DE10328067A1 - Isolated photoprotein Bolinopsin, as well as its use - Google Patents
Isolated photoprotein Bolinopsin, as well as its use Download PDFInfo
- Publication number
- DE10328067A1 DE10328067A1 DE2003128067 DE10328067A DE10328067A1 DE 10328067 A1 DE10328067 A1 DE 10328067A1 DE 2003128067 DE2003128067 DE 2003128067 DE 10328067 A DE10328067 A DE 10328067A DE 10328067 A1 DE10328067 A1 DE 10328067A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- photoprotein
- nucleic acid
- bolinopsin
- sequence
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 81
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 230000008827 biological function Effects 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 15
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241001234693 Bolinopsis infundibulum Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710128071 Mitrocomin Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 description 3
- 108010089402 phialidin Proteins 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001126328 Clytia gregaria Species 0.000 description 2
- 241000700108 Ctenophora <comb jellyfish phylum> Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 2
- 241001102657 Obelia geniculata Species 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000498640 Bolinopsidae Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000243318 Eumetazoa Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001295925 Gegenes Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000591312 Homo sapiens Putative MORF4 family-associated protein 1-like protein UPP Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241001126925 Lobata Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001429712 Mitrocoma cellularia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241001455930 Obelia longissima Species 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 102100034096 Putative MORF4 family-associated protein 1-like protein UPP Human genes 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241001234512 Tentaculata Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010017600 apoobelin Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000005669 field effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 239000003673 groundwater Substances 0.000 description 1
- 230000003760 hair shine Effects 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N morin Natural products OC1=CC(O)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229940034610 toothpaste Drugs 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft das Photoprotein Bolinopsin, dessen Nukleotid- und Aminosäuresequenz sowie die Aktivität und Verwendung des Photoproteins Bolinopsin.The invention relates to the photoprotein Bolinopsin, its nucleotide and amino acid sequence and the activity and use of the photoprotein Bolinopsin.
Description
Die Erfindung betrifft das Photoprotein Bolinopsin, dessen Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung des Photoproteins Bolinopsin.The The invention relates to the photoprotein Bolinopsin, whose nucleotide and amino acid sequence, as well as the activity and use of the photoprotein Bolinopsin.
PhotoproteinePhoto proteins
Als Biolumineszenz bezeichnet man das Phänomen der Lichterzeugung durch Lebewesen. Sie ist das Ergebnis von biochemischen Reaktionen in Zellen, bei denen die chemische Energie in Form von Lichtquanten abgegeben wird (sog. kalte Emission durch Chemolumineszenz). Derartig erzeugtes Licht ist monochromatisch, denn es wird bei einem diskreten Elektronen-Übergang abgestrahlt, kann aber durch sekundäre Leuchtfarbstoffe (z.B. fluoreszierende Proteine bei Leuchtquallen der Gattung Aequora) in längerwellige Spektralbereiche verschoben werden.When Bioluminescence is the phenomenon of light generation Creature. It is the result of biochemical reactions in Cells in which the chemical energy is released in the form of light quanta becomes (so-called cold emission by chemoluminescence). Such produced Light is monochromatic because it becomes at a discrete electron transition but may be colored by secondary luminescent dyes (e.g., fluorescent dyes) Proteins in light jellyfish of the genus Aequora) in longer-wave Spectral ranges are shifted.
Die biologische Funktion ist vielfältig: In der Meerestiefe zwischen 200 und 1000 m (Mesopelagial) leuchten rund 90% aller Lebewesen. Die Leuchtsignale werden hier zur Partnerwerbung, Täuschung und als Köder eingesetzt. Auch Glühwürmchen und Leuchtkäfer nutzen die Lichtsignale zur Partnersuche. Die Bedeutung des Leuchtens von Bakterien, Pilzen und einzelligen Algen ist dagegen unklar. Es wird vermutet, dass es zur Koordination von vielen Einzel-Individuen einer großen Population eingesetzt wird oder eine Art biologische Uhr darstellt.The biological function is manifold: In the sea depth between 200 and 1000 m (Mesopelagial) shine around 90% of all living beings. The light signals become a partner advertisement, illusion and as bait used. Also, fireflies and Fireflies use the light signals to find a partner. The meaning of lighting of bacteria, fungi and unicellular algae, however, is unclear. It is thought to be responsible for the coordination of many individuals a big one Population or represents a type of biological clock.
Eine Vielzahl an Coelenteraten ist biolumineszent (Morin et al., 1974). Diese Organismen emittieren blaues oder grünes Licht. Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte Aequorin aus Aequoria victoria (Shimomura et al., 1969) emittierte als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht grünes Licht wie phänotypisch beobachtet bei Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phänotypisch grün erscheinen lässt (Johnson et al, 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al, 1994). Als weitere Photoproteine konnten noch Clytin (Inouye et al., 1993), Mitrocomin (Fagan et al., 1993) und Obelin (Illarionov et al., 1995) identifiziert und beschrieben werden.A Variety of coelenterates is bioluminescent (Morin et al., 1974). These organisms emit blue or green light. The first in 1962 Light-producing protein identified aequorin from Aequoria victoria (Shimomura et al., 1969) emitted as an isolated protein a blue light and not green Light as phenotypic observed at Aequoria victoria. Later, the green could be fluorescent Protein (GFP) can be isolated from Aequoria victoria due to of the stimulation by the aequorin the medusa appear phenotypically green lets (Johnson et al, 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al, 1994). As another Photoproteins could still clytin (Inouye et al., 1993), mitrocomin (Fagan et al., 1993) and obelin (Illarionov et al., 1995) and described.
Tabelle
1: Übersicht über einige
Photoproteine. Angegeben ist der Name, der Organismus aus dem das
Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc.
No.) des Datenbankeintrages. 
Tabelle
2: Übersicht über einige
Photoproteine. Angegeben ist der Organismus aus dem das Protein
isoliert worden ist, der Name des Photoproteins und eine Auswahl
an Patenten bzw. Anmeldungen. 
Biolumineszenz wird heute in der Technik vielfältig genutzt, z.B. in Form von Bio-Indikatoren für Umweltverschmutzung oder in der Biochemie zum empfindlichen Nachweis von Proteinen, zur Quantifizierung bestimmter Verbindungen oder als sogenannte "Reporter" bei der Untersuchung zellulärer Gen-Regulation.bioluminescence is becoming diverse in technology today used, e.g. in the form of bio-indicators for pollution or in biochemistry for the sensitive detection of proteins, for the quantification of certain compounds or as so-called "reporters" in the investigation cellular Gene regulation.
