DE102007022915A1 - Method for analyzing polymerization of analyte in fluid, particularly organic monomer, involves overflowing reaction medium before beginning of analyzing sensor surface - Google Patents

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Abstract

Polymerization analyzing involves overflowing a reaction medium before beginning of analyzing a sensor surface. A measuring solution is added to the flowing reaction medium by a parallel addition flow. The reaction medium overflows the sensor area into a continuous sub-stream (4), where the addition flow is supplied to another sub-stream (5) at a port of the former sub-stream. The addition flow supplies to the former sub-stream directly before a measuring cell (2). An independent claim is also included for a system for analyzing the method, where a sensor with a sensor surface sensitive for the polymer is arranged within a measuring cell.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der Polymerisation eines in einem Fluid befindlichen Analyten, insbesondere eines organischen Monomers, wie beispielsweise Aktin, wobei innerhalb einer Messzelle ein Sensor mit einer für das Polymer sensiblen Sensorfläche angeordnet ist, wobei sich auf der Sensorfläche sammelndes Polymer nachgewiesen wird, wobei sich über der Sensorfläche in der Messzelle ein Reaktionsmedium, insbesondere eine Pufferlösung, befindet, die geeignete Bedingungen für die Polymerisation ausbildet, wobei zu Beginn der Untersuchung das mit Analyt versehene Fluid als Messlösung in das Reaktionsmedium gegeben wird. Die Erfindung betrifft gleichfalls ein System zur Umsetzung des Verfahrens.The The present invention relates to a method for the investigation of Polymerization of an analyte in a fluid, in particular an organic monomer, such as actin, wherein within a sensor with a sensor sensitive to the polymer Sensor surface is arranged, which is on the sensor surface collecting polymer is detected, which is above the Sensor surface in the measuring cell, a reaction medium, in particular a buffer solution, the appropriate conditions for the polymerization, being at the beginning of the investigation the analyte-provided fluid as a measuring solution in the reaction medium is given. The invention also relates to a system for Implementation of the procedure.

Im Bereich der Polymerchemie und der Biochemie sind einige Verfahren zur Untersuchung der Polymerisation, also zur Messung des Polymerisationsgrades oder zur Beobachtung der Reaktionskinetik, bekannt. Die Polymerisation des Proteins Aktin kann beispielsweise mittels eines Viskosimeters gemessen werden. Es ist auch bekannt, die gebildeten Polymere zu zentrifugieren oder die Polymerisation an der Veränderung der Fluoreszenz von speziellem Pyren-Aktin zu verfolgen. Ähnliche Untersuchungen, die jedoch auf der Polymerisation des Proteins Tubulin basieren, werden bei der Suche nach Drogen, in der Krebstherapie und für Screening Untersuchungen eingesetzt.in the The field of polymer chemistry and biochemistry are some methods for the investigation of the polymerization, thus for the measurement of the degree of polymerization or for monitoring reaction kinetics. The polymerization of the protein actin, for example, by means of a viscometer be measured. It is also known to use the polymers formed Centrifuging or polymerization on the change to track the fluorescence of specific pyrene actin. Similar Investigations, however, on the polymerization of the protein tubulin Be based in the search for drugs in cancer therapy and used for screening investigations.

Der Nachteil aller bekannten Verfahren ist, dass die Bedingungen, insbesondere die Konzentrationsverhältnisse, sich während der Polymerisation ändern und so die Ergebnisse beeinflusst werden. Durch die Polymerisation wird der Anteil der freien Moleküle im zu untersuchenden Medium verringert, wobei sich mit dieser Verarmung die äußeren Bedingungen kontinuierlich ändern. So muss bei der oben genannten und derzeit am häufigsten eingesetzten Methode, die Polymerisation über ein Pyren-Aktin zu verfolgen, das Pyren-Aktin in Mischungsanteilen zu gereinigten Aktinproben gegeben werden, wodurch die Probe selber verändert wird. Dennoch ist diese Methode von einer höheren Genauigkeit als die genannten Methode der Zentrifugation und die viskosimetrische Messung.Of the Disadvantage of all known methods is that the conditions, in particular the concentration ratios, during the Change the polymerization and influence the results become. Through the polymerization, the proportion of free molecules becomes decreased in the medium to be examined, with this depletion change the external conditions continuously. So must be at the above and currently the most common used method, the polymerization via a pyrene actin to track the pyrene actin in mixture proportions Actin samples are given, whereby the sample itself changes becomes. Nevertheless, this method is of a higher accuracy as the mentioned method of centrifugation and the viscometric Measurement.

Aufgabe der Erfindung ist es nunmehr, ein Verfahren zur Untersuchung der Polymerisation zu schaffen, bei dem sich die Reaktionsbedingungen während der Messung, wenn überhaupt, dann nur minimal oder aber kontrolliert verändern. Das Verfahren soll eine genaue Untersuchung der Vorgänge bei weitgehender Automatisation und hohem Komfort ermöglichen. Zudem ist es die Aufgabe, ein einfach aufgebautes und komfortabel zu bedienendes System zur Umsetzung des Verfahrens zu schaffen.task The invention is now a method for the investigation of To provide polymerization in which the reaction conditions during the measurement, if any, then only minimal or else controlled change. The procedure should be accurate Examination of the processes with extensive automation and allow high comfort. It is also the task a simple and easy to use system for Implementation of the procedure to create.

