DE102006035515A1

DE102006035515A1 - Verfahren und Reagenzzusammenstellung zur Sichtbarmachung von Aminosäuren und Peptiden

Info

Publication number: DE102006035515A1
Application number: DE102006035515A
Authority: DE
Inventors: Michael Schulz; Heinz-Emil Dr. Hauck
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2006-07-31
Filing date: 2006-07-31
Publication date: 2008-02-07
Also published as: JP2009545728A; EP2047273A1; US7858376B2; US20090258427A1; WO2008014859A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Reagenzzusammenstellung zur Anfärbung und damit Sichtbarmachung von Aminosäuren, Peptiden und ähnlichen Verbindungen, insbesondere nach Auftrennung mittels Dünnschichtchromatographie. Die Anfärbung erfolgt unter Verwendung von mindestens einem Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen in Kombination mit mindestens einer ionischen Flüssigkeit.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Reagenzzusammenstellung zur Anfärbung und damit Sichtbarmachung von Aminosäuren, Peptiden und ähnlichen Verbindungen insbesondere nach Auftrennung mittels Dünnschichtchromatographie. Die Anfärbung erfolgt unter Verwendung von mindestens einem Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden in Kombination mit mindestens einer ionischen Flüssigkeit.
Die Analytik von Proteinen spielt eine wichtige Rolle bei der Untersuchung von Zellstrukturen oder Zellstoffwechseln bzw. Zellfunktionen. Die Analytik von Proteinen oder Peptiden umfasst dabei z.B. die Strukturanalyse, Bestimmung des Molekulargewichts, Bestimmung eines Verteilungsmusters (Peptide Mapping) oder auch die Identifikation bestimmter Peptide oder Proteine.
In der Regel muss vor der Analyse der Proteine oder Peptide zunächst eine Auftrennung durchgeführt werden. Bekannte Methoden hierzu sind beispielsweise die Flüssigkeitschromatographie, die Ionenaustauschchromatographie, die Kapillarelektrophorese oder die Gelelektrophorese. Anschließend erfolgt die Analyse z.B. mittels Anfärben oder mittels Massenspektrometrie.
Auch die Dünnschichtchromatographie ist zur Auftrennung von Proteinen, Peptiden oder Aminosäuren geeignet. Ein großer Vorteil der Dünnschichtchromatographie besteht darin, dass sie kostengünstig und einfach in der Durchführung ist. Weiterhin kann die Auftrennung ein- oder mehrdimensional erfolgen, so dass die Auflösung der Trennung an das Trennproblem angepasst werden kann.
Für Aminogruppen-haltige Verbindungen wie Proteine, Peptide oder Aminosäuren stehen zur Auswertung einer dünnschichtchromatographischen Trennung (DC-Trennung) verschiedene Färbemethoden zur Verfügung. Die bekanntesten sind die Anfärbung mit Ninhydrin (2,2-Dihydroxyindan-1,3-dion), mit Fluorescamin oder Isatin-5-Sulfonsäure. Fluorescamin bietet im Vergleich zu Ninhydrin eine höhere Empfindlichkeit. Sowohl Ninhydrin als auch Fluorescamin geben jedoch keine zusätzliche Information über die angefärbte Verbindung, da alle Verbindungen in der gleichen Farbe angefärbt werden. Isatin-5-Sulfonsäure färbt Aminosäuren selektiv an, ist aber für Verbindungen, die aus mehreren Aminosäuren bestehen nicht geeignet, da die Empfindlichkeit sehr stark mit zunehmender Anzahl der Aminosäuren im zu untersuchenden Molekül abnimmt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren bzw. ein Reagenz zur selektiven Sichtbarmachung, insbesondere zur Anfärbung von Aminosäuren, Peptiden und Proteinen zur Verfügung zu stellen, das insbesondere auch nach einer DC-Trennung eingesetzt werden kann.
Es wurde gefunden, dass ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, insbesondere Ninhydrin oder eines seiner Derivate, ganz besonders bevorzugt Ninhydrin, in Kombination mit mindestens einer ionischen Flüssigkeit Aminosäuren und Verbindungen, die aus mehreren Aminosäuren bestehen, selektiv anfärbt. Man erhält Färbungen in einem breiten Farbspektrum zwischen gelb, grün, blau bis hin zu rot bis rosa. Die Empfindlichkeit der Anfärbung entspricht dabei zumindest der einer herkömmlichen Anfärbung von Aminosäuren mit beispielsweise Ninhydrin.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, insbesondere Ninhydrin oder eines seiner Derivate, und eine ionische Flüssigkeit.
In der einfachsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Reagenzzusammenstellung nur aus dem Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, insbesondere Ninhydrin oder eines seiner Derivate, und einer ionischen Flüssigkeit. In diesem liegt beispielsweise das Ninhydrin in der ionischen Flüssigkeit gelöst vor, so dass die ionische Flüssigkeit zusätzlich als Lösungsmittel fungiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reagenzzusammenstellung zumindest

a) ein Reagenz zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen in mindestens einem Lösungsmittel und
b) ein Reagenz zumindest enthaltend mindestens eine ionische Flüssigkeit.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reagenzzusammenstellung zumindest

a) ein Reagenz zumindest enthaltend 0.01–10 Massen-%, vorzugsweise 0.1–1 Massen-% Ninhydrin in mindestens einem Lösungsmittel
b) ein Reagenz zumindest enthaltend mindestens eine ionische Flüssigkeit, vorzugsweise in mindestens einem Lösungsmittel.

