DE102007011241A1 - Isolated photoprotein mtClytinDecay, and the use thereof - Google Patents

Isolated photoprotein mtClytinDecay, and the use thereof

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DE102007011241A1
DE102007011241A1 DE200710011241 DE102007011241A DE102007011241A1 DE 102007011241 A1 DE102007011241 A1 DE 102007011241A1 DE 200710011241 DE200710011241 DE 200710011241 DE 102007011241 A DE102007011241 A DE 102007011241A DE 102007011241 A1 DE102007011241 A1 DE 102007011241A1
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Ludmila Dr. Frank
Stefan Dr. Golz
Natalia Dr. Malikova
Svetlana Dr. Markova
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Bayer HealthCare AG
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae

Abstract

Die Erfindung betrifft die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F, deren Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sowie die Aktivität und Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F. The invention relates to photoproteins mtClytinDecay-141F and 182F-mtClytinDecay whose nucleotide and amino acid sequences as well as the type and use of the photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F.

Description

  • Die Erfindung betrifft die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F, dessen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, sowie die Aktivität und Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F. The invention relates to photoproteins mtClytinDecay-141F and 182F mtClytinDecay-, whose nucleotide and amino acid sequences, as well as the type and use of the photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F.
  • Photoproteine Photo proteins
  • Als Biolumineszenz bezeichnet man das Phänomen der Lichterzeugung durch Lebewesen. As bioluminescence refers to the phenomenon of light production by living organisms. Sie ist das Ergebnis von biochemischen Reaktionen in Zellen, bei denen die chemische Energie in Form von Lichtquanten abgegeben wird (sog. kalte Emission durch Chemolumineszenz). It is the result of biochemical reactions in cells in which the chemical energy in the form of photons emitted (so-called. Cold emission by chemiluminescence). Derartig erzeugtes Licht ist monochromatisch, denn es wird bei einem diskreten Elektronen-Übergang abgestrahlt, kann aber durch sekundäre Leuchtfarbstoffe (z. B. fluoreszierende Proteine bei Leuchtquallen der Gattung Aequoria) in längerwellige Spektralbereiche verschoben werden. Such generated light is monochromatic, because it is radiated in a discrete electron transfer, but by secondary luminescent dyes (e.g., fluorescent proteins as in luminous jellyfish Aequoria the genus) can be moved into longer-wave spectral regions.
  • Die biologische Funktion ist vielfältig: In der Meerestiefe zwischen 200 und 1000 m (Mesopelagial) leuchten rund 90% aller Lebewesen. The biological function is diverse: in the depths between 200 and 1000 m (mesopelagial), about 90% of all living things. Die Leuchtsignale werden hier zur Partnerwerbung, Täuschung und als Köder eingesetzt. The flares are used for attracting partners, deception and as bait. Auch Glühwürmchen und Leuchtkäfer nutzen die Lichtsignale zur Partnersuche. Also glowworms and fireflies use light signals for Dating. Die Bedeutung des Leuchtens von Bakterien, Pilzen und einzelligen Algen ist dagegen unklar. The importance of illumination of bacteria, fungi and unicellular algae is unclear. Es wird vermutet, dass es zur Koordination von vielen Einzel-Individuen einer großen Population eingesetzt wird oder eine Art biologische Uhr darstellt. It is believed that it is used for coordinating many single individuals in a large population or is a kind of biological clock.
  • Eine Vielzahl an Coelenteraten ist biolumineszent ( A variety of coelenterates is bioluminescent ( ). ). Diese Organismen emittieren blaues oder grünes Licht. These organisms emit blue or green light. Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte Aequorin aus Aequoria victoria ( The first light 1962 as isolated protein, aequorin from Aequoria victoria ( ) emittierte als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht grünes Licht wie phänotypisch beobachtet bei Aequoria victoria. ) Emitted as an isolated protein is a blue light and green light as not phenotypically observed in Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phänotypisch grün erscheinen lässt ( Later, the green fluorescent protein (GFP) from Aequoria victoria could be isolated, which by the aequorin can appear phenotypically green due to the excitation, the Medusa ( ; ; ; ; ). ). Als weitere Photoproteine konnten noch Clytin ( As another Photo clytin could still ( ), Mitrocomin ( (), Mitrocomin ) und Obelin ( () And Obelin ) identifiziert und beschrieben werden. ) Are identified and described. Tabelle 1: Übersicht über einige Photoproteine. Table 1: Summary of some photoproteins. Angegeben sind der Name, der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc. No.) des Datenbankeintrages. the name of the organism from which the protein has been isolated and the identification number are indicated (Acc. No.) of the database entry.
    Name Surname Organismus organism Identifikations Nr. Identification no.
    Obelin obelin Obelia geniculata Obelia geniculata AAL86372 AAL86372
    Clytin clytin Clytia gregaria Clytia gregaria CAA49754 CAA49754
    Aequorin aequorin Aequorea macrodactyla Aequorea macrodactyla AAK02061 AAK02061
    Aequorin aequorin Aequorea parva Aequorea parva AAK02060 AAK02060
    Mitrocomin mitrocomin Mitrocoma cellularia Mitrocoma cellularia AAA29298 AAA29298
    Pholasin pholasin Pholas dactylus Pholas dactylus AAM18085 AAM18085
    ? ? Symplectoteuthis oualaniensis Symplectoteuthis oualaniensis AX305029 AX305029
    Tabelle 2: Übersicht über einige Photoproteine. Table 2: Summary of some photoproteins. Angegeben sind der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist, der Name des Photoproteins und eine Auswahl an Patenten bzw. Anmeldungen. Indicated the organism from which the protein has been isolated, the name of the photoprotein and a selection of patents or applications.
    Organismus organism Fluoreszierendes Protein fluorescent protein Patent/Anmeldung Patent / Application
    Obelia geniculata Obelia geniculata Obelin obelin WO03006497 WO03006497
    Clytia gregaria Clytia gregaria Clytin clytin WO03006497 WO03006497
    Clytia gregaria Clytia gregaria mtClytin mtClytin WO2005035559 WO2005035559
    Aequoria victoria Aequoria victoria Aequorin aequorin WO200168824 WO200168824 US-0908909 US 0908909
    Pholas dactylus Pholas dactylus Pholasin pholasin WO0028025 WO0028025 GB-0024357 GB 0024357
  • Biolumineszenz wird heute in der Technik vielfältig genutzt, z. Bioluminescence is used today in the art varied, eg. B. in Form von Bio-Indikatoren für Umweltverschmutzung oder in der Biochemie zum empfindlichen Nachweis von Proteinen, zur Quantifizierung bestimmter Verbindungen oder als sogenannte "Reporter" bei der Untersuchung zellulärer Gen-Regulation. Example in the form of bio-indicators of environmental pollution or in biochemistry for sensitively detecting proteins or for quantifying particular compounds or as so-called "reporter" in investigating gene regulation.
  • Die Photoproteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sondern auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften. The photo-proteins differ not only in their nucleotide and amino acid sequence, but also because of their biochemical and physical properties.
  • Es konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz von Photoproteinen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften verändert werden können. It was shown that by changing the amino acid sequence of photoproteins the physical and biochemical properties can be changed. Beispiele von mutagenisierten Photoproteinen sind in der Literatur beschrieben ( Examples of mutated proteins Photo described in the literature ( US 6,495,355 US No. 6,495,355 ; ; US 5,541,309 US 5,541,309 ; ; US 5,093,240 US 5,093,240 ; ; ). ).
  • Die Lichterzeugung durch die oben genannten Photoproteine erfolgt durch die Oxidation von Coelenterazin ( Light production by the above photoproteins occurs by the oxidation of coelenterazine ( ; ; ). ).