Diese Aufgaben werden durch das Verfahren nach Anspruch 1 und das System nach Anspruch 12 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den jeweiligen Unteransprüchen genannt.These Tasks are achieved by the method of claim 1 and the system solved according to claim 12. Advantageous embodiments are mentioned in the respective subclaims.

Der wesentliche Grundgedanke der Erfindung liegt darin, die Polymerisation bei strömendem Reaktionsmedium zu untersuchen. Durch das Überströmen können gleichbleibende oder kontrolliert veränderbare Verhältnisse über dem Sensor respektive der Sensoroberfläche geschaffen werden. Ein weiterer wesentlicher Gedanke liegt darin, die Teilströme von Reaktionsmedium und Messlösung in möglichst kurzer Distanz erst unmittelbar vor dem Sensor zu dem zu messenden Gesamtstrom zusammenzuführen, damit die Polymerisation in dem zu messenden Gesamtstrom nicht schon fortgeschritten ist und das Ergebnis verfälscht oder sogar die Messzelle durch das sich verfestigende Polymer verstopft. Erfindungsgemäß wird also bei dem Verfahren vor Beginn der Untersuchung die Sensorfläche mit dem ersten Teilstrom des Reaktionsmediums überströmt, wobei die Messlösung dann diesem kontinuierlichen Teilstrom über einen Beigabestrom beigemischt wird. Dieser Beigabestrom tritt dem ersten Teilstrom des Reaktionsmediums an einer definiert lokalisierten Mündung bei, die sich möglichst unmittelbar vor dem Sensor befindet. Am Sensor gemessen wird dann die im Gesamtstrom in Gang gesetzte Polymerisation, die durch die erst unmittelbar zuvor erfolgte Zusammenführung im Idealfall erst in der Messzelle beginnt. Wenn der Zuleitungschlauch einen geringeren Innendurchmesser hat als der Ableitungsschlauch, kann die durch die Polymerisation gegebenenfalls hochviskose Lösung in der Sensorzelle die Schläuche nicht verstopfen.Of the essential idea of the invention lies in the polymerization to investigate with flowing reaction medium. By the overflow can be consistent or controlled changeable Conditions above the sensor respectively the sensor surface be created. Another important idea is the partial streams of reaction medium and measuring solution in the shortest possible distance only immediately in front of the sensor to merge to the total current to be measured so that the polymerization in the total current to be measured has not advanced is and falsifies the result or even the measuring cell blocked by the solidifying polymer. According to the invention So in the process before the start of the investigation, the sensor surface overflowed with the first partial flow of the reaction medium, wherein the measurement solution then this continuous partial flow over a Beigabestrom is admixed. This Beigabestrom enters the first partial flow of the reaction medium at a defined localized mouth which is as close to the sensor as possible. The sensor then measures the total current set in motion Polymerization, by the only immediately before merging Ideally, it only starts in the measuring cell. If the supply hose has a smaller inner diameter than the discharge hose, may optionally high viscosity solution by the polymerization in the sensor cell, do not clog the hoses.

Wesentlicher Grundgedanke ist somit die gewissermaßen „getrennte Fluidik", also der aus zunächst getrennten Teilströmen erzeugte Gesamtstrom. Dabei ist die Geometrie des Systems so vorzusehen, dass die Durchmischung der Teilströme, die insbesondere von Pufferlösungen gebildet werden, erst kurz vor der Messzelle geschieht. In dem einen Teilstrom ist der zu untersuchende Analyt vorhanden, wobei dieser vorteilhafterweise in den Teilstrom, wie später beschrieben wird, als Flüssigkeitssäule „eingeschleift" wird. Erst durch die Zusammenführung mindestens zweier vorher getrennter Teilströme, wobei der eine der Teilströme den polymerisierenden Analyten enthält, werden geeignete Bedingungen für die Polymerisation geschaffen und die Polymerisation in Gang gesetzt. Dabei ist es besonders vorteilhaft, zwei oder entsprechend mehrere voneinander getrennt ansteuerbare Pumpen einzusetzen, um die Teilströme getrennt steuern zu können. Auf diese Weise können die Teilströme je nach Bedarf konstant gehalten werden, oder es wird ein Gesamtstrom mit einem Konzentrationsgradienten erzeugt.essential The basic idea is thus to a certain extent "separate Fluidic ", ie from initially separate streams generated total current. The geometry of the system should be provided that the mixing of the partial flows, in particular be formed by buffer solutions, just before the measuring cell happens. In the one partial flow is the analyte to be examined present, this advantageously in the partial flow, such as will be described later, as a liquid column "looped" becomes. Only by bringing together at least two previously separate partial flows, wherein one of the partial flows containing the polymerizing analyte become suitable Conditions created for the polymerization and the polymerization set in motion. It is particularly advantageous, two or accordingly to use several separately controllable pumps to to be able to control the partial flows separately. On This way, the partial flows as needed be kept constant, or it will be a total current with one Concentration gradient generated.

Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass die Bedingungen während der Messung konstant gehalten oder kontrolliert verändert werden können. Ein besonders bevorzugtes Einsatzgebiet der Erfindung ist die Messung der Polymerisation der Cytoskelettproteine Aktin und Tubulin. Dabei ist es besonders vorteilhaft, die Polymerisationsreaktion an Monomeren zu erregen, die in einer Startreaktion auf der Sensoroberfläche immobilisiert wurden. Die Konzentration der Monomere, die zur Polymerisation notwendig ist, unterscheidet sich dabei nicht von den bisher verwendeten Methoden. Zudem kann das erfindungsgemäße System in der chemischen Industrie und der Lebensmittelindustrie zur Untersuchung chemischer Reaktionen und zur Kontrolle von Polymerisations- und Vernetzungsreaktionen Einsatz finden. Auch für die Suche nach Wirkstoffen und der Untersuchung von Interaktionsprozessen ist das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft. Es bietet sich auch für die Suche nach Cytostatica in der Krebs-Chemotherapie, beispielsweise im Falle des Tubulin, an.Of the substantial advantage of the method according to the invention This is because the conditions are constant during the measurement held or controlled can be changed. A particularly preferred field of application of the invention is the measurement the polymerization of the cytoskeletal proteins actin and tubulin. there it is particularly advantageous, the polymerization reaction of monomers which is immobilized in a starting reaction on the sensor surface were. The concentration of monomers necessary for the polymerization is not different from the methods used so far. In addition, the system according to the invention in the chemical industry and the food industry for investigation chemical reactions and for the control of polymerization and Crosslinking reactions find use. Also for the search for drugs and the investigation of interaction processes the method according to the invention is advantageous. It also lends itself to the search for cytostatica in the Cancer chemotherapy, for example in the case of tubulin.

Dabei lässt sich das Verfahren mit einfachen Mitteln umsetzen. Die Umsetzung kann sich bekannter Steuermittel bedienen, die eine nahezu vollständige Automatisierung und die Durchführung von Reihenuntersuchungen ermöglichen. Die einzusetzenden technischen Mittel, wie Pumpen, Ventile und Leitungen sind kommerziell erhältlich. Ganz besonders vorteilhaft ist es, als Sensor einen Oberflächenwellensensor („Surface Accoustic Wave", SAW) Sensor zu nutzen, mit dem sich die Polymerisation Online in Echtzeit beobachten lässt. Dabei bieten die an sich bekannten SAW-Sensoren den besonderen Vorteil, dass sich mit ihnen sowohl Massenänderungen als auch Viskositätsänderungen simultan messen lassen. In diesem Zusammenhang wird auf die DE 10 2004 006 823 A1 verwiesen, in der Messungen mit SAW Sensoren und die Auswertung der Ergebnisse beschrieben ist.The process can be implemented with simple means. The implementation may use known control means that allow for near-complete automation and screening. The technical means to be used, such as pumps, valves and lines are commercially available. It is particularly advantageous to use a surface acoustic wave sensor ("surface acoustic wave", SAW) sensor, with which the polymerization on-line in real time can be observed.The SAW sensors known per se have the particular advantage that with to measure both mass changes and viscosity changes simultaneously DE 10 2004 006 823 A1 in which measurements with SAW sensors and the evaluation of the results are described.

Das erfindungsgemäße Verfahren und der erfindungsgemäße Sensor können damit als Biosensor für die kontinuierliche Messung der Polymerisation und der Depolymerisation beispielsweise des hochviskosen Proteins Aktin genutzt werden. Dabei erlaubt der SAW-Sensor die Messung sowohl der Phase als auch der Amplitude des Signals, sodass zwischen den Effekten, die einerseits von der Masseänderung und andererseits von der Viskositätsänderung herrühren, unterschieden werden kann. Wie bereits beschrieben, liegt ein besonderer Vorteil darin, dass mit der erfindungsgemäßen, kontinuierlichen Eingabe der Probe die Aktinkonzentration über der Sensoroberfläche konstant gehalten werden kann. Dies ist ein wesentlicher Unterschied zu den bislang bekannten, sogenannten batch-Verfahren, bei denen die Aktinkonzentration mit dem Polymerisationsprozess abnimmt.The inventive method and the invention Sensor can thus be used as a biosensor for continuous Measurement of polymerization and depolymerization, for example of the high-viscosity protein actin. It allows the SAW sensor the measurement of both the phase and the amplitude of the Signals, so between the effects, on the one hand by the mass change and on the other hand, from the change in viscosity, different can be. As already described, there is a particular advantage in that with the inventive, continuous input the sample the actin concentration above the sensor surface can be kept constant. This is a significant difference to the previously known, so-called batch process, in which the Aktinkonzentration decreases with the polymerization process.

