DE102007011241A1

DE102007011241A1 - Isolated Photoprotein mtClytinDecay, as well as its use

Info

Publication number: DE102007011241A1
Application number: DE200710011241
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Golz; Eugene Prof. Dr. Vysotski; Svetlana Dr. Markova; Natalia Dr. Malikova; Ludmila Dr. Frank
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2007-03-08
Filing date: 2007-03-08
Publication date: 2008-09-11
Also published as: WO2008107104A1; TW200900418A

Abstract

Die Erfindung betrifft die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F, deren Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sowie die Aktivität und Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F.The invention relates to the photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F, their nucleotide and amino acid sequences as well as the activity and use of the photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F.

Description

Die Erfindung betrifft die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F, dessen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, sowie die Aktivität und Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F.The Invention relates to the photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F, its nucleotide and amino acid sequences, as well as the activity and use of the photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F.

PhotoproteinePhoto proteins

Als Biolumineszenz bezeichnet man das Phänomen der Lichterzeugung durch Lebewesen. Sie ist das Ergebnis von biochemischen Reaktionen in Zellen, bei denen die chemische Energie in Form von Lichtquanten abgegeben wird (sog. kalte Emission durch Chemolumineszenz). Derartig erzeugtes Licht ist monochromatisch, denn es wird bei einem diskreten Elektronen-Übergang abgestrahlt, kann aber durch sekundäre Leuchtfarbstoffe (z. B. fluoreszierende Proteine bei Leuchtquallen der Gattung Aequoria) in längerwellige Spektralbereiche verschoben werden.When Bioluminescence is the phenomenon of light generation by living beings. It is the result of biochemical reactions in cells where the chemical energy is released in the form of light quanta becomes (so-called cold emission by chemoluminescence). Such produced Light is monochromatic because it becomes at a discrete electron transition but can be emitted by secondary fluorescent dyes (eg fluorescent proteins in luminous jellyfish of the genus Aequoria) be shifted into longer wavelength spectral ranges.

Die biologische Funktion ist vielfältig: In der Meerestiefe zwischen 200 und 1000 m (Mesopelagial) leuchten rund 90% aller Lebewesen. Die Leuchtsignale werden hier zur Partnerwerbung, Täuschung und als Köder eingesetzt. Auch Glühwürmchen und Leuchtkäfer nutzen die Lichtsignale zur Partnersuche. Die Bedeutung des Leuchtens von Bakterien, Pilzen und einzelligen Algen ist dagegen unklar. Es wird vermutet, dass es zur Koordination von vielen Einzel-Individuen einer großen Population eingesetzt wird oder eine Art biologische Uhr darstellt.The biological function is varied: in the depth of the sea Between 200 and 1000 m (Mesopelagial), around 90% of all living beings light up. The flares become a partner advertisement, deception and used as bait. Also fireflies and fireflies use the light signals to find a partner. The importance of lighting of bacteria, fungi and unicellular Algae is unclear. It is believed that it is for coordination Used by many individuals of a large population becomes or represents a kind biological clock.

Eine Vielzahl an Coelenteraten ist biolumineszent ( Morin et al., 1974 ). Diese Organismen emittieren blaues oder grünes Licht. Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte Aequorin aus Aequoria victoria ( Shimomura et al., 1969 ) emittierte als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht grünes Licht wie phänotypisch beobachtet bei Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phänotypisch grün erscheinen lässt ( Johnson et al., 1962 ; Hastings et al., 1969 ; Inouye et al., 1994 ). Als weitere Photoproteine konnten noch Clytin ( Inouye et al., 1993 ), Mitrocomin ( Fagan et al., 1993 ) und Obelin ( Illarionov et al., 1995 ) identifiziert und beschrieben werden. Tabelle 1: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Name, der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc. No.) des Datenbankeintrages. Name Organismus Identifikations Nr. Obelin Obelia geniculata AAL86372 Clytin Clytia gregaria CAA49754 Aequorin Aequorea macrodactyla AAK02061 Aequorin Aequorea parva AAK02060 Mitrocomin Mitrocoma cellularia AAA29298 Pholasin Pholas dactylus AAM18085 ? Symplectoteuthis oualaniensis AX305029 Tabelle 2: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist, der Name des Photoproteins und eine Auswahl an Patenten bzw. Anmeldungen. Organismus Fluoreszierendes Protein Patent/Anmeldung Obelia geniculata Obelin WO03006497 Clytia gregaria Clytin WO03006497 Clytia gregaria mtClytin WO2005035559 Aequoria victoria Aequorin WO200168824 US-0908909 Pholas dactylus Pholasin WO0028025 GB-0024357 A variety of coelenterates is bioluminescent ( Morin et al., 1974 ). These organisms emit blue or green light. The 1962 first protein-producing protein identified Aequorin from Aequoria victoria ( Shimomura et al., 1969 ) emitted a blue light and not green light as an isolated protein, as observed phenotypically in Aequoria victoria. Later, the green fluorescent protein (GFP) could be isolated from Aequoria victoria, which causes the medusa to appear phenotypically green due to the stimulation by the aequorin ( Johnson et al., 1962 ; Hastings et al., 1969 ; Inouye et al., 1994 ). As further photoproteins still clytin ( Inouye et al., 1993 ), Mitrocomin ( Fagan et al., 1993 ) and obelin ( Illarionov et al., 1995 ) are identified and described. Table 1: Overview of some photoproteins. Given are the name, the organism from which the protein has been isolated and the identification number (Acc No.) of the database entry. Surname organism Identification no. obelin Obelia geniculata AAL86372 clytin Clytia gregaria CAA49754 aequorin Aequorea macrodactyla AAK02061 aequorin Aequorea parva AAK02060 mitrocomin Mitrocoma cellularia AAA29298 pholasin Pholas dactylus AAM18085 ? Symplectoteuthis oualaniensis AX305029 Table 2: Overview of some photoproteins. Given are the organism from which the protein has been isolated, the name of the photoprotein and a selection of patents or applications. organism Fluorescent protein Patent / Application Obelia geniculata obelin WO03006497 Clytia gregaria clytin WO03006497 Clytia gregaria mtClytin WO2005035559 Aequoria victoria aequorin WO200168824 US 0908909 Pholas dactylus pholasin WO0028025 GB 0024357

Biolumineszenz wird heute in der Technik vielfältig genutzt, z. B. in Form von Bio-Indikatoren für Umweltverschmutzung oder in der Biochemie zum empfindlichen Nachweis von Proteinen, zur Quantifizierung bestimmter Verbindungen oder als sogenannte "Reporter" bei der Untersuchung zellulärer Gen-Regulation.bioluminescence is widely used today in technology, for. In Form of bio-indicators of pollution or in biochemistry for the sensitive detection of proteins, for quantification certain compounds or as so-called "reporters" in the investigation cellular gene regulation.

Die Photoproteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sondern auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften.The Photoproteins differ not only because of their nucleotide and amino acid sequence, but also because of their biochemical and physical properties.

Es konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz von Photoproteinen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften verändert werden können. Beispiele von mutagenisierten Photoproteinen sind in der Literatur beschrieben ( US 6,495,355 ; US 5,541,309 ; US 5,093,240 ; Shimomura et al., 1986 ).It has been shown that altering the amino acid sequence of photoproteins can alter their physical and biochemical properties. Examples of mutagenized photoproteins are described in the literature ( US 6,495,355 ; US 5,541,309 ; US 5,093,240 ; Shimomura et al., 1986 ).

