DE102006032424A1

DE102006032424A1 - Behandlung von T-Zell-Malignomen

Info

Publication number: DE102006032424A1
Application number: DE102006032424A
Authority: DE
Inventors: Christian Andreas Prof. Dr. Schmidt; Piotr Dr. Grabarczyk; Grzegorz Dr. Przybylski
Original assignee: Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Current assignee: Universitaet Greifswald
Priority date: 2006-07-13
Filing date: 2006-07-13
Publication date: 2008-01-17
Also published as: WO2008006363A2; WO2008006363A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von BCL11b-Inhibitoren zur Behandlung von T-Zell-Malignomen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von BCL11b-Inhibitoren zur Behandlung von T-Zell-Malignomen.
T-Zell-Malignome sind eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, mit einer jährlichen Inzidenz von ca. 1/100.000 Einwohnern. Zu dieser Gruppe gehören die Precursor-T-lymphoblastische-Leukämie/lymphoblastisches-Lymphom und die reifzelligen T-Zellleukämien/-Lymphome. Wenn die Remissionsrate bei Erwachsenen derzeit auch bei ca. 65–85 liegt, erreichen nur ca. ein Drittel der Patienten eine dauerhafte Heilung. In Abhängigkeit vom diagnostizierten Sub-Typ der T-Zell-Neoplasie und von der Risikotyp-Klassifizierung kommen unterschiedliche Behandlungsstrategien zum Einsatz, die jedoch alle den Einsatz von Chemotherapeutika, Bestrahlung und zum Teil Stammzelltransplantation vorsehen. Die derzeit angewandten Therapieprotokolle sind zum Teil sehr kompliziert und richten sich nach der jeweiligen Diagnose. Die Behandlung erfolgt bei precursor T-ALL und T-ALL in der Regel im Rahmen der Multizentrischen Therapiestudie der akuten lymphatischen Leukämie des Erwachsenen (vgl. Gökbuget et al., Schweiz. Rundsch. Med. Prax. 88 (1999) 407-420).
Im Zusammenhang mit der Therapie werden zum Teil schwerwiegende Nebenwirkungen infolge der langfristig verabreichten und hoch dosierten Cytostatika beobachtet.
Aufgrund der variierenden Therapieschemata, den noch nicht zufrieden stellenden Heilungschancen und der bei konventioneller Therapie beobachteten, zum Teil schweren Nebenwirkungen besteht ein Bedarf nach alternativen Behandlungsstrategien.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, alternative Arzneimittel zur Behandlung von T-Zell-Malignomen, wie Precursor-T-lymphoblastische-Leukämie/lymphoblastisches Lymphom und die reifzelligen T-Zellleukämien/-Lymphome bereitzustellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von BCL11b-Inhibitoren gelöst.
Im Stand der Technik konnte gezeigt werden, dass das B-Zellen CLL/Lymphom 11B-Gen (BCL11b/CTIP2/RIT1/hRitα) das für ein Krüppel-ähnliches C₂H₂ Zinkfinger-Protein kodiert (das Gen ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:12 mit den beiden Transkript-Varianten 1 (SEQ ID NO:13; CDS von nt 268–2952) und 2 (SEQ ID NO:14; CDS von nt 268–2739) aus GenBank (gi:49574493 und gi:12597634) dargestellt; vgl. z.B. Cimasiu et al., Oncogene 24 (45), 6753-6764 (2005)), eine entscheidende Rolle bei der T-Zell-Lymphopoese und der T-Zell-Leukämogenese spielt. In transienten Transfektionsassays agierte das Gen als Transkriptions-Repressor. Die Repressor-Funktionen wird über eine direkte Bindung der SIRT1 Histondeacetylase ausgeübt. Zusätzlich co-lokalisiert und assoziiert Bcl11b mit dem Heterochromatin-assoziierten Protein HP1alpha. Vor kurzem wurde gefunden, dass endogenes Bcl11b direkt mit dem Nukleosom-Remodulierungs- und Histon-Deacetylase Komplex (NuRD), einem der wichtigsten transkriptionellen Co-Repressor-Komplexe in Säugetierzellen, interagiert. Die Funktion und endogenen transkriptionellen Zielmoleküle dieser Proteine sind noch nicht charakterisiert. Es wurde im Stand der Technik ferner gezeigt, dass BCL11b in vivo ausschließlich im Zentralnervensystem und im Immunsystem exprimiert wird (Leid et al., 2004, Gene Expr Patterns, 4, 733-9). Ein Fehlen von Bcl11b führt zu abnormaler Thymopoese und der vollständigen Abwesenheit von reifen αβ T-Zellen (Wakabayashi et al., 2003, Nat Immunol, 4, 533-9).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, dass die BCL11b-Expression in T-Zell-Malignomen erhöht ist und das Überleben humaner T-Zell Leukämie- und Lymphomzellen entscheidend davon abhängt. Beispielsweise induziert die Suppression von Bcl11b durch RNA-Interferenz die Apoptose selektiv in malignen T-Zellen, während normale T-Zellen unbeeinflusst bleiben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines BCL11b-Inhibitors zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von T-Zell-Malignomen. Dies schließt die Therapie und Prophylaxe von Precursor-T-lymphoblastische-Leukämie/lymphoblastisches-Lymphom und die reifzelligen T-Zellleukämien/-Lymphome ein.
Als BCL11b-Inhibitoren werden erfindungsgemäß Wirkstoffe verstanden, die geeignet sind, die Expression von BCL11b zu reduzieren oder zu unterdrücken. Das schließt unter anderem organisch-chemische Verbindungen, Proteine, Oligo- und Polypeptide, Peptidanaloga, Peptidomimetika, Nukleinsäuren, Oligo- und Polynukleotide, Antikörper usw. ein. Die Substanzen können entweder direkt als Wirkstoff appliziert werden oder als sogenannte „Prodrug", aus der der Wirkstoff durch den körpereigenen Stoffwechsel entsteht.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Inhibition durch RNA-Interferenz. Unter RNA-Interferenz (RNAi) versteht man einen Mechanismus in Eukaryoten, der die Expression von Genen post-transkriptionell hemmt. Dabei werden Doppelstrang-RNA-Moleküle benutzt, deren anti-sense-Strang zur Spaltung, zur Translationsblockade der Ziel-mRNA oder zum Methylieren des Gens führt. Somit wird die Produktion bestimmter Proteine gestoppt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können Micro-RNA (micro interfering RNA, miRNA) und kleine RNA (small interfering RNA, siRNA) gleichermaßen verwendet werden. Bei miRNA handelt es sich nach geltender Definition um einzelsträngige RNAs mit ca. 22 Nukleotiden Länge, die von Dicer aus einem Hairpin einer endogenen RNA prozessiert werden. miRNAs beeinflussen die Translation und den Abbau ihrer Ziel-mRNAs, die aufgrund ihrer teilweisen Komplementarität erkannt werden. miRNAs liegen in der Zelle als RNP also assoziiert mit Proteinen vor. Man spricht in diesem Zusammenhang vom Microprocessor Complex. Die miRNAs erfüllen hier (ähnlich wie z.B. bei den snoRNAs) eine Funktion als guide RNA, d.h. sie „zeigen" den Proteinen die richtigen Ziel-RNAs. Diese werden dann in ihrer Translation gehemmt oder ähnlich wie bei den siRNAs gespalten und abgebaut. Bei den siRNAs handelt es sich um 21–28 Nukleotide lange RNAs, die von der RNase III Dicer aus langen doppelsträngigen RNAs herausgeschnitten werden. Auch kleine einzelsträngige RNAs, die in der RNA-Interferenz (RNAi) benutzt werden, werden oftmals, egal ob sie synthetisch hergestellt wurden, als siRNAs bezeichnet.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem BCL11b-Inhibitor um siRNA, d.h., dass die BCL11b-Expression durch RNA-Interferenz inhibiert oder reduziert wird. Die Identifikation geeigneter siRNA erfolgte nach dem Verfahren von Block-iT^TM RNAi Designer (Invitrogen, Karlsruhe, Germany). Es handelt sich dabei um eine kommerziell erworbene Software. Für die weitere Herstellung der siRNA ist die Software nicht erforderlich. Die Herstellung erfolgt nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden. Kommerzielle Anbieter zur Herstellung von siRNA sind unter anderem auch folgende Firmen an: Ambion, Inc. 2130 Woodward Austin, TX 78744–1832 USA, Qiagen GmbH 40724 Hilden, Dharmacon Inc. Chicago, IL 60693, Oligoengine, Seattle, WA 98145.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete siRNA sind beispielsweise die Polynukleotide gemäß SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3 einschließlich Varianten (Homologe) davon, die sich in der Sequenz geringfügig unterscheiden aber dennoch BCL11b-inhibierende Wirkung aufweisen.