Das System kann beliebig erweitert werden in ein zwei- oder mehrkomponentiges System, indem beispielsweise alternativ bindende Elemente, wie ein Antikörper oder ein Aptamer, gegen das polymerisierende Monomer auf der Oberfläche immobilisiert werden. Über diese Komponente wird das erste Monomer gebunden und nachfolgend die Polymerisierung induziert. Vorteil eines solchen Vorgehens ist ggf. die Bindung alternativer Monomere an dieselbe Oberfläche und die Möglichkeit der Regenerierung der Oberfläche bis zu dieser alternativen Komponente, um einen erneuten, kompletten Polymerisationszyklus zu ermöglichen.The System can be expanded arbitrarily into a two- or multi-component System, by, for example, alternatively binding elements, such as an antibody or an aptamer, against the polymerizing monomer on the surface be immobilized. This component becomes the first one Monomer bound and subsequently induced the polymerization. Advantage of such a procedure is possibly the binding of alternative Monomers on the same surface and the possibility the regeneration of the surface up to this alternative Component to a new, complete polymerization cycle to enable.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der 1 und 2 näher erläutert. Es zeigenThe invention will be described below with reference to FIG 1 and 2 explained in more detail. Show it

1 das Schema eines Versuchsaufbaus und 1 the scheme of a test setup and

2 mit dem Versuchsaufbau erzielte Messergebnisse. 2 obtained with the experimental setup results.

In 1 ist ein SAW Sensor 1 gezeigt, dessen Funktion auf dem Oberflächenwellen-Prinzip basiert. Auf der sensitiven Oberfläche des Sensors 1 sind Monomere durch eine geeignete Kopplungsmethode immobilisiert. Dies kann beispielsweise über Carbodiimidchemie an der mit COOH-Alkanthiolen modifizierten Goldoberfläche geschehen. Bei der Messzelle 2 bildet der Sensor 1 die Bodenfläche. Die Messzelle 2 hat einen Einlass, über den der Gesamtstrom vermittels einer Zulaufleitung 3 zugeführt wird. Zur Abfuhr der Messlösung ist ein entsprechender Auslaß mit Auslassleitung vorgesehen. Erfindungsgemäß werden in der Zulaufleitung 3 zwei Teilströme kurz vor der Messzelle 2 zum Gesamtstrom zusammengeführt. Dazu werden eine erste Teilstromleitung 4 und eine zweite Teilstromleitung 5 über ein T-Stück 6 vereint, das in diesem Fall etwa 2,5 cm vor der Messzelle 2 angeordnet ist. Jede der Leitungen hat in diesem Fall einen Durchmesser zwischen 10 μm und 20 μm. In jeder der Teilstromleitungen 4 und 5 befindet sich eine getrennt ansteuerbare Pumpe 7. Zur Untersuchung der Polymerisation befinden sich in beiden Teilstromleitungen 4 und 5 Pufferströme, wobei in eine erste der beiden Teilstromleitungen einer den Analyten, insbesondere ein organisches Monomer wie Aktin, enthaltende Flüssigkeit injiziert werden kann. Im vorliegenden Fall haben die Ströme eine Stärke von etwa 15 μl/min. Gute Ergebnisse werden mit Gesamtströmen zwischen 20 μl/min und 100 μl/min innerhalb der Messzelle erreicht.In 1 is a SAW sensor 1 whose function is based on the surface wave principle. On the sensitive surface of the sensor 1 For example, monomers are immobilized by a suitable coupling method. This can be done, for example, via carbodiimide chemistry on the gold surface modified with COOH alkanethiols. At the measuring cell 2 forms the sensor 1 the floor area. The measuring cell 2 has an inlet through which the total flow by means of a supply line 3 is supplied. For discharging the measuring solution, a corresponding outlet is provided with outlet. According to the invention in the supply line 3 two partial streams shortly before the measuring cell 2 merged to the total current. For this purpose, a first partial flow line 4 and a second partial flow line 5 over a tee 6 in this case, about 2.5 cm in front of the measuring cell 2 is arranged. Each of the lines in this case has a diameter between 10 microns and 20 microns. In each of the partial flow lines 4 and 5 there is a separately controllable pump 7 , To investigate the polymerization are located in both partial flow lines 4 and 5 Buffer streams, wherein in a first of the two partial flow lines of the analyte, in particular an organic monomer such as actin, containing liquid can be injected. In the present case, the currents have a strength of about 15 μl / min. Good results are achieved with total flows between 20 μl / min and 100 μl / min within the measuring cell.