  • Reportersysteme reporter systems
  • Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. As a reporter or indicator generally refers to genes whose gene products can be readily detected using simple biochemical or histochemical methods. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen. A distinction is at least 2 types of reporter genes.
    • 1. Resistenzgene. 1. resistance genes. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt. As resistance genes genes are referred to, the expression of a cell resistance to antibiotics or other substances whose presence results in the growth medium to cell death when the resistance gene is absent.
    • 2. Reportergene. 2. reporter genes. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. The products of reporter genes are used in genetic engineering as fused or unfused indicators. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehören die beta-Galaktosidase ( The commonest reporter genes include beta-galactosidase ( ), alkalische Phosphatase ( ), alkaline phosphatase ( ; ; ), Luciferasen und andere Photoproteine ( ), Luciferases and other photoproteins ( ; ; ; ; ). ).
  • Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Luminescence refers to the emission of photons in the visible spectral range, which is carried out by excited emitter molecules. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt. In contrast to the fluorescence energy is in this case not supplied from outside in the form of radiation of shorter wavelength.
  • Man unterscheidet Chemolumineszenz und Biolumineszenz. A distinction chemiluminescence and bioluminescence. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion, die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Chemiluminescence refers to a chemical reaction that leads to an excited molecule which itself lights up when the excited electrons return to their ground state. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. If this reaction is catalyzed by an enzyme, it is called bioluminescence. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet. The enzymes involved in the reaction are generally termed luciferases.
  • Herstellung der Mutante Preparation of the mutant
  • Zur Herstellung der Mutanten wurden mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an den Position 141 [141F] (SEQ ID 1) und Position 182 [182F] (SEQ ID 3) eingefügt. To prepare the mutants molecular biological methods have been inserted, the mutations at position 141 [141F] (SEQ ID 1) and position 182 [182F] (SEQ ID 3) using. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stratagene (Katalog Nummer #200521; Revision #063001b; Auflage 2003) verwendet. To this end, the company Stratagene procedure was the "quick change" (catalog # 200521, Revision # 063001b; edition 2003) is used. Als Primer wurden SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 verwendet. As primers were SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: used 12th Die Vektoren wurde als pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F und pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F bezeichnet. The vectors were called pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F and pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F.
  • mtClytinDecay mtClytinDecay
  • In der Literatur wurden bereits Photoproteine beschrieben, die durch Austausch einzelner Aminosäuren verändertete spektrale oder biochemische Eigenschaften aufwiesen. Photoproteins have already been described in the literature, that showed by exchange of single amino acids verändertete spectral or biochemical properties. Zu diesen gehört Obelin W92F ( These include Obelin W92F ( ) und Aequorin ( (), And aequorin ; ; ). ).
  • Die mtClytin Mutante mtClytinDecay zeigt eine zeitlich veränderte Lichtfreisetzung verglichen mit dem Photoprotein mtClytin oder anderen Photoproteinen. The mutant mtClytin mtClytinDecay shows a temporally changing light release compared with the photo mtClytin or other photoproteins.
  • Das Photoprotein mtClytinDecay zeigt überraschenderweise eine bisher noch nicht beschriebene verlangsamte Kinetik der Lichtfreisetzung bzw. Lumineszenz. The photoprotein mtClytinDecay surprisingly shows a hitherto described slowed kinetics of light release or luminescence. Diese Eigenschaft ermöglicht die Verwendung des Photoproteins speziell für die Untersuchung von Reaktionen oder Mechanismen mit sehr schneller Kalziumfreisetzungen in eukaryotischen Zellen oder anderen Systemen. This property allows the use of the photoprotein specifically for the study of reactions or mechanisms with very fast calcium release in eukaryotic cells or other systems. Die Kinetik der Lichtfreisetzung von bisher beschriebenen Photoproteinmutanten oder Photoprotein Wildtypproteinen wird als "flash" Kinetik beschrieben, da das Licht nach Aktivierung (z. B. mit Kalzium) in kürzester Zeit freigesetzt wird und die Reaktion anschließend zum Stilstand kommt oder zumindest deutlich schwächer wird. The kinetics of the light release from previously described photoprotein mutants or photoprotein wild-type proteins is described as "flash" kinetics, since the light is released upon activation (z. B. with calcium) in a very short time and the reaction subsequently comes to style stand, or at least is significantly weaker. Zur Messung dieser schnellen Kinetik sind besondere Messinstrumente erforderlich. To measure these rapid kinetics Special measuring instruments are needed. Die beschriebene Photoproteinmutante mtClytinDecay bzw. dessen Äquivalente ermöglicht nicht nur die Verwendung anderer Messinstrumente oder Messverfahren, sondern vor allem die Untersuchung von sehr schnellen Kinetiken. The photoprotein mutant described mtClytinDecay or its equivalent not only allows the use of other measurement instruments or measurement methods, but also the investigation of very fast kinetics. Diese Kinetiken können z. These kinetics z can. B. bei Ionenkanälen der Familie P2X auftreten. As occur in ion channels of the P2X family.
  • mtClytinDecay zeichnet sich nicht nur durch eine veränderte Kinetik, sondern überraschenderweise auch durch eine besonders hohe Lichtfreisetzung aus. mtClytinDecay distinguished not only by an altered kinetics, but surprisingly also by a particularly high light release. Diese hohe Lichtfreisetzung – verglichen mit anderen Mutanten Photoproteinen – ermöglicht die Verwendung der mtClytinDecay Mutanten als sensitives Reportergen. This high light release - compared to other mutants photoproteins - enables use of the mtClytinDecay mutants as a sensitive reporter gene. Die hohe Lichtfreisetzung ermöglicht auch die Verwendung von Messgeräten oder Verfahren, die mit der Lichtfreisetzung anderen Photoproteine oder Reportersystemen nur unzureichende Ergbenisse liefern. The high light release also permits the use of measuring devices or methods that provide the light release other photoproteins or reporter systems insufficient Ergbenisse.
  • Das Spektrum von mtClytin wurde im Maximum mit 470 nm beschrieben ( The spectrum of mtClytin has been described at the maximum of 470 nm ( ). ). Eine Übersicht über die spektralen Eigenschaften von Coelenterazine wurde in Shinomuro ( An overview of the spectral properties of coelenterazine was (in Shinomuro ) beschrieben. ) Described.
  • Das Photoprotein mtClytinDecay zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene zu mtClytin aus Clytia gregaria mit einer Identität von 99%. The photoprotein mtClytinDecay shows the highest homology at the amino acid level from mtClytin Clytia gregaria with an identity of 99%.
  • Die Erfindung betrifft die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4. Ebenfalls betrifft die Erfindung die Nukleinsäuremoleküle dargestellt in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3. The invention relates to photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4. The invention also the nucleic acid molecules relates shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3rd
  • Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente oder Fragmente von mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F. The invention also concerns functional equivalents, or fragments of mtClytinDecay-141F and mtClytinDecay-182F. Funktionelle Äquivalente oder Fragmente sind solche Proteine, die vergleichbare funktionelle Eigenschaften aufweisen. Functional equivalents or fragments are those proteins which have similar functional properties.
  • Die Erfindung betrifft mtClytin Photoproteine, die in der Postion 141 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszenzkinetik führen Hierbei können mtClytin Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 131–151, 136–146, bevorzugt 139–143, insbesondere 140–142 eine oder mehrere Aminosäuremutationen aufweisen, welche zu veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszentkinetik führen. The invention relates to mtClytin photoproteins that have in the postion 141 an amino acid mutation which lead to changes in properties of bioluminescence, especially Biolumineszenzkinetik Here mtClytin photoproteins can also be those photoproteins, which in the area of ​​amino acids 131-151, 136-146, preferably 139-143, especially 140-142, one or more amino acid mutations include, leading to changed properties of bioluminescence, especially Biolumineszentkinetik.