Die Photoproteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sondern auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften.The Photoproteins differ not only because of their nucleotide and amino acid sequence, but also because of their biochemical and physical properties.
Es
konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz
von Photoproteinen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften
verändert
werden können.
Beispiele von mutagenisierten Photoproteinen sind in der Literatur
beschrieben (
Die Lichterzeugung durch die oben genannten Photoproteine erfolgt durch die Oxidation von Coelenterazin (Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999).The Light generation by the above-mentioned photoproteins is carried out by the oxidation of coelenterazine (Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999).
Reportersystemereporter systems
Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.
- 1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
- 2. Reportergene. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehört die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).
- 1. resistance genes. Resistance genes are genes whose expression confers on a cell resistance to antibiotics or other substances whose presence in the growth medium leads to cell death when the resistance gene is absent.
- 2. Reporter genes. The products of reporter genes are used in genetic engineering as fused or unfused indicators. Among the most common reporter genes is beta-galactosidase (Alam et al., 1990), alkaline phosphatase (Yang et al., 1997, Cullen et al., 1992), luciferases, and other photoproteins (Shinomura, 1985, Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).
Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.When Luminescence is the emission of photons in the visible Spectral range, where this is done by excited emitter molecules. In contrast to the fluorescence, the energy is not from Outside in the form of radiation shorter wavelength fed.
Man unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.you distinguishes chemiluminescence and bioluminescence. As chemiluminescence It is called a chemical reaction that leads to an excited molecule, the even shines when the excited electrons in the ground state to return. If this reaction is catalyzed by an enzyme, it is called Bioluminescence. The enzymes involved in the reaction become general referred to as luciferases.
Einordung der Spezies Bolinopsis infundibulumEinordung of the species Bolinopsis infundibulum
Eumetazoa → Radiata → Ctenophora → Tentaculata → Lobata → Bolinopsidae → Bolinopsis infundibulumEumetazoa → Radiata → Ctenophora → Tentaculata → Lobata → Bolinopsidae → Bolinopsis infundibulum
Isolierung der cDNAinsulation the cDNA
Zur Untersuchung der Biolumineszenz-Aktivität der Spezies Bolinopsis infundibulum wurden Exemplare im Weißen Meer (Biologische Station Kartesh, Russland) gefangen und in flüssigem Stickstoff gelagert. Zur Erstellung der cDNA-Bibliotheken von Bolinopsis infundibulum, wurde die poly(a)+ RNA mit Hilfe des „Straight A" Isolationsmethode von Novagen (USA) isoliert.to Investigation of the bioluminescence activity of the species Bolinopsis infundibulum were specimens in white Sea (biological station Kartesh, Russia) caught and in liquid nitrogen stored. To create the cDNA libraries of Bolinopsis infundibulum, was the poly (a) + RNA using the "Straight A" isolation method isolated from Novagen (USA).
Zur
Herstellung der cDNA wurde eine RT-PCR durchgeführt. Hierzu wurden 1 μg RNA mit
Reverser Transkriptase (Superscribt Gold In nach folgendem Schema
inkubiert: 
Die Reaktionsprodukte wurden zur Inaktivierung der Polymerase für 30 Minuten bei 37°C mit Proteinase K inkubiert und die cDNA mit Ethanol präzipitiert. Die Expression-cDNA Bank wurde mit Hilfe des „SMART cDNA Library Construction Kits" der Firma Clontech (USA) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Klonierung erfolgte in den Expressionsvektor pTriplEx2 (Clontech; USA). Die Expressionsvektoren wurden durch Elektroporation in Bakterien des Stammes E. coli XL1-Blue transformiert.The Reaction products were used to inactivate the polymerase for 30 minutes at 37 ° C incubated with proteinase K and the cDNA precipitated with ethanol. The expression cDNA library was constructed using the "SMART cDNA Library Construction Kits "the company Clontech (USA) according to manufacturer's instructions. The cloning took place into the expression vector pTriplEx2 (Clontech, USA). The expression vectors were isolated by electroporation into bacteria of the strain E. coli XL1-Blue transformed.
Die Bakterien wurden auf LB-Nährböden plattiert und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde eine Replikaplattierung durchgeführt, indem die Bakterien mit Hilfe eines Nitrocellulosefilters auf eine weitere Nährbodenplatte übertragen wurde. Die Replikaplatte wurde wiederum für 24 Stunden bei 37°C inkubiert und die gewachsenen Bakterienkolonien in LB-Flüssigmedium übertragen. Nach der Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,1 mM) wurden die Bakterien für 4 Stunden bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet und die Bakterienmasse in 0,5 ml Aufschlusspuffer (5 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL pH 9,0) bei 0°C resuspendiert. Anschließend erfolgte der Aufschluss der Bakterien durch Ultraschall.The Bacteria were plated on LB broths and for 24 hours at 37 ° C incubated. Subsequently was performed a replica plating, the bacteria with the help of a nitrocellulose filter on another Transfer nutrient plate has been. The replica plate was again incubated for 24 hours at 37 ° C and transfer the grown bacterial colonies to LB liquid medium. After the addition of IPTG (final concentration 0.1 mM) were the bacteria for 4 hours at 37 ° C on a shaker incubated. The bacteria were harvested by centrifugation and the bacterial mass in 0.5 ml digestion buffer (5 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 9.0) at 0 ° C resuspended. Subsequently the bacteria were disrupted by ultrasound.
Die Lysate wurden nach der Zugabe von Coelenterazine (Endkonzentration 10E-07 M) bei 4°C für 3 Stunden inkubiert. Anschließend erfolgte die Messung der Biolumineszenz nach der Zugabe von Calziumchlorid (Endkonzentration 20 mM) im Luminometer.The Lysates were added after the addition of coelenterazines (final concentration 10E-07 M) at 4 ° C for 3 hours incubated. Subsequently the measurement of the bioluminescence was carried out after the addition of calcium chloride (Final concentration 20 mM) in the luminometer.
Es wurde ein Photoprotein identifiziert. Das Photoprotein wurde als Bolinopsin bezeichnet. Im Folgenden wird das Photoprotein Bolinopsin im einzelnen dargestellt.It a photoprotein was identified. The photoprotein was named as Bolinopsin called. The following is the photoprotein Bolinopsin shown in detail.