Vor Beginn der Untersuchung überströmt der Gesamtstrom als Reaktionsmedium die Sensorfläche, wobei die Messlösung mit dem Analyten dem kontinuierlichen ersten Teilstrom in Teilstromleitung 4 über das T-Stück mit dem zweiten Teilstrom (Beigabestrom) in Teilstromleitung 5 gemischt wird. Diese Beimischung kann durch Injektion erfolgen, insbesondere dadurch, dass eine nicht dargestellte Probenleitung über die Injektion befüllt wird. In diesem speziellen Fall haben die Proben ein Volumen zwischen 20 μl und 400 μl. Die Probenleitung ist über ein 6-Wegeventil in das System eingebunden und wird zur Messung durch Schalten des 6-Wegeventils in eine der Teilstromleitungen eingeschleift. Das bedeutet, dass nach Schalten des 6-Wegeventils der eine Pufferstrom durch die Probenleitung geführt wird und die darin enthaltene Probe mitnimmt. Die Zusammensetzung des entsprechenden Pufferstomes 5 ist derart, dass keine Polymerisation erfolgt. Die Injektion ist hier vereinfachend durch die Spritze 8 dargestellt. Zur Steuerung der Pumpen und der Ventile sind entsprechende Steuermittel umfassend einen Computer vorgesehen, der auch die Auswertung der vom Sensor gelieferten Signale bewerkstelligen kann.Before the start of the investigation, the total flow as the reaction medium flows over the sensor surface, with the measurement solution containing the analyte being the continuous first partial flow in the partial flow line 4 via the T-piece with the second partial flow (adding flow) in the partial flow line 5 is mixed. These Admixture can be effected by injection, in particular by filling a sample line (not shown) via the injection. In this particular case, the samples have a volume between 20 μl and 400 μl. The sample line is integrated into the system via a 6-way valve and is looped into one of the partial flow lines for measurement by switching the 6-way valve. This means that after switching the 6-way valve, a buffer flow is passed through the sample line and entrains the sample contained therein. The composition of the corresponding buffer 5 is such that no polymerization takes place. The injection is simplified here by the syringe 8th shown. For controlling the pumps and the valves corresponding control means are provided comprising a computer, which can also accomplish the evaluation of the signals supplied by the sensor.

Mit einer der Pumpen wird somit ein Puffer über die Oberfläche des Sensors 1 geleitet, der die Monomere stabil in Lösung hält, ohne die Polymerisation anzuregen. Über das T-Stück 6 wird der zweite Pufferstrom kurz vor der Messzelle 2 zugemischt, wobei ein Mischverhältnis von 1:1 gewählt werden kann. Die Zusammensetzung des im zweiten Teilstrom befindlichen Puffers induziert als „Aktivator" die Polymerisation. So wird ermöglicht, dass die Polymerisation eines Anteils der Monomere an die im Sensor immobilisierten Monomere erfolgt. Durch Mischung mit verschiedenen Substanzen kann weiterhin der Einfluss auf die Polymerisation oder auf die polymerisierten Stränge respektive Filme untersucht werden.With one of the pumps is thus a buffer over the surface of the sensor 1 passed, which keeps the monomers stable in solution, without stimulating the polymerization. About the tee 6 the second buffer current is just before the measuring cell 2 admixed, wherein a mixing ratio of 1: 1 can be selected. The composition of the buffer in the second substream induces the polymerization as an "activator." This makes it possible to polymerize a proportion of the monomers to the monomers immobilized in the sensor polymerized strands or films are examined.

Da die Monomere für eine definierte Zeit bei einer vorher festgelegten Flussrate und/oder einem vorher festgelegten Konzentrationsgradienten über die Sensoroberfläche geleitet werden, wird während dieses Zeitraums ständig dieselbe Konzentration an Monomeren aufrecht erhalten. Eine Verarmung der Monomere, wie sie bei bisher bekannten Methoden auftraten, findet im vorliegenden System nicht statt. Somit können erstmalig „echte" Reaktionskinetiken gemessen werden. Bei einer Variation der beiden Flussraten sind zusätzlich Konzentrationsgradienten möglich. Der verwendete Sensor ermöglicht außerdem die Trennung des Masseanteils vom Polymerisationsanteil der Reaktion. Wenn die mit Analyt versehene Flüssigkeitssäule die Messzelle passiert hat, kann der Fluss der Pufferlösung weiter aufrecht erhalten bleiben, was zu einer Depolymerisation führt. Die Pufferlösung spült damit die Messzelle. Der Zyklus kann beliebig wiederholt werden.There the monomers for a defined time at a before fixed flow rate and / or a predetermined concentration gradient over the Sensor surface will be routed during this Periodically maintained the same concentration of monomers receive. A depletion of the monomers, as in previously known Methods did not occur in the present system. Consequently can measure "real" reaction kinetics for the first time become. At a variation of the two flow rates are additional Concentration gradients possible. The sensor used also allows the separation of the mass fraction from the polymerization portion of the reaction. When the analyte Liquid column has passed the measuring cell, can the flow of buffer solution continues to be maintained, which leads to depolymerization. The buffer solution flushes the measuring cell with it. The cycle can be repeated as required become.

Zusätzlich kann vor oder nach der Injektion der Polymerlösung eine weitere Komponente appliziert werden, z. B. Antikörper oder Aptamere. Neben der durch die Vermengung der Teilströme 4 und 5 induzierten Polymerisation kann so die Wechselwirkung des Polymers mit der immobilisierten Komponente analysiert werden.In addition, before or after the injection of the polymer solution, a further component can be applied, for. As antibodies or aptamers. In addition to the mixing of the partial flows 4 and 5 induced polymerization can thus be analyzed the interaction of the polymer with the immobilized component.