  • Desweiteren betrifft die Erfindung mtClytin Photoproteine, die in der Postion 182 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszenzkinetik führen. Furthermore, the invention mtClytin Photo proteins having an amino acid mutation in the postion 182 which lead to changes in properties of bioluminescence, especially Biolumineszenzkinetik relates. Hierbei können mtClytin Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 172–192, 177–187, bevorzugt 180–184, insbesondere 181–183 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszenzkinetik führen. Here mtClytin photoproteins may also be such photo proteins which have an amino acid mutation in the region of amino acids 172-192, 177-187, preferably 180-184, especially 181-183, which lead to changes in properties of bioluminescence, especially Biolumineszenzkinetik. Als Bereiche mit ähnlichem Motif gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90%, insbesondere 95% aufweisen. As areas having a similar motif those sequences which have an identity of 80%, preferably of 90%, in particular 95% in this field apply here.
  • Die Erfindung betrifft Kombinationen von mtClytin Photoproteinen, die im Bereich der Aminosäurepositionen 131–151, 136–146, bevorzugt 139–143, insbesondere 140–142 eine oder mehrere Aminosäuremutationen aufweisen, welche zu veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, führen, mit Mutationen im Bereich Aminosäureposition 182 oder Mutationen im Bereich von Aminosäureposition 182, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz führen. The invention relates to combinations of mtClytin photoproteins, in the region of amino acid positions 131-151, 136-146, preferably 139-143, particularly 140-142 having one or more amino acid mutations that result in altered properties of bioluminescence, with mutations in the region of amino acid position 182 or mutations in the region from amino acid position 182 which lead to changes in properties of bioluminescence. Desweiteren betrifft die Erfindung Kombinationen von mtClytin Photoproteinen, die in der Postion 182 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einer veränderten Biolumineszenzreaktion, insbesondere Biolumineszenzkinetik führen, mit Mutationen im Bereich Aminosäureposition 141. Hierbei können Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche in den erfindungsgemäßen Bereichen ein ähnliches Motiv aufweisen. Furthermore, the invention relates to combinations of mtClytin Photo proteins having an amino acid mutation in the postion 182 which lead to a modified bioluminescent reaction, in particular Biolumineszenzkinetik, with mutations in the region of amino acid position 141. In this case, can also be those photoproteins photoproteins, which in the inventive areas a similar have motive. Als Bereiche mit ähnlichem Motiv gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90%, insbesondere 95% aufweisen. As areas with a similar motif those sequences which have an identity of 80%, preferably of 90%, in particular 95% in this field apply here.
  • Desweiteren sind Kombinationen von mutanten mtClytin, die zu veränderten biolumineszenten Eigenschaften, insbesondere der Biolumineszenzkinetik, führen mit Mutationen oder Derivaten von mtClytin oder Clytin, die zu veränderten physikochemischen Eigenschaften führen, insbesondere spektrale Eigenschaften, Kalziumsensitivität oder Substratbindung. Furthermore, combinations of mutant mtClytin, to modified bioluminescent properties, particularly Biolumineszenzkinetik lead to mutations or derivatives of mtClytin clytin or which lead to altered physico-chemical properties, in particular spectral properties, calcium sensitivity, or substrate binding.
  • Ebenfalls sind funktionelle Fragmente des mtClytinDecay Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß. functional fragments of the protein or mtClytinDecay for such encoding nucleic acids are also according to the invention.
  • Ebenfalls sind verkürzte funktionelle Fragmente weiterer erfindungsgemäßer Proteine bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren Bestandteil der Erfindung. are also functional fragments shortened further inventive proteins or nucleic acids coding for such part of the invention.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Innenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as reporter genes for cellular systems, especially for receptors, for ion channels, for transporters, for transcription factors or for inducible systems.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich auch als Reportergene durch Markierung, Identifizierung und Charakterisierung von Zellorganellen speziell für Mitochondrien. The photo-proteins mtClytinDecay are also suitable as reporter genes by marking, identification and characterization of cell organelles, especially for mitochondria.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich auch als Reportergene zur Bestimmung von Parametern innerhalb und ausserhalb von Zellorganellen, speziell von Mitochondrien, speziell von Kalziumkonzentrationen. The photo-proteins mtClytinDecay are also suitable as reporter genes for determining parameters inside and outside cell organelles, especially mitochondria, especially calcium concentrations.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bacculo, in Pflanzen. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as reporter genes in bacterial and eukaryotic systems, especially in mammalian cells, in bacteria, in yeasts, in Bacculo, in plants.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen, speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as reporter genes for cellular systems in combination with bioluminescent or chemiluminescent systems, especially systems with luciferases, with oxygenases, with phosphatases.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Fusionsproteine speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine und für Glykoproteine. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as fusion proteins, especially for receptors, for ion channels, for transporters, for transcription factors, for proteinases, for kinases, for phosphodiesterases, for hydrolases, for peptidases, for transferases, for membrane proteins and glycoproteins.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger. The photoproteins mtClytinDecay suitable for immobilization, especially by antibodies, biotin, by magnetic or magnetizable carrier.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Proteine für Systeme des Energietransfers speziell der FREI-(Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET-(Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET(field effect transistors), FP(fluorescence polarization), HTRF(Homogeneous time-resolved fluorescence)Systemen. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as proteins for energy transfer systems, especially to get the free (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET- (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) systems.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen. The photoproteins mtClytinDecay suitable for labeling substrates or ligands, especially for proteases, for kinases, for transferases.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrat für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen. The photoproteins mtClytinDecay are suitable for expression in bacterial systems, especially for titer determination, as a substrate for biochemical systems, especially for proteinases and kinases.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Innenkanäle und andere Proteine. The photoproteins mtClytinDecay are especially coupled to antibodies, coupled to enzymes, coupled to receptors coupled to the inner channels and other proteins as a marker.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening). The photo-proteins mtClytinDecay suitable as reporter genes in pharmacological drug screening, especially in HTS (high throughput screening).
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene bei der Charakterisierung, Identifizierung und Untersuchung von Ionenkanälen, speziell des Typs P2X, TRP, SCN, KCN, CNG, ACCN. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as reporter genes in the characterization, identification and study of ion channels, especially of the type P2X, TRP, SCN, KCN, CNG, ACCN.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Komponenten von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mikroskopie. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as components of detection systems, especially for ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), for immunohistochemistry, for Western blot, for confocal microscopy.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechselwirkungen (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid;). The photoproteins mtClytinDecay are useful as markers for the analysis of interactions, especially for protein-protein interactions, for DNA-protein interactions, for DNA-RNA interactions, RNA-RNA interactions, RNA-protein interactions (DNA: deoxyribonucleic acid RNA: ribonucleic acid).
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker oder Fusionsprotein für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as a marker or fusion protein for expression in transgenic organisms, especially in mice, in rats, in hamsters and other mammals, in primates, in fish, in worms, in plants.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as a marker or fusion protein for analyzing embryonic development.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as a marker via a coupling mediator, especially via biotin, via NHS (N-hydroxysulfosuccimide) via CN-Br.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA. The photoproteins mtClytinDecay are coupled to nucleic acids, especially to DNA, of RNA as a reporter.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide. The photo-proteins mtClytinDecay are coupled to proteins or peptides as a reporter.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reporter zur Messung von intra- oder extrazellulären Calziumkonzentrationen. The photo-proteins mtClytinDecay suitable as a reporter for measuring intracellular or extracellular calcium concentrations.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Charakterisierung von Signalkaskaden in zellulären Systemen. The photo-proteins mtClytinDecay suitable for characterizing signal cascades in cellular systems.