BolinopsinBolinopsin
Das
Photoprotein Bolinopsin zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene
zu Aequorin aus Aequoria victoria mit einer Identität von 44
% (gezeigt in Beispiel 8;
Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente von Bolinopsin. Funktionelle Äquivalente sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische Eigenschaften haben und mindestens 70 % homolog sind zu SEQ ID NO: 2. Bevorzugt ist eine Homologie von mindestens 80 % oder 90 %. Besonders bevorzugt ist eine Homologie von mindestens 95 %.The The invention also relates to functional equivalents of bolinopsin. Functional equivalents are those proteins that have comparable physicochemical properties and at least 70% are homologous to SEQ ID NO: 2. Preferred is a homology of at least 80% or 90%. Especially preferred is a homology of at least 95%.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a reporter gene for cellular systems especially for Receptors, for Ion channels, for vans, for transcription factors or for inducible systems.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a reporter gene in bacterial and eukaryotic systems specifically in mammalian cells, in bacteria, in Yeast, in Bakulo, in plants.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Reportergene für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a reporter gene for cellular systems in combination with bioluminescent or chemiluminescent systems especially systems with luciferases, with oxygenases, with phosphatases.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Fusionsprotein speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine, für Glykoproteine.The Photoprotein Bolinopsin is particularly suitable as a fusion protein for receptors, for ion channels, for vans, for transcription factors, for proteinases, for kinases, for phosphodiesterases, for hydrolases, for peptidases, for transferases, for membrane proteins, for glycoproteins.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.The Photoprotein Bolinopsin is especially suitable for immobilization by antibodies, by biotin, by magnetic or magnetizable carriers.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Protein für Systeme des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET-(Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a protein for systems the energy transfer especially the FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) systems.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a marker of substrates or ligands specifically for Proteases, for Kinases, for Transferases.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrat für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.The Photoprotein Bolinopsin is suitable for expression in bacterial Systems specifically for titer determination, as substrate for biochemical Systems especially for Proteinases and kinases.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.The Photoprotein Bolinopsin is especially coupled as a marker to antibodies, coupled to enzymes coupled to receptors coupled to ion channels and others Proteins.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).The Photoprotein Bolinopsin is useful as a reporter gene in the pharmacological Drug search especially in HTS (High Throughput Screening).
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Komponente von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mikroskopie.The Photoprotein Bolinopsin is suitable as a component of detection systems especially for ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), for immunohistochemistry, for Western Blot, for the confocal microscopy.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechselwirkungen (DNA : deoxyribonucleic acid; RNA : ribonucleic acid;).The Photoprotein Bolinopsin is useful as a marker for the analysis of interactions specifically for protein-protein interactions, for DNA-protein interactions, for DNA-RNA interactions, for RNA-RNA interactions, for RNA-protein interactions (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid;).
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Marken oder Fusionsprotein für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a marker or fusion protein for the Expression in transgenic organisms especially in mice, in Rats, in hamsters and other mammals, in primates, in Fishing, in worms, in plants.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Marken oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a marker or fusion protein for analysis of embryonic development.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Marken über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.The Photoprotein Bolinopsin is suitable as a trademark via a coupling agent specifically about Biotin, about NHS (N-hydroxysulfosuccimide), about CN-Br.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a reporter coupled to nucleic acids specifically to DNA, to RNA.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a reporter coupled to proteins or peptides.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Reporter zur Messung von intra- oder extrazellulären Calziumkonzentrationen.The Photoprotein Bolinopsin is useful as a reporter for the measurement of intracellular or extracellular Calcium concentrations.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich zur Charakterisierung von Signalkaskaden in zellulären Systemen.The Photoprotein Bolinopsin is suitable for the characterization of signal cascades in cellular Systems.
Das an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelte Photoprotein Bolinopsin eignet sich als Sonde speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen.The photoprotein Bolinopsin coupled to nucleic acids or peptides is suitable as a probe especially for Northern blots, for Southern blots, for Western blots, for ELISA, for nucleic acid sequencing, for Protein analyzes, chip analyzes.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".The Photoprotein Bolinopsin is suitable for pharmacological labeling Formulations especially of infectious agents, of antibodies, of "small molecules ".
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.The Photoprotein Bolinopsin is suitable for geological investigations especially for Marine, groundwater and river currents.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefe Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.The Photoprotein Bolinopsin is suitable for expression in expression systems especially in in vitro translation systems, in bacterial systems, in yeast systems, in Bakulo systems, in viral systems, in eukaryotic systems Systems.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven.The Photoprotein Bolinopsin is useful for visualizing tissues or cells during surgery, especially invasive, in non-invasive, minimally invasive.
Das Photoprotein Bolinopsin eignet sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und anderen phänotypisch veränderten Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen Eingriffen.The Photoprotein Bolinopsin is also suitable for marking tumor tissue and other phenotypical changed Tissues specifically in histological examination, at operative Interventions.
Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Photoprotein Bolinopsin speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.The The invention also relates to the purification of the photoprotein bolinopsin especially as wild-type protein, as fusion protein, as mutagenized Protein.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Bolinopsin auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.The The invention also relates to the use of the photoprotein bolinopsin in the field of cosmetics, especially bath products, lotions, soaps, of body colors, of toothpaste, of body powders.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Bolinopsin zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.The The invention also relates to the use of the photoprotein bolinopsin for coloring especially food, bath products, ink, textiles, of plastics.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Bolinopsin zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.The The invention also relates to the use of the photoprotein bolinopsin for coloring of paper especially greeting cards, of paper products, of wallpaper, of craft articles.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Bolinopsin zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.The The invention also relates to the use of the photoprotein bolinopsin for coloring of liquids specifically for water pistols, for fountains, for drinks, for ice cream.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Bolinopsin zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke.The The invention also relates to the use of the photoprotein bolinopsin for making toys especially of finger paint, make-up.
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 2 kodieren.The The invention relates to nucleic acid molecules which the polypeptide disclosed by SEQ ID NO: 2 encode.
Die Erfindung betrifft das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 offenbart ist.The The invention relates to the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is disclosed.
Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Nukleinsäuremoleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 umfasst;
- b) Nukleinsäuremolekülen, welche die durch SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz enthalten;
- c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche die biologische Funktion eines Photoproteins aufweisen;
- d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden;
- e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und deren Proteinprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist; und
- f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 65 % zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und deren Proteinprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist.