Ionische Flüssigkeiten oder flüssige Salze sind ionische Spezies, die aus einem organischen Kation (K⁺) und einem in der Regel anorganischen Anion (A^–) bestehen. Sie enthalten keine neutralen Moleküle und weisen meistens Schmelzpunkte kleiner 373 K auf.
Das Gebiet der ionischen Flüssigkeiten wird zurzeit intensiv erforscht, da die Anwendungsmöglichkeiten vielfältig sind. Übersichtsartikel zu ionischen Flüssigkeiten sind beispielsweise R. Sheldon „Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399–2407; M.J. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future", Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391–1398; P. Wasserscheid, W. Keim „Ionische Flüssigkeiten – neue Lösungen für die Übergangsmetallkatalyse", Angew. Chem., 112 (2000), 3926–3945; T. Welton „Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis", Chem. Rev., 92 (1999), 2071–2083 oder R. Hagiwara, Va. Ito „Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions", J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221–227).
Wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren zur Sichtbarmachung sind die Ionischen Flüssigkeiten der allgemeinen Formel K⁺A^–. Vorzugsweise ist das Anion A^– ausgewählt aus der Gruppe umfassend Halogenide, insbesondere Chlorid und Bromid, Tetrafluoroborat, Sulfonate, insbesondere Trifluormethylsulfonat.
In Bezug auf die Wahl des Kations K⁺ der Ionischen Flüssigkeit der ionischen Flüssigkeit gibt es per se keine Einschränkungen. Vorzugsweise handelt es sich aber um organische Kationen, wobei es sich insbesondere bevorzugt um Ammonium-, Phosphonium, Thiouronium-, Guanidiniumkationen oder um heterocyclische Kationen handelt.
Ammoniumkationen können beispielsweise durch die Formel (1) [HR₄]⁺ (1),beschrieben werden, wobei
R jeweils unabhängig voneinander
H, wobei nicht alle Substituenten R gleichzeitig H sein dürfen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1–20 C-Atomen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen,
gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere R teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'₂, -SO₂NR'₂, -SO₂OH, -SO₂X, -NO₂, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome des R, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -N⁺R'₂-, -C(O)NR'-, -SO₂NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C₁- bis C₆-Alkyl, C₃- bis C₇-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen sein kann.
Phosphoniumkationen können beispielsweise durch die Formel (2) [PR² ₄]⁺ (2),beschrieben werden, wobei
R² jeweils unabhängig voneinander
H, NR'₂
geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1–20 C-Atomen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen,
gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere R² teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'₂, -SO₂NR'₂, -SO₂OH, -SO₂X, -NO₂, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome des R², durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -N⁺R'₂-, -C(O)NR'-, -SO₂NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C₁- bis C₆-Alkyl, C₃- bis C₇-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.
Ausgeschlossen sind jedoch Kationen der Formeln (1) und (2), in denen alle vier oder drei Substituenten R und R² vollständig mit Halogenen substituiert sind, beispielsweise das Tris(trifluormethyl)methylammoniumkation, das Tetra(trifluormethyl)ammoniumkation oder das Tetra(nonafluorbutyl)ammoniumkation.
Geeignete Thiouroniumkationen können durch die Formel (3), [(R³R⁴N)-C(=SR⁵)(NR⁶R⁷)]⁺ (3),beschrieben werden, wobei
R³ bis R⁷ jeweils unabhängig voneinander
Wasserstoff,
geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen,
gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere der Substituenten R³ bis R⁷ teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OH, -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'₂, -SO₂NR'₂, -SO₂OH, -SO₂X, -NO₂, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome von R³ bis R⁷ durch Atom; und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -N⁺R'₂-, -C(O)NR'-, -SO₂NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C₁- bis C₆-Alkyl, C₃-bis C₇-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.
Guanidiniumkationen können durch die Formel (4) [C(NR⁸R⁹)(NR¹⁰R¹¹)(NR¹²R¹³)]⁺ (4),beschrieben werden, wobei
R⁸ bis R¹³ jeweils unabhängig voneinander
Wasserstoff, -CN, NR'₂,
geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen,
gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann, bedeutet, wobei ein oder mehrere der Substituenten R⁸ bis R¹³ teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'₂, -SO₂NR'₂, -SO₂OH, -SO₂X, -NO₂, substituiert sein können, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständige Kohlenstoffatome von R⁸ bis R¹³ durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -N⁺R'₂-, -C(O)NR'-, -SO₂NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C₁- bis C₆-Alkyl, C₃- bis C₇-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.
Darüber hinaus können Kationen der allgemeinen Formel (5) [HetN]⁺ (5)eingesetzt werden, wobei
HetN⁺ ein heterocyclisches Kation, ausgewählt aus der Gruppe