Die Erkenntnis, dass BCL11b antiapoptotische Aktivität besitzt und eine verminderte Expression zur Apoptose der betroffenen T-Zellen führt, kann nunmehr genutzt werden, um nach weiteren Wirkstoffen zur Behandlung der genannten Erkrankungen zu suchen.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die Bcl11b inhibiert.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „BCL11b-Inhibition" in seiner breitesten Bedeutung verstanden. Dementsprechend bedeutet „BCL11b-Inhibition" einerseits, dass die Expression von BCL11b reduziert oder ganz unterdrückt und das Bcl11b-Protein somit nur vermindert oder gar nicht gebildet wird. Andererseits wird unter „BCL11b-Inhibition" auch verstanden, dass zwar die Expression des BCL11b-Gens stattfindet, die Wirkung des exprimierten Proteins aber ganz oder teilweise inhibiert wird, so dass seine antiapoptotische Aktivität ganz oder teilweise aufgehoben wird. In diesem Sinn wird unter einer „Substanz, die Bcl11b inhibiert" eine Substanz verstanden, die entweder auf der Ebene der Genexpression wirkt, z.B. im Rahmen der RNAi, oder posttranslational die Wirkung des Bcl11b reduziert oder ganz unterdrückt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die Bcl11b inhibiert – d.h. eines Wirkstoffs zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen – umfasst vorzugsweise die folgenden Schritte, bei denen man

a) an malignen T-Zellen, bei denen die BCL11b-Expression erhöht ist, das Expressionsniveau bestimmt,
b) man die Zellen mit der zu untersuchenden Substanz in Kontakt bringt und man
c) die BCL11b-Expression nach Zugabe der zu untersuchenden Substanz erneut bestimmt und mit dem in Stufe a) bestimmten Expressionsniveau vergleicht, d.h. die Veränderung der BCL11b-Expression durch die Prüfsubstanz bestimmt,

Synthetische Herstellung des BCL11b Proteins in in vitro Expressionsystemen:
Die in vitro Proteinsynthese wird beispielsweise als gekoppeltes Transkriptions-Translationssystem durchgeführt. Ein Templat für die Transkription mit dem Gen für das Zielprotein (Bcl11b) und das gewünschte Tag wird als Plasmid zu dem Zellextrakt zugesetzt. Promotor und RBS (ribosomale Bindungsstelle) des Plasmids müssen mit der Extraktquelle kompatibel sein. Ein Extrakt aus E. coli BL21/DE3 Zellen liefert z. B. die T7 RNA Polymerase für die Transkiption und passende Ribosomen für die RBS. Der Extrakt liefert die Komponenten der Transkriptions- und Translationsmaschinerie, wird aber durch Dialyse von niedermolekularen Bestandteilen befreit. Daher werden die Aminosäuren, Nukleotide, Formyltetrahydrofolat, Reduktionsmittel, Mg²⁺ und K⁺ und eine ATP/GTP Regenerationsquelle (PEP + PK, Pyruvate + Pyruvatoxidase + TPP + FAD o. ä.) wieder zugesetzt. Dies erfolgt in einer Dialyseanordnung (CECF system, continuous exchange cell free system), die einerseits die erwähnten Stoffe zuführt, andererseits störende Produkte wie Phosphat abführt.
Als Produkt erhält man überexprimiertes jedoch noch nicht reines rekombinantes Protein. Die gesamte Proteinsyntheselösung wird auf eine entsprechende Affinitätssäule geladen. Nach Waschen wird das gewünschte Protein unter nativen Bedingungen eluiert. Zur vollständigen Reinigung wird eine weitere Säulenchromatographie angeschlossen (z. B. Ionenaustauscher oder Gelfiltration). Zur volständigen Reinigung wird vorgereinigte Protein wird wiederum auf eine Affinitätssäule geladen (Alexander S. Spirin (Ed.) Cell-free translation systems Springer Verlag, Berlin, 2002, ISBN 3-540-42050-9).
Aus kommerziell verfügbaren „small compound libraries" werden Substanzen hinsichtlich Ihrer Interaktion mit dem Bcl11b Protein getestet. Dazu wird das in vitro synthetisierte Bcl11b Protein an eine Matrix gekoppelt und zur Untersuchung von „small compound-Bcl11b Wechselwirkungen als ,Köder' genutzt. Die small compounds werden über das an die Matrix gebundene Protein geleitet, so dass kurzfristige oder dauerhafte Bindung erfolgen kann. Beispiel einer Matrix ist die Goldoberfläche des Sensorchips eines Biacore A100 Gerätes (Biacore; Uppsala, Schweden), an die ein Partner über einen SH-haltigen Linker gekoppelt wird. Damit kann die Bindung identifiziert und bei zeitabhängiger Messung auch quantifiziert werden (kon, koff, Kassoziation).
Nach dem Nachweis der direkten Bindung von small compounds erfolgt der Nachweis der Wirkung in einem in vitro System (Zellkultur). Zum Ausschluss unspezifischer Effekte stehen zwei das Bcl11b Protein exprimierende Linien (Jurkat und Hut78) und eine Bcl11b-negative Kontrollzellinie zur Verfügung (Raji). Zum Nachweis eines spezifischen, Bcl11b vermittelten Effektes stehen als „read out panel" folgende Untersuchungen zur Verfügung:

1. Induktion der Apoptose, die durch FACS-Analyse bestimmt wird.
2. Untersuchung des Expressionspatterns von fünf Genen, die direkt oder indirekt duch Bcl11b reguliert werden, durch real time- und Western Blot-Analyse
2.1: Suppression von – BclX1, – terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase (TdT) – Thyroid-stimulating-hormone receptor (TSHR)
2.2.: Induktion der Expression von – Integrin-beta 7 (ITGB7) und von – Tumor necrosis factor „ligand" superfamily member 10 (Trail).