- a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 2;
- b) nucleic acid molecules containing the sequence represented by SEQ ID NO: 1;
- c) nucleic acid molecules whose complementary strand hybridizes with a nucleic acid molecule from a) or b) under stringent conditions and which have the biological function of a photoprotein;
- d) nucleic acid molecules which differ from those mentioned under c) due to the degeneration of the genetic code;
- e) nucleic acid molecules which show a sequence homology of at least 95% to SEQ ID NO: 1, and whose protein product has the biological function of a photoprotein; and
- f) Nucleic acid molecules which show a sequence homology of at least 65% to SEQ ID NO: 1, and whose protein product has the biological function of a photoprotein.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle, die eine Sequenzhomologie von mindestens 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 % oder 60 % zu SEQ ID NO: 1 aufweisen und für ein Polypeptid kodieren, welches die Eigenschaften eines Photoproteins besitzt.The The invention also relates to nucleic acid molecules which a sequence homology of at least 95%, 90%, 85%, 80%, 75 %, 70%, 65% or 60% to SEQ ID NO: 1 and for a polypeptide which has the properties of a photoprotein.
Die Erfindung betrifft die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, bei denen die Sequenz einen funktionalen Promotor 5' zu der das Photoprotein kodierenden Sequenz enthält.The The invention relates to the abovementioned nucleic acid molecules in which the sequence has a functional promoter 5 'to containing the photoprotein coding sequence.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren sind.The The invention also relates to nucleic acid molecules as above described as part of recombinant DNA or RNA vectors are.
Die Erfindung betrifft Organismen, die einen solchen Vektor enthalten.The The invention relates to organisms containing such a vector.
Die Erfindung bezieht sich auf Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch oder komplementär zur DNA oder RNA Sequenz der Bolinopsin Moleküle oder der weiteren erfindungsgemäßen Molekülen sind.The The invention relates to oligonucleotides having more than 10 consecutive oligonucleotides Nucleotides that are identical or complementary to the DNA or RNA sequence the bolinopsin molecules or the other molecules of the invention are.
Die Erfindung betrifft Photoproteine, die durch die vorhergehend beschriebenen Nukleotidsequenzen kodiert sind.The This invention relates to photoproteins characterized by those previously described Nucleotide sequences are encoded.
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.The This invention relates to methods for expressing the photoprotein of the invention Polypeptides in bacteria, eukaryotic cells or in vitro Expression systems.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptides.The The invention also relates to methods of purification / isolation of a Photoprotein according to the invention Polypeptide.
Die Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Photoproteine erkannt werden.The The invention relates to peptides with more than 5 consecutive Amino acids, immunologically by antibodies against the photoproteins of the invention be recognized.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, für Photoproteine kodierende Nukleinsäuren als Marker- oder Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.The This invention relates to the use of the invention for photoproteins encoding nucleic acids as marker or reporter genes, in particular for the pharmacological drug search and diagnostics.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Photoproteine bzw. eine erfindungsgemäße, für ein Photoprotein kodierende Nukleinsaüre als Marker oder Reporter bzw. als Marker- oder Reportergen.The The invention relates to the use of the photoproteins of the invention or an inventive, for a photoprotein coding nucleic acid as marker or reporter or as marker or reporter gene.
Die Erfindung betrifft die Verwendung des Photoproteins Bolinopsin (SEQ ID NO: 2) bzw. die Verwendung einer für das Photoprotein Bolinopsin kodierenden Nukleinsäure als Marker oder Reporter bzw. als Marker oder Reportergen insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.The The invention relates to the use of the photoprotein bolinopsin (SEQ ID NO: 2) or the use of one for the photoprotein Bolinopsin encoding nucleic acid as marker or reporter or as marker or reporter gene in particular for the pharmacological drug discovery and diagnostics.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.The The invention relates to the use of those shown in SEQ ID NO: 1 nucleic acid as a marker or reporter gene, in particular for the pharmacological drug search and diagnostics.
Gegenstand der Erfindung sind auch polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid erkennen.object The invention also includes polyclonal or monoclonal antibodies which a polypeptide according to the invention detect.
Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die das Photoprotein Bolinopsin (SEQ ID NO: 2) erkennen.The The invention also relates to monoclonal or polyclonal antibodies which recognize the photoprotein bolinopsin (SEQ ID NO: 2).
Expression der erfindungsgemäßen Photoproteineexpression the photoproteins according to the invention
Als Expression bezeichnet man die Produktion eines Moleküls, das nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in einen Expressionsvektor klonierte Fremdgen erlaubt. Expressionsvektoren enthalten die für die Expression von Genen in Zellen von Prokaryoten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale.When Expression is the production of a molecule that after introduction of the gene into a suitable host cell, the transcription and translation of the foreign gene cloned into an expression vector. Expression vectors contain those for the expression of genes Control signals required in cells of prokaryotes or eukaryotes.
Expressionsvektoren können prinzipiell auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Bei den sogenannten Transcriptionsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als authentisches, biologisch aktives Protein synthetisiert. Der Expressionsvektor trägt hierzu alle zur Expression benötigten 5'- und 3'-Kontrollsignale.expression vectors can principle be constructed in two different ways. at The so-called transcription fusions become that of the cloned one Foreign gene encoded protein as authentic, biologically active Synthesized protein. The expression vector carries all for expression required 5 'and 3' control signals.
Bei den sogenannten Translationsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein zusammen mit einem anderen Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen lässt. Die zur Expression benötigten 5'- und 3'-Kontrollsignale inklusive des Startcodons und eventuell ein Teil der für die N-terminalen Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen vom Vektor. Der zusätzliche eingeführte Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteasen, sondern lässt sich auch zum Nachweis und zur Isolierung des gebildeten Hybridproteins einsetzen. Die Expression kann sowohl transient, als auch stabil erfolgen. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen, Viren als auch eukaryotische Systeme.In so-called translational fusions, the protein encoded by the cloned foreign gene is expressed as a hybrid protein together with another protein that is easily detected. The 5'- and 3'-control signals required for expression, including the start codon and possibly a part of the N-th The minimal sequences of the hybrid protein to be formed are derived from the vector. The additional introduced protein portion not only stabilizes the protein encoded by the encoded foreign gene from degradation by cellular proteases in many cases, but can also be used to detect and isolate the hybrid protein formed. Expression can be transient as well as stable. Suitable host organisms are bacteria, yeasts, viruses as well as eukaryotic systems.
Reinigung der erfindungsgemäßen Photoproteinecleaning the photoproteins according to the invention
Die Isolierung von Proteinen (auch nach Überexpression) wird häufig als Proteinreinigung bezeichnet. Zur Proteinreinigung steht eine Vielzahl an etablierten Methoden und Verfahren zur Verfügung.The Isolation of proteins (even after overexpression) is often referred to as Protein purification called. For protein purification is a variety available on established methods and procedures.