bedeutet, wobei die Substituenten
R^1, bis R^4, jeweils unabhängig voneinander
Wasserstoff, -CN,
geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1–20 C-Atomen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Doppelbindungen,
geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2–20 C-Atomen und einer oder mehreren nicht konjugierten Dreifachbindungen,
gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Cycloalkyl mit 3–7 C-Atomen, das mit Alkylgruppen mit 1–6 C-Atomen substituiert sein kann, gesättigtes, teilweise oder vollständig ungesättigtes Heteroaryl, Heteroaryl-C₁-C₆-alkyl oder Aryl-C₁-C₆-alkyl bedeutet,
wobei die Substituenten R^1', R^2', R^3' und/oder R^4' zusammen auch ein Ringsystem bilden können,
wobei ein oder mehrere Substituenten R^1, bis R^4, teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'₂, -SO₂NR'₂, -C(O)X, -SO₂OH, -SO₂X, -NO₂, substituiert sein können, wobei jedoch nicht gleichzeitig R^1' und R^4' vollständig mit Halogenen substituiert sein dürfen, und wobei ein oder zwei nicht benachbarte und nicht am Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome der Substituenten R^1, bis R^4,, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der -O-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -N⁺R'₂-, -C(O)NR'-, -SO₂NR'-,
oder -P(O)R'- ersetzt sein können mit R' = H, nicht, teilweise oder perfluoriertes C₁- bis C₆-Alkyl, C₃- bis C₇-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl und X = Halogen.
Als Substituent R^2' eignen sich insbesondere auch Atomgruppierungen ausgewählt aus -OR', -NR'2, -C(O)OH, -C(O)NR'₂, -SO₂NR'₂, -SO₂OH, -SO₂X oder -NO₂.
Unter vollständig ungesättigten Substituenten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung auch aromatische Substituenten verstanden.
Als Substituenten R und R² bis R¹³ der Verbindungen der Formeln (1) bis (4) kommen erfindungsgemäß dabei neben Wasserstoff bevorzugt in Frage: C₁- bis C₂₀-, insbesondere C₁- bis C₁₄-Alkylgruppen, und gesättigte oder ungesättigte, d.h. auch aromatische, C₃- bis C₇-Cycloalkylgruppen, die mit C₁- bis C₆-Alkylgruppen substituiert sein können, insbesondere Phenyl.
Die Substituenten R und R² in den Verbindungen der Formel (1) oder (2) können dabei gleich oder verschieden sein. Bevorzugt sind die Substituenten R und R² verschieden.
Die Substituenten R und R² sind insbesondere bevorzugt Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl oder Tetradecyl.
Bis zu vier Substituenten des Guanidinium-Kations [C(NR⁸R⁹)(NR¹⁰R¹¹)(NR¹²R¹³)]⁺ können auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische Kationen entstehen. Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für solche Guanidinium-Kationen:
wobei die Substituenten R⁸ bis R¹⁰ und R¹³ eine zuvor angegebene oder besonders bevorzugte Bedeutung haben können.
Gegebenenfalls können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen Guanidinium-Kationen noch durch C₁- bis C₆-Alkyl, C₁- bis C₆-Alkenyl, NO₂, CN, NR'₂, F, Cl, Br, I, C₁-C₆-Alkoxy, SCF₃, SO₂CF₃, COOH, SO₂NR'₂, SO₂X' oder SO₃H substituiert sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben, substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter Heterocyclus substituiert sein.
Bis zu vier Substituenten des Thiouroniumkations [(R³R⁴N)-C(=SR⁵)(NR⁶R⁷)]⁺ können auch paarweise derart verbunden sein, dass mono-, bi- oder polycyclische Kationen entstehen.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für solche Kationen im Folgenden angegeben, wobei Y = S bedeutet:
wobei die Substituenten R³, R⁵ und R⁶ eine zuvor angegebene oder besonders bevorzugte Bedeutung haben können.
Gegebenenfalls können die Carbocyclen oder Heterocyclen der zuvor angegebenen Kationen noch durch C₁- bis C₆-Alkyl, C₁- bis C₆-Alkenyl, NO₂, CN, NR'₂, F, Cl, Br, I, C₁-C₆-Alkoxy, SCF₃, SO₂CF₃, COOH, SO₂NR'₂, SO₂X oder SO₃H oder substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl oder unsubstituierter oder substituierter Heterocyclus substituiert sein, wobei X und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben.
Die Substituenten R³ bis R¹³ sind jeweils unabhängig voneinander bevorzugt eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen. Die Substituenten R³ und R⁴, R⁶ und R⁷, R⁸ und R⁹, R¹⁰ und R¹¹ und R¹² und R¹³ in Verbindungen der Formeln (3) bis (4) können dabei gleich oder verschieden sein. Besonders bevorzugt sind R³ bis R¹³ jeweils unabhängig voneinander Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert.- Butyl, sek.-Butyl, Phenyl oder Cyclohexyl, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl oder n-Butyl.
Als Substituenten R^1' bis R^4' von Verbindungen der Formel (5) kommen erfindungsgemäß dabei neben Wasserstoff bevorzugt in Frage: C₁- bis C₂₀, insbesondere C₁- bis C₁₂-Alkylgruppen, und gesättigte oder ungesättigte, d.h. auch aromatische, C₃- bis C₇-Cycloalkylgruppen, die mit C₁- bis C₆-Alkylgruppen substituiert sein können, insbesondere Phenyl.
Die Substituenten R^1' und R^4' sind jeweils unabhängig voneinander insbesondere bevorzugt Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Decyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Benzyl. Sie sind ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Butyl oder Hexyl. In Pyrrolidinium-, Piperidinium- oder Indolinium-Verbindungen sind die beiden Substituenten R^1' und R^4' bevorzugt unterschiedlich.
Der Substituent R^2' oder R^3' ist jeweils unabhängig voneinander insbesondere Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Benzyl. Besonders bevorzugt ist R^2' Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl oder sek.-Butyl. Ganz besonders bevorzugt sind R^2' und R^3' Wasserstoff. Die C₁-C₁₂-Alkylgruppe ist beispielsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl, Propyl, Butyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl, ferner auch Pentyl, 1-, 2- oder 3-Methylbutyl, 1,1-, 1,2- oder 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl oder Dodecyl. Gegebenenfalls Difluormethyl, Trifluormethyl, Pentafluorethyl, Heptafluorpropyl oder Nonafluorbutyl.
Ein geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei auch mehrere Doppelbindungen vorhanden sein können, ist beispielsweise Allyl, 2- oder 3-Butenyl, Isobutenyl, sek.-Butenyl, ferner 4-Pentenyl, iso-Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl, -C₉H₁₇, -C₁₀H₁₉ bis -C₂₀H₃₉; vorzugsweise Allyl, 2- oder 3-Butenyl, Isobutenyl, sek.-Butenyl, ferner bevorzugt ist 4-Pentenyl, iso-Pentenyl oder Hexenyl.
Ein geradkettiges oder verzweigtes Alkinyl mit 2 bis 20 C-Atomen, wobei auch mehrere Dreifachbindungen vorhanden sein können, ist beispielsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2- oder 3-Butinyl, ferner 4-Pentinyl, 3-Pentinyl, Hexinyl, Heptinyl, Octinyl, -C₉H₁₅, -C₁₀H₁₇ bis -C₂₀H₃₇, vorzugsweise Ethinyl, 1- oder 2-Propinyl, 2- oder 3-Butinyl, 4-Pentinyl, 3-Pentinyl oder Hexinyl.
Aryl-C₁-C₆-alkyl bedeutet beispielsweise Benzyl, Phenylethyl, Phenylpropyl, Phenylbutyl, Phenylpentyl oder Phenylhexyl, wobei sowohl der Phenylring als auch die Alkylenkette, wie zuvor beschrieben teilweise oder vollständig mit Halogenen, insbesondere -F und/oder -Cl, oder teilweise mit -OR', -NR'₂, -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'₂, -SO₂NR'₂, -C(O)X, -SO₂OH, -SO₂X, -NO₂ substituiert sein können.
