 μg / ml.
Во второй экспериментальной серии дополнительно в культуру добавляли энзаймосомы в концентрации 20 мкг/мл.In the second experimental series, enzymes in a concentration of 20 μg / ml were additionally added to the culture.
Через 24 часа оценивали содержание жизнеспособных клеток по включению красителя трипанового синего.After 24 hours, the content of viable cells was evaluated by the inclusion of trypan blue dye.
Результаты эксперимента приведены в таблице 2.The experimental results are shown in table 2.
Процентное содержание жизнеспособных клеток через 48 часов после пассирования:The percentage of viable cells 48 hours after passage:
Таким образом, внеклеточная ДНК крови больного тяжелым диабетом II типа и атеросклерозом оказывает негативное воздействие как на здоровые В-клетки поджелудочной железы, так и на здоровые эндотелиальные клетки. Связывание и модификация внеклеточной ДНК крови больного препятствует этому согласно заявляемому способу.Thus, the extracellular DNA of the blood of a patient with severe type II diabetes and atherosclerosis has a negative effect on both healthy pancreatic B cells and healthy endothelial cells. The binding and modification of the extracellular DNA of the patient’s blood prevents this according to the claimed method.
Пример 3. Лечение злокачественной опухоли.Example 3. Treatment of a malignant tumor.
Группа 1 - 7 мышей с привитой карциномой Эрлиха - контроль.Group 1 - 7 mice vaccinated with Ehrlich carcinoma - control.
Группа 2 - 6 мышей с привитой карциномой Эрлиха, получивших на третий день после перевивки опухоли внутривенную инъекцию фракции человеческих анти-ДНК антител по 200 мкг на одно животное.Group 2 - 6 mice vaccinated with Ehrlich carcinoma, received on the third day after transplantation of the tumor an intravenous injection of a fraction of human anti-DNA antibodies of 200 μg per animal.
Группа 3 - 6 мышей с привитой карциномой Эрлиха, получивших на третий день после перевивки опухоли внутривенную инъекцию «энзаймосом» в дозе 700 мкг на одно животное.A group of 3 to 6 mice vaccinated with Ehrlich carcinoma, received on the third day after transplantation of the tumor an intravenous injection of “enzymes” at a dose of 700 mcg per animal.
Эффект определяли по величине опухоли на 7 день после перевивки.The effect was determined by the size of the tumor on
Размер опухоли через 7 дней после перевивки:
Приведенные данные свидетельствуют, что связывание и модификация внеклеточной ДНК крови оказывает противоопухолевый эффект.The data presented indicate that the binding and modification of extracellular blood DNA has an antitumor effect.
Пример 4. Лечение бактериальной и грибковой инфекции.Example 4. Treatment of bacterial and fungal infections.
В эксперименте использовали белых беспородных мышей весом 23-25 грамм.In the experiment used white outbred mice weighing 23-25 grams.
Группа 1 (10 мышей) - мышам вводили в ретроорбитальный синус бактерии патогенного штамма Staphylococcus aureus VT-2003R в дозе 1×1010 бактериальных клеток на мышь. Через 2 часа после инфицирования мышам внутривенно вводили анти-ДНК антитела в дозе 300 мкг/мышь.Group 1 (10 mice) - the mice were injected into the retroorbital sinus with bacteria of the pathogenic strain of Staphylococcus aureus VT-2003R at a dose of 1 × 10 10 bacterial cells per mouse. 2 hours after infection, the anti-DNA antibody was administered intravenously to the mice at a dose of 300 μg / mouse.
Группа 2 (10 мышей) - мышам вводили в ретроорбитальный синус бактерии патогенного штамма Staphylococcus aureus VT-2003R в дозе 1×1010 бактериальных клеток на мышь. Через 2 часа после инфицирования мышам внутривенно вводили энзаймосомы в дозе 1000 мкг/мышь.Group 2 (10 mice) - the mice were injected into the retroorbital sinus with bacteria of the pathogenic strain of Staphylococcus aureus VT-2003R at a dose of 1 × 10 10 bacterial cells per mouse. 2 hours after infection, mice were injected intravenously with enzymesosomes at a dose of 1000 μg / mouse.
Группа 3 (10 мышей) - мышам вводили в ретроорбитальный синус бактерии патогенного штамма Staphylococcus aureus VT-2003R в дозе 1×1010 бактериальных клеток на мышь. Фосфатный буфер вводился внутривенно через 2 часа после инфицирования.Group 3 (10 mice) - mice were injected into the retroorbital sinus with bacteria of the pathogenic strain of Staphylococcus aureus VT-2003R at a dose of 1 × 10 10 bacterial cells per mouse. Phosphate buffer was administered intravenously 2 hours after infection.
Оценивали выживаемость животных через 32 часа после инфицирования.The survival rate of animals was evaluated 32 hours after infection.
Результаты приведены в таблице 4.The results are shown in table 4.
Выживаемость мышей в различные сроки после инфицирования:The survival of mice at different times after infection:
Группа 4 (10 мышей) - мышам вводили внутривенно грибы, субкультивированные из патогенного клинического изолята Candida Albicans в дозе LD50. На третий день после инфицирования мышам внутривенно вводили анти-ДНК антитела в дозе 300 мкг/мышь.Group 4 (10 mice) - mice were injected intravenously with fungi subcultured from a pathogenic clinical isolate of Candida Albicans at a dose of LD50. On the third day after infection, 300 μg / mouse anti-DNA antibodies were intravenously administered to mice.