Die Fest-Flüssig-Trennung ist eine Grundoperation bei Proteinisolierungen. Sowohl bei der Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium als auch bei der Klärung des Rohextraktes nach Zellaufschluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei der Abtrennung von Niederschlägen nach Fällungen usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Er erfolgt durch Zentrifugation und Filtration.The Solid-liquid separation is a basic operation in protein isolation. Both at the Separation of the cells from the culture medium and in the clarification of the Crude extract after cell disruption and removal of cell debris, at the separation of precipitation after precipitations etc., the process step is required. It is done by centrifugation and filtration.
Durch Gewinnung intrazellulärer Proteine muss die Zellwand zerstört bzw. durchlässig gemacht werden. Je nach Maßstab und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rührwerkskugel- bzw. Glasperlenmühlen eingesetzt. Im Labormaßstab kommen u.a. mechanische Zellintegrationen und Ultraschallbehandlung zum Einsatz.By Extraction intracellular Proteins must destroy the cell wall or permeable be made. Depending on the scale and organism are mixed with high-pressure homogenizers or agitator beads. or glass bead mills used. In the laboratory scale come, etc. mechanical cell integrations and ultrasound treatment for use.
Sowohl für extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln (Alkohole, Aceton) eine schnelle und effiziente Methode zur Konzentration von Proteinen. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung der löslichen Nukleinsäuren erstrebenswert (Fällung z.B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat). Bei der Gewinnung extrazellulärer Proteine werden häufig Träger (z.B. Stärke, Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten.Either for extracellular as well intracellular Proteins (after cell disruption) are different precipitation methods with salts (especially ammonium sulfate) or organic solvents (Alcohols, acetone) a fast and efficient method of concentration of proteins. In the purification of intracellular proteins is the removal the soluble nucleic acids desirable (precipitation e.g. with streptomycin or protamine sulfate). In the extraction of extracellular proteins become common carrier (e.g., starch, Diatomaceous earth) before adding the precipitant added to obtain more manageable rainfall.
Für die Feinreinigung stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren zur Verfügung (Absorptions- und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Elektrophoresen). Eine Säulenchromatographie wird auch im technischen Maßstab angewandt. Für den Labormaßstab ist vor allem die Affinitätschromatographie von Bedeutung, die Reinigungsfaktoren bis zu mehreren 100 pro Schritt ermöglicht.For the fine cleaning Numerous chromatographic and distribution methods are available Available (absorption and ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, Electrophoresis). A column chromatography is also on an industrial scale applied. For the laboratory scale is above all the affinity chromatography Of importance, the cleaning factors up to several hundred per step allows.
Extrazelluläre Proteine fallen in relativ verdünnten Lösungen an. Sie müssen ebenso wie extrazelluläre Proteine vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. Neben den schon erwähnten Verfahren hat sich – auch im industriellen Maßstab – die Ultrafiltration bewährt.Extracellular proteins fall into relatively diluted solutions at. You need to as well as extracellular proteins be concentrated before their further use. Besides the ones already mentioned Procedure has changed - too on an industrial scale - ultrafiltration proven.
Anorganische Salze als Begleitstoffe von Proteinen sind für spezifische Anwendungen häufig unerwünscht. Sie können u.a. durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden.inorganic Salts as congeners of proteins are often undesirable for specific applications. she can et al be removed by gel filtration, dialysis and diafiltration.
Zahlreiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum Einsatz. Als Trocknungsverfahren sind die Vakuum-, Gefrier- und Sprühtrocknung von Bedeutung.numerous Proteins come as dry preparations for use. As a drying process, the vacuum, freezing and spray drying significant.
Nukleotid- und Aminosäuresequenzennucleotide and amino acid sequences
Das
Photoprotein Bolinopsin wird durch die folgende Nukleotidsequenz
kodiert (SEQ ID NO: 1): 
Daraus
ergibt sich eine Aminosäuresequenz
von (SEQ ID NO: 2): 
Diese Sequenzen finden sich im Sequenzlisting wieder.These Sequences can be found in the sequence listing again.
Kurze Beschreibung der FigurenShort description the figures
BeispieleExamples
Beispiel 1example 1
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pTriplEx2 der Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als pTriplEx2-Bolinopsin bezeichnet. Der Vektor pTriplEx2-Bolinopsin wurde zur Expression von Bolinospin in bakteriellen Systemen verwendet.As a vector for the preparation of the construct shown below, the plasmid pTriplEx2 used by the company Clontech. The derivative of the vector was termed pTriplEx2-bolinopsin. The vector pTriplEx2-bolinopsin was used to express bolinospin in bacterial systems.
Die
Beispiel 2Example 2
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als pcDNA3-Bolinopsin bezeichnet. Der Vektor pcDNA3-Bolinopsin wurde zur Expression von Bolinospin in eukaryotischen Systemen verwendet.When Vector for the preparation of the construct shown below the plasmid pcDNA3.1 (+) from Clontech was used. The Derivative of the vector was termed pcDNA3-bolinopsin. Of the Vector pcDNA3-bolinopsin was used to express bolinospin in used eukaryotic systems.
Die
Beispiel 3Example 3
Bakterielle Expressionbacterial expression
Die bakterielle Expression erfolgte im E. coli Stamm BL21(DE3) durch Transformation der Bakterien mit den Expressionsplasmiden pTriplEX2-Bolinopsin und pTriplEX2. Die transformierten Bakterien wurden in LB-Medium bei 37°C für 3 Stunden inkubiert und die Expression für 4 Stunden durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Die induzierten Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in PBS + 5 mM EDTA resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. Das Lysat wurde 3 Stunden mit Coelenterazin im dunkeln inkubiert.The Bacterial expression was carried out in E. coli strain BL21 (DE3) Transformation of the bacteria with the expression plasmids pTriplEX2-bolinopsin and pTriplEX2. The transformed bacteria were in LB medium at 37 ° C for 3 hours incubated and expression for 4 hours by adding IPTG to a final concentration of 1 mM induced. The induced bacteria were removed by centrifugation harvested, resuspended in PBS + 5mM EDTA and sonicated open minded. The lysate was darkened with coelenterazine for 3 hours incubated.
Direkt nach der Zugabe von 5 mM Calziumchlorid wurde die Biolumineszenz im Luminometer gemessen. Die Integrationszeit der Messung betrug 40 Sekunden.Directly after the addition of 5 mM calcium chloride, the bioluminescence measured in the luminometer. The integration time of the measurement was 40 seconds.