In Versuchen konnte die Reaktonskinetik in Abhängigkeit von der Konzentration der Salze MgCl2 und KCl für die Polymerisation und ATP für die Depolymerisation untersucht werden. Dazu wurden Polymerisations- und Depolymerisationszyklen unter variierenden Bedingungen untersucht. Mit dem erfindungsgemäßen Biosensor-System konnten Polymerisationsraten in Echtzeit und unter kontrollierten und vordefinierten Bedingungen durchgeführt werden. Dabei konnte insbesondere die Aktinkonzentration während der Messung konstant gehalten werden.In experiments, the reaction kinetics could be investigated depending on the concentration of the salts MgCl 2 and KCl for the polymerization and ATP for the depolymerization. For this purpose, polymerization and depolymerization cycles were investigated under varying conditions. With the biosensor system according to the invention, polymerization rates could be carried out in real time and under controlled and predefined conditions. In particular, the Aktinkonzentration could be kept constant during the measurement.

Die Messungen, deren Ergebnisse in den 2 dargestellt sind, wurden mit einer Anordnung nach 1 aufgenommen. Aktin mit einer eingestellten Menge von ATP (0,4 mM G-Aktin oder 2 mM F-Aktin) wurde in den kontinuierlichen Strom eines nicht-polymerisierenden zweiten Puffers mit 5 mM Tris-HCl, pH 8.0 und 200 μM CaCl2 injiziert. Die Messzelle eines S-sens® K5 Biosensorsystems wurde mit einem entsprechend präparierten Sensorchip ausgerüstet. Im T-Stück trifft der zweite Puffer auf den Strom eines ersten Puffers, enthaltend 5 mM Tris HCl, pH 8.0, 200 μM CaCl2 und die Salze 100 mM KCl und 4 mM MgCl2. Nach dem Mischen formte sich das hochviskose Aktin-Polymer und konnte in der Messzelle gemessen werden, ohne dass die Zu- und Ableitungen verstopften.The measurements whose results in the 2 have been shown with an arrangement after 1 added. Actin with an adjusted amount of ATP (0.4 mM G-actin or 2 mM F-actin) was injected into the continuous stream of a non-polymerizing second buffer with 5 mM Tris-HCl, pH 8.0 and 200 μM CaCl 2 . The measuring cell of a S-sens ® K5 biosensor system was equipped with a suitably prepared sensor chip. In the T-piece, the second buffer encounters the flow of a first buffer containing 5 mM Tris HCl, pH 8.0, 200 μM CaCl 2 and the salts 100 mM KCl and 4 mM MgCl 2 . After mixing, the highly viscous actin polymer formed and could be measured in the measuring cell without clogging the inlet and outlet lines.

In den 2a und 2b sind die während der Polymerisation erzeugten Signale für verschiedene Versuchsbedingungen dargestellt. Zunächst wurde vor der Messung die Oberfläche des Sensors mit 50 μM Aktin belegt. In 2a ist der Phasenwinkel des Sensorsignals gegen die Zeit in Sekunden aufgetragen. Die vier Kurven unterscheiden sich in der Salzkonzentration und der ATP-Konzentration im ersten Puffer. Zu erkennen ist jeweils der steile Anstieg des Signals, das den Grad der Polymerisation nach der Injektion kennzeichnet. An der Spitze des Signals ist das gesamte injizierte Aktin über den Sensor geflossen und die reine Pufferlösung befreit die Rezeptoren wieder. In 2b sind die Amplituden der Signale dargestellt.In the 2a and 2 B the signals generated during the polymerization are shown for different experimental conditions. First, the surface of the sensor was occupied with 50 μM actin before the measurement. In 2a the phase angle of the sensor signal is plotted against time in seconds. The four curves differ in salt concentration and ATP concentration in the first buffer. The steep rise of the signal, which indicates the degree of polymerization after the injection, can be seen in each case. At the tip of the signal, all the injected actin has flowed across the sensor and the pure buffer solution freed the receptors again. In 2 B the amplitudes of the signals are shown.

Eine typische, zeitabhängige Messung einer Aktinpolymerisation zeigt eine Verarmung der Aktinkonzentration, da die anderen Pufferbestandteile wie Salze und ATP im Überschuss zugegeben werden. Eine solche Polymerisationskurve folgt einer typischen S-förmigen Kurve. Diese weist drei Phasen auf: Die Anfangsphase (lag-Phase) ist langsam und zeigt einen geringen Kurvenanstieg, wobei sich erste Aktinmonomere zu sogenannten Nukleationskernen zusammenfinden, von denen die weitere Polymerisation ausgeht. Dies geht über in eine schnelle exponentielle Phase, in der nahezu eine Gerade erreicht wird. Während dieses Zeitraums nimmt die Aktinkonzentration rapide ab. Dadurch geht die Kurve in eine abschließende Gleichgewichtsphase (equilibrium) über, wenn die Aktinkonzentration zum Ende der Reaktion soweit abgenommen hat, dass sich dadurch die Polymerisationsrate verringert.A typical, time-dependent measurement of actin polymerization shows depletion of the actin concentration as the other buffer constituents such as salts and ATP are added in excess. Such a polymerization curve follows a typical S-shaped curve. This has three phases: The initial phase (lag phase) is slow and shows a small increase in the curve, with first Aktinmonomere to so-called nucleation nuclei, from which the further polymerization proceeds. This turns into a fast exponential phase where nearly a straight line is reached becomes. During this period, the actin concentration decreases rapidly. Thereby, the curve goes into a final equilibrium phase (equilibrium) when the Aktinkonzentration has decreased to the end of the reaction to the extent that thereby reduces the rate of polymerization.