Die Lichterzeugung durch die oben genannten Photoproteine erfolgt durch die Oxidation von Coelenterazin ( Haddock et al., 2001 ; Jones et al., 1999 ).The light generation by the above-mentioned photoproteins takes place by the oxidation of coelenterazine ( Haddock et al., 2001 ; Jones et al., 1999 ).

Reportersystemereporter systems

Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.

1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
2. Reportergene. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehören die beta-Galaktosidase ( Alam et al., 1990 ), alkalische Phosphatase ( Yang et al., 1997 ; Cullen et al., 1992 ), Luciferasen und andere Photoproteine ( Shinomura, 1985 ; Phillips GN, 1997 ; Snowdowne et al., 1984 ).

Reporter or indicator genes are generally genes whose gene products can easily be detected by simple biochemical or histochemical methods. There are at least two types of reporter genes.

1. resistance genes. Resistance genes are genes whose expression confers on a cell resistance to antibiotics or other substances whose presence in the growth medium leads to cell death when the resistance gene is absent.
2. Reporter genes. The products of reporter genes are used in genetic engineering as fused or unfused indicators. The most common reporter genes include beta-galactosidase ( Alam et al., 1990 ), alkaline phosphatase ( Yang et al., 1997 ; Cullen et al., 1992 ), Luciferases and other photoproteins ( Shinomura, 1985 ; Phillips GN, 1997 ; Snowdowne et al., 1984 ).

Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.When Luminescence is the emission of photons in the visible Spectral range, these being excited by emitter molecules he follows. In contrast to fluorescence, this is the energy not shorter from the outside in the form of radiation Wavelength supplied.

Man unterscheidet Chemolumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion, die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.you distinguishes chemiluminescence and bioluminescence. As chemiluminescence A chemical reaction is called an excited reaction Molecule leads, which shines even when the excited electrons return to the ground state. Is this reaction going through catalyzing an enzyme is called bioluminescence. The at the Reaction enzymes are generally referred to as luciferases.

Herstellung der MutanteProduction of the mutant

Zur Herstellung der Mutanten wurden mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an den Position 141 [141F] (SEQ ID 1) und Position 182 [182F] (SEQ ID 3) eingefügt. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stratagene (Katalog Nummer #200521; Revision #063001b; Auflage 2003) verwendet. Als Primer wurden SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 verwendet. Die Vektoren wurde als pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F und pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F bezeichnet.to Production of the mutants were made using molecular biology methods the mutations at position 141 [141F] (SEQ ID 1) and position 182 [182F] (SEQ ID 3). For this purpose, the "Quick change" Process of the company Stratagene (catalog number # 200521; Revision # 063001b; Edition 2003). As primers, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12. The Vectors were identified as pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F and pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F designated.

mtClytinDecaymtClytinDecay

In der Literatur wurden bereits Photoproteine beschrieben, die durch Austausch einzelner Aminosäuren verändertete spektrale oder biochemische Eigenschaften aufwiesen. Zu diesen gehört Obelin W92F ( Vysotski et al., 2003 ) und Aequorin ( Shrestha et al., 2002 ; Ohmiya et al., 1993 ).In the literature, photoproteins have already been described which have altered spectral or biochemical properties by substitution of individual amino acids. These include Obelin W92F ( Vysotski et al., 2003 ) and aequorin ( Shrestha et al., 2002 ; Ohmiya et al., 1993 ).

Die mtClytin Mutante mtClytinDecay zeigt eine zeitlich veränderte Lichtfreisetzung verglichen mit dem Photoprotein mtClytin oder anderen Photoproteinen.The mtClytin mutant mtClytinDecay shows a temporally altered Light release compared with the photoprotein mtClytin or others Photo proteins.

Das Photoprotein mtClytinDecay zeigt überraschenderweise eine bisher noch nicht beschriebene verlangsamte Kinetik der Lichtfreisetzung bzw. Lumineszenz. Diese Eigenschaft ermöglicht die Verwendung des Photoproteins speziell für die Untersuchung von Reaktionen oder Mechanismen mit sehr schneller Kalziumfreisetzungen in eukaryotischen Zellen oder anderen Systemen. Die Kinetik der Lichtfreisetzung von bisher beschriebenen Photoproteinmutanten oder Photoprotein Wildtypproteinen wird als "flash" Kinetik beschrieben, da das Licht nach Aktivierung (z. B. mit Kalzium) in kürzester Zeit freigesetzt wird und die Reaktion anschließend zum Stilstand kommt oder zumindest deutlich schwächer wird. Zur Messung dieser schnellen Kinetik sind besondere Messinstrumente erforderlich. Die beschriebene Photoproteinmutante mtClytinDecay bzw. dessen Äquivalente ermöglicht nicht nur die Verwendung anderer Messinstrumente oder Messverfahren, sondern vor allem die Untersuchung von sehr schnellen Kinetiken. Diese Kinetiken können z. B. bei Ionenkanälen der Familie P2X auftreten.The Photoprotein mtClytinDecay surprisingly shows a not yet described slowed kinetics of light release or luminescence. This property allows use of the photoprotein specifically for the study of reactions or mechanisms with very fast calcium releases in eukaryotic Cells or other systems. The kinetics of the release of light from previously described photoprotein mutants or photoprotein wild-type proteins is described as "flash" kinetics, since the light after activation (eg with calcium) is released in a very short time and the reaction then comes to style or at least significantly weaker. To measure this fast Kinetics special measuring instruments are required. The described Photoprotein mutant mtClytinDecay or its equivalents not only allows the use of other measuring instruments or measurement method, but especially the investigation of very fast kinetics. These kinetics can z. B. in ion channels the family P2X occur.

mtClytinDecay zeichnet sich nicht nur durch eine veränderte Kinetik, sondern überraschenderweise auch durch eine besonders hohe Lichtfreisetzung aus. Diese hohe Lichtfreisetzung – verglichen mit anderen Mutanten Photoproteinen – ermöglicht die Verwendung der mtClytinDecay Mutanten als sensitives Reportergen. Die hohe Lichtfreisetzung ermöglicht auch die Verwendung von Messgeräten oder Verfahren, die mit der Lichtfreisetzung anderen Photoproteine oder Reportersystemen nur unzureichende Ergbenisse liefern.mtClytinDecay is not only characterized by a changed kinetics, but surprisingly also by a particularly high Light release off. This high release of light - compared with other mutants photoproteins - allows the use of mtClytinDecay mutants as a sensitive reporter gene. The high release of light also allows the use of gauges or procedures involving the release of light other photoproteins or reporter systems only insufficient results deliver.

Das Spektrum von mtClytin wurde im Maximum mit 470 nm beschrieben ( Shimomuro et al., 1966 ). Eine Übersicht über die spektralen Eigenschaften von Coelenterazine wurde in Shinomuro ( Shimomura et al., 2000 ) beschrieben.The spectrum of mtClytin was described in the maximum with 470 nm ( Shimomuro et al., 1966 ). An overview of the spectral properties of coelenterazines has been published in Shinomuro ( Shimomura et al., 2000 ).