Das Auftreten dieses biologischen Effektes (Apoptose) zusammen mit den beschriebenen Expressionsänderungen in Bcl11b positiven und nicht in der negativen Kontrollzellinie belegt einen spezifischen Effekt.
Eine auf dem oben beschriebenen Weg gefundene Substanz wird als Bcl11b inhibierende Substanz identifiziert, wenn die Substanz entweder zu einer Verminderung der Bcl11b-Expression führt oder die Bcl11b Wirkung verringert bzw. aufgehoben wird.
Ferner kann die Substanz zur weiteren Untersuchung ihrer Wirksamkeit in einem Schritt

d) einem Versuchstier oder einem Probanden verabreicht werden, das/der an einer T-Zell-Malignität erkrankt ist, wobei man die Abnahme der transformierten T-Zellen bestimmt, die vor Verabreichung der zu untersuchenden Substanz eine erhöhte Bcl11b-Expression aufwiesen, d.h. man den Anteil an transformierten T-Zellen bestimmt, die im Vergleich zu normalen T-Zellen Bcl11b erhöht exprimieren.

Ein nach der bzw. durch die Behandlung abnehmender Anteil an T-Zellen, die Bcl11b erhöht exprimieren, weist auf eine Bcl11b-hemmende Wirkung der untersuchten Substanz hin.
Zur Durchführung des Verfahrens zur Identifizierung von Bcl11b-Inhibitoren können auch Bcl11b erhöht exprimierende Zellen aus nicht-humanen Quellen, wie z.B. Mäusen, Ratten, Kaninchen, Primaten, transgenen Tieren oder Knock-out Tieren, verwendet werden. Die so identifizierten Wirkstoffe sollten vorzugsweise anschließend hinsichtlich ihrer Wirkung an malignen humanen T-Zellen getestet werden.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von T-Zell-Malignomen, bereitgestellt, bei dem man ein vorgenanntes Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die Bcl11b hemmen, durchführt und man die so identifizierten Substanzen mit pharmazeutisch akzeptablen Hilfs- und/oder Trägerstoffen formuliert.
Die Erfindung betrifft somit die Verwendung einer nach einem vorgenannten Verfahren zur Identifizierung einer Bcl11b hemmenden Substanz zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung der genannten Erkrankungen.
Mit der erfindungsgemäß gewonnenen Erkenntnis, dass Bcl11b antiapoptotische Aktivität besitzt und eine verminderte Expression zur Apoptose der betroffenen T-Zellen führt, werden alternative Protokolle zur Therapie der genannten Erkrankung bereitgestellt. Durch Bestimmung des Anteils an Bcl11b erhöht exprimierenden T-Zellen im erkrankten Organismus ist eine individuelle Messung der Wirkung des Medikamentes möglich. Dies ist bislang mit den bisherigen Substanzen nicht möglich.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen, Figuren und einem Sequenzprotokoll erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Beschreibung der Figuren:
1. Inhibierung von Bcl11b in Jurkat und huT78 Zellen durch RNA Interferenz.
(a) Suppression der BCL11b mRNA, gemessen durch QR-PCR, nach der transienten Nukleoinfektion des BCL11b-spezifischen 674 Duplex, verglichen mit Zellen, die mit non-silencing gemischter Kontroll-siRNA behandelt wurden. Die Ergebnisse sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten ± SD. (b) Bcl11b Proteinniveaus in Jurkat und huT78 Zellen 48h und 72h nach der BCL11b-674 siRNA Nukleoinfektion (5μg). Nicht-behandelte (nt), mock transfizierte (mock) und mit non-silencing gemischter siRNA (sc) behandelte Zellen wurden als Kontrollen verwendet. (c) Konditionaler Bcl11b Knock-down in Jurkat Zellen. Die Expression von BCL11b-spezifischer shRNA (1415) und non-silencing gemischter Kontroll shRNA (sc) wurde für 96h mit 0,5 μg/ml Doxycyklin induziert. Zwei Banden, die durch Bcl11b-spezifische Antikörper in (b) und (c) nachgewiesen wurden, entsprechen den zwei Splicevarianten von BCL11b. β-Aktin diente als Beladungskontrolle. Die gezeigten Ergebnisse ergeben sich aus drei Experimenten.
2. Induktion der Apoptose durch Bcl11b Suppression.
Jurkat, huT78 und Raji Zellen wurden mit BCL11b-674 (ausgefüllte Histogramme) und non-silencing gemischten Kontroll-siRNA (schwarze Linien) Duplexen nukleoinfiziert. Annexin V Bindung, Aktivierung der Caspase 3 und der DNA Inhalt (Propidium Iodid) wurden 72h nach der siRNA Behandlung gemessen. Diese Ergebnisse ergeben sich aus drei unabhängigen Experimenten.
3. Apoptose nach shRNA-vermittelter Bcl11b Suppression in Jurkat Zellen.
Lebensfähigkeit der Zellen und Apoptose Induktion vor und 96h nach der Induktion der Bcl11b-spezifischen (1415) oder der non-silencing (Sc) shRNAs mit 0,5 μg/ml Doxycyklin. (a) Lebensfähigkeit der Zellen gemessen durch Trypan Blau Ausschluss Assay. (b) Caspase 3/7 Aktivität (RLA – relative Luminiszenz Einheiten). Die Ergebnisse sind Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten ± SD.
4. (a) Dosis-abhängiger Effekt des Bcl11b Knock-down in huT78 Zellen.
Die Zellen wurden mit steigenden Dosen BCL11b-674 (ausgefüllte Histogramme) und gemischten Kontroll- (Sc; schwarze Linien) Duplexen nukleoinfiziert. Die Apoptose wurde 48 nach der Behandlung durch ein Annexin V Bindungsassay gemessen. Bcl11b Niveaus wurden durch Western Blots analysiert. Eine gleichmäßige Proteinbeladung wurde durch Nachweis von β-Aktin bestätigt. Die Ergebnisse ergeben sich aus drei unabhängigen Experimenten. (b) Suppression der Apoptose, die durch Bcl11b-Verminderung induziert wurde, mit Caspase Inhibitoren. HuT78 Zellen wurden mit BCL11b-674 oder mit sc Duplexen nukleoinfiziert und entweder unbehandelt belassen oder in Gegenwart von 50 μM eines Caspase 8 (C8i), Caspase 9 (C9i) und eines negativen Kontrollinhibitors kultiviert. DMSO in der Verdünnung, die der Menge der Inhibitoren entsprach, wurde als Kontrolle verwendet. Die Apoptose wurde 48h und 72h nach der Behandlung durch Annexin V Bindung analysiert. Die Ergebnisse repräsentieren Durchschnittswerte aus drei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung (±SD).