  • Die an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelten Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Sonden speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen. The coupled to nucleic acids or peptides Photo mtClytinDecay proteins are useful as probes, especially for Northern blots, for Southern blots, for Western blots, for ELISA, for nucleic acid sequencing, for protein analysis chip analyzes.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules". The photoproteins mtClytinDecay suitable for labeling pharmacological formulations, especially infectious agents, antibodies of "small molecules".
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen. The photo-proteins mtClytinDecay suitable for geological investigations, especially for ocean, groundwater and river currents.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefe Systemen, in Bacculo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen. The photoproteins mtClytinDecay are suitable for expression in expression systems, especially in in vitro translation systems, in bacterial systems, in yeast systems in Bacculo systems in viral systems, in eukaryotic systems.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven. The photo-proteins mtClytinDecay suitable for visualizing tissues or cells in surgical interventions, especially in invasive, in noninvasive, in minimally invasive.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und anderen phänotypisch veränderten Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen Eingriffen. The photo-proteins mtClytinDecay are also suitable for labeling tumor tissues and other phenotypically altered tissues, especially in histological examination, in surgical procedures.
  • Die Erfindung betrifft auch die Reinigung der Photoproteine mtClytinDecay speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein. The invention also relates to the cleaning of the photoproteins mtClytinDecay especially as wild-type protein, as fusion protein, as a mutagenized protein.
  • Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur gleichzeitigen Messung verschiedener Reportergene in einem Expressionsystem (multiplexing). The photoproteins mtClytinDecay are suitable for the simultaneous measurement of various reporter genes in an expression system (multiplexing).
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern. The invention also relates to the use of the photoproteins mtClytinDecay in the field of cosmetics, especially of bath additives, lotions, soaps, body paints, of toothpaste and body powders.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen. The invention also relates to the use of the photoproteins mtClytinDecay to dyeing, especially dyeing foodstuffs, bath additives, ink, of textiles, of plastics.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln. The invention also relates to the use of the photoproteins mtClytinDecay for dyeing paper, especially of greeting cards, paper products, wallpapers and handicraft articles.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoprotein mtClytinDecay zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis. The invention also relates to the use of the photoprotein mtClytinDecay for the coloration of liquids, especially for water pistols, fountains, for beverages and ice.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke. The invention also relates to the use of the photoproteins mtClytinDecay for the manufacture of toys, especially finger dye and makeup.
  • Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 2 bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente desselben kodieren. The invention relates to nucleic acid molecules, which discloses the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 or encoding the same functional equivalents or functional fragments.
  • Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 4 bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente desselben kodieren. The invention relates to nucleic acid molecules, which discloses the polypeptide represented by SEQ ID NO: 4, or encoding the same functional equivalents or functional fragments.
  • Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Nukleinsäuremoleküle bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente derselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: The invention further relates to nucleic acid molecules or functional equivalents or functional fragments thereof selected from the group consisting of:
    • a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beinhaltet; a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide having the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 includes;
    • b) Nukleinsäuremolekülen, welche die durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz enthalten; b) nucleic acid molecules which are defined by SEQ ID NO: 3 sequence shown;: 1 or SEQ ID NO
    • c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins aufweisen; c) nucleic acid molecules whose complementary strand hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid molecule of a) or b) and the expression product having the biological function of a photoprotein; Eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen wird in einer wässrigen Lösung, die 0,2 × SSC (1 × standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 68°C durchgeführt ( A stringent hybridization of nucleic acid molecules is carried out in an aqueous solution containing 0.2 × SSC (1 x standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate) contains at 68 ° C ( ). ).
    • d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden. d) nucleic acid molecules which differ due to the degeneracy of the genetic code from those mentioned under c).
  • Die Erfindung betrifft die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, bei denen die Sequenz einen funktionalen Promotor 5' zu der das Photoprotein kodierenden Sequenz bzw. der das Leader- oder Signalsequenz kodierenden Sequenz enthält. The invention relates to the above nucleic acid molecules in which the sequence to which contains a functional promoter 5 'the photoprotein coding sequence or the leader or signal sequence coding sequence.
  • Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren sind. The invention also relates to nucleic acid molecules as hereinbefore described, which are part of recombinant DNA or RNA are vectors.
  • Die Erfindung betrifft Organismen, die einen solchen Vektor enthalten. The invention relates to organisms containing such a vector.
  • Die Erfindung betrifft Photoproteine, die durch die vorhergehend beschriebenen Nukleotidsequenzen kodiert sind. The invention relates to photoproteins that are encoded by the above-described nucleotide sequences.
  • Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen. The invention relates to methods of expressing the photoprotein according to the invention the polypeptides in bacteria, eukaryotic cells or in in vitro expression systems.
  • Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptides. The invention relates to methods of purifying / isolating a photoprotein polypeptide of the invention.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, für Photoproteine kodierende Nukleinsäuren als Marker- oder Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik. The invention relates to the use of the invention, photoprotein-encoding nucleic acids as marker or reporter genes, particularly for pharmacological drug and diagnostics.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Photoproteine bzw. eine erfindungsgemäße, für ein Photoprotein kodierende Nukleinsäure als Marker oder Reporter bzw. als Marker- oder Reportergen. The invention relates to the use of the photoproteins of the invention or an inventive nucleic acid, encoding a photoprotein as a marker or reporter or as a marker or reporter gene.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4) oder seiner funktionellen Fragmente oder Äquivalente bzw. die Verwendung einer für das Photoprotein mtClytinDecay kodierenden Nukleinsäure oder ihrer funktionellen Fragmente oder Äquivalente als Marker oder Reporter bzw. als Marker oder Reportergen insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik. The invention relates to the use of the photoproteins mtClytinDecay (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4) or its functional fragments or equivalents, or the use of a DNA encoding the photoprotein mtClytinDecay nucleic acid or functional fragment or equivalent as a marker or reporter or as a marker or reporter gene in particular for pharmacological drug and diagnostics.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung der in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik. The invention relates to the use of in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 nucleic acid shown as a marker or reporter gene, especially for the pharmacological drug and diagnostics.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid erkennen. The invention also relates to polyclonal or monoclonal antibodies that recognize a polypeptide of the invention.
  • Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die das Photoprotein mtClytinDecay (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4) erkennen. The invention also relates to monoclonal or polyclonal antibodies which the photoprotein mtClytinDecay (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4) recognize.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure wie in den vorangehenden Absätzen beschrieben, welche einen funktionalen Promotor 5' zur kodierenden Sequenz enthält. The invention relates to a nucleic acid described in the preceding paragraphs, which contains a functional promoter 5 'to the coding sequence.
  • Die Erfindung beinhaltet rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren enthalten. The invention includes recombinant DNA or RNA vectors containing the nucleic acids described above.
  • Organismen, die einen wie vorangehend beschriebenen Vektor enthalten, sind ebenfalls erfindungsgemäß. Organisms containing a vector as described above, are also according to the invention.
  • Ein Polypeptid, das durch eine wie oben beschriebene Nukleinsäuresequenz kodiert ist, ist ebenfalls Teil der Erfindung. A polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence as described above, is also part of the invention.
  • Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Expression der vorangehend genannten Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen. According to the invention is also a method for expressing the above-mentioned polypeptides in bacteria, eukaryotic cells or in in vitro expression systems.
  • Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides. Part of the invention is also a method of purification / isolation of a polypeptide of the invention.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen. The invention relates to the use of a nucleic acid according to the invention as a marker or reporter gene.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Photoproteins als Marker oder Reporter. The invention relates to the use of a photoprotein according to the invention as a marker or reporter.
  • Bestandteil der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polyppeptids in Kombination mit einer oder mehrerer Luziferasen und/oder einem oder mehrerer Photoproteine. Part of the invention is also the use of a Polyppeptids invention in combination with one or more luciferases and / or one or more photoproteins.
  • Erfindungsgemäß ist ein Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Position 131–151, 136–146, bevorzugt 139–143, insbesondere 140–142 oder eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Position 172–192, 177–187, bevorzugt 180–184, insbesondere 181–183 oder einer Kombination aus beiden, besitzt und welches ein verändertes, speziell verlangsamtes Biolumineszenzsignal aufweist. According to the invention is a photo-protein or a functional fragment thereof, comprising one or more mutations in the region of the position 131-151, 136-146, preferably 139-143, particularly 140-142 or one or more mutations in the region of position 172 to 192, 177 -187, preferably 180-184, in particular 181-183 or a combination of both, has and which has an altered, specifically slower bioluminescence.
  • Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz beinhaltet, die für ein Protein gemäß der beiden vorangehenden Abschnitte kodiert. Also according to the invention is a nucleic acid molecule which includes a sequence encoding a protein according to the two preceding sections.
  • Ein weiteres Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Photoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Photoprotein in der Region definiert durch Position 131–151, 136–146, bevorzugt 139–143, insbesondere 140–142 oder eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Position 172–192, 177–187, bevorzugt 180–184, insbesondere 181–183 eine oder mehrere Mutationen eingeführt werden, was zu einer Veränderung der Biolumineszenz, insbesondere Biolumineszenzkinetik führt. Another part of the invention is a method for producing a photoprotein, characterized in that defined in a photoprotein in the region through position 131-151, 136-146, preferably 139-143, particularly 140-142 or one or more mutations in the region the position 172-192, 177-187, preferably 180-184, especially 181-183, one or more mutations are introduced, resulting in a change in bioluminescence, especially Biolumineszenzkinetik.
  • Ein Photoprotein, hergestellt durch ein Verfahren wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben ist ebenfalls erfindungsgemäß. A photoprotein, prepared as described in the preceding section by a method according to the invention is also.
  • Die Erfindung betrifft auch andere Photoproteine, die durch eine oder mehrere Veränderungen in der Aminosäuresequenz eine veränderte Kinetik der Lichtfreisetzung aufweisen. The invention also relates to other photoproteins, which have by one or more changes in the amino acid sequence of a modified release kinetics of light.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung anderer veränderter Photoproteine für die beschriebenen Verwendungen der Mutanten des Photoproteins mtClytinDecay. The invention also relates to the use of other modified photoproteins for the described uses of the mutants of the photoprotein mtClytinDecay.
  • Photoproteine mit veränderter Kinetik der Lichtfreisetzung, besonders einer verlangsamten Lichtfreisetzung oder verlängerten Zeitspanne, in der Licht freigesetzt wird, eignen sich besonders als Reportergene in zellbasierten Verfahren, speziell in der pharmakologischen Wirkstoffsuche und Charakterisierung, speziell in der Diagnostik. Photoproteins with altered kinetics of light release, particularly a slow release or extended period of time light is released to the light, are particularly suitable as reporter genes in cell-based methods, specifically in characterization and pharmacological drug, particularly in diagnostics.
  • Photoproteine mit veränderter Kinetik der Lichtfreisetzung, besonders einer verlangsamten Lichtfreisetzung oder verlängerten Zeitspanne, in der Licht freigesetzt wird, eignen sich besonders zur Untersuchung von Ionenkanälen. Photo proteins with altered kinetics of the release of light, especially in slower light release or prolonged period, is released into the light, are particularly suitable for the study of ion channels.
  • Die Erfindung betrifft auch kodonoptimierte Varianten der erfindungsgemäßen Proteine zur Veränderung der biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften, speziell der verbesserten Expression, speziell der veränderten Stabilität. The invention also relates to codon-optimized variants of the proteins of the invention to alter the biochemical or physicochemical properties, especially the improved expression, especially the changed stability.
  • Die Erfindung betrifft auch Fusionen der erfindungsgemäßen Proteine mit Erkennungspeptiden zum Transport oder Lokalisierung der erfindungsgemäßen Proteinen in Zellorganellen oder Kompartimenten. The invention also relates to fusions of the proteins of the invention with recognition peptides for transport or localization of the proteins of the invention in cell organelles or compartments.
  • Die Erfindung betrifft auch Varianten der erfindungsgemäßen Proteine, die zu einer Veränderung der spektralen Eigenschaften, der Lumineszenzintensität, der Substratspezifität, der Verwendung von Cofaktoren, der Kalziumaffinität oder anderer physikochemischen oder biochemischen Eigenschaften führen. The invention also relates to variants of the proteins according to the invention, which lead to a change in the spectral properties of the luminescence intensity, the substrate specificity, the use of cofactors, the calcium affinity or other physicochemical or biochemical properties.
  • Der kinetische Verlauf der Lichtfreisetzung kann in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen variieren. The kinetic curve of the light release may vary depending on the experimental conditions. In In 7 7 ist der kinetische Verlauf der Lichtfreisetzung für mtClytinDecay beispielhaft gezeigt. the kinetic curve of the light release for mtClytinDecay exemplified.
  • Expression der erfindungsgemäßen Photoproteine Expression of the proteins of the invention Photo
  • Als Expression bezeichnet man die Produktion eines Moleküls, das nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in einen Expressionsvektor klonierte Fremdgen erlaubt. As the expression is referred to the production of a molecule, the transcription and translation of the cloned foreign gene into an expression vector allows, after the introduction of the gene into a suitable host cell. Expressionsvektoren enthalten die für die Expression von Genen in Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale. Expression vectors containing the information necessary for the expression of genes in cells of prokaryotes or eukaryotes control signals.
  • Expressionsvektoren können prinzipiell auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Expression vectors can in principle be constructed in two different ways. Bei den sogenannten Transkriptionsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als authentisches, biologisch aktives Protein synthetisiert. In the so-called transcription fusions, the foreign gene encoded by the cloned protein is synthesized as an authentic, biologically active protein. Der Expressionsvektor trägt hierzu alle zur Expression benötigten 5'- und 3'-Kontrollsignale. The expression vector carrying this, all 5 'and 3' expression required for control signals.
  • Bei den sogenannten Translationsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein zusammen mit einem anderen Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen lässt. In so-called translational fusions the encoded by the cloned foreign gene is expressed as a hybrid protein with another protein, which can be detected readily. Die zur Expression benötigten 5'- und 3'-Kontrollsignale inklusive des Startcodons und eventuell ein Teil der für die N-terminalen Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen vom Vektor. The required for the expression of 5'- and 3'-control signals including the start codon and possibly a portion of the coding for the N-terminal regions of forming the hybrid protein sequences are derived from the vector. Der zusätzliche eingeführte Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteasen, sondern lässt sich auch zum Nachweis und zur Isolierung des gebildeten Hybridproteins einsetzen. The additional imported protein portion not only stabilized in many cases, the foreign gene encoded by the cloned protein from degradation by cellular proteases, but can also be used for the detection and isolation of hybrid protein produced. Die Expression kann sowohl transient, als auch stabil erfolgen. Expression can both transient, as also be stable. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen, Viren als auch eukaryotische Systeme. As host organisms are bacteria, yeasts, viruses and eukaryotic systems.