Группа 5 (10 мышей) - мышам вводили внутривенно грибы, субкультивированные из патогенного клинического изолята Candida Albicans в дозе LD50. Мышам внутривенно вводили энзаймосомы в дозе 1000 мкг/ мышь на 3 день после инфицирования.Group 5 (10 mice) - mice were injected intravenously with fungi subcultured from a pathogenic clinical isolate of Candida Albicans at a dose of LD50. Enzyosomes were administered intravenously to mice at a dose of 1000 μg /
Группа 6 (10 мышей) - мышам вводили внутривенно грибы, субкультивированные из патогенного клинического изолята Candida Albicans в дозе LD50. В качестве негативного контроля вводился фосфатный буфер внутривенно на 3 день после инфицирования.Group 6 (10 mice) - mice were injected intravenously with fungi subcultured from a pathogenic clinical isolate of Candida Albicans at a dose of LD50. As a negative control, phosphate buffer was administered intravenously 3 days after infection.
Оценивали выживаемость и массу мышей на 7 день после инфицирования.The survival and weight of the mice were evaluated on
Результаты приведены в таблице 5.The results are shown in table 5.
Выживаемость мышей в различные сроки после инфицирования:The survival of mice at different times after infection:
Таким образом, связывание и модификация внеклеточной ДНК крови инфицированных животных оказывает лечебный эффект как при бактериальной, так и при грибковой инфекции.Thus, the binding and modification of the extracellular DNA of the blood of infected animals has a therapeutic effect in both bacterial and fungal infections.
Пример 5. Лечение аутоиммунного заболевания.Example 5. Treatment of an autoimmune disease.
30 мышей С57В1 иммунизировали суспензией Mycobacterium Smegmatis (100 мкг антигена в 50 мкл алюминиевых квасцов) подкожно в подушечку лапы. Через 4 недели в подушечку противоположной лапы мышам вводили разрешающую дозу антигена (50 мкг).30 C57B1 mice were immunized with a suspension of Mycobacterium Smegmatis (100 μg antigen in 50 μl aluminum alum) subcutaneously in the paw pad. After 4 weeks, a resolving dose of antigen (50 μg) was injected into the mice of the opposite paw.
Мышам первой группы (10 мышей) за 30 минут до введения разрешающей дозы вводили анти-ДНК антитела внутривенно в дозе 200 мкг на мышь.The mice of the first group (10 mice) were injected anti-DNA antibodies intravenously at a dose of 200 μg per
Мышам второй группы (10 мышей) за 30 минут до введения разрешающей дозы внутривенно вводили энзаймосомы в дозе 750 мкг на мышь.Mice of the second group (10 mice) 30 minutes before the administration of the resolving dose were given intravenous enzymes at a dose of 750 μg per mouse.
Мышам контрольной группы (10 мышей) за 30 минут до введения разрешающей дозы внутривенно вводили фосфатный буфер.Mice in the control group (10 mice) were injected with
Оценивали интенсивность отека лапы через 1, 2, 5 и 24 часа после введения разрешающей дозы антигена.The intensity of paw edema was evaluated at 1, 2, 5, and 24 hours after the administration of the resolving dose of antigen.
Результаты приведены в таблице 6.The results are shown in table 6.
Интенсивность отека лапы в разные сроки после введения разрешающей дозы антигена.The intensity of paw edema at different times after the introduction of a resolving dose of antigen.
Таким образом, связывание и модификация внеклеточной ДНК крови оказывает подавляющий эффект на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа.Thus, the binding and modification of extracellular blood DNA has an inhibitory effect on the development of a delayed-type hypersensitivity reaction.
Пример 6. Лечение аутоиммунного диабета и злокачественных опухолей.Example 6. Treatment of autoimmune diabetes and malignant tumors.
В эксперименте использовали 20 самок мышей линии NOD и 20 самок мышей линии С3Н.In the experiment, 20 female NOD mice and 20 female C3H mice were used.
Диабет у NOD мышей возникает вследствие развития аутоиммунного поражения в-клеток поджелудочной железы. Мыши первой группы (10 самок линии NOD) получили внутривенные инъекцию фракции мышиных антиG-f актин антител (Calbiochem) по 200 мкг на мышь в возрасте 6, 7, 8, 9 и 10 недель. 10 мышей контрольной третьей группы получали инъекции фосфатного буфера с 6 по 10 неделю. Начиная с 15 недели раз в три дня измеряли уровень глюкозы в крови мышей. В случае, если уровень глюкозы превышал 250 мг/дл при двух последующих измерениях, констатировалось наличие диабета. Оценивали количество заболевших к 15, 18, 24 и 28 неделе мышей.Diabetes in NOD mice occurs due to the development of autoimmune damage to pancreatic b cells. Mice of the first group (10 females of the NOD line) received an intravenous injection of a fraction of mouse anti-G-f actin antibodies (Calbiochem) at 200 μg per mouse at the age of 6, 7, 8, 9, and 10 weeks. 10 mice of the control third group received injections of phosphate buffer from 6 to 10 weeks. Starting from
Результаты приведены в таблице 7.The results are shown in table 7.
Соотношение здоровых и больных мышей (Первая цифра - число здоровых животных в группе; вторая цифра - число больных животных в группе):The ratio of healthy and sick mice (The first digit is the number of healthy animals in the group; the second digit is the number of sick animals in the group):
Опухоли индуцировали путем внутрикожной инъекции 3-метилхолантрена (1 мг 3-метилхолантрена, растворенного в 50 мкл оливкового масла, на мышь) в 4-х-недельном возрасте. Оценивали количество мышей с развившимися опухолями на 10 неделе после введения канцерогена.Tumors were induced by intradermal injection of 3-methylcholanthrene (1 mg of 3-methylcholanthrene dissolved in 50 μl of olive oil per mouse) at 4 weeks of age. The number of mice with developing tumors was estimated at 10 weeks after carcinogen administration.