5. Expression von Apoptose-verwandten Genen nach BCL11b Inhibierung.
(a) Verringerte BCL-xL mRNA Expression und Induktion von TRAIL, gemessen durch QR-PCR, nach transienter Suppression von Bcl11b in Jurkat und huT78 Zellen verglichen mit Zellen, die mit sc-RNA Duplexen behandelt wurden. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte aus drei Experimenten ±SD. (b) Suppression des Bcl-xL Proteins, die aus transientem (huT78) und induziertem (Jurkat) Bcl11b Knock-down resultiert. 674: BCL11b-spezifische siRNA, sc: non-silencing gemischte Kontroll siRNA/shRNA, nt: nicht-behandelte Zellen, mock: mock nukleoinfiziert, 1415: Bcl11b-spezifische shRNA, –dox: Zellen vor der Induktion der shRNA Expression, +dox: Zellen, die mit 0,5 μg/ml Doxycyklin für 96h induziert wurden. Gleiche Proteinbeladungen wurden durch β-Aktin Färbung bestätigt. (c) Dosis-abhängiger Effekt des Bcl11b Knock-down auf die Expression von Trail in der huT78 Zelllinie. Die Zellen wurden mit steigenden Dosen BCL11b-674 (ausgefüllte Histogramme) und sc (schwarze Linien) Duplexen nukleoinfiziert. Membran-gebundenes Trail wurde durch FACS 48h nach Transfektion gemessen. (d) Schützender Effekt der Trail Inhibierung. HuT78 Zellen wurden mit BCL11b-674 und sc-siRNA nukleoinfiziert und entweder unbehandelt belassen (schwarze Linien) oder in Anwesenheit von 25 ng/ml eines Trail-neutralisierenden Antikörpers kultiviert. Die Apoptose wurde durch Annexin V Bindung 72h nach der Nukleoinfektion analysiert. Die dargestellten Daten sind das Ergebnis aus drei unabhängigen Experimenten.
6. Inhibierung von BCL11b in normalen T Zellen durch RNA Interferenz.
(a) Suppression von Bcl11b mRNA, gemessen durch QR-PCR, nach transienter Nukleoinfektion eines BCL11b-674 Duplex verglichen mit Zellen, die mit non-silencing gemischter Kontroll-siRNA behandelt wurden. (b) Bcl11b Proteinniveaus in T-Zellen 48h und 72h nach der BCL11b-674 siRNA Nuleoinfektion (5 μg). Nichtbehandelte (nt), mock transfizierte (mock) und mit non-silencing gemischter Kontroll-siRNA behandelte Zellen wurden als Kontrollen verwendet, β-Aktin diente als Proteinbeladungskontrolle. (c) Fehlen der Apoptose Induktion nach Bcl11b Suppression in T-Zellen. Normale T-Zellen aus drei gesunden Individuen wurden mit BCL11b-674 (ausgefüllte Histogramme) und non-silencing gemischten Kontroll-siRNA (schwarze Linien) Duplexen nukleoinfiziert. Annexin V Bindung wurde 48h und 72h nach der siRNA Behandlung bestimmt. Die Ergebnisse ergeben sich aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.
7. Expression von Apoptose-verwandten Genen nach BCL11b Inhibierung in normalen T Lymphozyten.
(a) BCL-xL und TRAIL mRNA Änderungen, gemessen durch QR-PCR, nach transienter Suppression von Bcl11b in normalen T-Zellen verglichen mit Zellen, die mit gemischten Kontroll-RNA Duplexen behandelt wurden. Die Ergebnisse sind Mittelwerte aus drei Experimenten ± SD. (b) Suppression des Bcl-xL Proteins, die sich aus dem transienten Bcl11b Knock-down in normalen T-Zellen ergibt. 674: Bcl11b-spezifische siRNA, Sc: non-silencing gemischte Kontroll-siRNA, nt: nicht-behandelte Zellen, mock: mock-nukleoinfizierte Zellen. Gleiche Proteinbeladungen wurden durch β-Aktin Färbung bestätigt. (c) Fehlen der Trail Induktion nach Bcl11b Inhibierung in normalen T-Zellen. Zellen wurden mit 5 mg BCL11b-674 (ausgefüllte Histogramme) und sc (schwarze Linien) Duplexen nukleoinfiziert. Membran-gebundenes Trail wurde durch FACS 48h und 72h nach Transfektion gemessen. Die dargestellten Ergebnisse ergeben sich aus drei Experimenten.
BEISPIELE
Materialien und Methoden
Reagenzien
Alle Biochemikalien wurden von Sigma Chemicals (München, Deutschland) bezogen, soweit es nicht anders angegeben ist. Der Caspase 8 Inhibitor, IETD-FMK und das negative Kontrollpeptid Z-FA-FMK wurden von R&D Systems (Abingdon, UK) bezogen und in DMSO als 20 mM Stocklösungen gelöst. Der Caspase 9 Inhibitor LEHD-FMK wurde von BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) zur Verfügung gestellt und in DMSO als 10 mM Stocklösung gelöst.
Antikörper
Primäre Antikörper für die folgenden Proteine wurden verwendet: affinitäts-aufgereinigt, anti-humaner Bcl11b Kaninchen polyklonaler Antikörper (Biogenes, Berlin, Deutschland); antihumaner Trail-PE Maus monoklonaler Antikörper (R&D Systems, Abingdon, UK); anti-humaner Bcl-xl Maus monoklonaler Antikörper (BD Transduction Laboratories, Erembodegem, Belgien); anti-Actin, affinitäts-aufgereinigter Antikörper (Sigma, Saint Louis, MO); antihumaner Caspase 3-FITC, aktive Form, (BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland). Sekundärer mit alkalischer Phosphatase konjugierter Esel anti-Maus IgG und Ziege anti-Kaninchen Antikörper wurden von Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (Soham, UK) bezogen. Ziege anti-Maus HRP konjugierter Antikörper wurde von Dako Cytomation (Hamburg, Deutschland) zur Verfügung gestellt.
Zellkultur
Jurkat humane T-Zell Leukämie (DSMZ Braunschweig, Deutschland), huT78 humane T-Zell Lymphom Zelllinien (ATCC, Manassas, VA) und Raji humane Burkitt Lymphom Zelllinie (ATCC, Manassas, VA) wurden in RPMI 1640 Medium (Invitrogen, Paisley, UK), das mit 1mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren (Invitrogen, Paisley, UK), 10% FCS (Invitrogen, Paisley, UK) und 5μg/ml Plasmocin (Amaxa, Köln, Deutschland) ergänzt war, angezogen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C und 5% CO₂ gehalten. Alle Experimente wurden unter Verwendung von Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase durchgeführt. Die Jurkat TetR-IRES-dsRed Zelllinie, die den Tetracyklinrepressor exprimiert und eine freundliche Gabe von D.W. Kowalczyk war, wurde in RPMI 1640 Medium, das mit 1mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren (Invitrogen, Paisley, UK) und 10% TetOn System geprüften FCS (BD Clontech, Heidelberg, Deutschland) ergänzt war, kultiviert.
Aufgereinigte humane T-Zellen von 3 gesunden Individuen wurden unter Verwendung des Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Deutschland) hergestellt und stimuliert, wie von dem T Cell Activation/Expansion Kit (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Deutschland) gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers angegeben. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium, das mit 1mM Natriumpyruvat, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren (Invitrogen, Paisley, UK), 10% FCS (PanBiotech, Aidenbach, Deutschland) und 20 U/ml rekombinantem humanem IL-2 (Sigma, München, Deutschland) ergänzt war, kultiviert.
siRNA und Zelltransfektion
Bcl11b-spezifische (BCL11b-674) und non-silencing Kontroll-RNA (BCL11b-sc) Duplexe wurden von Invitrogen (Paisley, UK) synthetisiert. Die Zielsequenz („sense" Strang) war wie folgt:
5'-CCAAGCAGGAGAACATTGCAGGTAA-3' (SEQ ID NO:1). Die Duplexe wurden in DEPC-behandeltem Wasser als 1 μg/μl Lösungen gelöst und in Aliquots bei –20°C aufbewahrt.
