DE102006039370A1

DE102006039370A1 - Verfahren zur Analyse von Makromolekülen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE102006039370A1
Application number: DE200610039370
Authority: DE
Inventors: Holger MÜHLBERGER; Werner Dr. Hoffmann
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Current assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date: 2006-08-22
Filing date: 2006-08-22
Publication date: 2008-02-28
Also published as: EP2054717A2; WO2008022718A8; WO2008022718A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von elektrisch leitfähigen Makromolekülen, die frei von magnetischen Markern sind und sich frei beweglich in einem ionenleitenden Fluid befinden, und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine hierfür geeignete Vorrichtung zum Nachweis einzelner oder einiger weniger Makromoleküle, vorzugsweise von Nukleinsäuren oder Proteinen, bereitzustellen, ohne dass die Makromoleküle zuvor mit einem magnetischen Marker oder Label versehen werden müssen. Ebenso sollen dieses Verfahren und die hierfür geeignete Vorrichtung die Manipulation einzelner oder einiger weniger Makromoleküle ermöglichen, z. B. um diese zur Analyse zu transportieren, zu separieren oder anzureichern. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einbringen des ionenleitenden Fluids, das mindestens ein elektrisch leitfähiges Makromolekül (4), das frei von magnetischen Markern ist, enthält, in ein Volumen (1), b) Beaufschlagen des Volumens (1) mit einem elektrischen Feld, wodurch in dem Markomolekül (4) ein erstes magnetisches Feld erzeugt wird, und c) Analyse des Makromoleküls (4) durch Ermitteln des Signals des ersten magnetischen Felds oder durch Beaufschlagen des Volumens (1) mit einem zweiten magnetischen Feld, wodurch das Makromolekül (4) bewegt und zum Nachweis gebracht wird.