Мыши третьей группы (10 самок линии С3Н) получили внутривенные инъекции фракции мышиных анти G-f актин антител по 200 мкг на мышь в возрасте 5, 6, 7, 8, 9 и 10 недель.Mice of the third group (10 females of the C3H line) received intravenous injections of a 200 μg mouse anti-G-f actin antibody fraction per mouse at 5, 6, 7, 8, 9, and 10 weeks old.
Мыши четвертой группы (10 самок линии СЗН) получали внутривенные инъекции фосфатного буфера в возрасте 5, 6, 7, 8, 9 и 10 недель.Mice of the fourth group (10 females of the SZN line) received intravenous injections of phosphate buffer at the age of 5, 6, 7, 8, 9, and 10 weeks.
Определяли наличие опухолей у животных в возрасте 14 недель. Результаты приведены в таблице 8.The presence of tumors in animals at the age of 14 weeks was determined. The results are shown in table 8.
Соотношение здоровых и больных мышей (Первая цифра - число здоровых животных в группе; вторая цифра - число больных животных в группе):The ratio of healthy and sick mice (The first digit is the number of healthy animals in the group; the second digit is the number of sick animals in the group):
Таким образом, подавление активности собственных ингибиторов эндогенной ДНКазы I оказывает лечебный эффект при развитии аутоиммунного диабета и рака.Thus, suppressing the activity of intrinsic inhibitors of endogenous DNase I has a therapeutic effect in the development of autoimmune diabetes and cancer.
Пример 7. Подавление распространения мутантного гена. Ряд заболеваний человека возникают вследствие развития состояния соматического мозаицизма - экспансии мутантного гена в популяции соматических клеток (Youssoufian H, Pyeritz RE. Mechanisms and Consequences of Somatic Mosaicism in Humans. Nature Reviews Genetics 2002; 3:748-758).Example 7. Suppression of the spread of a mutant gene. A number of human diseases arise due to the development of the state of somatic mosaicism - expansion of a mutant gene in a population of somatic cells (Youssoufian H, Pyeritz RE. Mechanisms and Consequences of Somatic Mosaicism in Humans. Nature Reviews Genetics 2002; 3: 748-758).
В качестве модели развития соматического мозаицизма была изучена частота мутаций гена HPRT в Т-лимфоцитах крови. Человеческий HPRT ген (Хромосома Xq26) кодирует конститутивно экспрессируемый, но не эссенциальный фермент, вовлеченный метаболизм пуриновых оснований. Клонирование проводили по методике, описанной Bigbee W (Bigbee W. Et al., Mutation Res., 1998, v.397, pp.119-136). Клонированию подвергались лимфоциты периферической крови 8 больных, получавших курс трехнедельной иммуностимулирующей терапии препаратом Неовир после хирургического удаления опухоли. Из 8 больных 4 пациента дополнительно получали терапию человеческой рекомбинантной ДНКазой I (Genetech) (200 мкг/кг внутривенно, 4 раза в сутки в течение 3 недель). Частота встречаемости HPRT-дефицитных клонов в крови больных, получавших терапию ДНКазой I, в среднем была в 3 раза ниже таковой в крови больных, получавших только иммуностимулирующую терапию. Добавление внеклеточной ДНК крови больных, не получавших ДНКазу, в культуральную среду при клонировании Т-лимфоцитов больных, получавших терапию ДНКазой, повышает частоту встречаемости HPRT-дефицитных клонов при клонировании последних. Преинкубация внеклеточной ДНК крови больных, не получавших ДНКазу с анти-ДНК антителами или с энзаймосомами (0,1 мкг антител или 5 мкг энзаймосом на 0,1 мкг ДНК в 1 мл плазмы 30 минут при 37°С), перед добавлением в культуральную среду при клонировании лишает ее способности повышать частоту встречаемости HPRT-дефицитных клонов.As a model for the development of somatic mosaicism, the mutation frequency of the HPRT gene in blood T-lymphocytes was studied. The human HPRT gene (Chromosome Xq26) encodes a constitutively expressed but not essential enzyme involved in the metabolism of purine bases. Cloning was performed according to the method described by Bigbee W (Bigbee W. Et al., Mutation Res., 1998, v.397, pp. 119-136). The peripheral blood lymphocytes were cloned in 8 patients who received a course of three-week immunostimulating therapy with Neovir after surgical removal of the tumor. Of 8 patients, 4 patients additionally received human recombinant DNase I (Genetech) therapy (200 μg / kg intravenously, 4 times a day for 3 weeks). The frequency of occurrence of HPRT-deficient clones in the blood of patients receiving DNase I therapy was on average 3 times lower than that in the blood of patients receiving only immunostimulating therapy. The addition of extracellular DNA from the blood of patients who did not receive DNase into the culture medium during the cloning of T-lymphocytes of patients treated with DNase increases the frequency of occurrence of HPRT-deficient clones during cloning of the latter. Pre-incubation of extracellular DNA of blood of patients who did not receive DNase with anti-DNA antibodies or with enzymes (0.1 μg of antibodies or 5 μg of enzymes per 0.1 μg of DNA in 1 ml of plasma for 30 minutes at 37 ° C), before being added to the culture medium when cloned, deprives her of the ability to increase the frequency of occurrence of HPRT-deficient clones.