Die Zellen wurden mit dem Amaxa Nucleofection Device II (Amaxa, Köln, Deutschland) unter Verwendung des Amaxa Nucleofection Kit V oder T-Zellen Nucleofection Kit transfiziert. Zusammengefasst: die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase wurden durch Zentrifugation gesammelt und 2–5 × 10⁶ Zellen wurden in 100 μl Nukleoinfektionspuffer resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit siRNA gemischt und nukleoinfiziert. Die Transfektionsbedingungen wurden zunächst durch Verwendung von FITC-markierter non-silencing siRNA (Invitrogen, Paisley, UK) optimiert. Die Bedingungen, die die höchste Transfektions-Effizienz und die geringste Toxizität boten, wurden durch FACS bestimmt und in den späteren Experimenten eingesetzt. Andere Experimentbedingungen sind in den Figurenbeschreibungen angegeben.
Um das Tetracyklin-induzierbare BCL11b-spezifische RNA-Interferenz System zu entwickeln, wurden die folgenden DNA Oligonukleotide entworfen und von Oligoengine (Seattle, WA) bezogen:
BCL11b-14l5 „sense" Strang:
5'-GATCCCCGCTGCTACTGGAGAACGAGTTCAAGAGACTCGTTCTCCAGTAGCAGCTTTTTC-3' (SEQ ID NO:2),
BCL11b-1415 „antisense" Strang:
5'- TCGAGAAAAAGCTGCTACTGGAGAACGAGTCTCTTGAACTCGTTCTCCAGTAGCAGCGGG-3' (SEQ ID NO:3),
non-silencing Kontrolle „sense" Strang:
5'- GATCCCCGCTAAGCGAGCTGCTAGAGTTCAAGAGACTCTAGCAGCTCGCTTAGCTTTTTC-3' (SEQ ID NO:4),
non-silencing Kontrolle „antisense" Strang:
5'- TCGAGAAAAAGCTAAGCGAGCTGCTAGAGTCTCTTGAACTCTAGCAGCTCGCTTAGCGGG-3' (SEQ ID NO:5).
Die Oligonukleotide wurden gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers angelagert (annealed) und in die Bg1II/Xhol Stellen des pSuperior-Neo^r-EGFP Plasmids unter Verwendung von Standard-Klonierungsverfahren ligiert. Die Plasmide wurden in Jurkat TetR-IRES-DsRed Zellen unter Verwendung von Lipofectamin2000 (Invitrogen, Paisley, UK) transfiziert und stabil transfizierte Zellen wurden durch Kultivierung in Anwesenheit von 1mg/ml Genticin (Invitrogen, Paisley, UK) selektiert.
RNA Isolierung, Erstellung eines Expressionsprofils, Reverse Transkription und Echtzeit Quantitative PCR
Gesamt-RNA wurde aus den Zellen mit Trizol (Invitrogen, Paisley, UK) isoliert. Affymetrix Microarray Analysen wurden unter Verwendung des One-Cycle Target Labeling und Control Reagents, das das GeneChip Sample Cleanup Modul enthält, und der Genome U133 Plus 2.0 DNA Microarrays (Affymetrix, Santa Clara, CA) gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers durchgeführt. Das nachfolgende Scannen wurde mit Hilfe des GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix) durchgeführt. Die rohen Expressionsdaten wurden an dem Standard Ziel-Signal von 500 kalibriert und die Analyse wurde auf Basis der Standard-Schwellenwerte durchgeführt. Die erhaltenen Daten wurden von der GeneChip Operating Software (Affymetrix) in Microsoft Excel exportiert. Sondensätze, denen auf beiden Arrays „abwesende” Aufrufe („absence calls") oder Aufrufe „ohne Änderung" („no change calls") zugewiesen wurden, wurden ausgeschlossen. Aus der verbleibenden Gruppe wurden Sondensätze, die Signal Log Verhältnisse von ≥ 1 or ≤ 1 und Signalunterschiede von ≥ 200 zeigten, als in der Knock-down Probe im Vergleich zu der Kontrolle reguliert betrachtet. Signal Log Verhältnisse wurden anschließend in -fache Änderungswerte mit dem Term 2^{signal Log Verhältnis} für ein Signal Log Verhältnis ≥ 0 oder –2^{–signal
Log Verhältnis} für ein Signal Log Verhältnis < 0 umgewandelt.
Für die QR-PCR wurde RNA mit der „PowerScript" Reversen Transkriptase (BD Clontech, Palo Alto, CA) unter Verwendung von Zufalls-Hexameren (Promega, Madison, WI) revers transkribiert. Alle Primer und Sonden wurden von TibMolBiol (Berlin, Deutschland) synthetisiert. Die Quantifizierung der BCL11b mRNA wurde so durchgeführt, wie in (Przybylski et al., 2005) beschrieben. Die BCLxL und TRAIL mRNA Expression wurde mit dem 7500 RealTime PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von Platinum^® SYBR^® Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Paisley, UK) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Primern gemessen: TRAIL-F vorwärts Primer 5'-AGTGCTCCTGCAGTCTCTCTGTG-3' (SEQ ID NO:6) und TRAIL-R rückwärts Primer 5'-TCTAACGAGCTGACGGAGTTGC-3' (SEQ ID NO:7), BCLxL-F 5'-AAACTGGGTCGCATTGTGG-3' (SEQ ID NO:8) und BCLxL-R 5'-TCTCGGCTGCTGCATTGTTC-3' (SEQ ID NO:9). Das Referenz-Gen, β-2-MG wurde unter Verwendung des b2MGf41 vorwärts Primer 5-'CTCGCGCTACTCTCTCTTTCT-3' (SEQ ID NO:10) und B2MGb372 rückwärts Primer 5'-'TACATGTCTCGATCCCACTTAACTAT-3' (SEQ ID NO:11) amplifiziert. Zusammengefasst: Die PCR Amplifikation wurde in einem Gesamtvolumen von 25μl mit 2μl cDNA, 25pmol jedes Primers und Platinum^® SYBR^® Green qPCR SuperMix-UDG durchgeführt. Die Uracil N-Glycosylase wurde durch eine anfängliche Inkubation bei 50°C für 2 min aktiviert, gefolgt von einer Denaturierung bei 95°C für 2 min, um die Platinum Polymerase zu aktivieren. Anschließend wurden 45 Zwei-Schritt Zyklen bestehend aus 95°C für 15 s und 64°C für 1 min durchgeführt. Ein nicht-spezifisches Signal, das aus der Bildung von Primer-Dimeren resultierte, wurde durch Analysierung der Dissoziationskurven und Agarose Gelelektrophorese ausgeschlossen.