Unsubstituierte gesättigte oder teilweise oder vollständig ungesättigte Cycloalkylgruppen mit 3–7 C-Atomen sind daher Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclopentenyl, Cyclohexenyl, Phenyl, Cycloheptenyl, welche mit C₁- bis C₆-Alkylgruppen substituiert sein können, wobei wiederum die Cycloalkylgruppe oder die mit C₁- bis C₆-Alkylgruppen substituierte Cycloalkylgruppe auch mit Halogenatomen wie F, Cl, Br oder I, insbesondere F oder Cl oder mit -OR', -CN, -C(O)OH, -C(O)NR'₂, -SO₂NR'₂, -SO₂OH, -SO₂X, -NO₂ substituiert sein kann.
In den Substituenten R, R² bis R¹³ oder R^1' bis R^4' können auch ein oder zwei nicht benachbarte und nicht α-ständig zum Heteroatom gebundene Kohlenstoffatome, durch Atome und/oder Atomgruppierungen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -N⁺R'₂-, -C(O)NR'-, -SO₂NR'-, oder -P(O)R'- ersetzt werden, mit R' = nicht, teilweise oder perfluoriertes C₁- bis C₆-Alkyl, C₃- bis C₇-Cycloalkyl, unsubstituiertes oder substituiertes Phenyl.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit sind Beispiele für derart modifizierte Substituenten R, R² bis R¹³ und R^1' bis R^4':
-OCH₃, -OCH(CH₃)₂, -CH₂OCH₃, -CH₂-CH₂-O-CH₃, -C₂H₄OCH(CH₃)₂, -C₂H₄SC₂H₅, -C₂H₄SCH(CH₃)₂, -S(O)CH₃, -SO₂CH₃, -SO₂C₆H₅, -SO₂C₃H₇, -SO₂CH(CH₃)₂, -SO₂CH₂CF₃, -CH₂SO₂CH₃, -O-C₄H₈-O-C₄H₉, -CF₃, -C₂F₅, C₃F₇, -C₄F₉, -C(CF₃)₃, -CF₂SO₂CF₃, -C₂F₄N(C₂F₅)C₂F₅, -CHF₂, -CH₂CF₃, -C₂F₂H₃, -C₃FH₆, -CH₂C₃F₇, -C(CFH₂)₃, -CH₂C(O)OH, -CH₂C₆H₅ oder P(O)(C₂H₅)₂.
In R' ist C₃- bis C₇-Cycloalkyl beispielweise Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl.
In R' bedeutet substituiertes Phenyl, durch C₁- bis C₆-Alkyl, C₁- bis C₆-Alkenyl, NO₂, CN, NR'₂, F, Cl, Br, I, C₁-C₆-Alkoxy, SCF₃, SO₂CF₃, COOH, SO₂X', SO₂NR''₂ oder SO₃H substituiertes Phenyl, wobei X' F, Cl oder Br und R" ein nicht, teilweise oder perfluoriertes C₁- bis C₆-Alkyl oder C₃- bis C₇-Cycloalkyl wie für R' definiert bedeutet, beispielsweise, o-, m- oder p-Methylphenyl, o-, m- oder p-Ethylphenyl, o-, m- oder p-Propylphenyl, o-, m- oder p-Isopropylphenyl, o-, m- oder p-tert.-Butylphenyl, o-, m- oder p-Nitrophenyl, o-, m- oder p-Methoxyphenyl, o-, m- oder p-Ethoxyphenyl, o-, m-, p-(Trifluormethyl)phenyl, o-, m-, p-(Trifluormethoxy)phenyl, o-, m-, p-(Trifluormethylsulfonyl)phenyl, o-, m- oder p-Fluorphenyl, o-, m- oder p-Chlorphenyl, o-, m- oder p-Bromphenyl, o-, m- oder p-Iodphenyl, weiter bevorzugt 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dimethylphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dihydroxyphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Difluorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dichlorphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dibromphenyl, 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-Dimethoxyphenyl, 5-Fluor-2-methylphenyl, 3,4,5-Trimethoxyphenyl oder 2,4,5-Trimethylphenyl.
In R^1' bis R^4' wird als Heteroaryl ein gesättigter oder ungesättigter mono- oder bicyclischer heterocyclischer Rest mit 5 bis 13 Ringgliedern verstanden, wobei 1, 2 oder 3 N- und/oder 1 oder 2 S- oder O-Atome vorliegen können und der heterocyclische Rest ein- oder mehrfach durch C₁- bis C₆-Alkyl, C₁- bis C₆-Alkenyl, NO₂, CN, NR'₂, F, Cl, Br, I, C₁-C₆-Alkoxy, SCF₃, SO₂CF₃, COOH, SO₂X', SO₂NR'₂ oder SO₃H substituiert sein kann, wobei X' und R' eine zuvor angegebene Bedeutung haben.
Der heterocyclische Rest ist vorzugsweise substituiertes oder unsubstituiertes 2- oder 3-Furyl, 2- oder 3-Thienyl, 1-, 2- oder 3-Pyrrolyl, 1-, 2-, 4- oder 5-Imidazolyl, 3-, 4- oder 5-Pyrazolyl, 2-, 4- oder 5-Oxazolyl, 3-, 4- oder 5-Isoxazolyl, 2-, 4- oder 5-Thiazolyl, 3-, 4- oder 5-Isothiazolyl, 2-, 3- oder 4-Pyridyl, 2-, 4-, 5- oder 6-Pyrimidinyl, weiterhin bevorzugt 1,2,3-Triazol-1-, -4- oder -5-yl, 1,2,4-Triazol-1-, -4- oder -5-yl, 1- oder 5-Tetrazolyl, 1,2,3-Oxadiazol-4- oder -5-yl 1,2,4-Oxadiazol-3- oder -5-yl, 1,3,4-Thiadiazol-2- oder -5-yl, 1,2,4-Thiadiazol-3- oder -5-yl, 1,2,3-Thiadiazol-4- oder -5-yl, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-2H-Thiopyranyl, 2-, 3- oder 4-4H-Thiopyranyl, 3- oder 4-Pyridazinyl, Pyrazinyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzofuryl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzothienyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-1H-Indolyl, 1-, 2-, 4- oder 5-Benzimidazolyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzopyrazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzoxazolyl, 3-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzisoxazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzthiazolyl, 2-, 4-, 5-, 6- oder 7-Benzisothiazolyl, 4-, 5-, 6- oder 7-Benz-2,1,3-oxadiazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinolinyl, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Isochinolinyl, 1-, 2-, 3-, 4- oder 9-Carbazolyl, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- oder 9-Acridinyl, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Cinnolinyl, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-Chinazolinyl oder 1-, 2- oder 3-Pyrrolidinyl.
Unter Heteroaryl-C₁-C₆-alkyl wird nun in Analogie zu Aryl-C₁-C₆-alkyl beispielsweise Pyridinyl-methyl, Pyridinyl-ethyl, Pyridinyl-propyl, Pyridinyl-butyl, Pyridinyl-pentyl, Pyridinyl-hexyl verstanden, wobei weiterhin die zuvor beschriebenen Heterocyclen in dieser Weise mit der Alkylenkette verknüpft werden können.
HetN⁺ ist bevorzugt
wobei die Substituenten R¹' bis R^4' jeweils unabhängig voneinander eine zuvor beschriebene Bedeutung haben.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Kationen der erfindungsgemäßen ionischen Flüssigkeit um Ammonium-, Imidazolium-, Pyridinium-, Pyrrolidinium-, Piperidinium-, Phosphonium-, Morpholinium- oder Piperidinium-Kationen.
Besonders bevorzugte Ionische Flüssigkeiten sind 1-Pentyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Hexyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Heptyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Octyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Nonyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Decyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, Trihexyltetradecyl-phosphoniumchlorid, Ethyldimetylpentylammoniumbromid, Ethyldimethylpropylammoniumchlorid, 1-Methyl-1-octylpyrrolidiniumchlorid, n-Butylpyridiniumchlorid, n-Octylpyridiniumchlorid, 4-Methyl-4-pentylmorpholiniumbromid oder 1-Methyl-1-pentylpiperidiniumbromid.
Ganz besonders bevorzugte Ionische Flüssigkeiten sind 1-Pentyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Hexyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Heptyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Octyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Nonyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Decyl-3-methyl imidazoliumchlorid, Ethyldimetylpentylammoniumbromid und 1-Methyl-1-octylpyrrolidiniumchlorid.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält die Reagenzzusammenstellung zusätzlich zumindest eine DC-Platte.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch

a) chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte)
b) Anfärben der aufgetrennten Probe auf der DC-Platte mit einer Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und mindestens eine ionische Flüssigkeit.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch

a') chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte), wobei das Fließmittel mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält, und
b') Anfärben der aufgetrennten Probe auf der DC-Platte mit einer Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen.

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte), wobei das Fließmittel mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin oder eines seiner Derivate, und mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als DC-Platte in Schritt a) oder a') eine Platte mit einer unpolaren Phase oder einer Cellulose-Phase eingesetzt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Sichtbarmachung in Schritt b), indem die DC-Platte in einem Schritt b1) zunächst mit einem Reagenz behandelt wird, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und anschließend in einem Schritt b2) mit einem Reagenz, das zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin oder eines seiner Derivate, enthält. Es ist auch möglich die Sichtbarmachung in Schritt b) durchzuführen, indem zunächst eine Behandlung mit mindestens einem Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin (b2), und dann mit der ionischen Flüssigkeit (b1) erfolgt. Vorzugsweise jedoch erfolgt die Sichtbarmachung in Schritt b), indem die DC-Platte in einem Schritt b1) zunächst mit einem Reagenz behandelt wird, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und anschließend in einem Schritt b2) mit einem Reagenz, das zumindest Ninhydrin oder eines seiner Derivate enthält, behandelt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt b) nach der Behandlung der DC-Platte mit der Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und mindestens eine ionische Flüssigkeit oder nach Schritt b') für 0.5 bis 10 Minuten auf eine Temperatur zwischen 50 und 200°C erhitzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Reagenzzusammenstellung verwendet, die ein Reagenz enthält, das zumindest 0.01–10 Massen-%, vorzugsweise 0.1–1 Massen-% Ninhydrin in mindestens einem Lösungsmittel enthält, und ein Reagenz, das zumindest 0.1 bis 10% mindestens einer ionischen Flüssigkeit in mindestens einem Lösungsmittel enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Verfahren zur Sichtbarmachung, insbesondere zur Anfärbung von Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine mit einer Reagenzkombination behandelt werden, die zumindest eine ionische Flüssigkeit und mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin oder eines seiner Derivate, enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine zunächst mit einem Reagenz behandelt, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und dann mit einem Reagenz, das zumindest Ninhydrin enthält.
Weitere Kombinationen bzw. bevorzugte Ausführungsformen sind in den Patentansprüchen offenbart.
Eine Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen ist erfindungsgemäß eine Probe, von der angenommen wird, dass sie zumindest eine Aminosäure und/oder ein Peptid enthält. Die Probe kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein, z.B. ein Zellextrakt, eine Körperflüssigkeit, ein Proteinverdau oder das Reaktionsgemisch einer Peptidsynthese. In der Regel handelt es sich um eine flüssige Probe, wobei die Analyten typischerweise in einem organischen Lösungsmittel oder Wasser oder Gemischen organischer Lösungsmittel oder Mischungen von organischen Lösungsmitteln und Wasser vorliegen. Die Probe kann beliebige weitere feste, emulgierte oder gelöste Bestandteile enthalten, die aber weder die DC-Auftrennung noch die spätere Anfärbung der Analyten (Aminosäuren und/oder Peptide) stören sollten.
Feste Proben werden in der Regel zunächst in einem der oben genannten Lösungsmittel aufgenommen, damit sie auf die DC-Platte aufgetragen werden können. Bei konzentrierten Proben kann es notwendig sein, diese zunächst zu verdünnen. Dem Fachmann im Bereich der Dünnschichtchromatographie ist bekannt, wie groß die Probenmenge und Probenkonzentration in Abhängigkeit von der eingesetzten DC-Platte und dem jeweiligen Trennproblem sein darf bzw. sein muss, um möglichst ideal auswertbare Banden zu erhalten.
Aminosäuren, Peptide und/oder Proteinen sind erfindungsgemäß alle natürlichen oder synthetischen Aminosäuren, Verbindungen, die zwei oder mehrere natürliche oder synthetische Aminosäuren enthalten sowie Aminogruppen-haltige Verbindungen, die beispielsweise mit einer herkömmlichen Ninhydrin-Färbung angefärbt werden können. Verbindungen, die zwei oder mehrere natürliche oder synthetische Aminosäuren enthalten, sind bevorzugt Oligoaminosäuren oder Peptide, insbesondere Peptide mit einer Kettenlänge bis zu 150 Aminosäuren, bevorzugt mit einer Kettenlänge zwischen 2 und 100, besonders bevorzugt zwischen 2 und 25 Aminosäuren. Beispiele für Aminogruppen-haltige Verbindungen, die mit einer herkömmlichen Ninhydrin-Färbung angefärbt werden können, sind Aminosäuren, Amine oder Aminozucker. Bei den Aminosäuren kann es sich um synthetische oder natürliche Aminosäuren handeln. Vorzugsweise handelt es sich um natürliche Aminosäuren wie Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Typ, Tyr oder Val.
Möchte man mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Proteine oder Peptide mit einer Kettenlänge von mehr als 150 Aminosäuren analysieren, so können diese in einer weiteren Ausführungsform zunächst in Peptide mit einer Kettenlänge von unter 150 Aminosäuren gespalten werden – z.B. durch einen tryptischen Verdau.
Eine DC-Platte ist erfindungsgemäß jedes Medium, auf dem eine dünnschichtchromatographische Auftrennung durchgeführt werden kann. In der Regel besteht eine DC-Platte aus einem Träger z.B. in Form einer Glasplatte, einer Metallplatte oder -folie oder einer Kunststofffolie, die mit einer Sorbens-Phase belegt oder beschichtet ist. Als Sorbentien werden typischerweise die für chromatographische Zwecke bekannten Basis-Sorbentien verwendet. Dies sind z.B. Kieselgel, Aluminiumoxid, Cellulose, Kieselgur oder andere organische oder anorganische Polymere oder organisch/anorganische Hybridpolymere. Weiterhin können die Basis-Sorbentien mit funktionellen Gruppen derivatisiert sein, die ihre Trenneigenschaften verändern. Beispiele hierfür sind RP-Phasen, bei denen z.B. Kieselgel mit Liganden derivatisiert ist, die C8 oder C18 Ketten aufweisen (Reversed Phase Material). Andere Bespiele sind CN oder Diolmodifizierte Phasen. Einen Überblick über gängige Sorbens-Phasen für die DC findet man in Klaus K. Unger, Packings and Stationary Phases in Chromatographic Techniques, M. Decker, New York 1990. Entsprechend der Polarität ihrer Oberfläche kann man die Sorbens-Phasen in polare, mittelpolare und unpolare Phasen aufteilen. Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemäße Reagenzzusammenstellung besonders geeignet ist zur Anfärbung von Aminosäuren und/oder Peptiden auf unpolaren Phasen, wie Kieselgur oder Reversed Phase Materialien. Auch Cellulose-Phasen lassen sich mit hervorragender Farb-Qualität und Intensität anfärben.
Eine erfindungsgemäße Reagenzzusammenstellung enthält zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und mindestens eine ionische Flüssigkeit. Die Reagenzzusammenstellung kann in Form eines Reagenzes, typischerweise eines flüssigen Reagenzes, vorliegen, oder mehrere unterschiedliche Reagenzien bzw. Komponenten enthalten. Dabei können das mindestens eine Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und zumindest eine ionische Flüssigkeit zusammen in einem Reagenz vorliegen oder in zwei unterschiedlichen Reagenzien bzw. Komponenten der Reagenzzusammenstellung.
In einer Ausführungsform besteht die Reagenzzusammenstellung zumindest aus einem typischerweise flüssigen Reagenz, das zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Reagenzzusammenstellung zumindest aus

a) einem Reagenz, das zumindest Ninhydrin oder eines seiner Derivate enthält
b) einem Reagenz, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält.