Die Messungen in 2 zeigen eine rapide Zunahme der Phase und Amplitude aufgrund der zugegebenen Aktinlösung, durch spezifische und unspezifische Interaktion mit der Oberfläche. Nach diesen ersten Sekunden, deren Zeitdauer abhängig ist von der gewählten Flussrate, erfolgt rasch die schnelle Polymerisation der Aktinmonomere an der Oberfläche. Dies folgt einer Geraden entsprechend der exponentiellen Phase, ohne dass eine Verarmung eintreten kann, da eine kontinuierliche Injektion erfolgt. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist abhängig von den gewählten Konzentrationen in der Lösung und von der Dichte der reaktiven Aktinmonomere auf der Sensoroberfläche. Der plötzliche Abbruch der Polymerisationkurve erfolgt erst, wenn die Injektion des Aktingemisches beendet wird. Innerhalb von wenigen Sekunden wird kontinuierlich die reine Pufferlösung über die Oberfläche geleitet. Die Ablösung der polymerisierten Monomere von der Oberfläche folgt einer eigenen Kinetik.The measurements in 2 show a rapid increase in phase and amplitude due to the added actin solution, through specific and nonspecific interaction with the surface. After these first seconds, the duration of which depends on the chosen flow rate, the rapid polymerization of the actin monomers on the surface takes place rapidly. This follows a straight line corresponding to the exponential phase, without the possibility of depletion, as a continuous injection occurs. The reaction rate depends on the selected concentrations in the solution and on the density of the reactive actin monomers on the sensor surface. The sudden termination of the polymerization curve occurs only when the injection of the Aktingemisches is terminated. Within a few seconds, the pure buffer solution is continuously passed over the surface. The detachment of the polymerized monomers from the surface follows its own kinetics.

Durch die Verwendung des akustischen Messprinzips mit einer transparenten Fluidikzelle wird zusätzlich bei Verwendung z. B. von fluoreszenzmarkierten Molekülen, die parallele Messung eines dritten Messparameters ermöglicht. Einerseits werden über die Messkurven Masse und viskoelastische Veränderungen bestimmt, während andererseits eine optische Verfolgung während der Polymerisation durch eine durchsichtige Messzelle eine kontinuierliche Messung der Fluoreszenzänderung ermöglicht. Nach Beendigung der Messung kann auch der Chip dem Gerät entnommen werden, um die aktuellen Messwerte in Relation zu setzen mit komplementären Analysemethoden wie der Gesamtfluoreszenz oder Radioaktivität der gebundenen Moleküle, aber auch anderen, optischen Sensortechnologien.By the use of the acoustic measuring principle with a transparent one Fluidic cell is additionally z. B. of fluorescently labeled Molecules, the parallel measurement of a third measurement parameter allows. On the one hand are about the traces Mass and viscoelastic changes are determined while on the other hand, optical tracking during the polymerization through a transparent measuring cell a continuous measurement the fluorescence change allows. After completion the measurement can also be taken from the chip, the device in order to relate the current measured values to complementary ones Analysis methods such as total fluorescence or radioactivity of bound molecules, but also other optical sensor technologies.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

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Claims (16)