Apoptose Assays
Die Zellen wurden mit siRNA behandelt wie in den Figuren-Legenden beschrieben; 24–72h nach der siRNA Behandlung wurde der DNA Gehalt durch den Propidium-Iodid-Einbau Assay analysiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in 70% Ethanol bei –20°C für mindestens 30 Minuten fixiert. Nach einer Zentrifugation wurden die Zellen in PBS, das 1% Glukose, 50 μg/ml RNAse A und 50 μg/ml Propidium-Iodid (Sigma Chemicals, München, Deutschland) enthielt, resuspendiert und im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Eine Fluß-Cytometrie Analyse wurde in einem Becton Dickinson FACSCalibur (Heidelberg, Deutschland) unter Verwendung der CellQuest Software durchgeführt, 20000 Zellen wurden in jeder Probe analysiert. Apoptotische Zellen wurden als sub-G₀/G₁ Peak nachgewiesen. Die Ergebnisse werden als Prozent apoptotische Zellen ausgedrückt.
Annexin V Bindungsassays wurden 24h, 48h und 72h nach der siRNA Nukleoinfektion unter Verwendung des BD (Palo Alto, CA) ApoAlert Annexin V-FITC Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Prozent apoptotischen Zellen wurden durch FACS Analyse quantifiziert.
Die Aktivierung der Caspase 3 wurde durch FACS mit FITC-markierten aktiven Caspase 3 Kaninchen IgG nach Fixierung und Permeabilisierung der Zellen mit CytoFix/CytoPerm (Pharmingen, San Jose, CA) gemessen.
Die Caspase 8- und Caspase 9-Inhibierung wurde durch IETD-FMK (R&D, Abingdon, UK) bzw. LEHD-FMK (BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland) erreicht; das Z-FA-FMK Peptid (R&D, Abingdon, UK) wurde als negative Kontrolle verwendet. Verschiedene Konzentrationen der Inhibitoren, die von 10–200 μM reichten, wurden getestet und die Konzentrationen, die die größten signifikanten Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Zellen lieferten, wurden in den weiteren Experimenten verwendet. DMSO, als Vehikel zugesetzt, wurde bei den Verdünnungen, die den Konzentrationen der Inhibitoren entsprechen, als zusätzliche Kontrolle eingesetzt.
Um TRAIL zu inhibieren, wurden steigende Dosen (2–50 ng/ml) eines TRAIL neutralisierenden Antikörpers (Abcam, Cambridge, UK) nach der Bcl11b Suppression zu den Zellkulturen zugegeben. Die Menge an Antikörper, die den höchsten anti-apoptotischen Effekt lieferte, wurde in den späteren Experimenten eingesetzt. Jurkat Zellen wurden nach shRNA-vermitteltem konditionalem Bcl11b Knock-down auf apoptotische Kerne mit Hoechst 33342 (1 μg/ml) bei verschiedenen Doxycyclin-(Clonetech, Palo Alto, CA) Konzentrationen und nach verschiedenen Expositionszeiten angefärbt. Cytospins wurden hergestellt und die Zellen wurden unter Verwendung des VectaShield Mounting Mediums (Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA) aufgebracht („mounted"). Die Kerne wurden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop untersucht und gezählt. Die Caspase 3 Aktivität wurde mit dem Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) nachgewiesen und mit einem Genios Luminometer (Tecan, Crailsheim, Deutschland) gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurden durch Trypan Blau (Invitrogen, Paisley, UK) Färbung beurteilt.
Immunoblots
Die Zellen wurden auf Eis für 15 min (1 × 10 Zellen/50 μl RIPA Puffer; PBS, das 1% Igepal enthält, 0,5% Deoxycholinsäure und 0,1% SDS) ergänzt mit einem frisch zugegebenen vollständigen Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Palo Alto, CA) gemäß dem Verfahren des Herstellers lysiert. Nachdem die Zellen lysiert wurden, wurden die Proben bei 10.000g zentrifugiert. Die Proteinkonzentrationen der Überstände wurden durch einen Micro BCA Assay (Pierce, Rockford, IL) bestimmt und die Proben wurden durch SDS-10% PAGE oder SDS-15% PAGE (BioRad, München, Deutschland) aufgetrennt. Die Proteine (50 μg oder 25 μg) wurden auf Polyvinylidin Membranen (Roth, Deutschland) unter Verwendung eines Tank Blotting Systems (BioRad, München, Deutschland) geblottet. Gleiche Protein Ladungen wurden durch Ponceau Färbung und durch Immunodetektion von β-Aktin bestätigt. Die Membranen wurden anschließend in 50 mM Trisgepufferten Salin (pH = 7,6), das 3% NaCl und 3% fettfreie Trockenmilch (BioRad, München, Deutschland) enthielt, blockiert. Danach wurden die Membranen mit polyklonalen Kaninchen antihumanen Bcl11b Antikörpern (0,2 μg/ml, BioGenes, Berlin, Deutschland) und Kaninchen anti-Aktin Antikörpern (0,5 μg/ml, Sigma, München, Deutschland), gefolgt von mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziege anti-Kanninchen Antikörpern (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd, Soham, UK) inkubiert. Die Bindung wurde durch das Sigma Fast BCIP/NBT gepufferte Substrat sichtbar gemacht. Das Bcl-xL Protein wurde unter Verwendung eines anti-humanen Bcl-xL Maus Antikörpers (0,5 μg/ml, BD Transduction Laboratories, Erembodegem, Belgien) gefolgt von Ziege anti-Maus IgG-HRP (Dako Cytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) nachgewiesen und durch ECL Plus Nachweisreagenzien (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) unter Verwendung der Image Station 440CF (Kodak, Rochester, NY) sichtbar gemacht.
Cytofluorometrische Analyse
Die Zellen wurden gemäß den Protokollen, die mit den Assays oder Antikörpern zur Verfügung gestellt wurden, für die FACS Messungen vorbereitet und mit FACSCalibur (BectonDickinson, Franklin Lakes, NJ) gemessen. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der CellQuest und WinMDI 2.8 Software analysiert.
Ergebnisse
Bcl11b-spezifische siRNAs unterdrücken die Bcl11b Expression in Jurkat und huT78 humanen T-Zell Leukämie/Lymphom Zellen
Um die Effizienz der Bcl11b Inhibierung nach siRNA (Bcl11b-674) Behandlung zu bestimmen, wurde die Bcl11b Expression auf Basis des mRNA Niveaus unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR (QR-PCR) mit Primern, die die BCL11b-674 Bindestelle umspannen, und des Proteinniveaus durch Western-Blot analysiert. Eine ungefähr 3- bis 5-fache Reduzierung der mRNA Niveaus wurde 24h nach der Nukleoinfektion in beiden Zelllinien, verglichen mit den Zellen, die mit non-silencing (nicht inhibierenden) Kontroll-siRNA behandelt wurden, beobachtet (1a). Die BCL11b mRNA kehrte 72h nach der Transfektion auf die Niveaus, die in den mit Kontroll-siRNA behandelten Zellen gemessen wurden, zurück. Auf dem Protein- Niveau erreichte der Bcl11b Knock-down Effekt ungefähr 80% nach 48h und die Suppression dauerte bis 72h nach Transfektion (1b). Die Herunterregulierung von Bcl11b wurde in nicht- oder mock-transfizierten Zellen nicht beobachtet. Um mögliche „off-target" Effekte des BCL11b-674 Duplex auszuschließen, wurde ein anderes Jurkat-Tetracyklin-induzierbares Bcl11b-RNA Interferenzsystem entwickelt. In diesem System wurde eine kurze Haarnadel-RNA (short hairpin RNA; shRNA-1415), die eine andere Bcl11b-mRNA Region als Ziel hat, von einem pSuperior-pgk-Neor-EGFP Vektor nach der Doxycyklin-Induktion exprimiert. Der Knock-down Effekt trat verglichen mit der oben beschriebenen transienten Nukleoinfektion später auf und erreichte eine ungefähr 90%ige Suppression nach 96h in Anwesenheit von 0,5 μg/ml Doxycyklin (1c).