Die
Beispiel 4Example 4
Eukaryotische Expressioneukaryotic expression
Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-Bolinopsin und pcDNA3.1(+) in transienten Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM-F12 Medium inkubiert.The constitutive eukaryotic expression was carried out in CHO cells Transfection of the cells with the expression plasmid pcDNA3-bolinopsin and pcDNA3.1 (+) in transient experiments. This was 10000 Cells per well in DMEM-F12 medium on 96 well microtiter plates plated and over Incubated at 37 ° C overnight. The transfection was carried out using the Fugene 6 kit (Roche) Manufacturer's instructions. The transfected cells were overnight at 37 ° C in DMEM-F12 medium incubated.
Beispiel 5Example 5
BLASTBLAST
Ergebnis einer BLAST-Analyse von Bolinopsin auf der Aminosäureebene.Result of a BLAST analysis of Bolinopsin at the amino acid level.
- – pdb|1JF2|A Chain A, Crystal Structure Of W92f Obelin Mutant From Obelia Longissima At 1.72 Angstrom Resolution, Length = 195, Score = 85.1 bits (209), Expect = 8e-16, Identities = 52/177 (29%), Positives = 90/177 (50%), Gaps = 4/177 (2%)- pdb | 1JF2 | A Chain A, Crystal Structure Of W92f Obelin Mutant From Obelia Longissima At 1.72 Angstrom Resolution, Length = 195, Score = 85.1 bits (209), Expect = 8e-16, Identities = 52/177 (29%), Positive = 90/177 (50%), Gaps = 4/177 (2%)
- – emb|CAD87698.1| unnamed protein product [synthetic construct], Length = 195, Score = 81.6 bits (200), Expect = 8e-15, Identities = 51/177 (28%), Positives = 89/177 (49%), Gaps = 4/177 (2%)- emb | CAD87698.1 | unnamed protein product [synthetic construct], length = 195, score = 81.6 bits (200), Expect = 8e-15, Identities = 51/177 (28%), Positive = 89/177 (49%), gaps = 4/177 (2%)
- – pdb|1JF0|A Chain A, The Crystal Structure Of Obelin From Obelia Geniculata At 1.82 A Resolution, gb|AAL86372.1|AF394688_1 apoobelin [Obelia geniculata], Length = 195, Score = 80.1 bits (196), Expect = 2e-14, Identities = 51/177 (28%), Positives = 89/177 (49%), Gaps = 4/177 (2%)- pdb | 1JF0 | A Chain A, The Crystal Structure Of Obelin By Obelia Geniculata At 1.82 A Resolution, gb | AAL86372.1 | AF394688_1 apoobelin [Obelia geniculata], length = 195, score = 80.1 bits (196), expect = 2e-14, Identities = 51/177 (28%), positives = 89/177 (49%), gaps = 4/177 (2%)
- – sp|P39047|MYTR_MITCE Mitrocomin precursor, pir||S39022 mitrocomin precursor – Mitrocoma cellularia, gb|AAA29298.1| apomitrocomin, Length = 198, Score = 78.6 bits (192), Expect = 7e-14, Identities = 47/177 (26%), Positives = 91/177 (50%), Gaps = 4/177 (2%)- sp | P39047 | MYTR_MITCE Mitrocomin precursor, pir || S39022 mitrocomin precursor - mitrocoma cellularia, gb | AAA29298.1 | apomitrocomin, length = 198, score = 78.6 bits (192), Expect = 7e-14, Identities = 47/177 (26%), Positive = 91/177 (50%), gaps = 4/177 (2%)
- – sp|Q08121|CLYT_CLYGR Clytin precursor (Phialidin), pir||S28860 clytin – hydromedusa (Clytia gregarium), emb|CAA49754.1| clytin [Clytia gregaria], gb|AAA28293.1| apoclytin, Length = 198, Score = 77.4 bits (189), Expect = 2e-13, Identities = 53/177 (29%), Positives = 89/177 (49%), Gaps = 4/177 (2%)- sp | Q08121 | CLYT_CLYGR Clytin precursor (phialidine), pir || S28860 clytin-hydromedusa (Clytia gregarium), emb | CAA49754.1 | clytin [Clytia gregaria], gb | AAA28293.1 | apoclytin, Length = 198, Score = 77.4 bits (189), Expect = 2e-13, Identities = 53/177 (29%), positives = 89/177 (49%), gaps = 4/177 (2%)
Beispiel 6Example 6
BLASTBLAST
Ergebnis einer BLAST-Analyse von Bolinopsin auf Nukleinsäureebene.Result of a BLAST analysis of bolinopsin at the nucleic acid level.