Таким образом, связывание и модификация внеклеточной ДНК крови снижает частоту встречаемости мутантного гена в клеточной популяции и препятствует развитию соматического мозаицизма.Thus, the binding and modification of extracellular blood DNA reduces the frequency of the mutant gene in the cell population and prevents the development of somatic mosaicism.
Пример 8. Лечение болезни Маркиафавы-МикелиExample 8. The treatment of the disease of Markiafava-Mikeli
Болезнь Маркиафавы - Микели очень редкое заболевание, связанное с наличием соматической генной мутации в локусе гена PI (phosphatidyl glycan class А). Больная О., 17 лет, страдает данным заболевание в течение 3 лет. В течение последних 2 лет заболевание удавалось компенсировать приемом глюкокортикостероидных гормонов. В течение последнего года вновь появились и стали интенсивно прогрессировать симптомы заболевания: эпизоды гемолиза (2-3 раза в месяц), гемоглобинурии, гепатоспленомегалия, макроцитоз, анизоцитоз. Было произведено 4 гемотрансфузии. Четыре месяца назад у больной развился эпизод острой почечной недостаточности (креатинин - 8, 2 мг\дл) вследствие интенсивного эпизода внутрисосудистого гемолиза на фоне перенесенной гнойной ангины. В течение недели больной проводились процедуры гемодиализа. После компенсации функции почек с согласия больной ей были прописаны еженедельные инфузии человеческих донорских связывающих ДНК антител, выделенных у больных системной красной волчанкой, в разовой дозе 500 мг (1, 2, 3 и 4 недели). В течение этого месяца наблюдался только один пароксизм заболевания (2 неделя) значительно меньшей интенсивности, чем предыдущий. Криз был легко купирован трехдневным курсом преднизолона в дозе 50 мг в сутки. На 5 неделе больной были прописаны ежедневные однократные внутримышечные инъекции ДНКазы I в дозе 2000000 Ед. Кунца в сутки. В течение последующих трех месяцев наблюдения у больной нормализовалась формула крови, исчезла желтушность и гепатоспленомегалия. Пароксизмы заболевания не повторялись (фиг.1).Markiafava disease - Mikeli is a very rare disease associated with the presence of a somatic gene mutation at the PI gene locus (phosphatidyl glycan class A). Patient O., 17 years old, suffers from this disease for 3 years. Over the past 2 years, the disease has been able to compensate for the use of glucocorticosteroid hormones. Over the past year, the symptoms of the disease reappeared and began to intensify: episodes of hemolysis (2-3 times a month), hemoglobinuria, hepatosplenomegaly, macrocytosis, anisocytosis. 4 blood transfusions were performed. Four months ago, the patient developed an episode of acute renal failure (creatinine - 8, 2 mg / dl) due to an intense episode of intravascular hemolysis against a background of purulent tonsillitis. Within a week, the patient underwent hemodialysis procedures. After compensating for kidney function, with the patient's consent, she was prescribed weekly infusions of human donor DNA-binding antibodies isolated in patients with systemic lupus erythematosus in a single dose of 500 mg (1, 2, 3 and 4 weeks). During this month, there was only one disease paroxysm (2 weeks) of significantly lower intensity than the previous one. The crisis was easily stopped by a three-day course of prednisone at a dose of 50 mg per day. At
Пример 9. Лечение сахарного диабетаExample 9. Treatment of diabetes
В исследование включено 2 больных (Больной Ш. и больной И.) с тяжелым инсулин-зависимым сахарным диабетом, с высокой суточной потребностью в инсулине и отсутствием адекватного контроля гликемии, что проявлялось в частых эпизодах гипергликемии. У больного Ш отмечались жалобы на боли за грудиной, слюнотечение, отрыжку и изжогу, не отвечавшие на стандартную антацидную терапию (париет 0,01 г\сутки). При фиброгастродуоденоскопии выявлен кандидоз дистального отдела пищевода.The study included 2 patients (Patient Sh. And Patient I.) with severe insulin-dependent diabetes mellitus, with a high daily requirement for insulin and a lack of adequate glycemic control, which manifested itself in frequent episodes of hyperglycemia. Patient III noted complaints of pain behind the sternum, salivation, belching and heartburn, which did not respond to standard antacid therapy (soars 0.01 g / day). When fibrogastroduodenoscopy revealed candidiasis of the distal esophagus.
Больным вводили препарат иммуноглобулина, полученный путем фракционирования плазмы здоровых доноров-добровольцев, 3-кратно иммунизированных ранее ДНК тимуса теленка. Препарат вводился внутривенно 1 раз в неделю в количестве 1000 мг. Всего было осуществлено 4 введения препарата. Вычисляли суточную потребность в инсулине (как показатель активности основного заболевания) и количество еженедельных эпизодов гипергликемии (уровень глюкозы крови контролировался приборным методом 5 раз в день).Patients were injected with an immunoglobulin preparation obtained by fractionating the plasma of
Результаты исследования приведены в таблице 9.The results of the study are shown in table 9.
Эффект лечения анти-ДНК антителами на течение инсулин-зависимого сахарного диабета.The effect of anti-DNA antibody treatment on the course of insulin-dependent diabetes mellitus.
К концу исследования больной Ш отметил полное исчезновение жалоб на диспептические явления. При повторной фиброгастроскопии признаков кандидозного поражения пищевода не выявлено.By the end of the study, patient III noted the complete disappearance of complaints of dyspeptic phenomena. With repeated fibrogastroscopy, no signs of esophageal candidiasis were detected.
Пример 10. Лечение злокачественной опухоли.Example 10. Treatment of a malignant tumor.