Das Photoprotein mtClytinDecay zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene zu mtClytin aus Clytia gregaria mit einer Identität von 99%.The Photoprotein mtClytinDecay shows the highest homology at the amino acid level to mtClytin from Clytia gregaria with an identity of 99%.

Die Erfindung betrifft die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4. Ebenfalls betrifft die Erfindung die Nukleinsäuremoleküle dargestellt in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3.The The invention relates to the photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4. Also relates to the invention the nucleic acid molecules shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.

Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente oder Fragmente von mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F. Funktionelle Äquivalente oder Fragmente sind solche Proteine, die vergleichbare funktionelle Eigenschaften aufweisen.The The invention also relates to functional equivalents or fragments from mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F. Functional equivalents or fragments are those proteins that are comparable functional Have properties.

Die Erfindung betrifft mtClytin Photoproteine, die in der Postion 141 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszenzkinetik führen Hierbei können mtClytin Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 131–151, 136–146, bevorzugt 139–143, insbesondere 140–142 eine oder mehrere Aminosäuremutationen aufweisen, welche zu veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszentkinetik führen.The The invention relates to mtClytin photoproteins which are in the position 141 have an amino acid mutation which is altered Properties of bioluminescence, in particular bioluminescence kinetics This can cause mtClytin photoproteins too such photoproteins, which are in the range of amino acids 131-151, 136-146, preferably 139-143, in particular 140-142 one or more amino acid mutations which have altered the properties of the bioluminescence, especially the Biolumineszentkinetik lead.

Desweiteren betrifft die Erfindung mtClytin Photoproteine, die in der Postion 182 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszenzkinetik führen. Hierbei können mtClytin Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 172–192, 177–187, bevorzugt 180–184, insbesondere 181–183 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszenzkinetik führen. Als Bereiche mit ähnlichem Motif gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90%, insbesondere 95% aufweisen.Furthermore The invention relates to mtClytin photoproteins which are in the position 182 have an amino acid mutation which results in a altered properties of bioluminescence, in particular lead to the bioluminescence kinetics. Here you can mtClytin photoproteins may also be those photoproteins which are present in the Range of amino acids 172-192, 177-187, preferably 180-184, in particular 181-183 an amino acid mutation which leads to an altered properties of the Bioluminescence, in particular the Biolumineszenzkinetik lead. As regions with similar Motif apply here such sequences, which in this area an identity of 80%, more preferably 90%, in particular 95%.

Die Erfindung betrifft Kombinationen von mtClytin Photoproteinen, die im Bereich der Aminosäurepositionen 131–151, 136–146, bevorzugt 139–143, insbesondere 140–142 eine oder mehrere Aminosäuremutationen aufweisen, welche zu veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, führen, mit Mutationen im Bereich Aminosäureposition 182 oder Mutationen im Bereich von Aminosäureposition 182, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz führen. Desweiteren betrifft die Erfindung Kombinationen von mtClytin Photoproteinen, die in der Postion 182 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einer veränderten Biolumineszenzreaktion, insbesondere Biolumineszenzkinetik führen, mit Mutationen im Bereich Aminosäureposition 141. Hierbei können Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche in den erfindungsgemäßen Bereichen ein ähnliches Motiv aufweisen. Als Bereiche mit ähnlichem Motiv gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90%, insbesondere 95% aufweisen.The invention relates to combinations of mtClytin photoproteins which have one or more amino acid mutations in the region of the amino acid positions 131-151, 136-146, preferably 139-143, in particular 140-142, which lead to altered properties of the bioluminescence, with mutations in Be amino acid position 182 or amino acid position 182 mutations leading to altered bioluminescence properties. Furthermore, the invention relates to combinations of mtClytin photoproteins which have an amino acid mutation in the position 182 which lead to an altered bioluminescent reaction, in particular bioluminescence kinetics, with mutations in the amino acid position 141. In this case, photoproteins may also be those photoproteins which are similar in the fields according to the invention Have a motif. As regions with a similar motif here are those sequences that have an identity of 80%, preferably 90%, in particular 95% in this area.

Desweiteren sind Kombinationen von mutanten mtClytin, die zu veränderten biolumineszenten Eigenschaften, insbesondere der Biolumineszenzkinetik, führen mit Mutationen oder Derivaten von mtClytin oder Clytin, die zu veränderten physikochemischen Eigenschaften führen, insbesondere spektrale Eigenschaften, Kalziumsensitivität oder Substratbindung.Furthermore are combinations of mutant mtClytin that are too altered bioluminescent properties, in particular bioluminescence kinetics, lead with mutations or derivatives of mtClytin or Clytin, that lead to altered physicochemical properties, in particular spectral properties, calcium sensitivity or substrate binding.

Ebenfalls sind funktionelle Fragmente des mtClytinDecay Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß.Also are functional fragments of mtClytinDecay protein or for such encoding nucleic acids according to the invention.

Ebenfalls sind verkürzte funktionelle Fragmente weiterer erfindungsgemäßer Proteine bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren Bestandteil der Erfindung.Also are truncated functional fragments of other inventive Proteins or for such encoding nucleic acids Component of the invention.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Innenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable as reporter genes for cellular systems specific for receptors, for Internal channels, for transporters, for transcription factors or for inducible systems.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich auch als Reportergene durch Markierung, Identifizierung und Charakterisierung von Zellorganellen speziell für Mitochondrien.The Photoproteins mtClytinDecay are also suitable as reporter genes Labeling, identification and characterization of cell organelles especially for mitochondria.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich auch als Reportergene zur Bestimmung von Parametern innerhalb und ausserhalb von Zellorganellen, speziell von Mitochondrien, speziell von Kalziumkonzentrationen.The Photoproteins mtClytinDecay are also useful as reporter genes Determination of parameters inside and outside of cell organelles, specifically of mitochondria, especially of calcium concentrations.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bacculo, in Pflanzen.The Photoproteins mtClytinDecay are useful as reporter genes in bacterial and eukaryotic systems specifically in mammalian cells, in Bacteria, in yeasts, in bacculo, in plants.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen, speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable as reporter genes for cellular systems in combination with bioluminescent or chemiluminescent systems, especially systems with luciferases, with oxygenases, with phosphatases.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Fusionsproteine speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine und für Glykoproteine.The Photoproteins mtClytinDecay are particularly suitable as fusion proteins for receptors, for ion channels, for Transporters, for transcription factors, for proteinases, for kinases, for phosphodiesterases, for hydrolases, for peptidases, for transferases, for Membrane proteins and for glycoproteins.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.The Photoproteins mtClytinDecay are particularly suitable for immobilization by antibodies, by biotin, by magnetic or magnetizable carriers.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Proteine für Systeme des Energietransfers speziell der FREI-(Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET-(Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET(field effect transistors), FP(fluorescence polarization), HTRF(Homogeneous time-resolved fluorescence)Systemen.The Photoproteins mtClytinDecay are useful as proteins for Systems of energy transfer specifically the FREES (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) systems.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable for marking substrates or ligands specifically for proteases, for kinases, for transferases.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrat für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable for expression in bacterial Systems specifically for titer determination, as a substrate for biochemical systems especially for proteinases and kinases.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Innenkanäle und andere Proteine.The Photoproteins mtClytinDecay are especially coupled as markers to antibodies coupled to enzymes coupled to receptors, coupled to internal channels and other proteins.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).The Photoproteins mtClytinDecay are useful as reporter genes in the pharmacological drug discovery especially in HTS (High Throughput Screening).