- – gb|AC073341.10| Homo sapiens BAC clone RP11-549I23 from 7, complete sequence, Length = 185574, Score = 52.6 bits (27), Expect = 4e-04, Identities = 33/36 (91%)- gb | AC073341.10 | Homo sapiens BAC clone RP11-549I23 from 7, complete sequence, length = 185574, Score = 52.6 bits (27), Expect = 4e-04, Identities = 33/36 (91%)
- – gb|AC092850.13| Homo sapiens 12 BAC RP11-346B9 (Roswell Park Cancer Institute Human BAC Library) complete sequence, Length = 176733, Score = 46.8 bits (24), Expect = 0.023, Identities = 32/36 (88%)- gb | AC092850.13 | Homo sapiens 12 BAC RP11-346B9 (Roswell Park Cancer Institute Human BAC Library) complete sequence, length = 176733, score = 46.8 bits (24), Expect = 0.023, Identities = 32/36 (88%)
- – gb|AC126564.7| Homo sapiens 12 BAC RP11-638F5 (Roswell Park Cancer Institute Human BAC Library) complete sequence, Length = 121242, Score = 46.8 bits (24), Expect = 0.023, Identities = 32/36 (88%)- gb | AC126564.7 | Homo sapiens 12 BAC RP11-638F5 (Roswell Park Cancer Institute Human BAC Library) complete sequence, length = 121242, score = 46.8 bits (24), Expect = 0.023, Identities = 32/36 (88%)
- – gb|AC093924.3| Genomic sequence for Mus musculus, clone RP23-239M9, from chromosome 17, complete sequence, Length = 166277, Score = 44.9 bits (23), Expect = 0.086, Identities = 31/35 (88%)- gb | AC093924.3 | Genomic sequence for musculus, clone RP23-239M9, from chromosomes 17, complete sequence, length = 166277, score = 44.9 bits (23), Expect = 0.086, Identities = 31/35 (88%)
- – gb|AC060234.11| Homo sapiens chromosome 10 clone RP11-523018, complete sequence, Length = 170073, Score = 44.9 bits (23), Expect = 0.086, Identities = 31/35 (88%) - gb | AC060234.11 | Homo sapiens chromosomes 10 clone RP11-523018, complete sequence, Length = 170073, Score = 44.9 bits (23), Expect = 0.086, Identities = 31/35 (88%)
- – gb|AC084727.14| Homo sapiens chromosome 10 clone RP11-507P23, complete sequence, Length = 188652, Score = 44.9 bits (23), Expect = 0.086, Identities = 31/35 (88%)- gb | AC084727.14 | Homo sapiens chromosomes 10 clone RP11-507P23, complete sequence, Length = 188652, Score = 44.9 bits (23), Expect = 0.086, Identities = 31/35 (88%)
Beispiel 7Example 7
Die
Beispiel 8Example 8
Die
Beispiel 9Example 9
Spektrum des Photoproteins BolinopsinSpectrum of Photoprotein Bolinopsin
Zur Messung der spektralen Eigenschaften von Bolinopsin wurden E. coli BL21(DE3) mit den Plasmiden pTriplEX2-CGFP und pTriplEX2 transformiert. Die Induktion erfolgte durch die Zugabe von 1 mM IPTG und einer Inkubation von 4 Stunden bei 37°C. Anschließend wurden die Bakterien geerntet und in PBS resuspendiert. Die Lyse erfolgte durch Ultraschall. Anschließend erfolgte die Messung der Fluoreszenz bzw. Biolumineszenz. Das Maximum der Exitation lag bei 352 nm, der Fluoreszenz bei 452 nm und das der Biolumineszenz bei 468 nm.to Measurement of the spectral properties of bolinopsin were E. coli BL21 (DE3) was transformed with the plasmids pTriplEX2-CGFP and pTriplEX2. Induction was by the addition of 1 mM IPTG and a Incubation of 4 hours at 37 ° C. Subsequently the bacteria were harvested and resuspended in PBS. The lysis was done by ultrasound. Subsequently, the measurement of the Fluorescence or bioluminescence. The maximum of the exitation was at 352 nm, the fluorescence at 452 nm and that of the bioluminescence at 468 nm.
Die
Die
Die
Beispiel 10Example 10
Zur Identifizierung von Substraten für Bolinopsin wurden 5 μl Lösungen verschiedener Coelenterazinderivate (10–4 M) in Methanol mit jeweils 0, 10, 20 und 40 μl Lysat in einem Gesamtvolumen von 75 μl für 3 Stunden bei 4°C inkubiert und die Lumineszenz nach der Zugabe von 25 μl Calziumchlorid (Endkonzentration 5 mM) gemessen. Die Coelenterazine wurden von Sigma (Deutschland) bezogen. Bolinopsin zeigte mit allen eingesezten Coelenterazinderivaten Biolumineszenzaktivität. Die höchste Aktivität könnte mit dem nativen Coelenterazin gemessen werden.To identify substrates for bolinopsin, 5 μl of solutions of various coelenterazine derivatives (10 -4 M) in methanol were incubated with 0, 10, 20 and 40 μl of lysate in a total volume of 75 μl for 3 hours at 4 ° C. and the luminescence after Addition of 25 .mu.l of calcium chloride (final concentration 5 mM) was measured. The coelenterazines were purchased from Sigma (Germany). Bolinopsin showed bioluminescence activity with all celeinazine derivatives ingested. The highest activity could be measured with native coelenterazine.
Die
Literatur/PatenteLiterature / Patents
-
US 6,495,355US 6,495,355 -
US 5,541,309US 5,541,309 -
US 5,093,240US 5,093,240 -
US-0908909US 0908909 -
US 6,152,358US 6,152,358 -
JP-0176125JP-0176125 -
GB-0024357GB 0024357 - WO03006497 WO03006497
- WO200168824WO200168824
- Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem. 1990 Aug 1; 188(2): 245–54Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription. Anal Biochem. 1990 Aug 1; 188 (2): 245-54
- Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997); Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs; Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997); gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs; Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402
- Cullen Bryan R., Malim Michael H., Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Methods in Enzymology. 216: 362ffCullen Bryan R., Malim Michael H., Secreted placental alkaline phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Methods in Enzymology. 216: 362ff
- Fagan TF, Ohmiya Y, Blinks JR, Inouye S, Tsuji FI. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-binding photoprotein, mitrocomin. FEBS Lett. 1993 Nov 1; 333(3): 301–5Fagan TF, Ohmiya Y, Blink's JR, Inouye S, Tsuji FI. Cloning, Expression and sequence analysis of cDNA for the Ca (2 +) - binding photoprotein, mitrocomin. FEBS Lett. 1993 Nov 1; 333 (3): 301-5
- Hastings, J.W. and Morin, J.G. (1969) Comparative biochemistry of calciumactivated photoproteins from the ctenophore, Mnemiopsis and the coelenterates Aequorea, Obelia, and Pelagia. Biol. Bull. 137, 402.Hastings, J.W. and Morin, J.G. (1969) Comparative biochemistry of calciumactivated photoproteins from the ctenophore, Mnemiopsis and the coelenterates of Aequorea, Obelia, and Pelagia. Biol. Bull. 137, 402.
- Haddock SH, Rivers TJ, Robison BH. Can coelenterates make coelenterazine? Dietary requirement for luciferin in cnidarian bioluminescence. Proc Natl Acad Sci U SA 2001 Sep 25; 98(20): 11148–51Haddock SH, Rivers TJ, Robison BH. Can coelenterates make coelenterazine? Dietary requirement for luciferin in cnidarian bioluminescence. Proc Natl Acad Sci U SA 2001 Sep 25; 98 (20): 11148-51
- Inouye S, Tsuji FI. (1994) Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein. FEBS Lett 1994 Mar 21; 341(2–3): 277–80 Inouye S, Tsuji FI. (1994) Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein. FEBS Lett 1994 Mar 21; 341 (2-3): 277-80
- Inouye S, Tsuji FI. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-activated photoprotein, clytin. FEBS Lett. 1993 Jan 11; 315(3): 343–6.Inouye S, Tsuji FI. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca (2+) - activated photoprotein, clytin. FEBS Lett. 1993 Jan 11; 315 (3): 343-6.