Beide Reagenzien sind typischerweise flüssig.
Als Lösungsmittel können ein oder mehrere organische Lösungsmittel oder Mischungen von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln mit Wasser oder Wasser eingesetzt werden. Es ist auch möglich, dass die ionische Flüssigkeit selbst als Lösungsmittel dient und beispielsweise gemäß der oben beschriebenen Ausführungsform als Lösungsmittel für das Reagenz zum Nachweisen von Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen fungiert. Es können mehrere LM sein, bevorzugt wird nur ein LM verwendet. Für in organischen LM schwer lösliche ILs kann Wasser oder eine Mischung aus Wasser + Alkohol sinnvoll sein.
Bei einem Reagenz, das beispielsweise Ninhydrin und zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält, dient als Lösungsmittel bevorzugt Aceton oder Propanol. Bei einem Reagenz, das Ninhydrin aber keine ionische Flüssigkeit enthält, dient bevorzugt ein organisches Lösungsmittel wie Propanol oder Aceton als Lösungsmittel. Bei einem Reagenz, das mindestens eine ionische Flüssigkeit aber kein Ninhydrin enthält, dient als Lösungsmittel bevorzugt Aceton, Propanol, Wasser und Wasser/Alkohol-Mischungen.
Die Reagenzien können zudem optional weitere Stoffe enthalten, z.B. eine oder mehrere zusätzliche ionische Flüssigkeiten, Lösungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, weitere Farbstoffe etc.
Ninhydrin liegt in den erfindungsgemäßen Reagenzien typischerweise in Konzentrationen zwischen 0.01 und 10, bevorzugt in Konzentrationen zwischen 0.1 und 1 Massen-% vor.
Die ionische Flüssigkeit kann, je nach Art der Reagenzienzusammenstellung, in Konzentrationen zwischen 0.1 und 100 Massen-% vorliegen. Dient die ionische Flüssigkeit zugleich als Lösungsmittel, bzw. umfasst die Reagenzienzusammenstellung getrennte Reagenzien von beispielsweise Ninhydrin und ionischer Flüssigkeit, so liegt der Anteil der ionischen Flüssigkeit typischerweise zwischen 80 und 100%. Es versteht sich von selbst, dass im Falle der Ausführungsform, bei der beispielsweise Ninhydrin und die ionische Flüssigkeit zusammen vorliegen, der Anteil der ionischen Flüssigkeit nicht 100% betragen kann, sondern entsprechend um den Anteil an Ninhydrin verringert werden muss. Wird zusätzlich ein anderes Lösungsmittel verwendet, liegt die ionische Flüssigkeit typischerweise in Konzentrationen zwischen 0.1 und 15, bevorzugt in Konzentrationen zwischen 0.1 und 10, besonders bevorzugt in Konzentrationen zwischen 1 und 5 Massen-% vor. Enthält ein Reagenz zwei oder mehrere verschiedene ionische Flüssigkeiten, dann gelten die obigen Konzentrationsangaben für die Gesamtmenge an ionischer Flüssigkeit.
Weitere optionale Bestandteile der erfindungsgemäßen Reagenzkombination sind beispielsweise ein oder mehrere weitere Reagenzien, die zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen, vorzugsweise Ninhydrin, und/oder eine oder mehrere ionische Flüssigkeit enthalten (z.B. Reagenzien, die diese Bestandteile in anderen Konzentrationen enthalten oder Reagenzien, die andere ionische Flüssigkeit enthalten), eine oder mehrere DC-Platten, alternative Färbereagenzien (z.B. Reagenzien zur Fluorescamin-Färbung) oder Farbtabellen bzw. Farbmuster zur Auswertung der Färbeergebnisse.
Beispiele für erfindungsgemäße Reagenzkombinationen sind:

1. Eine Reagenzkombination bestehend aus einem Reagenz, das zumindest zwischen 0.01 und 10% Ninhydrin und zwischen 0.1 und 10% einer oder mehrerer ionischer Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält.
2. Eine Reagenzkombination enthaltend a) ein Reagenz das zumindest zwischen 0.01 und 10% Ninhydrin in einem Lösungsmittel enthält b) ein Reagenz, das zumindest zwischen 0.1 und 10% einer oder mehrerer ionischer Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält
3. Eine Reagenzkombination entsprechend Variante 2, die zusätzlich ein weiteres Reagenz enthält, das zumindest eine oder mehrere ionische Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält, wobei sich die Art, Konzentration und/oder Zusammensetzung der ionischen Flüssigkeiten dieses zusätzlichen Reagenzes von der des anderen Reagenzes, das zumindest eine oder mehrere ionische Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält, unterscheidet.
4. Eine Reagenzkombination entsprechend Variante 1, 2 oder 3, zusätzlich enthaltend eine oder mehrere DC-Platten und/oder alternative Färbereagenzien (z.B. Reagenzien zur Fluorescamin-Färbung) und/oder Farbtabellen bzw. Farbmuster zur Auswertung der Färbeergebnisse.

Bevorzugte Reagenzkombinationen enthalten zwei oder mehrere Reagenzien, wobei Ninhydrin einerseits und ein oder mehrere ionische Flüssigkeiten andererseits getrennt in unterschiedlichen Reagenzien vorliegen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen wird die Probe zunächst auf eine DC-Platte aufgetragen und dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Die Durchführung einer dünnschichtchromatographischen Trennung ist dem Fachmann bekannt, z.B. aus Dünnschichtchromatographie, Praktische Durchführung und Fehlervermeidung von Elke Hahn-Deinstrop, Wiley-VCH (1998). Die Auftrennung kann eindimensional oder mehrdimensional durchgeführt werden.
Nach erfolgter dünnschichtchromatographischer Auftrennung erfolgt die Anfärbung mit einer Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend Ninhydrin und mindestens eine ionische Flüssigkeit zur Sichtbarmachung der in der Probe enthaltenen Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine. Dazu wird die DC-Platte bevorzugt zunächst leicht, vorzugsweise vollständig, getrocknet, damit das Fließmittel, das bei der DC-Trennung verwendet wurde, ganz oder teilweise entfernt wird. Die erfindungsgemäße Anfärbung kann jedoch auch auf noch vom Fließmittel angefeuchteten DC-Platten durchgeführt werden.
Der Auftrag der erfindungsgemäßen Reagenzkombination, d.h. in der Regel das Benetzen der DC-Platte mit den Reagenzien der Reagenzzusammenstellung, erfolgt typischerweise durch Eintauchen der DC-Platte in die entsprechenden flüssigen Reagenzien oder bevorzugt durch Aufsprühen der Reagenzien auf die DC-Platte.
In einer Ausführungsform wird die DC-Platte mit einem Reagenz benetzt, das zumindest Ninhydrin und eine oder mehrere ionische Flüssigkeiten in einem Lösungsmittel enthält. Dieses Reagenz kann bereits längere Zeit vor seiner Verwendung zusammengestellt worden sein oder bevorzugt maximal 24 Stunden vor seiner Verwendung zusammengemischt worden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DC-Platte zunächst mit einem Reagenz benetzt, das zumindest eine ionische Flüssigkeit in mindestens einem Lösungsmittel enthält. Anschließend, bevorzugt nach ganz oder teilweisem Trocknen der DC-Platte, wird die Platte mit einem Reagenz benetzt, das zumindest Ninhydrin enthält.
Je nach Art der anzufärbenden Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine kann die Farbreaktion spontan oder nach mehrstündiger Inkubationszeit auftreten oder, wie in den häufigsten Fällen, erst nach Erhitzen. Aus diesem Grund wird die DC-Platte bevorzugt nach dem Auftrag der Reagenzien der erfindungsgemäßen Reagenzkombination auf Temperaturen über 35°C, bevorzugt über 50°C erhitzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird auf Temperaturen zwischen 50 und 200°C erhitzt. Die Dauer der Temperaturbehandlung beträgt in der Regel zwischen 0,5 und 10 Minuten.
Die entstehende Färbung kann visuell oder mit entsprechenden optischen Geräten ausgewertet werden.
Die erfindungsgemäße Reagenzkombination kann auch zum Anfärben von Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen in anderen Medien verwendet werden, beispielsweise in flüssiger Phase oder auf anderen Trägern, wie Papier, Gelen oder Membranen. Genauso kann die Reagenzkombination für einen Schnelltest eingesetzt werden, in dem zunächst nur generell festgestellt wird, ob Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine in einer Probe vorhanden sind. Dazu muss keine chromatographische oder andere Trennung durchgeführt werden. Es ist ausreichend, die Probe – bevorzugt auf einem Träger, z.B. einer DC-Platte – mit der Reagenzkombination in Kontakt zu bringen. Die Durchführung erfolgt dabei entsprechend Schritt b) des oben beschriebenen Verfahrens. Anhand der Farbentwicklung lässt sich dann feststellen ob und gegebenenfalls welche Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine in der Probe vorhanden sind.
Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Reagenzzusammenstellung beziehungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass bei verschiedenen Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen eine unterschiedliche Färbung entsteht. Während bei der herkömmlichen Ninhydrin-Färbung, bei der keine ionischen Flüssigkeiten zugesetzt werden, alle Aminosäuren und/oder Peptide außer Prolin eine blau bis violette Färbung zeigen, variiert die Farbe bei der erfindungsgemäßen Färbung über das gesamte Farbspektrum. Hinzu kommt, dass durch die Wahl der eingesetzten ionischen Flüssigkeit bzw. Mischung zweier oder mehrerer ionischer Flüssigkeiten das entstehende Farbspektrum verändert werden kann. So kann man, falls nötig, anhand weniger Versuche mit verschiedenen ionischen Flüssigkeiten herausfinden, welche ionische Flüssigkeit oder welche Mischung für das vorliegende Analyseproblem besonders vorteilhaft ist und somit die Zielanalyte besonders gut und unterscheidbar von anderen in der Probe vorhandenen Aminosäuren und/oder Peptiden anfärbt.
Sowohl Aminosäuren wie auch Peptide zeigen je nach ihrer chemischen Struktur bzw. ihrer Zusammensetzung nach Behandlung mit der erfindungsgemäßen Reagenzkombination verschiedene Färbungen. Dadurch wird sowohl die Identifikation bestimmter Aminosäuren in einer Probe erheblich erleichtert, aber auch die Identifikation von Peptiden, z.B. für das Peptide Mapping nach einem tryptischen Verdau.