В январе 2004 года в клинике торакальной хирургии двум больным (мужчина в возрасте 57 лет и женщина в возрасте 55 лет) с диагнозом рака легкого в стадии T4N2M+ были произведены паллиативные операции удаления пораженного легкого. Все больные ранее получали химиотерапевтическое и лучевое лечение. После операции больным с их согласия была проведена процедура мобилизации стволовых клеток периферической крови (ГМ-КСФ по 5 мкг\кг подкожно трехкратно в течение 3 суток) с последующим выделением стволовых клеток методом цитафереза на аппарате Haemonetic. Выделенные клетки были подвергнуты трансфекции кДНК гена человеческой дорназы-альфа (Дезоксирибонуклеазы I) методом катионных липосом и введены больным внутривенно в количестве 50000000 клеток. Процедура была повторена через 3, 6 и 9 месяцев. К настоящему моменту (срок наблюдения -14 месяцев, контрольные обследования через каждые 3 месяца) ни у одного из наблюдаемых больных не обнаружено признаков прогрессирования заболевания. В то же время данные ретроспективного контроля свидетельствуют о том, что вероятность развития рецидива к данному сроку и у подобных больных приближается к 100%. На чертеже приведены сведения о содержании внеклеточной ДНК крови больных до начала лечения и в период осуществления лечения по заявляемому способу (фиг.2).In January 2004, in a clinic for thoracic surgery, two patients (a man aged 57 years old and a woman aged 55 years old) with a diagnosis of lung cancer in the T4N2M + stage underwent palliative surgery to remove the affected lung. All patients previously received chemotherapy and radiation treatment. After surgery, patients with their consent underwent a procedure for the mobilization of peripheral blood stem cells (GM-CSF of 5 μg / kg subcutaneously three times within 3 days), followed by stem cell isolation by cytapheresis on a Haemonetic apparatus. The isolated cells were transfected with cDNA of the human dornase-alpha gene (Deoxyribonuclease I) by cationic liposomes and 50,000,000 cells were injected intravenously. The procedure was repeated after 3, 6 and 9 months. To date (observation period -14 months, follow-up examinations every 3 months), none of the observed patients showed signs of disease progression. At the same time, the data of retrospective control indicate that the likelihood of developing a relapse by this time and in such patients is approaching 100%. The drawing shows information about the content of extracellular DNA of the blood of patients before treatment and during treatment by the present method (figure 2).
Пример 11. Лечение малярииExample 11. The treatment of malaria
Больная Д. 49 лет, поступила в стационар на 20 день от начала заболевания с жалобами на повышение температуры до 40-41°С, потрясающий озноб в утренние и дневные часы, повторяющийся через 48 часов, длительностью 2,5-3 часа, сменяющийся на жар в течение 4 часов, без потливости, слабость, интенсивную диффузную головную боль, плохой аппетит, прерывистый сон. 2 месяца назад приехала из Индии, где проводила отпуск. При микроскопии крови обнаружены Plasmodium Vivax (3-5 в поле зрения). Больной были прописаны Делагил в курсовой дозе 2,5 г и Примаквин по 0,015 г в день в курсовой дозе 0.2 г. На четвертый день от начала лечения при микроскопии в крови сохранялся Plasmodium Vivax, сохранялись приступы лихорадки и гепатоспленомегалия. С согласия больной ей были осуществлены внутрикожные инъекции ДНК из тимуса теленка, смешанной с неполным адъювантом Фрейнда (50 мг\50 мг). Всего 3 инъекции с интервалом 48 часов. В течение 2-х недель осуществлялось симптоматическое лечение. Через 2 недели был назначен повторный курс Делагила, по завершении которого наблюдались санация крови от паразита, исчезновение приступов лихорадки и нормализация самочувствия.Patient D., 49 years old, was admitted to the hospital on the 20th day from the onset of the disease with complaints of fever up to 40-41 ° C, tremendous chills in the morning and afternoon, repeated after 48 hours, lasting 2.5-3 hours, changing to fever for 4 hours, without sweating, weakness, intense diffuse headache, poor appetite, intermittent sleep. 2 months ago I came from India, where I spent my vacation. Microscopy revealed Plasmodium Vivax (3-5 in the field of view). The patient was prescribed Delagil at a course dose of 2.5 g and Primakvin at 0.015 g per day at a course dose of 0.2 g. On the fourth day from the start of treatment with microscopy, Plasmodium Vivax remained in the blood, fever attacks and hepatosplenomegaly persisted. With the patient’s consent, she received intradermal injections of DNA from a calf thymus mixed with Freund’s incomplete adjuvant (50 mg / 50 mg). Only 3 injections with an interval of 48 hours. Symptomatic treatment was carried out for 2 weeks. After 2 weeks, a repeated course of Delagil was prescribed, at the end of which there was a sanation of blood from the parasite, the disappearance of fever attacks and normalization of well-being.
В таблице приведены сведения о содержании внеклеточной ДНК крови больной и титре анти-ДНК антител в процессе лечения.The table shows information about the content of extracellular DNA of the patient’s blood and the titer of anti-DNA antibodies in the course of treatment.
(День 0 - при поступлении в стационар)(Day 0 - upon admission to the hospital)
в ДНК крови нг\млDays from the start of treatment
in blood DNA
Пример 12. Лечение сепсиса.Example 12. The treatment of sepsis.