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene bei der Charakterisierung, Identifizierung und Untersuchung von Ionenkanälen, speziell des Typs P2X, TRP, SCN, KCN, CNG, ACCN.The Photoproteins mtClytinDecay are useful as reporter genes in the Characterization, identification and investigation of ion channels, specifically of the type P2X, TRP, SCN, KCN, CNG, ACCN.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Komponenten von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mikroskopie.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable as components of detection systems especially for ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), for immunohistochemistry, for western blot, for confocal microscopy.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechselwirkungen (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid;).The Photoproteins mtClytinDecay are useful as markers for the analysis of interactions specifically for protein-protein interactions, for DNA-protein interactions, for DNA-RNA interactions, for RNA-RNA interactions, for RNA-protein interactions (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid;).

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker oder Fusionsprotein für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable as markers or fusion proteins for expression in transgenic organisms especially in Mice, in rats, in hamsters and other mammals, in primates, in fish, in worms, in plants.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable as markers or fusion proteins for analysis of embryonic development.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.The Photoproteins mtClytinDecay are useful as markers a coupling agent specifically via biotin, via NHS (N-hydroxysulfosuccimide), via CN-Br.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable as reporters coupled to Nucleic acids specifically to DNA, to RNA.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable as reporters coupled to Proteins or peptides.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reporter zur Messung von intra- oder extrazellulären Calziumkonzentrationen.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable as reporters for measurement of intracellular or extracellular calcium concentrations.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Charakterisierung von Signalkaskaden in zellulären Systemen.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable for the characterization of Signal cascades in cellular systems.

Die an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelten Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Sonden speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen.The nucleic acids or peptides-coupled photoproteins mtClytinDecay are suitable as probes especially for Northern blots, for Southern blots, for western blots, for ELISA, for nucleic acid sequencing, for Protein analyzes, chip analyzes.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".The Photoproteins mtClytinDecay are suitable for pharmacological labeling Formulations especially of infectious agents, of antibodies, of "small molecules".

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable for geological Investigations specifically for marine, groundwater and river currents.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefe Systemen, in Bacculo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable for expression in expression systems especially in in vitro translation systems, in bacterial systems, in yeast systems, in bacculo systems, in viral systems, in eukaryotic systems Systems.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven.The Photoproteins mtClytinDecay are suitable for the visualization of tissues or cells during surgery, especially invasive, in non-invasive, minimally invasive.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und anderen phänotypisch veränderten Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen Eingriffen.The Photoproteins mtClytinDecay are also suitable for labeling Tumor tissues and other phenotypically altered Tissues specifically in histological examination, at operative Interventions.

Die Erfindung betrifft auch die Reinigung der Photoproteine mtClytinDecay speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.The The invention also relates to the purification of the photoproteins mtClytinDecay especially as wild-type protein, as fusion protein, as mutagenized Protein.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur gleichzeitigen Messung verschiedener Reportergene in einem Expressionsystem (multiplexing).The Photoproteins mtClytinDecay are suitable for simultaneous measurement various reporter genes in an expression system (multiplexing).

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.The invention also relates to the use of photoproteins mtClytinDecay in the field of Kos especially of bath products, lotions, soaps, body colors, toothpaste, body powders.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.The The invention also relates to the use of the photoproteins mtClytinDecay for coloring foodstuffs, bath additives, of ink, textiles, plastics.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.The The invention also relates to the use of the photoproteins mtClytinDecay for coloring paper, especially greeting cards, of paper products, of wallpaper, of craft articles.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoprotein mtClytinDecay zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.The The invention also relates to the use of the photoprotein mtClytinDecay for coloring liquids especially for Water pistols, for fountains, for drinks, for ice cream.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke.The The invention also relates to the use of the photoproteins mtClytinDecay for making toys especially of finger paint, make-up.

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 2 bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente desselben kodieren.The The invention relates to nucleic acid molecules containing the Polypeptide disclosed by SEQ ID NO: 2 or functional equivalents or functional fragments thereof.

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 4 bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente desselben kodieren.The The invention relates to nucleic acid molecules containing the Polypeptide disclosed by SEQ ID NO: 4 or functional equivalents or functional fragments thereof.

Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Nukleinsäuremoleküle bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente derselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beinhaltet;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz enthalten;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins aufweisen; Eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen wird in einer wässrigen Lösung, die 0,2 × SSC (1 × standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 68°C durchgeführt ( Sambrook et al., 1989 ).
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden.

The invention further relates to nucleic acid molecules or functional equivalents or functional fragments thereof, selected from the group consisting of:

a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4;
b) nucleic acid molecules containing the sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3;
c) nucleic acid molecules whose complementary strand hybridizes with a nucleic acid molecule from a) or b) under stringent conditions and whose expression product has the biological function of a photoprotein; Stringent hybridization of nucleic acid molecules is carried out in an aqueous solution containing 0.2 × SSC (1 × standard saline citrate = 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate) at 68 ° C. ( Sambrook et al., 1989 ).
d) Nucleic acid molecules which differ from those mentioned under c) due to the degeneration of the genetic code.

Die Erfindung betrifft die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, bei denen die Sequenz einen funktionalen Promotor 5' zu der das Photoprotein kodierenden Sequenz bzw. der das Leader- oder Signalsequenz kodierenden Sequenz enthält.The Invention relates to the above-mentioned nucleic acid molecules, in which the sequence is a functional promoter 5 'to which Photoprotein coding sequence or coding the leader or signal sequence Contains sequence.

Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren sind.The The invention also relates to nucleic acid molecules such as previously described, which is part of recombinant DNA or RNA vectors.

Die Erfindung betrifft Organismen, die einen solchen Vektor enthalten.The The invention relates to organisms containing such a vector.

Die Erfindung betrifft Photoproteine, die durch die vorhergehend beschriebenen Nukleotidsequenzen kodiert sind.The This invention relates to photoproteins characterized by those previously described Nucleotide sequences are encoded.

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.The The invention relates to methods of expression of the invention Photoprotein polypeptides in bacteria, eukaryotic cells or in in vitro expression systems.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptides.The The invention also relates to methods of purification / isolation of a Photoprotein polypeptides according to the invention.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, für Photoproteine kodierende Nukleinsäuren als Marker- oder Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.The Invention relates to the use of the invention, for photoproteins encoding nucleic acids as Marker or reporter genes, especially for the pharmacological Drug discovery and diagnostics.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Photoproteine bzw. eine erfindungsgemäße, für ein Photoprotein kodierende Nukleinsäure als Marker oder Reporter bzw. als Marker- oder Reportergen.The Invention relates to the use of the invention Photoproteins or an inventive, for a nucleic acid encoding a photoprotein as a marker or Reporter or as a marker or reporter gene.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4) oder seiner funktionellen Fragmente oder Äquivalente bzw. die Verwendung einer für das Photoprotein mtClytinDecay kodierenden Nukleinsäure oder ihrer funktionellen Fragmente oder Äquivalente als Marker oder Reporter bzw. als Marker oder Reportergen insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.The The invention relates to the use of photoproteins mtClytinDecay (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4) or its functional fragments or equivalents or the use of a for the photoprotein mtClytinDecay encoding nucleic acid or their functional fragments or equivalents Marker or reporter or as a marker or reporter gene in particular for pharmacological drug discovery and diagnostics.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.The The invention relates to the use of those shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 nucleic acid as marker or reporter gene, especially for pharmacological drug discovery and Diagnostics.