Bcl11b Suppression induziert Apoptose in Jurkat und huT78 T-Zelllinien
Die biologischen Konsequenzen des Bcl11b Silencing wurden weiterhin in von T-ALL (Jurkat) und T-Zell-Lymphom (huT78) abgeleiteten Zelllinien untersucht. Die BCL11b-negative Raji Burkitt Lymphom Zelllinie wurde als Kontrolle verwendet. Der Prozentsatz an apoptotischen Zellen wurde in allen drei Zelllinien 48h und 72h nach der siRNA Behandlung durch Annexin-V-FITC Bindungsassays bestimmt. Sowohl die Jurkat als auch die huT78 Zellen zeigten einen starken Anstieg von Annexin-V positiven Zellen nach Bcl11b Suppression, während die Raji Zellen nicht betroffen waren. Der Effekt war bereits 48h nach der Transfektion nachweisbar (Daten nicht gezeigt) und erreichte 50% nach 72h in Jurkat bzw. 80% nach 72h in huT78 Zelllinien (2). Die mit Kontroll-siRNA behandelten, unbehandelten oder mock-transfizierten Zellen zeigten vergleichbare Prozentsätze an apoptotischen Zellen, die von 5-10% reichten.
Der pro-apoptotische Effekt des Bcl11b Knock-down wurde außerdem durch den Nachweis der aktiven Form von Caspase 3 und der DNA Degradation durch Färbung mit Propidium-Iodid bestätigt. Wiederum beeinflusste die Bcl11b-siRNA die Raji Zellen nicht, während der Anteil von sub-diploiden Zellen und Zellen, die positiv für aktive Caspase 3 waren, in Jurkat und huT78 gut mit den Annexin-V Bindungsmessungen korrelierte.
In dem konditionalen shRNA System zeigten die Jurkat Zellen 96h nach der Induktion mit Doxycyclin weniger als 50% Lebensfähigkeit, wie durch den Trypan-Blau Ausschluss Assay gemessen wurde, während die Kontroll-Zelllinie, die die non-silencing shRNA exprimierte, mehr als 95% lebensfähige Zellen zeigte (3a). Die Caspase 3 Aktivität war bei 96h in Bcl11b-defizienten Zellen mehr als 6-fach höher als in den Kontrollzellen (3b). In den unbehandelten Zellen wurden keine signifikanten Unterschiede bei der Lebensfähigkeit oder Caspase 3 Aktivität gefunden. Zusätzlich zeigten die Bcl11b-defizienten Zellen typische apoptotische Chromatin-Kondensationen, wenn sie mit Hoechst 33342 gefärbt wurden, während die Kerne der Kontrollzellen gleichmäßig gefärbt waren und weniger Fluoreszenz zeigten (3c).
Als nächstes bestimmten wir die Dosisabhängigkeit der Bcl11b-siRNA induzierten Apoptose. HuT78 Zellen wurden mit steigenden Dosen von BCL11b-674 und BCL11b-sc siRNAs nukleoinfiziert und die Apoptose wurde 72h nach Transfektion beurteilt. Die Anzahl der Annexin-positiven Zellen korrelierte sehr gut mit der verwendeten Menge an BCL11b-674 siRNA und der Bcl11b Knock-down Wirksamkeit. Wie erwartet wurde kein Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen in Bcl11b-sc behandelten Zellen beobachtet (4a).
Um die upstream-Kaskaden, die zur Aktivierung des Effektors Caspase 3 führten, zu bestimmen, wurden huT78 Zellen mit spezifischen Caspase-Inhibitoren nach der Bcl11b Suppression behandelt und die Apoptose wurde 48h und 72h nach Transfektion gemessen. Wie in 4b gezeigt ist, reduzierte der Caspase 8 spezifische Inhibitor IETD, der die wichtigste regulatorische Caspase downstream von dem Todes-Rezeptor-Stoffwechselweg als Ziel hat, den Anteil an apoptotischen Zellen um ungefähr 40% bei 48h und 65% bei 72h, verglichen mit den unbehandelten Zellen. Der spezifische Caspase 9 Inhibitor LEHD, der die Aktivität des intrinsischen Stoffwechselwegs blockiert, reduzierte den Anteil an Annexin-V positiven Zellen um ungefähr 30% zu beiden Zeitpunkten. DMSO, das als Vehikel entsprechend der Konzentration der verwendeten Inhibitoren bei der Verdünnung zugegeben wurde, hatte genauso wie ein Peptid Z-FA, das als negative Kontrolle diente, keinen Effekt auf die Lebensfähigkeit. Keine der Behandlungen beeinflusste die Lebensfähigkeit der Zellen, die mit Kontroll-siRNAs nukleoinfiziert wurden. Dies bestätigte die Beteiligung von Caspasen bei der Bcl11b-siRNA induzierten Apoptose.
Bcl11b-siRNA induziert TRAIL Expression und unterdrückt BCLxL
Um einen Einblick in die molekularen Mechanismen, die für den Bcl11b-siRNA vermittelten Zelltod von Bedeutung sind, zu bekommen, wurde ein globales Genexpressionsprofil durch Verwendung des Affymetrix HG U133 Plus 2.0 Gen-Chips erstellt. Jurkat Zellen wurden mit BCL11b-674 und BCL11b-sc siRNAs transient nukleoinfiziert und die Gesamt-RNA wurde 48h nach Transfektion isoliert, dem Zeitpunkt, an dem ungefähr 80% Suppression von Bcl11b auf dem Proteinniveau bereits nachgewiesen worden ist (1) und das Verhältnis von apoptotischen zu lebensfähigen Zellen noch relativ gering war. Es wurde herausgefunden, dass 49 Sondensätze mindesten 3fach nach Bcl11b Suppression reguliert waren, was einem Signal Log Verhältnis von ≥ 1,58 oder ≤ 1,58 entspricht (Daten nicht gezeigt). Ein Satz von 15 Genen wurde ausgewählt und mittels semi-quantitativer Echtzeit RT-PCR gemessen, um die Genauigkeit der Daten zu beurteilen. Der Einfluss der Bcl11b Suppression auf die Expression dieser Gene wurde für 14 der 15 ausgewählten Gene bestätigt (nicht gezeigt). Zwei Gene, von denen bekannt ist, dass sie direkt an der Apoptose beteiligt sind, wurden im Detail untersucht.
Nach der Bcl11b-siRNA Behandlung war das Gen, das für den Tumor-Nekrose-Faktor verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL) kodiert, verglichen mit der non-silencing Kontroll-siRNA ungefähr 5-fach hochreguliert, was einen Beweis für die Beteiligung des Todes-Rezeptor-vermittelten Apoptose Stoffwechselwegs darstellt. Außerdem wurde das Gen, das für das anti-apoptotische Bcl-2 Familienmitglied BCLxL kodiert, dessen mRNA Niveaus ungefähr 3-fach verringert waren, als mögliches Ziel einer transkriptionellen Regulation durch BCL11b identifiziert.