Больной 32 лет доставлен в больницу через 80 часов от начала заболевания с диагнозом острый аппендицит. При осмотре состояние тяжелое, заторможен. Кожа и слизистые бледные. Частота дыхания 25 в минуту. Пульс - 142 уд. в минуту, слабого наполнения, неритмичный. ЦВД отрицательное. АД 70/50 мм рт.ст. Тоны сердца глухие. Живот равномерно вздут, не участвует в акте дыхания. Положительные симптомы раздражения брюшины, перистальтика кишечника отсутствует. Диурез резко снижен. В анализах крови токсические изменения. Больной оперирован по экстренным показаниям. При вскрытии брюшной полости - гангренозный, прободной аппендицит, разлитой гнойный перитонит. Произведена аппенэктомия, санация и дренирование брюшной полости, назогастроинтестинальная интубация. В послеоперационном периоде развился инфекционно-токсический шок. Больному начали проводить антибактериальную терапию: цефепим 100 мг/кг/сут в/в, ванкомицин 60 мг/кг/сут в/в, офлоксацин 20 мг/кг/сут в/в. Поскольку характер изменений в брюшной области не позволял исключить наличие аэробно-анаэробной ассоциации возбудителей, было начато в/в введение метронидазола в дозе 22,5 мг/кг/сут.A 32-year-old patient was admitted to the hospital 80 hours after the onset of the disease with a diagnosis of acute appendicitis. On examination, the condition is serious, inhibited. The skin and mucous membranes are pale.
Несмотря на проводимое лечение состояние больного продолжало ухудшаться, сохранялись и нарастали проявления интоксикации и дыхательной недостаточности; гипертермия, азотемия.Despite the treatment, the patient's condition continued to deteriorate, intoxication and respiratory failure persisted and increased; hyperthermia, azotemia.
С учетом тяжести состояния больного и отсутствия реакции на антибактериальную терапию было решено провести гемосорбцию с применением сорбента, содержащего иммобилизованный фермент метилазу. Через 18 часов после хирургического вмешательства проведено 6 гемосорбций с интервалом в 6 часов. Состояние больного после первой гемосорбции несколько улучшилось. Исчезли явления энцефалопатии, снизилась температура тела до 37,3 С, уменьшилась тахикардия, частота дыханий, появилась вялая перистальтика. В анализах крови сохранялся лейкоцитоз с нейтрофильным сдвигом влево, гипопротеинемия с гипоальбуминемией. Отмечено достоверное снижение уровня мочевины.Given the severity of the patient’s condition and the lack of response to antibiotic therapy, it was decided to carry out hemosorption using a sorbent containing an immobilized enzyme methylase. 18 hours after surgery, 6 hemosorption was performed with an interval of 6 hours. The patient’s condition after the first hemosorption improved slightly. The phenomena of encephalopathy disappeared, body temperature decreased to 37.3 C, tachycardia, respiratory rate decreased, and flaccid peristalsis appeared. In blood tests, leukocytosis with a neutrophilic shift to the left, hypoproteinemia with hypoalbuminemia, persisted. A significant decrease in the level of urea was noted.
После проведения повторных процедур состояние больного улучшалось. Стабилизировалась гемодинамика. После 3-й гемосорбции появилась активная перистальтика, был стул. Нормализовался диурез. Отмечена постепенная нормализация общего анализа крови, мочевины, констатировано также увеличение концентрации общего белка и альбумина плазмы крови. Поведение комплексной терапии по описанной схеме привело к быстрой инволюции воспалительного процесса в брюшной полости, восстановлению функций паренхиматозных органов и гомеостаза. Через 3 суток после начала лечения больной в удовлетворительном состоянии был переведен в хирургическое отделение.After repeated procedures, the patient's condition improved. Hemodynamics stabilized. After the 3rd hemosorption, active peristalsis appeared, there was a stool. Normalized diuresis. A gradual normalization of the general analysis of blood and urea was noted, and an increase in the concentration of total protein and albumin in blood plasma was also noted. The behavior of complex therapy according to the described scheme led to a rapid involution of the inflammatory process in the abdominal cavity, restoration of the functions of parenchymal organs and homeostasis. 3 days after the start of treatment, the patient in satisfactory condition was transferred to the surgical department.
На 20-е сутки выписан на амбулаторное лечениеOn the 20th day I was discharged for outpatient treatment
Уровень метилирования внеклеточной ДНК крови измеряли по методике J.Worm (In-Tube DNA Methylation Profiling by Fluorescence Melting Curve Analysis Clinical Chemistry 47: 1183-1189, 2001).The level of methylation of extracellular blood DNA was measured according to the method J. Worm (In-Tube DNA Methylation Profiling by Fluorescence Melting Curve Analysis Clinical Chemistry 47: 1183-1189, 2001).
Результаты представлены на фиг.3.The results are presented in figure 3.
Выявляется значительно более высокий уровень метилирования внеклеточной ДНК крови после начала лечения по заявляемому способу.A significantly higher level of methylation of extracellular blood DNA is detected after the start of treatment according to the claimed method.