- Illarionov BA, Bondar VS, Illarionova VA, Vysotski ES. Sequence of the cDNA encoding the Ca(2+)-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Gene. 1995 Feb 14; 153(2): 273–4.Illarionov BA, Bondar VS, Illarionova VA, Vysotski ES. Sequence of the cDNA encoding the Ca (2+) - activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Genes. 1995 Feb 14; 153 (2): 273-4.
- Jones K, Hibbert F, Keenan M. Glowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine. Trends Biotechnol 1999 Dec; 17(12): 477–81Jones K, Hibbert F, Keenan M. Glowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine. Trends Biotechnol 1999 Dec; 17 (12): 477-81
- Johnson, F.H., Shimomura, O., Saiga, Y., Gershman, L.C., Reynolds, G.T., and Waters, J.R. (1962) Quantum efficiency of Cypridina luminescence, with a note on that of Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 60, 85–103.Johnson, F.H., Shimomura, O., Saiga, Y., Gershman, L.C., Reynolds, G. T., and Waters, J.R. (1962) Quantum efficiency of Cypridina luminescence, with a note on that of Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 60, 85-103.
- Morin, J.G. and Hastings, J.W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol. 77, 305–311.Morin, J.G. and Hastings, J.W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol. 77, 305-311.
- Phillips GN. Structure and dynamics of green fluorescent protein. Curr Opin Struct Biol. 1997 Dec; 7(6): 821–7Phillips GN. Structure and dynamics of green fluorescent protein. Curr Opin Struct Biol. 1997 Dec; 7 (6): 821-7
- Shimomura O, Johnson FH. Properties of the bioluminescent protein aequorin. Biochemistry. 1969 Oct; 8(10): 3991–7Shimomura O, Johnson FH. Properties of the bioluminescent protein aequorin. Biochemistry. 1969 Oct; 8 (10): 3991-7
- Shimomura O., Bioluminescence in the sea: photoprotein systems. Symp Soc Exp Biol. 1985; 39: 351–72Shimomura O., Bioluminescence in the sea: photoprotein systems. Symp Soc Exp Biol. 1985; 39: 351-72
- Shimomura O. Isolation and properties of various molecular forms of aequorin. Biochem J. 1986 Mar 1; 234(2): 271–7.Shimomura O. Isolation and properties of various molecular forms of aequorin. Biochem J. 1986 Mar 1; 234 (2): 271-7.
- Snowdowne KW, Borle AB. Measurement of cytosolic free calcium in mammalian cells with aequorin. Am J Physiol. 1984 Nov; 247(5 Pt 1): C396–408.Snowdowne KW, Borle AB. Measurement of cytosolic free calcium in mammalian cells with aequorin. At the J Physiol. 1984 Nov; 247 (5 Pt 1): C396-408.
- Yang Te-Tuan, Sinai Parisa, Kitts Paul A. Kain Seven R., Quantification of gene expresssion with a secreted alkaline phosphatase reporter system. Biotechnique. 1997 23(6) 1110ffYang Te-Tuan, Sinai Parisa, Kitts Paul A. Kain Seven R., Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system. Biotechnique. 1997 23 (6) 1110ff
SEQUENCE
LISTING 
Claims (11)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2003128067 DE10328067A1 (en) | 2003-06-23 | 2003-06-23 | Isolated photoprotein Bolinopsin, as well as its use |
| EP04740054A EP1638998A1 (en) | 2003-06-23 | 2004-06-18 | Isolated photoprotein bolinopsin, and the use thereof |
| PCT/EP2004/006608 WO2005000885A1 (en) | 2003-06-23 | 2004-06-18 | Isolated photoprotein bolinopsin, and the use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2003128067 DE10328067A1 (en) | 2003-06-23 | 2003-06-23 | Isolated photoprotein Bolinopsin, as well as its use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10328067A1 true DE10328067A1 (en) | 2005-01-27 |
Family
ID=33546604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2003128067 Withdrawn DE10328067A1 (en) | 2003-06-23 | 2003-06-23 | Isolated photoprotein Bolinopsin, as well as its use |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1638998A1 (en) |
| DE (1) | DE10328067A1 (en) |
| WO (1) | WO2005000885A1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102005016980A1 (en) * | 2005-04-13 | 2006-11-02 | Bayer Healthcare Ag | Isolated photoprotein gr-bolinopsin, as well as its use |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2827292B1 (en) * | 2001-07-12 | 2004-06-18 | Centre Nat Rech Scient | MUTE PHOTOPROTEINS AND THEIR APPLICATIONS |
-
2003
- 2003-06-23 DE DE2003128067 patent/DE10328067A1/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-06-18 WO PCT/EP2004/006608 patent/WO2005000885A1/en not_active Application Discontinuation
- 2004-06-18 EP EP04740054A patent/EP1638998A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1638998A1 (en) | 2006-03-29 |
| WO2005000885A1 (en) | 2005-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Matz et al. | Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species | |
| WO2008095622A2 (en) | SECRETED LUCIFERASE MLuc7 AND USE THEREOF | |
| DE60122562T2 (en) | NUCLEIC ACIDS CODING STICHODACTYLIDAE CHROMOPROTEINS | |
| JP4480674B2 (en) | Fluorescent protein derived from Copepoda species and method of using the protein | |
| EP1664102B1 (en) | Isolated photoprotein mtclytin, and use thereof | |
| EP1572732B1 (en) | Isolated fluorescent protein from clytia gregaria cgfp and use thereof | |
| WO2002042469A1 (en) | Isolated luciferases lu164, lual and lu22, and the use of the same | |
| DE10328067A1 (en) | Isolated photoprotein Bolinopsin, as well as its use | |
| DE10339567A1 (en) | Isolated photoprotein berovine, as well as its use | |
| WO2008095623A2 (en) | SECRETED LUCIFERASE Lu164M3 AND USE THEREOF | |
| DE102005016980A1 (en) | Isolated photoprotein gr-bolinopsin, as well as its use | |
| DE102005022146A1 (en) | Isolated photoprotein AQdecay and its use | |
| DE102007011241A1 (en) | Isolated Photoprotein mtClytinDecay, as well as its use | |
| WO2006010454A1 (en) | Isolated photoprotein aequorin y89f and use thereof | |
| DE102005005438A1 (en) | Mutants of the fluorescent protein CGFPs, as well as their use | |
| WO2007140983A1 (en) | FLUORESCENT PROTEINS wfCGFP, and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8130 | Withdrawal |