Description

M. Tondra, A. Popple, A. Jander, R.L. Millen, N. Pekas und M. D. Porter stellen in Microfabricated tools for manipulation and analysis of magnetic microcarriers, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, Band 293, S. 725-730, 2005, eine Vorrichtung mit mikrostrukturierten Sensoren und Drähten, die auf dem Riesenmagnetwiderstand (Giant Magneto Resistance, GMR) basieren, zum Nachweis und zur Manipulation von magnetischen Mikroträgern vor.
Aus H. Brückel und J. Schotter, Magnetoresistiver Nachweis von Biomolekülen, Technisches Messen, Band 70, S. 577-581, 2003, ist ein Biochip auf der Basis magnetoresistiver Sensoren zum Nachweis von magnetischen Markern (Beads) bekannt. Zur Durchführung dieses Verfahrens ist es erforderlich, dass die nachzuweisenden Moleküle mit einem Marker versehen sind.
Aus B. Xu, P. Zhang, X. Li und N. Tao, Direct Conductance Measurement of Single DNA molecules in Aqueous Solution, Nanoletters 2004, Band 4, S. 1105-1008 ist bekannt, dass isolierte Desoxyribonukleinsäure (DNA) Moleküle elektrische Leitfähigkeit zeigen. Hierbei wurden für verschiedene Sequenzen unterschiedliche Leitfähigkeitsmechanismen beobachtet. Das hierin beschriebene Verfahren erfordert eine aufwändige Präparation und ist für den Routineeinsatz nicht geeignet.
Demnach ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Analyse von Makromolekülen, die sich frei beweglich in einem innenleitenden Fluid befinden, und eine Vor richtung zur Durchführung dieses Verfahrens vorzuschlagen, die die genannten Nachteile und Einschränkungen nicht aufweisen.
Insbesondere sollen ein derartiges Verfahren und eine hierfür geeignete Vorrichtung den Nachweis einzelner oder einiger weniger Makromoleküle, vorzugsweise von Nukleinsäuren oder Proteinen, routinemäßig ermöglichen, ohne dass diese zuvor mit einem magnetischen Marker oder Label versehen werden müssen.
Weiterhin sollen ein derartiges Verfahren und eine hierfür geeignete Vorrichtung die Manipulation einzelner oder einiger weniger Makromoleküle ermöglichen, z.B. um diese zur Analyse zu transportieren, zu separieren oder anzureichern.
Diese Aufgabe wird im Hinblick auf das Verfahren durch die Schritte des Anspruchs 1 und im Hinblick auf die Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens durch die Merkmale des Anspruchs 5 gelöst. Die Unteransprüche beschreiben jeweils vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse mindestens eines Makromoleküls basiert auf der Anregung eines Stromflusses über das elektrische leitfähige Makromolekül, so dass um das Makromolekül ein Magnetfeld induziert wird.
Durch Anlegen eines elektrischen Felds über ein flüssiges oder gasförmiges Medium (Fluid), in dem sich mindestens ein elektrisch leitfähiges Makromolekül befindet, fließt hierüber ein elektrischer Strom. Dieser induziert ein magnetisches Feld um das Makromolekül, das proportional zum Strom über das Makromolekül und umgekehrt proportional zum Abstand vom Makromolekül ist. Das auf diese Weise entstehende Magnetfeld ist in makroskopischer Entfernung äußerst gering. Erfolgt die Erfassung des Signals des Magnetfelds jedoch in einem geringen Abstand vom erzeugenden Molekül, wie es z.B. in einer mikrofluidischen Messzelle der Fall ist, so nimmt die Größe des Magnetfelds mit abnehmendem Abstand entsprechend zu.
Moderne elektronische Messtechnik erlaubt es heute, kleinste Magnetfelder mit hoher Auflösung zu detektieren. Magnetfeldsensoren auf Basis des Riesenmagnetwiderstands (GMR) und des Tunnelmagnetwiderstands (TMR, Tunneling Magneto Restistance) sind darauf optimiert, sehr kleine Manetfelder mit einer örtlichen Auflösung im Nanometerbereich nachzuweisen.
Das auf diese Weise messtechnisch erfasste erste Magnetfeld dient in erster Linie dem Nachweis des Vorhandenseins der Makromoleküle in einem Volumen. Vorzugsweise wird hierbei die Stärke des magnetischen Felds annähernd senkrecht zur Richtung des elektrischen Felds erfasst und gemessen.
In einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung wird das mindestens eine Makromolekül zusätzlich mit einem elektrischen Wechselfeld beaufschlagt, wodurch es sich periodisch bewegt, so dass über die Form des Signals des aufgenommenen Magnetfelds auf zusätzliche Informationen zur Charakterisierung des Makromoleküls geschlossen werden kann. Befindet sich während des Nachweises nur noch ein einzelnes Makromolekül im Volumen, so erfolgt die Bestimmung der zusätzlichen Informationen direkt. Auf diese Weise entfällt die sonst übliche Separation der Moleküle z.B. über die Laufzeit bei der Elektrophorese.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung werden die Makromoleküle aufgrund ihrer elektrisch induzierten magnetischen Eigenschaften durch Beaufschlagung mit einem zweiten magnetischen Feld manipuliert. Dadurch wird z.B. ein Transport der Makromoleküle, eine Separation der Makromoleküle nach ihrer Magnetfeldstärke entsprechend dem Prinzip eines Massenspektrometers oder eine Fokussierung der Makromoleküle verwirklicht, die der Analyse der nachzuweisenden Makromoleküle dient.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse von elektrisch leitfähigen Makromolekülen, die sich frei beweglich in einem innenleitenden Fluid befinden, weist die nachfolgend im Einzelnen erläuterten Schritte a) bis c) auf.
Gemäß Schritt a) wird zunächst das mindestens eine nachzuweisende Makromolekül in einer innenleitenden Lösung (Fluid) z.B. in einer Matrix in Form eines Gels in ein Volumen eingebracht.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich in erster Linie zum Nachweis von Makromolekülen wie Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA) wie Transfer-Ribonukleinsäure (t-RNA), Messenger-Ribonukleinsäure (m-RNA), ribosomaler Ribonukleinsäure (r-RNA), small nuclear Ribonukleinsäure (sn-RNA), von Proteinen natürlichen oder synthetischen Derivaten davon, oder einer Mischung dieser Makromoleküle.
Hieran anschließend werden die Makromoleküle innerhalb des Volumens gemäß Schritt b) mit einem elektrischen Gleich- oder Wechselfeld beaufschlagt. Das Einbringen des elektrischen Felds in das Volumen erfolgt vorzugsweise über ein oder mehrere Elektrodenpaare, die inner- oder außerhalb des Volumens angebracht sind. Wie bereits erläutert, wird hierdurch ein erstes magnetisches Feld im Makromolekül erzeugt (induziert).
Schließlich wird gemäß Schritt c) entweder das Signal des auf diese Weise im Makromolekül erzeugten ersten magnetischen Felds bzw. die hierdurch hervorgerufenen Änderung des ersten magnetischen Felds mit einem geeigneten Sensor erfasst und ausgewertet oder das Volumen, in dem sich das Makromolekül befindet, wird derart mit einem zweiten magnetischen Feld beaufschlagt, dass das mindestens eine Makromolekül (4) eine Kraft erfährt und zum Nachweis gebracht wird.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Analyse von Makromolekülen, die frei von magnetischen Markern sind und sich frei beweglich in einem innenleitenden Fluid befinden, weist mindestens die folgenden Bestandteile auf:

– mindestens ein Volumen zum Einbringen des innenleitenden Fluids mit dem mindestens einen Makromolekül,
– mindestens ein Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Felds über das Volumen, und
– mindestens ein Mittel zum Nachweis oder zum Anlegen eines Magnetfelds.

In einer bevorzugten Ausgestaltung wird hierzu mindestens ein Elektrodenpaar als Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Gleich- oder Wechselfeldes inner- oder außerhalb des Volumens angebracht.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung

– eine Vielzahl von Volumina zum Einbringen von innenleitenden Fluiden mit jeweils mindestens einem Makromolekül,
– eine oder mehrere Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Feldes, und
– mindestens ein Mittel zum Nachweis oder zum Anlegen eines Magnetfelds, das mittels des so genannten Multiplexens kurz hintereinander über mehrere oder alle Volumina eingesetzt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist hochempfindlich, da die Erzeugung des Magnetfeldes durch die Leitfähigkeit des Moleküls bedingt ist, so dass bereits mit kleinen Mengen an Makromolekülen innerhalb des Volumens gearbeitet werden kann. Verunreinigungen z.B. durch kleine Ionen stellen kein Problem dar, da sie keinen Beitrag zum magnetischen Signal liefern. Die Nachweisgrenzen sind gering, obwohl auf das Markieren bzw. Labeln der Makromoleküle verzichtet wird.
Da die heutigen Detektoren in Leseköpfen für Computer-Festplatten bereits mit räumlichen Auflösungen im Nanometerbereich arbeiten, können auch Unterschiede im Magnetfeld über ein einzelnes Molekül ausgewertet werden, um dessen Molekülstruktur zu analysieren. Bei einer weiteren Erhöhung der Empfindlichkeit der Detektoren sind so Aussagen über die Struktur des Makromoleküls möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren arbeitet berührungslos. Das Anlegen eines elektrischen Feldes über ein Messvolumen ist einfach zu durchzuführen.
Als Sensoren lassen sich bereits für Festplatten entwickelte Detektoren einsetzen. Wird zusätzlich der Sensor entsprechend einem Festplatten-Lesekopf beweglich gestaltet, so kann sich der Detektor mit einer sehr hohen Positionierungsgenauigkeit und Geschwindigkeit zwischen mehreren Messzellen bewegen. Auf diese Weise wird Multiplexen über eine sehr große Anzahl von Messzellen möglich. Miniaturisierte hochparallelisierte Systeme z.B. zur Genomsequenzierung werden so realisierbar.
Neben dem Einsatz zum quantitativen Nachweis von Molekülen z.B. am Ende einer elektrophoretischen Trennung lassen sich mit dem vorliegenden Verfahren auch direkt Informationen über die Struktur des Moleküls gewinnen. Ebenso wird eine direkte Manipulation von Molekülen möglich.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels und der Figur näher erläutert.
Die Figur zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens. An ein Volumen 1 in einem offenen (z.B. Gel-Pad) oder geschlossenen (z.B. Kapillare) Behältnis 10, in dem sich ein Fluid, d.h. eine Flüssigkeit, ein Gas oder eine Matrix z.B. in Form eines Gels, ist ein Elektrodenpaar 2; 2' zum Anlegen eines elektrischen Felds angebracht.
Wird nun über ein Mittel 3 zum Anlegen eines elektrischen Felds ein elektrisches Feld über das Volumen 1 angelegt, so fließt durch das elektrisch leitfähige Makromolekül 4, das sich frei beweglich im Volumen 1 befindet, ein Strom, der ein erstes magnetisches Feld über das Makromolekül 4 induziert. Das erste magnetische Feld bzw. dessen zeitliche Änderung lässt sich mittels des Magnetfeldsensors 5 ermitteln.
Das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderliche Auflösungsvermögen lässt sich wie folgt abschätzen:
Die magnetische Feldstärke H im Radius r um einen elektrischen Leiter, in dem ein Strom I fließt, beträgt H = I/(2Πr). Die Größe des Stroms I durch den Leiter beträgt I = U/R, wobei sich der elektrische Widerstand R des Leiters im Falle einer zylinderförmigen Geometrie durch seine Länge l, seine Querschnittsfläche A und seinen spezifischen Widerstand ρ mit R = (ρ·l)/A beschreiben lässt.
Betrachtet man das zu erfassende Makromolekül als einen 100 nm langen zylinderförmigen Leiter mit einem Querschnitt von 1 nm² und wird ein spezifischen Widerstand des Makromoleküls in der Größenordnung von Kohle mit ρ = 40 (Ω·mm²)/m angenommen, so ergibt sich der elektrische Widerstand zu R = 4·10⁶ Ω.
Wird nun eine Spannung in Höhe von 0,1 V an den Leiter angelegt, fließt ein sehr kleiner Strom der Größe I = 2,5·10^-8 A. Dieser ruft im Abstand von 1 μm eine magnetische Feldstärke in Höhe von H = 4·10^-3 A/m hervor. Es sind bereits GMR Sensoren erhältlich, die Auflösungen von 0,1 nT (~ 1·10^-4 A/m) bei einer Reproduzierbarkeit von 1 nT (~ 1·10^-3 A/m) zeigen.
Bei einer elektrischen Leitfähigkeit von Makromolekülen, die vergleichbar mit der des Kohlenstoffs ist, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren den Nachweis einzelner Moleküle. Dabei ist zu beachten, dass das theoretisch abgeschätzte Nachweislimit für die GMR um 3 Größenordnungen geringer ist als gegenwärtig erhältliche Sensoren. Werden GMR Sensoren durch TMR Sensoren ersetzt, so lässt sich die Nachweisempfindlichkeit sogar noch weiter steigern.