Gegenstand der Erfindung sind auch polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid erkennen.object The invention also includes polyclonal or monoclonal antibodies, which recognize a polypeptide of the invention.

Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die das Photoprotein mtClytinDecay (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4) erkennen.The Invention also relates to monoclonal or polyclonal antibodies, which comprises the photoprotein mtClytinDecay (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4) recognize.

Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure wie in den vorangehenden Absätzen beschrieben, welche einen funktionalen Promotor 5' zur kodierenden Sequenz enthält.The The invention also relates to a nucleic acid as in the preceding Paragraphs describing a functional promoter 5 'to the coding sequence contains.

Die Erfindung beinhaltet rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren enthalten.The The invention includes recombinant DNA or RNA vectors which contain the above-described nucleic acids.

Organismen, die einen wie vorangehend beschriebenen Vektor enthalten, sind ebenfalls erfindungsgemäß.organisms which contain a vector as described above are also according to the invention.

Ein Polypeptid, das durch eine wie oben beschriebene Nukleinsäuresequenz kodiert ist, ist ebenfalls Teil der Erfindung.One A polypeptide obtained by a nucleic acid sequence as described above is also part of the invention.

Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Expression der vorangehend genannten Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.According to the invention also a method for expression of the aforementioned polypeptides in bacteria, eukaryotic cells or in in vitro expression systems.

Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides.component The invention is also a process for purification / isolation a polypeptide of the invention.

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen.The The invention relates to the use of an inventive Nucleic acid as a marker or reporter gene.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Photoproteins als Marker oder Reporter.The The invention also relates to the use of an inventive Photoproteins as markers or reporters.

Bestandteil der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polyppeptids in Kombination mit einer oder mehrerer Luziferasen und/oder einem oder mehrerer Photoproteine.component The invention also relates to the use of an inventive Polyppeptids in combination with one or more luciferases and / or one or more photoproteins.

Erfindungsgemäß ist ein Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Position 131–151, 136–146, bevorzugt 139–143, insbesondere 140–142 oder eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Position 172–192, 177–187, bevorzugt 180–184, insbesondere 181–183 oder einer Kombination aus beiden, besitzt und welches ein verändertes, speziell verlangsamtes Biolumineszenzsignal aufweist.According to the invention a photoprotein or a functional fragment thereof, which one or more mutations in the field of heading 131-151, 136-146, preferably 139-143, in particular 140-142 or one or more mutations in position 172-192, 177-187, preferably 180-184, especially 181-183 or a combination of both, owns and which has a changed, Specially slowed bioluminescence signal has.

Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz beinhaltet, die für ein Protein gemäß der beiden vorangehenden Abschnitte kodiert.Also According to the invention, a nucleic acid molecule, which contains a sequence corresponding to a protein according to the encoded in both preceding sections.

Ein weiteres Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Photoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Photoprotein in der Region definiert durch Position 131–151, 136–146, bevorzugt 139–143, insbesondere 140–142 oder eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Position 172–192, 177–187, bevorzugt 180–184, insbesondere 181–183 eine oder mehrere Mutationen eingeführt werden, was zu einer Veränderung der Biolumineszenz, insbesondere Biolumineszenzkinetik führt.One Another component of the invention is a process for the preparation a photoprotein, characterized in that in a photoprotein defined in the region by heading 131-151, 136-146, preferably 139-143, in particular 140-142 or a or several mutations in the area of the position 172-192, 177-187, preferably 180-184, in particular 181-183 one or several mutations are introduced, leading to a change the bioluminescence, in particular bioluminescence kinetics leads.

Ein Photoprotein, hergestellt durch ein Verfahren wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben ist ebenfalls erfindungsgemäß.One Photoprotein prepared by a method as in the preceding Section described is also according to the invention.

Die Erfindung betrifft auch andere Photoproteine, die durch eine oder mehrere Veränderungen in der Aminosäuresequenz eine veränderte Kinetik der Lichtfreisetzung aufweisen.The The invention also relates to other photoproteins which are characterized by one or more several changes in the amino acid sequence have a modified kinetics of the release of light.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung anderer veränderter Photoproteine für die beschriebenen Verwendungen der Mutanten des Photoproteins mtClytinDecay.The The invention also relates to the use of other modified ones Photoproteins for the described uses of the mutants of the photoprotein mtClytinDecay.

Photoproteine mit veränderter Kinetik der Lichtfreisetzung, besonders einer verlangsamten Lichtfreisetzung oder verlängerten Zeitspanne, in der Licht freigesetzt wird, eignen sich besonders als Reportergene in zellbasierten Verfahren, speziell in der pharmakologischen Wirkstoffsuche und Charakterisierung, speziell in der Diagnostik.Photo proteins with altered kinetics of light release, especially a slowed release of light or prolonged Period of time in which light is released, are particularly suitable as reporter genes in cell-based procedures, especially in the pharmacological Drug search and characterization, especially in diagnostics.

Photoproteine mit veränderter Kinetik der Lichtfreisetzung, besonders einer verlangsamten Lichtfreisetzung oder verlängerten Zeitspanne, in der Licht freigesetzt wird, eignen sich besonders zur Untersuchung von Ionenkanälen.Photo proteins with altered kinetics of light release, especially a slowed release of light or prolonged Period of time in which light is released, are particularly suitable for the investigation of ion channels.

Die Erfindung betrifft auch kodonoptimierte Varianten der erfindungsgemäßen Proteine zur Veränderung der biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften, speziell der verbesserten Expression, speziell der veränderten Stabilität.The The invention also relates to codon-optimized variants of the invention Proteins for the modification of biochemical or physicochemical Properties, especially improved expression, especially the changed stability.

Die Erfindung betrifft auch Fusionen der erfindungsgemäßen Proteine mit Erkennungspeptiden zum Transport oder Lokalisierung der erfindungsgemäßen Proteinen in Zellorganellen oder Kompartimenten.The Invention also relates to fusions of the invention Proteins with recognition peptides for transport or localization the proteins according to the invention in cell organelles or compartments.

Die Erfindung betrifft auch Varianten der erfindungsgemäßen Proteine, die zu einer Veränderung der spektralen Eigenschaften, der Lumineszenzintensität, der Substratspezifität, der Verwendung von Cofaktoren, der Kalziumaffinität oder anderer physikochemischen oder biochemischen Eigenschaften führen.The Invention also relates to variants of the invention Proteins leading to a change in the spectral properties, the luminescence intensity, the substrate specificity, the use of cofactors, calcium affinity or other physicochemical or biochemical properties.