  • Reinigung der erfindungsgemäßen Photoproteine Cleaning the photo novel proteins
  • Die Isolierung von Proteinen (auch nach Überexpression) wird häufig als Proteinreinigung bezeichnet. The isolation of proteins (also after overexpression) is often referred to as protein purification. Zur Proteinreinigung steht eine Vielzahl an etablierten Methoden und Verfahren zur Verfügung. For protein purification is a number of established methods and procedures.
  • Die Fest-Flüssig-Trennung ist eine Grundoperation bei Proteinisolierungen. The solid-liquid separation is a basic operation in protein isolation. Sowohl bei der Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium als auch bei der Klärung des Rohextraktes nach Zellaufschluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei der Abtrennung von Niederschlägen nach Fällungen usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Both in the separation of the cells from the culture medium as well as in the clarification of the raw extract after cell disruption and removal of the cell debris, in the separation of precipitates after precipitation, etc. of the process step is required. Er erfolgt durch Zentrifugation und Filtration. It is carried out by centrifugation and filtration.
  • Durch Gewinnung intrazellulärer Proteine muss die Zellwand zerstört bzw. durchlässig gemacht werden. By obtaining intracellular proteins, the cell wall must be destroyed or made permeable. Je nach Maßstab und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rührwerkskugel- bzw. Glasperlenmühlen eingesetzt. Depending on the scale and the organism to high pressure homogenizers or stirred ball mills or glass beads are used. Im Labormaßstab kommen ua mechanische Zellintegrationen und Ultraschallbehandlung zum Einsatz. On a laboratory scale, inter alia, mechanical cell integration and ultrasound treatment are used.
  • Sowohl für extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln (Alkohole, Aceton) eine schnelle und effiziente Methode zur Konzentration von Proteinen. Both extracellular and intracellular proteins (after cell disruption), various precipitation processes with salts (in particular ammonium sulfate) or organic solvents (alcohols, acetone) a rapid and efficient method for the concentration of proteins. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung der löslichen Nukleinsäuren erstrebenswert (Fällung z. B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat). In the purification of intracellular proteins, the removal of the soluble nucleic acids desirable (precipitation z. B. with protamine sulfate or streptomycin) is. Bei der Gewinnung extrazellulärer Proteine werden häufig Träger (z. B. Stärke, Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten. often carriers are added (eg. starch, diatomaceous earth) before addition of the precipitating agent to obtain better handle precipitates in the extraction of extracellular proteins.
  • Für die Feinreinigung stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren zur Verfügung (Absorptions- und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Elektrophoresen). For the fine cleaning Numerous chromatographic and partition methods are available (absorption and ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, electrophoresis). Eine Säulenchromatographie wird auch im technischen Maßstab angewandt. Column chromatography is also applied on an industrial scale. Für den Labormaßstab ist vor allem die Affinitätschromatographie von Bedeutung, die Reinigungsfaktoren bis zu mehreren 100 pro Schritt ermöglicht. For the laboratory scale is mainly the affinity of meaning which purification factors of up to several 100 permits per step.
  • Extrazelluläre Proteine fallen in relativ verdünnten Lösungen an. Extracellular proteins accrue in relatively dilute solutions. Sie müssen ebenso wie extrazelluläre Proteine vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. You must be just as extracellular proteins concentrated prior to further use. Neben den schon erwähnten Verfahren hat sich – auch im industriellen Maßstab – die Ultrafiltration bewährt. In addition to the already mentioned methods has - proven ultrafiltration - on an industrial scale.
  • Anorganische Salze als Begleitstoffe von Proteinen sind für spezifische Anwendungen häufig unerwünscht. Inorganic salts which accompany proteins are frequently undesirable for specific applications. Sie können ua durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden. They can be removed by gel filtration, dialysis and diafiltration among others.
  • Zahlreiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum Einsatz. Numerous proteins are used as dry preparations. Als Trocknungsverfahren sind die Vakuum-, Gefrier- und Sprühtrocknung von Bedeutung. Useful drying processes are vacuum drying, freeze drying and spray drying is important.
  • Nukleotid- und Aminosäuresequenzen Nucleotide and amino acid sequences
  • Das Photoprotein mtClytinDecay-141F wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 1): The photoprotein mtClytinDecay-141F by the following nucleotide sequence encodes (SEQ ID NO: 1):
    Figure 00170001
  • Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 2): This results in an amino acid sequence of (SEQ ID NO: 2):
    Figure 00170002
    Figure 00180001
  • Das Photoprotein mtClytinDecay-182F wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 3): The photoprotein mtClytinDecay-182F is encoded by the following nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3):
    Figure 00180002
  • Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 4): This results in an amino acid sequence of (SEQ ID NO: 4):
    Figure 00180003
  • Das Photoprotein mtClytin wird in Patentanmeldung The photo mtClytin is in patent application WO2005035559 WO2005035559 beschrieben und wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 5): and described by the following nucleotide sequence encodes (SEQ ID NO: 5):
    Figure 00190001
  • Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 6): This results in an amino acid sequence of (SEQ ID NO: 6):
    Figure 00190002
  • Das putative Signalpeptide des Photoprotein mtClytin besitzt folgende Sequenz (SEQ ID NO: 7): The putative signal peptides of the photo mtClytin has the following sequence (SEQ ID NO: 7):
    Figure 00190003
    und weist folgende Nukleinsäuresequenz auf and has the following nucleic acid sequence
    Figure 00200001
  • Zu Herstellung der Mutante mtClytinDecay-141 F wurde folgende primer verwendet: For preparation of mutant mtClytinDecay-141 F The following primer was used:
    Figure 00200002
  • Zu Herstellung der Mutante mtClytinDecay-182F wurde folgende primer verwendet: For preparation of mutant mtClytinDecay-182F following primer was used:
    Figure 00200003
  • Diese Sequenzen finden sich im Sequenzlisting wieder. These sequences are found in the sequence listing again.
  • Kurze Beschreibung der Figuren BRIEF DESCRIPTION OF FIGURES
  • 1 1 : Die : The 1 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F. shows the plasmid map of the vector pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F.
  • 2 2 : Die : The 2 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F shows the plasmid map of the vector pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F
  • 3 3 : Die : The 3 3 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-141F. shows the plasmid map of vector pcDNA3 mtClytinDecay-141F.
  • 4 4 : Die : The 4 4 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-182F. shows the plasmid map of vector pcDNA3 mtClytinDecay-182F.
  • 5 5 : Die : The 5 5 zeigt das Alignment der Photoproteine mtClytin, mtClytinDecay-141F und mtClytin-182F auf Aminosäureebene. shows the alignment of the photoproteins mtClytin mtClytinDecay-141F and 182F mtClytin-amino acid level.
  • 6 6 : Die : The 6 6 zeigt die Biolumineszenzreaktion von mtClytinDecay nach bakterieller Expression X-Achse: Zeit in Sekunden; shows the bioluminescence reaction of mtClytinDecay after bacterial expression X-axis: time in seconds; Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units). Y axis: relative light units (relative light units).
  • 7 7 : Die : The 8 8th zeigt die Biolumineszenzreaktion von mtClytinDecay nach eukaryotischer Expression. shows the bioluminescence reaction of mtClytinDecay after eukaryotic expression. X-Achse: Zeit in Sekunden; X-axis: time in seconds; Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units); Y axis: relative light units (relative light units); Die Angaben in der Legende entsprechen der finalen Konzentration an ATP (Adenosintriphosphat) im beschriebenen experimentellen Ansatz. The information in the legend correspond to the final concentration of ATP (adenosine triphosphate) in the described experimental approach.