Claims

Verfahren zur Analyse von elektrisch leitfähigen Makromolekülen, die frei von magnetischen Markern sind und sich frei beweglich in einem innenleitenden Fluid befinden, mit den Schritten a) Einbringen des innenleitenden Fluids, in dem sich das mindestens eine Makromolekül (4), das frei von magnetischen Markern ist, befindet, in ein Volumen (1), b) Beaufschlagen des Volumens (1) mit einem elektrischen Feld, wodurch um das mindestens eine Makromolekül (4) ein erstes magnetisches Feld erzeugt wird, und c) Analyse des mindestens einen Makromoleküls (4) durch Ermitteln des Signals des ersten magnetischen Felds oder durch Beaufschlagen des Volumens (1) mit einem zweiten magnetischen Feld, wodurch das mindestens eine Makromolekül (4) bewegt und zum Nachweis gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Volumen (1), in dem sich das mindestens eine Makromolekül (4) befindet, zusätzlich mit einem elektrischen Wechselfeld beaufschlagt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Desoxyribonukleinsäure (DNA), eine Ribonukleinsäure (RNA), ein Protein, eines ihrer Derivate, oder eine Mischung hiervon in einem innenleitenden Fluid als Makromolekül (4) in das Volumen (1) eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Magnetfeldsensor auf Basis des Riesenmagnetwiderstands oder des Tunnelmagnetwiderstands zur Ermittlung des Signals des ersten magnetischen Felds eingesetzt wird.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, enthaltend – mindestens ein Volumen (1) zur Aufnahme des mindestens einen elektrisch leitfähigen Makromoleküls (4), das frei von magnetischen Markern ist und sich frei beweglich in einem innenleitenden Fluid befindet, – mindestens ein Mittel (3) zur Erzeugung eines elektrischen Felds über das Volumen (1), wodurch um das mindestens eine Makromolekül (4) ein erstes magnetisches Feld erzeugt wird, und – ein Mittel (5) zur Ermittlung des Signals des ersten magnetischen Felds oder zur Beaufschlagung des Volumens (1) mit einem zweiten magnetischen Feld.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei ein Magnetfeldsensor auf Basis des Riesenmagnetwiderstands oder des Tunnelmagnetwiderstands als Mittel zur Ermittlung des Signals des magnetischen Felds eingesetzt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, enthaltend weitere Volumina zur Aufnahme einer Vielzahl von elektrisch leitfähigen Makromolekülen, die sich frei beweglich in einem innenleitenden Fluid befinden, und weitere Mittel zur Erzeugung von elektrischen Feldern über die Volumina, wobei das Mittel (5) beweglich angeordnet ist.