Пример 13. Лечение атеросклерозаExample 13. The treatment of atherosclerosis
Пациентка А., 32 лет, с диагнозом наследственной гиперхолестеринемии, перенесла инфаркт миокарда в 24 года, страдает стенокардией напряжения 2-3 функционального класса, находится на инвалидности. На фоне диеты, приема 40 мг ловастатина и холестирамина уровень общего холестерина 450 мг %. Содержание внеклеточной ДНК крови - 64 нг\мл. По данным ВЭМ - проба положительная, депрессия сегмента СТ. По данным коронарографии в 2-х коронарных артериях 3 стеноза 60, 60 и 70%. Больной начали вводить препарат иммуноглобулина, полученный путем фракционирования плазмы здоровых доноров-добровольцев, 3-кратно иммунизированных ранее ДНК тимуса теленка. Препарат вводился внутривенно 1 раз в неделю в количестве 1000 мг. Всего было осуществлено 20 введений препарата. К моменту окончания лечения по заявляемому способу отмечена регрессия ксантом, эпизодов стенокардии нет. Уровень общего холестерина около 160 мг %, содержание внеклеточной ДНК крови - 12 нг\мл. По данным велоэргометрии - проба отрицательная, депрессии сегмента СТ нет. По данным ангиографии отмечено снижение степени стенозирования коронарных артерий (40, 40 и 30%) и отсутствие новых стенозов. Самочувствие пациентки удовлетворительное.Patient A., 32 years old, with a diagnosis of hereditary hypercholesterolemia, suffered myocardial infarction at 24 years old, suffers from angina pectoris of 2-3 functional class, is in disability. Against the background of a diet, taking 40 mg of lovastatin and cholestyramine, the level of total cholesterol is 450 mg%. The content of extracellular blood DNA is 64 ng / ml. According to VEM, the test is positive, depression of the ST segment. According to coronary angiography in 2
Пример 14. Лечение системной красной волчанкиExample 14. Treatment of systemic lupus erythematosus
В исследование было включено 4 пациента с установленным диагнозом системной красной волчанки и лабораторными симптомами гломерулонефрита (протеинурия, микрогематурия). Все пациенты получали стандартную терапию (Нестероидные противовоспалительные средства, хлороквин и ежедневные капельные инфузии 6% раствора DEAE-декстрана (400 мл 6% раствора) на протяжении 15 суток. Изучали концентрацию ДНК в плазме крови до начала лечения и после его окончания. Оценивали состояние больных по шкале SLAM (Sustemic Lupus Activity Measure). Содержание ДНК в плазме у больных снизилось на 50% по окончании 15-дневного курса лечения. Активность заболевания у 4 контрольных больных, получавших только стандартную терапию, снизилась на 20% (среднее значение до начала терапии - 9,7; после окончания терапии - 7,2). Активность заболевания у больных, получавших терапию DEAE-декстраном, снизилась на 40% (среднее значение до начала терапии - 9,2; после окончания терапии - 5,3).The study included 4 patients with an established diagnosis of systemic lupus erythematosus and laboratory symptoms of glomerulonephritis (proteinuria, microhematuria). All patients received standard therapy (non-steroidal anti-inflammatory drugs, chloroquine and daily drip infusions of 6% DEAE-dextran solution (400 ml of 6% solution) for 15 days. We studied the concentration of DNA in the blood plasma before and after treatment. Patients were evaluated. according to the SLAM (Sustemic Lupus Activity Measure) scale. The plasma DNA content in patients decreased by 50% at the end of the 15-day course of treatment. The disease activity in 4 control patients who received only standard therapy decreased by 20% (average value about the beginning of therapy - 9.7; after the end of therapy - 7.2). The disease activity in patients receiving DEAE-dextran therapy decreased by 40% (the average value before therapy was 9.2; after the end of therapy - 5.3 )
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004108059/14A RU2267329C2 (en) | 2004-03-12 | 2004-03-12 | Method for treating diseases accompanied with alterations of qualitative and/or quantitative composition of blood extra-cellular dna (variants) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004108059/14A RU2267329C2 (en) | 2004-03-12 | 2004-03-12 | Method for treating diseases accompanied with alterations of qualitative and/or quantitative composition of blood extra-cellular dna (variants) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004108059A RU2004108059A (en) | 2005-09-27 |
| RU2267329C2 true RU2267329C2 (en) | 2006-01-10 |
Family
ID=35849665
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004108059/14A RU2267329C2 (en) | 2004-03-12 | 2004-03-12 | Method for treating diseases accompanied with alterations of qualitative and/or quantitative composition of blood extra-cellular dna (variants) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2267329C2 (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8388951B2 (en) | 2003-07-14 | 2013-03-05 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic DNA mutation disease |
| US8431123B2 (en) | 2003-07-14 | 2013-04-30 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic bacterial, fungal and protozoan infection |
| US8710012B2 (en) | 2003-07-14 | 2014-04-29 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating oncological diseases |
| US8871200B2 (en) | 2006-11-28 | 2014-10-28 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating human diseases associated with an increased deoxyribonucleic acid content in extracellular spaces of tissues and a medicinal preparation for carrying out said method |
| US8916151B2 (en) | 2005-04-25 | 2014-12-23 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating a reduction of fertility |
| US10617743B2 (en) | 2014-06-19 | 2020-04-14 | Cls Therapeutics Limited | Method to improve safety and efficacy of anti-cancer therapy |
| US11701410B2 (en) | 2015-05-22 | 2023-07-18 | Cls Therapeutics Limited | Extracellular DNA as a therapeutic target in neurodegeneration |
| US11905522B2 (en) | 2018-01-16 | 2024-02-20 | Cls Therapeutics Limited | Treatment of diseases by liver expression of an enzyme which has a deoxyribonuclease (DNase) activity |
-
2004
- 2004-03-12 RU RU2004108059/14A patent/RU2267329C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| c.19, 26-27, 33-34 (из 36 с). * |