  • Beispiele Examples
  • Beispiel 1 example 1
  • Zur Herstellung der Mutante wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an der Position 141 oder 182 eingefügt. To produce the mutant molecular biological methods has been inserted, the mutations at position 141 or 182 with the aid. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stragene (USA) verwendet. To this end, the company Stratagene (USA) procedure was the "quick change" used. Als Primer wurden (SEQ ID NO: 9 + 10) und (SEQ ID NO: 11 + 12) verwendet. As primers (SEQ ID NO: 9 + 10) and (SEQ ID NO: 11 + 12) is used. Die Insertion der cDNA erfolgte in die Schnittstelle SfiIA-SfiIB des Vektors pTrip1Ex2. The insertion of the cDNA was carried out in the interface SfiIA-SfiIB the vector pTrip1Ex2. Die Vektoren wurde als pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F und pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F bezeichnet. The vectors were called pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F and pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F.
  • Die The 1 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTirp1Ex2-mtClytinDecay-141F. shows the plasmid map of the vector pTirp1Ex2-mtClytinDecay-141F.
  • Die The 2 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTirp1Ex2-mtClytinDecay-182F. shows the plasmid map of the vector pTirp1Ex2-mtClytinDecay-182F.
  • Beispiel 2 example 2
  • Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. As the vector for the production of the construct illustrated below, the plasmid pcDNA3.1 (+) from Clontech was used. Die Derivate des Vektors wurde als pcDNA3-mtClytinDecay-141F und pcDNA3-mtClytinDecay-182F bezeichnet. The derivatives of the vector was designated as pcDNA3-mtClytinDecay-141F and pcDNA3-mtClytinDecay-182F. Die Vektoren pcDNA3-mtClytinDecay-141F und pcDNA3-mtClytinDecay-182F wurden zur Expression von mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F in eukaryotischen Systemen verwendet. The vectors pcDNA3-mtClytinDecay-141F and pcDNA3-mtClytinDecay-182F were used for the expression of mtClytinDecay-141F and 182F mtClytinDecay-in eukaryotic systems.
  • Die The 3 3 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-141F. shows the plasmid map of vector pcDNA3 mtClytinDecay-141F.
  • Die The 4 4 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-182F. shows the plasmid map of vector pcDNA3 mtClytinDecay-182F.
  • Beispiel 3 example 3
  • Bakterielle Expression bacterial expression
  • Die bakterielle Expression erfolgte in E. coli durch Transformation der Bakterien mit den Expressionsplasmiden pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F oder pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F. Bacterial expression was performed in E. coli by transformation of the bacteria with the expression pTrip1Ex2-mtClytinDecay-141F or pTrip1Ex2-mtClytinDecay-182F. Die transformierten Bakterien wurden in LB-Medium bei 37°C für 3 Stunden inkubiert und die Expression nach Herstellerangaben induziert. The transformed bacteria were incubated in LB medium at 37 ° C for 3 hours, and expression was induced according to the manufacturer's instructions. Die induzierten Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris/HCl (pH 9,0) + 5 mM EDTA resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. The induced bacteria were harvested by centrifugation, resuspended in 50 mM Tris / HCl (pH 9.0) + 5 mM EDTA and disrupted by sonication. Das Lysat wurde anschliessend für 15 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute (16000 rcf) zentrifugiert und der Überstand abgenommen. The lysate was subsequently for 15 minutes at 13,000 revolutions per minute (16000 rcf) and the supernatant removed. Der Überstand wurde 3 Stunden mit Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in Tris/HCl pH 9,0) im dunkeln inkubiert. The supernatant was incubated for 3 hours with coelenterazine (10E-07 M coelenterazine in Tris / HCl pH 9.0) in the dark. Direkt nach der Zugabe von 5 mM Calziumchlorid wurde die Biolumineszenz im Luminometer gemessen. Immediately after the addition of 5 mM calcium chloride bioluminescence was measured in the luminometer. Die Integrationszeit der Messung betrug 60 Sekunden. The integration time of the measurement was 60 seconds.
  • Die The 6 6 zeigt die Kinetik der Biolumineszenzmessung von mtClytinDecay in Bakterien. shows the kinetics of the bioluminescence of mtClytinDecay in bacteria.
  • Beispiel 4 example 4
  • Eukaryotische Expression eukaryotic expression
  • Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-mtClytinDecay-141F, pcDNA3-mtClytinDecay-182F und pcDNA3.1(+) in transienten oder stabilen Experimenten. Constitutive eukaryotic expression was effected in CHO cells by transfection of the cells with the expression plasmids pcDNA3-mtClytinDecay-141F, pcDNA3-mtClytinDecay-182F and pcDNA3.1 (+) in transient or stable experiments. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. For this purpose, 10,000 cells per well in DMEM-F12 medium were plated on 96 well microtiter plates and incubated overnight at 37 ° C. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Transfection was performed using the Fugene 6 kit (Roche) according to manufacturer's instructions. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM-F12 Medium inkubiert. The transfected cells were incubated overnight at 37 ° C in DMEM-F12 medium. Anschliessend wurde das Medium entfernt und durch 50 μl Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in PBS) ersetzt. The medium was then removed and replaced with 50 ul coelenterazine (10E-07 M Coelenterazine in PBS). Die Zellen wurden für 24 Stunden bei 28°C inkubiert und anschliessend ATP (Adenosintriphosphat) bis zu einer Finalkonzentration von 5 μM zugegeben. The cells were incubated for 24 hours at 28 ° C and then ATP (adenosine triphosphate) to a final concentration of 5 .mu.M was added. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe im Luminometer gestartet. The measurement was started right after the addition in the luminometer. Die Integrationszeit betrug 1 Sekunde, bei einer Gesamtmessdauer von 90 Sekunden. The integration time was 1 second, with a total measurement time of 90 seconds.
  • Die The 7 7 zeigt die Ergebnisse der Biolumineszenzmessung von mtClytinDecay in CHO Zellen. shows the results of bioluminescence of mtClytinDecay in CHO cells.
  • Beispiel 5 example 5
  • Die The 5 5 zeigt das Alignment von mtClytinDecay-141F, mtClytinDecay-182F mit mtClytin (wildtype; wt) auf Aminosäureebene. shows the alignment of mtClytinDecay-141F, 182F with mtClytinDecay-mtClytin (wild type; WT) at the amino acid level.
  • Beispiel 6 example 6
  • Kinetische Analyse von mtClytinDecay in expremiert in CHO Zellen Kinetic analysis of mtClytinDecay in expremiert in CHO cells
  • Zur kinetischen Analyse der Biolumineszenz von mtClytinDecay-141F, wurden CHO (Chinese Hamster Ovarian Cells) Zellen mit pcDNA3-mtClytinDecay-141F bzw. pcDNA3 (ohne integrierte cDNA) transfiziert. For the kinetic analysis of the bioluminescence of mtClytinDecay-141F, CHO were transfected (Chinese hamster ovarian cells) cells with pcDNA3-mtClytinDecay-141F or pcDNA3 (without integrated cDNA). Die Transfektion und Messung erfolgte wie unter Beispiel 4 beschrieben. Transfection and measurement was carried out as described in Example 4. FIG. Die Messdaten wurden für einen Zeitraum von 60 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde erhoben. The measurement data were collected for a period of 60 seconds with an integration time of 1 second.
  • Die The 7 7 zeigt die Ergebnisse der kinetischen Analyse von mtClytinDecay in CHO Zellen. shows the results of the kinetic analysis of mtClytinDecay in CHO cells.