Verfahren zur Untersuchung der Polymerisation eines in einem Fluid befindlichen Analyten, insbesondere eines organischen Monomers, wobei innerhalb einer Messzelle (2) ein Sensor (1) mit einer für das Polymer sensiblen Sensorfläche angeordnet ist, wobei das sich auf der Sensorfläche sammelnde Polymer nachgewiesen wird, wobei sich über der Sensorfläche in der Messzelle (2) ein Reaktionsmedium, insbesondere eine Pufferlösung, befindet, die geeignete Reaktionsbedingungen für die Polymerisation ausbildet, wobei zur Untersuchung das mit Analyt versehene Fluid als Messlösung in das Reaktionsmedium gegeben wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium vor Beginn der Untersuchung die Sensorfläche überströmt, wobei die Messlösung dem strömenden Reaktionsmedium über einen parallelen Beigabestrom (5) beigemischt wird.Method for investigating the polymerization of an analyte, in particular an organic monomer, contained in a fluid, wherein within a measuring cell ( 2 ) a sensor ( 1 ) is arranged with a sensor surface sensitive to the polymer, whereby the polymer collecting on the sensor surface is detected, wherein above the sensor surface in the measuring cell ( 2 ) is a reaction medium, in particular a buffer solution, which forms suitable reaction conditions for the polymerization, wherein for analysis, the fluid provided with analyte is added as a measuring solution in the reaction medium, characterized in that the reaction medium overflows the sensor surface before the start of the investigation, wherein the Measuring solution to the flowing reaction medium via a parallel Beigabestrom ( 5 ) is added. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium in einem kontinuierlichen ersten Teilstrom (4) die Sensorfläche überströmt, wobei der Beigabestrom als zweiter Teilstrom (5) an einer Mündung dem ersten Teilstrom (4) zugeführt wird.A method according to claim 1, characterized in that the reaction medium in a continuous first substream ( 4 ) flows over the sensor surface, wherein the Beigabestrom as a second partial flow ( 5 ) at an orifice to the first partial flow ( 4 ) is supplied. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Beigabestrom dem ersten Teilstrom (4) unmittelbar vor der Messzelle (2) zugeführt wird.A method according to claim 2, characterized in that the addition flow to the first partial flow ( 4 ) immediately in front of the measuring cell ( 2 ) is supplied. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerisation eines Cytoskelettproteins, wie Aktin oder Tubulin, untersucht wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the polymerization of a cytoskeletal protein, such as actin or tubulin, is being studied. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Untersuchung eine Probenleitung mit dem den Analyten enthaltenden Fluid befüllt wird, wobei zu Beginn der Untersuchung die Probenleitung durch Umleitung des Beigabestromes (5), insbesondere nach Schalten eines 6-Wege Ventils, durchspült wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that prior to the investigation, a sample line is filled with the fluid containing the analyte, wherein at the beginning of the investigation, the sample line by redirecting the Beigabestromes ( 5 ), especially after switching a 6-way valve, is flushed. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Teilstrom (4) und der Beigabestrom (5) vor der Untersuchung kontinuierlich als Mischung die Messzelle (2) durchströmen.Method according to claim 5, characterized in that the first partial flow ( 4 ) and the admixture stream ( 5 ) continuously before mixing as a mixture the measuring cell ( 2 ) flow through. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke des ersten Teilstroms (4) und/oder des Beigabestroms (5) während der Messung kontrolliert verändert wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the strength of the first partial flow ( 4 ) and / or the addition stream ( 5 ) is changed in a controlled manner during the measurement. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke des ersten Teilstroms (4) und/oder des Beigabestroms (5) während der Messung kontrolliert verändert wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the strength of the first partial flow ( 4 ) and / or the addition stream ( 5 ) is changed in a controlled manner during the measurement. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Monomere auf der Sensorfläche immobilisiert werden, insbesondere über Carbodiimidchemie an der mit COOH-Alkanthiolen modifizierten Goldoberfläche, oder durch eine alternativ bindende, regenerierbare Bindungskomponente.Method according to one of the preceding claims, characterized in that monomers on the sensor surface be immobilized, especially on Carbodiimidchemie on the gold surface modified with COOH-alkanethiols, or by an alternatively binding, regenerable binding component. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messzelle (2) nach der Untersuchung mit Pufferlösung gespült und die Depolymerisation gemessen wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the measuring cell ( 2 ) is rinsed with buffer solution after the assay and the depolymerization is measured. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Untersuchung ein SAW Sensor (1) eingesetzt wird und mittels des SAW Sensors (1) Massenänderungen und Viskositätsänderungen simultan gemessen werden.Method according to one of the preceding claims, characterized in that a SAW sensor ( 1 ) and by means of the SAW sensor ( 1 ) Mass changes and viscosity changes are measured simultaneously. System zur Umsetzung des Verfahrens nach einem der vorherigen Ansprüche aufweisend einen innerhalb einer Messzelle (2) angeordneten Sensor (5) mit einer für das Polymer sensiblen Sensorfläche angeordnet ist, wobei die Messzelle (2) eine Zulaufleitung (3) und eine Auslassleitung aufweist gekennzeichnet durch einen unmittelbar vor der Messzelle (2) vorgesehenen Mündungsbereich, in dem eine erste Teilstromleitung (4) und eine zweite Teilstromleitung (5) vereint werden, wobei in einer der Teilstromleitungen (4, 5) Mittel für die Einbringung des im Fluid befindlichen Analyten vorgesehen sind.System for implementing the method according to one of the preceding claims, comprising one within a measuring cell ( 2 ) arranged sensor ( 5 ) is arranged with a sensitive sensor surface for the polymer, wherein the measuring cell ( 2 ) a supply line ( 3 ) and an outlet line characterized by a directly in front of the measuring cell ( 2 ) provided opening area in which a first partial flow line ( 4 ) and a second partial flow line ( 5 ), wherein in one of the partial flow lines ( 4 . 5 ) Means are provided for the introduction of the fluid in the analyte. System nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass in jeder der Teilstromleitungen (4, 5) eine separat ansteuerbare Pumpe (7) vorgesehen ist.System according to claim 12, characterized in that in each of the partial flow lines ( 4 . 5 ) a separately controllable pump ( 7 ) is provided. System nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel für die Einbringung des im Fluid befindlichen Analyten eine Probenleitung umfassen, die über ein Ventil die Teilstromleitung eingebunden wird.System according to claim 12 or 13, characterized that the means for the introduction of the located in the fluid Analytes include a sample line that passes through a valve the partial flow line is integrated. System nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor (1) ein SAW-Sensor ist.System according to claim 12, characterized in that the sensor ( 1 ) is a SAW sensor. System nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Steuermittel für die nahezu vollständige Automatisierung vorgesehen sind.System according to claim 12, characterized in that that control means for the almost complete Automation are provided.
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