Der kinetische Verlauf der Lichtfreisetzung kann in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen variieren. In 7 ist der kinetische Verlauf der Lichtfreisetzung für mtClytinDecay beispielhaft gezeigt.The kinetic course of the release of light may vary depending on the experimental conditions. In 7 For example, the kinetic course of the release of light for mtClytinDecay is shown by way of example.

Expression der erfindungsgemäßen PhotoproteineExpression of the invention Photo proteins

Als Expression bezeichnet man die Produktion eines Moleküls, das nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in einen Expressionsvektor klonierte Fremdgen erlaubt. Expressionsvektoren enthalten die für die Expression von Genen in Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale.When Expression is the production of a molecule, after insertion of the gene into a suitable host cell Transcription and translation of the cloned into an expression vector Foreign gene allowed. Expression vectors contain the for the expression of genes in cells of prokaryotes or eukaryotes required control signals.

Expressionsvektoren können prinzipiell auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Bei den sogenannten Transkriptionsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als authentisches, biologisch aktives Protein synthetisiert. Der Expressionsvektor trägt hierzu alle zur Expression benötigten 5'- und 3'-Kontrollsignale.expression vectors can in principle be constructed in two different ways become. In the so-called transcription mergers, the von der einklonierten foreign gene coded protein as authentic, biological synthesized active protein. The expression vector carries all 5'- and 3'-control signals required for expression.

Bei den sogenannten Translationsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein zusammen mit einem anderen Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen lässt. Die zur Expression benötigten 5'- und 3'-Kontrollsignale inklusive des Startcodons und eventuell ein Teil der für die N-terminalen Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen vom Vektor. Der zusätzliche eingeführte Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteasen, sondern lässt sich auch zum Nachweis und zur Isolierung des gebildeten Hybridproteins einsetzen. Die Expression kann sowohl transient, als auch stabil erfolgen. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen, Viren als auch eukaryotische Systeme.at The so-called translational fusions become that of the cloned one Foreign gene encoded protein as hybrid protein together with another Expressed protein that can be easily detected. The included for expression 5 'and 3' control signals included the start codon and possibly a part of the for the N-terminal Regions of the hybrid protein to be formed coding sequences derived from the vector. The additional introduced protein part not only stabilizes that of the cloned in many cases Foreign gene encoded protein from degradation by cellular Proteases, but can also be used for detection and Use isolation of the formed hybrid protein. The expression can be transient, as well as stable. As host organisms Bacteria, yeasts, viruses as well as eukaryotic are suitable Systems.

Reinigung der erfindungsgemäßen PhotoproteinePurification of the invention Photo proteins

Die Isolierung von Proteinen (auch nach Überexpression) wird häufig als Proteinreinigung bezeichnet. Zur Proteinreinigung steht eine Vielzahl an etablierten Methoden und Verfahren zur Verfügung.The Isolation of proteins (even after overexpression) is commonly referred to as protein purification. For protein purification There are a variety of established methods and procedures available.

Die Fest-Flüssig-Trennung ist eine Grundoperation bei Proteinisolierungen. Sowohl bei der Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium als auch bei der Klärung des Rohextraktes nach Zellaufschluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei der Abtrennung von Niederschlägen nach Fällungen usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Er erfolgt durch Zentrifugation und Filtration.The Solid-liquid separation is a basic operation in protein isolation. Both in the separation of the cells from the culture medium and in the clarification of the crude extract after cell disruption and removal cell debris, at separation of precipitates after precipitation, etc., the process step is required. It is done by centrifugation and filtration.

Durch Gewinnung intrazellulärer Proteine muss die Zellwand zerstört bzw. durchlässig gemacht werden. Je nach Maßstab und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rührwerkskugel- bzw. Glasperlenmühlen eingesetzt. Im Labormaßstab kommen u. a. mechanische Zellintegrationen und Ultraschallbehandlung zum Einsatz.By Extraction of intracellular proteins must destroy the cell wall or permeable. Depending on the scale and organism are mixed with high-pressure homogenizers or agitator beads. or glass bead mills used. In the laboratory scale come u. a. mechanical cell integrations and ultrasound treatment for use.

Sowohl für extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln (Alkohole, Aceton) eine schnelle und effiziente Methode zur Konzentration von Proteinen. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung der löslichen Nukleinsäuren erstrebenswert (Fällung z. B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat). Bei der Gewinnung extrazellulärer Proteine werden häufig Träger (z. B. Stärke, Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten.Either for extracellular as well as intracellular Proteins (after cell disruption) are different precipitation methods with salts (especially ammonium sulfate) or organic solvents (Alcohols, acetone) a fast and efficient method of concentration of proteins. When purifying intracellular proteins is the removal of soluble nucleic acids desirable (precipitation eg with streptomycin or protamine sulfate). In the extraction of extracellular proteins are common Carrier (eg starch, kieselguhr) before adding the Precipitant added to more manageable rainfall to obtain.

Für die Feinreinigung stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren zur Verfügung (Absorptions- und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Elektrophoresen). Eine Säulenchromatographie wird auch im technischen Maßstab angewandt. Für den Labormaßstab ist vor allem die Affinitätschromatographie von Bedeutung, die Reinigungsfaktoren bis zu mehreren 100 pro Schritt ermöglicht.For The fine cleaning are numerous chromatographic and distribution methods available (absorption and ion exchange chromatography, Gel filtration, affinity chromatography, electrophoreses). A column chromatography is also on an industrial scale applied. For the laboratory scale is above all the affinity chromatography of importance, the purification factors up to several hundred per step.

Extrazelluläre Proteine fallen in relativ verdünnten Lösungen an. Sie müssen ebenso wie extrazelluläre Proteine vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. Neben den schon erwähnten Verfahren hat sich – auch im industriellen Maßstab – die Ultrafiltration bewährt.Extracellular Proteins fall into relatively dilute solutions at. They must as well as extracellular proteins be concentrated before their further use. Besides the ones already mentioned process has become - even in industrial Scale - the ultrafiltration proven.

Anorganische Salze als Begleitstoffe von Proteinen sind für spezifische Anwendungen häufig unerwünscht. Sie können u. a. durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden.inorganic Salts as concomitants of proteins are specific Applications often undesirable. You can u. a. be removed by gel filtration, dialysis and diafiltration.

Zahlreiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum Einsatz. Als Trocknungsverfahren sind die Vakuum-, Gefrier- und Sprühtrocknung von Bedeutung.numerous Proteins are used as dry preparations. As a drying process are the vacuum, freeze and spray drying of importance.

Nukleotid- und AminosäuresequenzenNucleotide and amino acid sequences

Das Photoprotein mtClytinDecay-141F wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 1):

The photoprotein mtClytinDecay-141F is encoded by the following nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1):

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 2):

This results in an amino acid sequence of (SEQ ID NO: 2):

Das Photoprotein mtClytinDecay-182F wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 3):

The photoprotein mtClytinDecay-182F is encoded by the following nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3):

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 4):

This results in an amino acid sequence of (SEQ ID NO: 4):

Das Photoprotein mtClytin wird in Patentanmeldung WO2005035559 beschrieben und wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 5):

The photoprotein mtClytin is in patent application WO2005035559 and is encoded by the following nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5):

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 6):

This results in an amino acid sequence of (SEQ ID NO: 6):

Das putative Signalpeptide des Photoprotein mtClytin besitzt folgende Sequenz (SEQ ID NO: 7):

und weist folgende Nukleinsäuresequenz auf

The putative signal peptide of the photoprotein mtClytin has the following sequence (SEQ ID NO: 7):

and has the following nucleic acid sequence

Zu Herstellung der Mutante mtClytinDecay-141 F wurde folgende primer verwendet:

To prepare the mutant mtClytinDecay-141 F, the following primers were used:

Zu Herstellung der Mutante mtClytinDecay-182F wurde folgende primer verwendet:

To prepare the mutant mtClytinDecay-182F, the following primers were used:

Diese Sequenzen finden sich im Sequenzlisting wieder.These Sequences can be found in the sequence listing again.