  • Beispiel 7 example 7
  • Verwendung von mtClytinDecay in multiplexing Experimenten Using mtClytinDecay in multiplexing experiments
  • Die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytin-182F eignen sich als Komponenten von multiplexing Readout-Verfahren, in denen mehrere Reportergene (z. B. Luziferasen oder Photoproteine) in einem experimentellen Ansatz verwendet werden. The photoproteins mtClytinDecay-141F and mtClytin-182F are used in an experimental approach as components of multiplexing readout method in which multiple reporter genes (eg. B. Luciferases or photoproteins). Hierzu wurden mtClytinDecay-141F oder mtClytinDecay-182F expremierende CHO-Zellen im Verhältnis 1:1 (oder 1:2, 1:3, ..) mit CHO Zellen gemischt, die das wildtyp Photoprotein mtClytin expremierten. For this purpose mtClytinDecay-141F or mtClytinDecay-182F were -expressing CHO cells in a ratio of 1: 1 (or 1: 2, 1: 3, ..) are mixed with CHO cells, the wild-type expremierten the photoprotein mtClytin. Die Zelle, die das wildtyp mtCyltin expremierten, expremierten zusätzlich einen G-Protein gekoppelten Rezeptor (z. B. Neuromedin U Rezeptor 2). The cell expremierten the wild type mtClytin addition expremierten a G-protein coupled receptor (z. B. neuromedin U receptor 2). Die Zellmischung wurde auf 96, 384 oder 1536 Loch-Mikrotiterplatten ausgebracht und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. The cell mixture was spread on 96, 384 or 1536 well microtiter plates and incubated for 24 hours at 37 ° C.
  • Anschliessend wurden die Zellen mit Coelenterazine beladen (wie unter Beispiel 4 beschrieben). Subsequently, the cells were loaded with coelenterazine (as described in Example 4). Durch die Zugabe des G-Protein Rezeptor Agonisten kommt es zur intrazellulären Kalziumfreisetzung, die durch das wildtyp mtClytin ausgelesen werden kann (Lichtfreisetunzung durch wildtyp Aequorin). The addition of the G-protein receptor agonists it comes to intracellular calcium release, which can be read by the wild-type mtClytin (Lichtfreisetunzung by wild type Aequorin). Durch die anschliessende Zugabe eines Agonisten, der einen CHO endogenen Rezeptor aktiviert (z. B. ATP), kann das mtClytinDecay-141F oder mtClytin-182F des zweiten Zelltyps aktiviert werden. By the subsequent addition of an agonist of a CHO endogenous receptor activated (eg. B. ATP), the mtClytinDecay-141F or mtClytin-182F of the second cell type can be activated.
  • Literatur/Patente Literature / Patents
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Claims (18)

  1. Nukleinsäuremolekül oder ein funktionelles Fragment desselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beinhaltet; the same nucleic acid molecule or functional fragment selected from the group consisting of a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide having the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 includes; b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz beinhalten; b) nucleic acid molecules which in SEQ ID NO: 3 include sequence shown;: 1 or SEQ ID NO c) Nukleinsäuremolekülen, die Fragmente von Nukleinsäuremolekülen gemäß a) oder b) enthalten, wobei die Nukleinsäuremoleküle funktionelle Photoproteine kodieren und die Fragmente Polypeptide kodieren, die die Aminosäure 141 bezogen auf die SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäure 182 bezogen auf die SEQ ID NO: 4 enthalten. c) nucleic acid molecules that are fragments of nucleic acid molecules a) or b) contain accordance, wherein the nucleic acid molecules encoding functional photoproteins and the fragments encode polypeptides, the amino acid based 141 on the SEQ ID NO: 2 or the amino acid 182 based on the SEQ ID NO : included 4th
  2. Polypeptid oder ein funktionelles Fragment desselben, das durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert ist und die Eigenschaft eines Photoproteins besitzt. Polypeptide or a functional fragment thereof which is encoded by a nucleic acid sequence of claim 1 and has the property of a photoprotein.
  3. Polypeptid, die Sequenzen dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 enthaltend. Polypeptide sequences shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 containing.
  4. Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine oder mehrere Mutationen in Position 131 bis 152 bezogen auf SEQ ID NO: 2 besitzt und welches eine veränderte zeitliche Biolumineszenz aufweist. the same photo protein or a functional fragment based one or more mutations at position 131-152 on SEQ ID NO: 2 and which has a modified temporal bioluminescence.
  5. Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine Mutation in Position 172 bis 192 bezogen auf SEQ ID NO: 4 besitzt und welches eine veränderte zeitliche Biolumineszenz aufweist. the same photo protein or a functional fragment obtained a mutation at position 172-192 on SEQ ID NO: 4 and having a modified temporal bioluminescence.
  6. Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz beinhaltet, die für ein Protein gemäß Ansprüchen 4 oder 5 kodiert. Nucleic acid molecule which includes a sequence which encodes a protein according to claims 4 or 5th
  7. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 6, welche einen funktionalen Promotor 5' zur kodierenden Sequenz enthält. Nucleic acid of claim 1 or 6, which contains a functional promoter 5 'to the coding sequence.
  8. Rekombinanter DNA oder RNA Vektor, welcher Nukleinsäuren nach Anspruch 7 enthält. Recombinant DNA or RNA vector comprising nucleic acids as claimed in claim 7 includes.
  9. Prokaryontische oder eukaryontische Zelle oder ein nicht humaner Organismus, einen Vektor gemäß Anspruch 8 enthaltend. Prokaryotic or eukaryotic cell or a non-human organism containing a vector according to claim 8.
  10. Verfahren zur Expression der Polypeptide gemäss Anspruch 2, 3, 4 oder 5 in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen. A process for expression of the polypeptides according to claim 2, 3, 4 or 5 in bacteria, eukaryotic cells or in in vitro expression systems.
  11. Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines gemäß Anspruch 10 expremierten Photoprotein Polypeptides. A method for purifying / isolating a expremierten according to claim 10 photoprotein polypeptide.
  12. Verwendung einer Nukleinsaüre gemäß den Ansprüchen 1 oder 6 als Marker- oder Reportergen. Use of a Nukleinsaüre according to claims 1 or 6 as a marker or reporter gene.
  13. Verwendung einer Nukleinsaüre gemäß den Ansprüchen 1 oder 6 als Marker- oder Reportergen in Kombination mit anderen Reportergenen. Use of a Nukleinsaüre according to claims 1 or 6 as a marker or reporter gene in combination with other reporter genes.
  14. Verfahren zur Herstellung eines Photoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Photoprotein in der Region definiert durch Position 131 bis 152 bezogen auf SEQ ID NO: 2 eine oder mehrere Mutationen eingeführt werden, was zu einer Veränderung der zeitlichen Biolumineszenz führt. A process for producing a photoprotein, characterized in that in a photoprotein in the region defined by position 131 to 152 relative to SEQ ID NO: 2, one or more mutations are introduced, resulting in a change in the temporal bioluminescence.
  15. Photoprotein, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 14. Photo protein produced by a method according to claim fourteenth
  16. Verwendung eines Photoproteins gemäß Anspruch 2, 3, 4, 5 oder 15 als Marker oder Reporter. Use of a photoprotein according to claim 2, 3, 4, 5, or 15 as a marker or reporter.
  17. Verwendung eines Photoproteins gemäß Anspruch 2, 3, 4, 5 oder 15 als Marker oder Reporter in Kombination mit anderen Reportergenen. Use of a photoprotein according to claim 2, 3, 4, 5, or 15 as a marker or reporter in combination with other reporter genes.
  18. Eine Variante des Photoproteins mtClytin, welche eine veränderte zeitliche Bioluminszenz aufweist. A variant of the photoprotein mtClytin having a modified temporal Bioluminszenz.
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