In den angefügten Tabellen 1 und 2 werden beispielhaft für erfindungsgemäße Reagenzkombinationen mit unterschiedlichen ionischen Flüssigkeiten die bei der Färbung einiger Aminosäuren entstehenden Farbmuster aufgelistet. Tabelle 1

		Erfindungsgemäße Färbung mit Ninhydrin und ionischer Flüssigkeit:
Aminosäure	Herkömmliche Färbung mit Ninhydrin	1-Pentyl-3-Methyl Imidazolium Cl	Trihexyl tetradecyl phosphonium Cl	Tetrabutyl phosphonium Cl	Ethyl dimetyl pentyl ammonium Br
Alanin	violett	blau	violett	türkis	türkis
Arginin	violett	grau	violett	blau	violett
Asparagin	violett	orange	violett	bräunlich	orange
Asparaginsäure	violett	türkis	violett	türkis	türkis
Cystein	violett	rosa	violett	rosa	rosa
Glutamin	violett	grau	violett	blau	grau
Glutaminsäure	violett	blau	violett	blau	blau
Glycin	violett	violett	violett	blau	braun
Histidin	violett	graubraun	violett	bräunlich	braun
Isoleucin	violett	blau	violett	blau	blau
Leucin	violett	schwarzviolett	violett	grau	graugrün
Lysin	violett	blau	violett	blau	blau
Metheonin	violett	bräunlich	violett	grau	bräunlich
Phenylalanin	violett	grau	violett	blau	violett
Prolin	gelb	gelb	gelb	gelb	orange
Serin	violett	grau	violett	grünlich	grünlich
Threonin	violett	blau	violett	blau	blau
Tryptophan	violett	bräunlich	violett	violett	violett
Tyrosin	violett	gräulich	violett	gräulich	braun
Valin	violett	blau	violett	blau	blau

Tabelle 2

	Erfindungsgemäße Färbung mit Ninhydrin und ionischer Flüssigkeit:
Aminosäure	Ethyl dimethyl propyl ammonium Cl	1-methyl 1-octoy pyrrolidinium Cl	n-butyl pyridinium Cl	n-octyl pyridinium Cl	4-methyl 4-pentyl morpholinium Br	1-methyl 1-pentyl peperidinium Br
Alanin	blau	türkis	blau	türkis	türkis	türkis
Arginin	grau	grau	grau	grau	violett	violett
Asparagin	orange	orange	braun	orange	orange	orange
Asparaginsäure	türkis	türkis	türkises	türkis	türkis	türkis
Cystein	rot	rosa	rot	rosa	rosa	rosa
Glutamin	gräulich	blaugrau	gräulich	blaugrau	grau	grau
Glutaminsäure	blau	blaugrau	blau	blaugrau	blau	blau
Glycin	violett	braun	violett	violett	braun	braun
Histidin	braun	bräunlich	braun	braun	braun	braun
Isoleucin	blau	blau	blau	blau	blau	blau
Leucin	grau	braungrau	grau	braungrau	graugrün	graugrün
Lysin	blau	blau	blau	blau	blau	blau
Metheonin	grau	grau	grau	grau	bräunlich	bräunlich
Phenylalanin	blau	blau	blau	blau	violett	violett
Prolin	gelb	gelb	gelb	gelb	orange	orange
Serin	violett	grünlich	violett	grünlich	grünlich	grünlich
Threonin	violett	blau	violett	blau	blau	blau
Tryptophan	grau	–	grau	grau	violett	violett
Tyrosin	grau	–	grau	bräunlich	braun	braun
Valin	blau	–	blau	blau	blau	blau

Üblicherweise kann die Sichtbarmachung bereits bei Mengen von 10 bis 50 ng an Aminosäure bzw. Peptid erfolgen.
Neben Ninhydrin können selbstverständlich auch entsprechende Derivate von Ninhydrin oder Komplexe des Ninhydrins, z.B. jene in Kombination mit z.B. Cu, Cd, Sn, eingesetzt werden.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Die vorliegende Erfindung kann die genannten notwendigen oder optionalen Bestandteile bzw. Einschränkungen umfassen, daraus im wesentlichen bestehen oder daraus bestehen.
Beispiele

1. Selektive Anfärbung von Aminosäuren

Anfärbung mit IL und Ninhydrin

Substanzen: Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, (von links nach rechts)

Mobile Phase: 2-Butanol/Pyridin/Essigsäure (100%)/Wasser (30/20/6/24)