Kurze Beschreibung der FigurenBrief description of the figures

1: Die 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F. 1 : The 1 shows the plasmid map of the vector pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F.

2: Die 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F 2 : The 2 shows the plasmid map of the vector pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F

3: Die 3 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-141F. 3 : The 3 shows the plasmid map of the vector pcDNA3-mtClytinDecay-141F.

4: Die 4 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-182F. 4 : The 4 shows the plasmid map of the vector pcDNA3-mtClytinDecay-182F.

5: Die 5 zeigt das Alignment der Photoproteine mtClytin, mtClytinDecay-141F und mtClytin-182F auf Aminosäureebene. 5 : The 5 shows the alignment of the photoproteins mtClytin, mtClytinDecay-141F and mtClytin-182F at the amino acid level.

6: Die 6 zeigt die Biolumineszenzreaktion von mtClytinDecay nach bakterieller Expression X-Achse: Zeit in Sekunden; Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units). 6 : The 6 shows the bioluminescent reaction of mtClytinDecay after bacterial expression X-axis: time in seconds; Y axis: relative light units.

7: Die 8 zeigt die Biolumineszenzreaktion von mtClytinDecay nach eukaryotischer Expression. X-Achse: Zeit in Sekunden; Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units); Die Angaben in der Legende entsprechen der finalen Konzentration an ATP (Adenosintriphosphat) im beschriebenen experimentellen Ansatz. 7 : The 8th shows the bioluminescent reaction of mtClytinDecay after eukaryotic expression. X-axis: time in seconds; Y axis: relative light units; The data in the legend correspond to the final concentration of ATP (adenosine triphosphate) in the described experimental approach.

BeispieleExamples

Beispiel 1example 1

Zur Herstellung der Mutante wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an der Position 141 oder 182 eingefügt. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stragene (USA) verwendet. Als Primer wurden (SEQ ID NO: 9 + 10) und (SEQ ID NO: 11 + 12) verwendet. Die Insertion der cDNA erfolgte in die Schnittstelle SfiIA-SfiIB des Vektors pTrip1Ex2. Die Vektoren wurde als pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F und pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F bezeichnet.to Production of the mutant was using molecular biological methods the mutations are inserted at position 141 or 182. For this purpose, the "quick change" method of Stragene (USA) used. As primers (SEQ ID NO: 9 + 10) and (SEQ ID NO: 11 + 12). The insertion of the cDNA was carried out in the interface SfiIA-SfiIB of the vector pTrip1Ex2. The vectors were named pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F and pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F.

Die 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTirp1Ex2-mtClytinDecay-141F.The 1 shows the plasmid map of the vector pTirp1Ex2-mtClytinDecay-141F.

Die 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTirp1Ex2-mtClytinDecay-182F.The 2 shows the plasmid map of the vector pTirp1Ex2-mtClytinDecay-182F.

Beispiel 2Example 2

Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. Die Derivate des Vektors wurde als pcDNA3-mtClytinDecay-141F und pcDNA3-mtClytinDecay-182F bezeichnet. Die Vektoren pcDNA3-mtClytinDecay-141F und pcDNA3-mtClytinDecay-182F wurden zur Expression von mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F in eukaryotischen Systemen verwendet.When Vector for the preparation of the construct shown below the plasmid pcDNA3.1 (+) from Clontech was used. The Derivatives of the vector were identified as pcDNA3-mtClytinDecay-141F and pcDNA3-mtClytinDecay-182F designated. The vectors pcDNA3-mtClytinDecay-141F and pcDNA3-mtClytinDecay-182F were used to express mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F used in eukaryotic systems.

Die 3 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-141F.The 3 shows the plasmid map of the vector pcDNA3-mtClytinDecay-141F.

Die 4 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-182F.The 4 shows the plasmid map of the vector pcDNA3-mtClytinDecay-182F.

Beispiel 3Example 3

Bakterielle ExpressionBacterial expression

Die bakterielle Expression erfolgte in E. coli durch Transformation der Bakterien mit den Expressionsplasmiden pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F oder pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F. Die transformierten Bakterien wurden in LB-Medium bei 37°C für 3 Stunden inkubiert und die Expression nach Herstellerangaben induziert. Die induzierten Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris/HCl (pH 9,0) + 5 mM EDTA resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. Das Lysat wurde anschliessend für 15 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute (16000 rcf) zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Der Überstand wurde 3 Stunden mit Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in Tris/HCl pH 9,0) im dunkeln inkubiert. Direkt nach der Zugabe von 5 mM Calziumchlorid wurde die Biolumineszenz im Luminometer gemessen. Die Integrationszeit der Messung betrug 60 Sekunden.Bacterial expression was carried out in E. coli by transformation of the bacteria with the expression plasmids pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F or pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F. The transformed bacteria were incubated in LB medium at 37 ° C for 3 hours and the expression according to manufacturer indu ed. The induced bacteria were harvested by centrifugation, resuspended in 50mM Tris / HCl (pH 9.0) + 5mM EDTA and disrupted by sonication. The lysate was then centrifuged for 15 minutes at 13,000 revolutions per minute (16,000 rcf) and the supernatant removed. The supernatant was incubated for 3 hours with coelenterazine (10E-07 M coelenterazine in Tris / HCl pH 9.0) in the dark. Immediately after the addition of 5 mM calcium chloride, the bioluminescence in the luminometer was measured. The integration time of the measurement was 60 seconds.

Die 6 zeigt die Kinetik der Biolumineszenzmessung von mtClytinDecay in Bakterien.The 6 shows the kinetics of bioluminescence measurement of mtClytinDecay in bacteria.

Beispiel 4Example 4

Eukaryotische ExpressionEukaryotic expression

Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-mtClytinDecay-141F, pcDNA3-mtClytinDecay-182F und pcDNA3.1(+) in transienten oder stabilen Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM-F12 Medium inkubiert. Anschliessend wurde das Medium entfernt und durch 50 μl Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in PBS) ersetzt. Die Zellen wurden für 24 Stunden bei 28°C inkubiert und anschliessend ATP (Adenosintriphosphat) bis zu einer Finalkonzentration von 5 μM zugegeben. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe im Luminometer gestartet. Die Integrationszeit betrug 1 Sekunde, bei einer Gesamtmessdauer von 90 Sekunden.The constitutive eukaryotic expression was carried out in CHO cells Transfection of the cells with the expression plasmids pcDNA3-mtClytinDecay-141F, pcDNA3-mtClytinDecay-182F and pcDNA3.1 (+) in transient or stable Experiments. For this purpose, 10000 cells per hole in DMEM-F12 medium plated on 96 well microtiter plates and overnight incubated at 37 ° C. The transfection was done with help of the Fugene 6 kit (Roche) according to the manufacturer's instructions. The transfected Cells were incubated overnight at 37 ° C in DMEM-F12 medium incubated. Subsequently, the medium was removed and replaced by 50 μl Coelenterazine (10E-07M coelenterazine in PBS). The cells were incubated for 24 hours at 28 ° C and then ATP (adenosine triphosphate) up to a final concentration of 5 μM added. The measurement was made immediately after the addition in the luminometer started. The integration time was 1 second, for a total measurement time of 90 seconds.