| весь документ. KRAPF F. et al. The estimation of circulating immune complexes, C3d, and antids-DNA-antibody serum levels in the monitoring of therapeutic plasmapheresis in a patient with systemic lupus erythematosus. A case report// Clin. Exp. Rheumatol. 1985 Apr-Jun; 3(2): 159-62, abstr. PubMed (на сайте http://www.pubmed.com). RAZ E. et al. Anti-DNA antibodies bind directly to renal antigens and induce kidney dysfunction in th isolated perfused rat kidney// J Immunol. 1989 May 1; 142(9):3076-82, abstr. PubMed, там же ГЛУХОВ Б.М. Значение нуклеаз в патогенезе нейровирусных заболеваний: Автореф.дисс. д.м.н. Новосибирск, 1996, с.15-16, 21-26. * |
| пп.2, 5, 6, 7, 10, 12 формулы, описание - ч. 1 с.2-6, а также примеры 3 (Б), 8, 17, 18. * |
| формула, с.1-2 описания. * |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9463223B2 (en) | 2003-07-14 | 2016-10-11 | Cls Therapeutics Limited | Method for monitoring development of somatic mosaicism |
| US9248166B2 (en) | 2003-07-14 | 2016-02-02 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating oncological diseases |
| US8535663B2 (en) | 2003-07-14 | 2013-09-17 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating delayed-type hypersensitivity |
| US8710012B2 (en) | 2003-07-14 | 2014-04-29 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating oncological diseases |
| US8796004B2 (en) | 2003-07-14 | 2014-08-05 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic DNA mutation disease |
| US9845461B2 (en) | 2003-07-14 | 2017-12-19 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating oncological diseases |
| US8431123B2 (en) | 2003-07-14 | 2013-04-30 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic bacterial, fungal and protozoan infection |
| US9072733B2 (en) | 2003-07-14 | 2015-07-07 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic bacterial, fungal and protozoan infection |
| US9770492B2 (en) | 2003-07-14 | 2017-09-26 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic DNA mutation disease |
| US8388951B2 (en) | 2003-07-14 | 2013-03-05 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic DNA mutation disease |
| US8916151B2 (en) | 2005-04-25 | 2014-12-23 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating a reduction of fertility |
| US8871200B2 (en) | 2006-11-28 | 2014-10-28 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating human diseases associated with an increased deoxyribonucleic acid content in extracellular spaces of tissues and a medicinal preparation for carrying out said method |
| US10617743B2 (en) | 2014-06-19 | 2020-04-14 | Cls Therapeutics Limited | Method to improve safety and efficacy of anti-cancer therapy |
| US11701410B2 (en) | 2015-05-22 | 2023-07-18 | Cls Therapeutics Limited | Extracellular DNA as a therapeutic target in neurodegeneration |
| US11905522B2 (en) | 2018-01-16 | 2024-02-20 | Cls Therapeutics Limited | Treatment of diseases by liver expression of an enzyme which has a deoxyribonuclease (DNase) activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004108059A (en) | 2005-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cohen et al. | Fungal infection in chronic granulomatous disease: the importance of the phagocyte in defense against fungi | |
| Klausner et al. | A trial of levofloxacin 750 mg once daily for 5 days versus ciprofloxacin 400 mg and/or 500 mg twice daily for 10 days in the treatment of acute pyelonephritis | |
| Plumet et al. | Bacteriophage therapy for Staphylococcus aureus infections: a review of animal models, treatments, and clinical trials | |
| Sookpranee et al. | Multicenter prospective randomized trial comparing ceftazidime plus co-trimoxazole with chloramphenicol plus doxycycline and co-trimoxazole for treatment of severe melioidosis | |
| US8916151B2 (en) | Method for treating a reduction of fertility | |
| US10201537B2 (en) | Use of levocetirizine and montelukast in the treatment of autoimmune disorders | |
| Wong et al. | Vancomycin hypersensitivity: synergism with narcotics and" desensitization" by a rapid continuous intravenous protocol | |
| KR20070069220A (en) | Use of antifungal agents for the topical treatment of fungus-induced mucositis | |
| Voulgari et al. | Infliximab therapy in established rheumatoid arthritis: an observational study | |
| CN102215858A (en) | Methods of treatment using single doses of oritavancin | |
| RU2267329C2 (en) | Method for treating diseases accompanied with alterations of qualitative and/or quantitative composition of blood extra-cellular dna (variants) | |
| Tanphaichitra | Tropical disease in the immunocompromised host: melioidosis and pythiosis | |
| JP2002523437A (en) | Methods for treating staphylococcal diseases | |
| RU2403071C1 (en) | Method of treating chronic recurring inflammatory diseases of nasal cavity and paranasal sinises by method of endonasal autolymphocyto therapy | |
| RU2269358C2 (en) | Method for treatment of generalized infections mordibidized by bacteria or fungi and protozoa, or arteriosclerosis, or diabetes mellitus, or diseases mediated by delayed hyperresponsiveness reaction, or diseases mediated by somatic cell gene mutations | |
| RU2269359C2 (en) | Method for prophylaxis of oncological diseases, or infections mordibidized by bacteria or fungi and protozoa, or arteriosclerosis, or diabetes mellitus, or diseases mediated by delayed hyperresponsiveness reaction, or diseases mediated by somatic cell gene mutations (variants) | |
| Britt et al. | Naja naja cobra bite | |
| Jain et al. | HBO therapy in infections | |
| Schindel | Unexpected Reactions to Modern Therapeutics: Antibiotics | |
| Vandersmissen et al. | Cutaneous cryptococcosis in corticosteroid-treated patients without AIDS | |
| JP2003519088A (en) | Use of GSSG reductase for treatment and prevention of HIV infected patients | |
| Kosmidis et al. | Fleroxacin in single dose oral therapy of uncomplicated lower urinary tract infection | |
| Borse et al. | A concise review on mucormycosis | |
| US20230414655A1 (en) | Compositions and methods for treating and preventing venom related poisoning | |
| RU2414228C1 (en) | Method of patient-specific immunotherapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210313 |