Stationäre Phase: ProteoChrom^® HPTLC Cellulose Aluminiumfolie (Hersteller Merck KGaA, Deutschland)

Anfärbung: Sprühen mit 3,5%iger Tonic Liquid Lösung, trocknen, Sprühen mit 0,5%iger Ninhydrinlösung und auf 110°C erhitzen

Ionic Liquid: 1-Pentyl-3-methyl-imidazolim chloride (Farben siehe Tabelle 1)

2. Selektive Anfärbung von Peptiden aus dem tryptischen Verdau von Proteinen

Anfärbung mit IL und Ninhydrin

Substanzen: Tryptischer Verdau von Phosphitin, Myoglobin, Cytochrome C, β-Casein, BSA (von links nach rechts)

Mobile Phase: 2-Butanol/Pyridin/Essigsäure(100%)/Wasser (30/20/6/24)

Anfärbung: Sprühen mit 3,5%iger Ionic Liquid Lösung, trocknen, Sprühen mit 0,5%iger Ninhydrinlösung und auf 110°C erhitzen

Ionic Liquid: 1-Pentyl-3-methyl-imidazolim chloride

Farben: Braun, rot, rotbraun, blau, violett

Verfahrensbeschreibung:
Probenauftragung: Die Proben werden mit einer Kapillare oder mit einem automatischen DC Auftragegerät (z.B. Linomat V, Camag, Muttenz, Schweiz) auf die DC-Platte aufgetragen. Bei einer typischen Probekonzentration von 1–2 mg/ml werden 1–10 μl aufgetragen.
Entwicklung: Die Entwicklung erfolgt in einer DC-Kammer. Die Platte wird nach der Auftragung kurz getrocknet und dann in eine mit Fließmittel (Mobile Phase) befüllte DC-Kammer (ohne Kammersättigung) gestellt und entwickelt. Die Entwicklungsstrecke ist 5 cm und die Entwicklungszeit für 5 cm liegt bei ca. 1 h.
Trocknung: Die Platte wird für mindestens 30 min unter Druckluft getrocknet, um das Fließmittel möglichst vollständig zu entfernen.
Anfärbung: Die Anfärbung erfolgt durch Besprühen mit einem DC-Sprühgerät. Dazu wird eine 3,5%ige IL Lösung und eine 0,5%ige Ninhydrin Lösung vorbereitet. Die Platte wird erst mit der IL Lösung besprüht. Dann erfolgt eine Zwischentrocknung von 5 min. Dann wird die Platte mit Ninhydrin Lösung besprüht und gleich danach für zwei Minuten auf 110°C erhitzt. Die Platte wird kurz abgekühlt und dokumentiert.
Alternativ kann auch ein vollautomatisches Sprühgerät, z.B. das Gerät ChromaJet DS 20 von DESAGA SARSTEDT-Gruppe (Deutschland), eingesetzt werden.

Claims

Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und mindestens eine ionische Flüssigkeit.
Reagenzzusammenstellung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen Ninhydrin oder eines seiner Derivate enthält.
Reagenzzusammenstellung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzzusammenstellung zumindest a) ein Reagenz zumindest enthaltend Ninhydrin oder eines seiner Derivate in mindestens einem Lösungsmittel und b) ein Reagenz zumindest enthaltend mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält.
Reagenzzusammenstellung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzzusammenstellung zumindest a) ein Reagenz zumindest enthaltend 0.01–10 Massen-% Ninhydrin in mindestens einem Lösungsmittel b) ein Reagenz zumindest enthaltend 0.1 bis 10 Massen-% mindestens einer ionischen Flüssigkeit in mindestens einem Lösungsmittel enthält.
Reagenzzusammenstellung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzzusammenstellung ein Reagenz enthält, das als ionische Flüssigkeit 1-Pentyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Hexyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Heptyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Octyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Nonyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Decyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, Trihexyl tetradecyl-phosphoniumchlorid, Ethyldimetylpentylammoniumbromid, Ethyldimethylpropylammoniumchlorid, 1-Methyl-1-octylpyrrolidiniumchlorid, n-Butylpyridiniumchlorid, n-Octylpyridiniumchlorid, 4-Methyl-4-pentylmorpholiniumbromid oder 1-Methyl-1-pentylpiperidiniumbromid enthält.
Reagenzzusammenstellung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenzzusammenstellung zusätzlich zumindest eine DC-Platte enthält.
Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch a) chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte) b) Anfärben der aufgetrennten Probe auf der DC-Platte mit einer Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und mindestens eine ionische Flüssigkeit.
Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch a') chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte), wobei das Fließmittel mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält, und b') Anfärben der aufgetrennten Probe auf der DC-Platte mit einer Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen.
Verfahren zur Analyse einer Probe mit Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen durch chromatographische Auftrennung der Probe auf einer dünnschichtchromatographischen Platte (DC-Platte), wobei das Fließmittel mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und mindestens eine ionische Flüssigkeit enthält.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen Ninhydrin oder eines seiner Derivate ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als DC-Platte in Schritt a) oder a') eine Platte mit einer unpolaren Phase oder einer Cellulose-Phase eingesetzt wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Anfärbung in Schritt b) erfolgt, indem die DC-Platte in einem Schritt b1) zunächst mit einem Reagenz behandelt wird, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und anschließend in einem Schritt b2) mit einem Reagenz, das zumindest mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen enthält.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) nach der Behandlung der DC-Platte mit der Reagenzzusammenstellung zumindest enthaltend mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen und eine ionische Flüssigkeit für 0.5 bis 10 Minuten auf eine Temperatur zwischen 50 und 200°C erhitzt wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reagenzzusammenstellung verwendet wird, die ein Reagenz enthält, das zumindest 0.01–10 Massen-% Ninhydrin in mindestens einem Lösungsmittel enthält, und ein Reagenz, das zumindest 0.1 bis 10 Massen-% mindestens einer ionischen Flüssigkeit in mindestens einem Lösungsmittel enthält.
Verfahren zur Sichtbarmachung von Aminosäuren, Peptiden und/oder Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine mit einer Reagenzkombination behandelt werden, die zumindest eine ionische Flüssigkeit und mindestens ein Reagenz zum Nachweis von Aminosäuren, Peptiden oder Proteinen enthält.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren, Peptide und/oder Proteine zunächst mit einem Reagenz behandelt werden, das zumindest eine ionische Flüssigkeit enthält und anschließend mit einem Reagenz, das zumindest Ninhydrin oder eines seiner Derivate enthält.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit ausgewählt ist aus 1-Pentyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Hexyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Heptyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Octyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Nonyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, 1-Decyl-3-methyl-imidazoliumchlorid, Trihexyl-tetradecyl-phosphoniumchlorid, Ethyldimetylpentylammoniumbromid, Ethyldimethylpropylammoniumchlorid, 1-Methyl-1-octylpyrrolidiniumchlorid, n-Butylpyridiniumchlorid, n-Octylpyridiniumchlorid, 4-Methyl-4-pentylmorpholiniumbromid oder 1-Methyl-1-pentylpiperidiniumbromid.