Die 7 zeigt die Ergebnisse der Biolumineszenzmessung von mtClytinDecay in CHO Zellen.The 7 shows the results of the bioluminescence measurement of mtClytinDecay in CHO cells.

Beispiel 5Example 5

Die 5 zeigt das Alignment von mtClytinDecay-141F, mtClytinDecay-182F mit mtClytin (wildtype; wt) auf Aminosäureebene.The 5 shows the alignment of mtClytinDecay-141F, mtClytinDecay-182F with mtClytin (wildtype; wt) at the amino acid level.

Beispiel 6Example 6

Kinetische Analyse von mtClytinDecay in expremiert in CHO ZellenKinetic analysis of mtClytinDecay in expressed in CHO cells

Zur kinetischen Analyse der Biolumineszenz von mtClytinDecay-141F, wurden CHO (Chinese Hamster Ovarian Cells) Zellen mit pcDNA3-mtClytinDecay-141F bzw. pcDNA3 (ohne integrierte cDNA) transfiziert. Die Transfektion und Messung erfolgte wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Messdaten wurden für einen Zeitraum von 60 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde erhoben.to kinetic analysis of the bioluminescence of mtClytinDecay-141F, were CHO (Chinese hamster ovarian cells) cells with pcDNA3-mtClytinDecay-141F or pcDNA3 (without integrated cDNA) transfected. The transfection and measurement was carried out as described in Example 4. The measured data were for a period of 60 seconds with an integration time raised by 1 second.

Die 7 zeigt die Ergebnisse der kinetischen Analyse von mtClytinDecay in CHO Zellen.The 7 shows the results of the kinetic analysis of mtClytinDecay in CHO cells.

Beispiel 7Example 7

Verwendung von mtClytinDecay in multiplexing ExperimentenUsing mtClytinDecay in multiplexing experiments

Die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytin-182F eignen sich als Komponenten von multiplexing Readout-Verfahren, in denen mehrere Reportergene (z. B. Luziferasen oder Photoproteine) in einem experimentellen Ansatz verwendet werden. Hierzu wurden mtClytinDecay-141F oder mtClytinDecay-182F expremierende CHO-Zellen im Verhältnis 1:1 (oder 1:2, 1:3, ..) mit CHO Zellen gemischt, die das wildtyp Photoprotein mtClytin expremierten. Die Zelle, die das wildtyp mtCyltin expremierten, expremierten zusätzlich einen G-Protein gekoppelten Rezeptor (z. B. Neuromedin U Rezeptor 2). Die Zellmischung wurde auf 96, 384 oder 1536 Loch-Mikrotiterplatten ausgebracht und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert.The Photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytin-182F are useful as Components of multiplexing readout methods in which multiple Reporter genes (eg luciferases or photoproteins) in an experimental Approach can be used. For this purpose, mtClytinDecay-141F or mtClytinDecay-182F expressing CHO cells in the ratio 1: 1 (or 1: 2, 1: 3, ..) mixed with CHO cells containing the wild-type photoprotein mtClytin expremierten. The cell expressing the wild-type mtCyltin, additionally expressed a G-protein coupled receptor (eg neuromedin U receptor 2). The cell mixture was set to 96, 384 or 1536 hole microtiter plates and applied for Incubated at 37 ° C for 24 hours.

Anschliessend wurden die Zellen mit Coelenterazine beladen (wie unter Beispiel 4 beschrieben). Durch die Zugabe des G-Protein Rezeptor Agonisten kommt es zur intrazellulären Kalziumfreisetzung, die durch das wildtyp mtClytin ausgelesen werden kann (Lichtfreisetunzung durch wildtyp Aequorin). Durch die anschliessende Zugabe eines Agonisten, der einen CHO endogenen Rezeptor aktiviert (z. B. ATP), kann das mtClytinDecay-141F oder mtClytin-182F des zweiten Zelltyps aktiviert werden.Subsequently The cells were loaded with coelenterazines (as in Example 4 described). By adding the G-protein receptor agonist it comes to intracellular calcium release, by the wild-type mtClytin can be read (Lichtfreisetunzung by wild-type aequorin). By the subsequent addition of an agonist, which activates a CHO endogenous receptor (eg ATP), can mtClytinDecay-141F or mtClytin-182F of the second cell type become.

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Claims

Nucleic acid molecule or a functional fragment thereof, selected from the group consisting of a) Nucleic acid molecules which encode a polypeptide having the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; b) Nucleic acid molecules which have the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 include; c) nucleic acid molecules, the fragments of nucleic acid molecules according to a) or b), wherein the nucleic acid molecules functional photoproteins encode the fragments and polypeptides encode amino acid 141 with respect to SEQ ID NO: 2 or amino acid 182 based on SEQ ID NO: 4 included.

Polypeptide or a functional fragment thereof, which encodes by a nucleic acid sequence according to claim 1 and possesses the property of a photoprotein.

Polypeptide, the sequences shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 containing.

Photoprotein or a functional fragment thereof, which relates one or more mutations in position 131 to 152 on SEQ ID NO: 2 and which has an altered temporal Bioluminescence has.

Photoprotein or a functional fragment thereof, which has a mutation in position 172 to 192 with respect to SEQ ID NO: 4 and which has an altered temporal bioluminescence having.

Nucleic acid molecule which is a Sequence includes that for a protein according to claims 4 or 5 encoded.

Nucleic acid according to claim 1 or 6, which contains a functional promoter 5 'to the coding sequence.

Recombinant DNA or RNA vector containing nucleic acids according to claim 7 contains.

Prokaryotic or eukaryotic cell or a non-human organism, a vector according to claim Containing 8.

Process for the expression of the polypeptides according to Claim 2, 3, 4 or 5 in bacteria, eukaryotic cells or in in vitro expression systems.

Process for the purification / isolation of a according to claim 10 expressed photoprotein polypeptides.

Use of a nucleic acid according to the Claims 1 or 6 as a marker or reporter gene.

Use of a nucleic acid according to the Claims 1 or 6 as a marker or reporter gene in combination with other reporter genes.

Process for the preparation of a photoprotein, characterized characterized in that defined in a photoprotein in the region by position 131 to 152 relative to SEQ ID NO: 2 one or more Mutations are introduced, causing a change the temporal bioluminescence leads.

A photoprotein prepared by a method according to claim 14th

Use of a photoprotein according to claim 2, 3, 4, 5 or 15 as a marker or reporter.

Use of a photoprotein according to claim 2, 3, 4, 5 or 15 as a marker or reporter in combination with others Reporter genes.

A variant of the photoprotein mtClytin, which has an altered temporal bioluminescence.