Für beide Gene wurden die Microarray Daten anschließend durch TRAIL und BCLxL-spezifische semi-quantitative Echtzeit RT-PCR Assays für RNAs bestätigt, die aus 3 unabhängigen Experimenten erhalten worden sind, die in Jurkat und huT78 T-Zelllinien durchgeführt wurden. Die Kinetiken der TRAIL und BCLxL transkriptionellen Regulation wurden außerdem durch Analysieren der cDNA Niveaus bei 24h, 48h und 72h untersucht. Nach der Bcl11b-siRNA Behandlung war der Anstieg des TRAIL mRNA Niveaus, verglichen mit der gemischten Kontroll-siRNA, in beiden Zelllinien ähnlich, wobei eine ungefähr 6- und 8-fache Induktion 48h nach der Behandlung in huT78 bzw. Jurkat Zellen erreicht wurde (5a). Eine signifikante BCLxL Suppression wurde 24h nach Transfektion nachgewiesen und blieb bis 72h stabil (5a). Ähnliche Ergebnisse wurden im Fall des Tetracyklin-induzierbaren Knock-down Systems erhalten (Daten nicht gezeigt).
Als nächstes wurden die Niveaus der Proteine, die den identifizierten Genen entsprechen, untersucht. Die Analyse von Bcl-xL in der huT78 Zelllinie durch Western Blot ergab nach der transienten Suppression von Bcl11b eine signifikante Runterregulierung des Proteins verglichen mit Kontroll-siRNA behandelten Zellen, unbehandelten und mock-transfizierten Zellen. Dies wurde außerdem in dem Jurkat konditionalen shRNA-vermittelten Bcl11b Knock-down System bestätigt (5b).
Die Niveaus des oberflächengebundenen Trail wurden durch FACS Analyse von huT78 Zellen als Funktion der Dosis der verwendeten siRNA untersucht. Der Prozentsatz an Trail positiven Zellen korrelierte sehr gut mit der Menge an Bcl11b-674 Duplexen (5c), der Anzahl an apoptotischen Zellen und der Bcl11b Knock-down Effizienz (4a), während steigende Dosen der Kontroll-siRNA keinen Effekt zeigten.
Um zu beschreiben, ob eine gesteigerte Trail Expression eine Rolle bei der durch BCL11b-Suppression induzierten Apoptose spielen könnte, wurde versucht, das Cytokin mit einem neutralisierenden Antikörper zu inaktivieren. Tatsächlich sank die Anzahl an Annexin-V positiven Zellen dramatisch, verglichen mit den unbehandelten Zellen, wenn die huT78 Zellen in Gegenwart des Antikörpers nach der Inhibierung von Bcl11b kultiviert wurden (5d). Wie erwartet beeinflusste die Behandlung die Zellen, die mit der Kontroll-siRNA transfiziert worden waren, nicht (5d).
Bcl11b Suppression induziert die Apoptose in normalen T-Zellen nicht
Um zu überprüfen, ob die Bcl11b Suppression auch nicht-transformierte T-Zellen betrifft, wurden die gleichen Experimente in normalen peripheren Blut T-Lymphozyten durchgeführt. Rufgereinigte T-Zellen, die aus 3 gesunden Individuen erhalten wurden, wurden vor dem transienten Bcl11b Knock-down in vitro stimuliert und expandiert. QR-PCR und Western Blot Analysen bestätigten die Effizienz der Behandlung. Die Kinetiken der Bcl11b mRNA Suppression waren leicht unterschiedlich im Vergleich zu der, die in Jurkat oder huT78 Zellen beobachtet wurde, wobei der maximale Wert 48h nach der Behandlung erreicht wurde (6a). Auf dem Proteinniveau wurde eine ungefähr 90%ige Reduktion von Bcl11b 48h nach Transfektion erreicht, die bis 72h andauerte ( 6b). Die Apoptose, die zu beiden Zeitpunkten durch Annexin-V Bindung gemessen wurde, ergab niedrige Niveaus von spontanem Zelltod und leichte Unterschiede zwischen den T-Zellen, die von den verschiedenen Spendern erhalten wurden, aber überraschenderweise wurde kein Unterschied zwischen Bcl11b-defizienten und Kontrollzellen nachgewiesen (6c). Um der Frage nachzugehen, ob das beobachtete Fehlen der Apoptose von normalen T-Zellen mit dem Zellzyklus oder Stimulationsstatus in Beziehung stehen könnte, wurde ein ähnliches Experiment mit frisch isolierten, aufgereinigten, nicht-stimulierten und nicht-proliferierenden T-Zellen durchgeführt. Wieder wurde keine Steigerung des Prozentsatzes an apoptotischen Zellen in Bcl11b-defizienten Zellen beobachtet, unabhängig davon, ob die Zellen nach der siRNA Gabe stimuliert oder nicht-stimuliert waren (Daten nicht gezeigt).
Diese Ergebnisse veranlassten dazu, den Status der Gene zu untersuchen, die mit der Apoptose in Beziehung stehen, und deren Expression sich nach dem Bcl11b Knock-down in Jurkat und huT78 Zellen änderte. In den in vitro expandierten T-Zellen waren die Niveaus der BCL-xL mRNA und des Proteins in Bcl11bsiRNA behandelten Zellen deutlich reduziert, verglichen mit der gemischten Kontrolle, mock-transfizierten und unbehandelten Zellen. Das Ausmaß der Änderungen war ähnlich zu dem, dass in Jurkat und huT78 Zellen beobachtet wurde (7a, 7b). Im Gegensatz dazu wurde die TRAIL mRNA in einem wesentlich geringeren Ausmaß induziert als in T-Zelllinien, wobei eine 2-fache Hochregulierung in Bcl11b-defizienten Zellen nicht übertroffen wurde (7a). In Übereinstimmung damit zeigte der FACS-basierte Assay keine Induktion von oberflächen-gebundenem Trail nach Inhibierung von Bcl11b (7c). Diese Ergebnisse wurden außerdem in nicht-stimulierten T-Zellen bestätigt.
Diskussion
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, dass Bcl11b bei T-ALL im Vergleich zum Expressionniveau in normalen T-Zellen oder im Gehirn deutlich hochreguliert ist. Damit hat Bcl11b keine Tumorsuppressor Eigenschaften.
Um die Funktion von Bcl11b zu hemmen, wurde u.a. unter Verwendung der RNA-Interferenz in zwei verschiedenen, von humanen T-Zell Leukämie und Lymphom abgeleiteten Zelllinien die Bcl11b-Expression inhibiert. Die Ergebnisse belegen erstmals die entscheidende Rolle von Bcl11b bei der Förderung des Überlebens dieser malignen Zellen.
Zwei verschiedene RNA-Interferenz Strategien, die verschiedene Regionen der Bcl11b Sequenz als Ziel haben, führten zu übereinstimmenden Ergebnissen. Die Reduktion der Bcl11b Expression führte zu einer dramatisch gesteigerten Apoptose sowohl in T-Zell Leukämie- als auch Lymphom-Zelllinien. Der Effekt war stabil und von der Dosis der siRNA, der Knock-down Effizienz und den Bcl11b Proteinniveaus abhängig.
Die erfindungsgemäßen Ergebnisse zeigen, dass das Überleben der malignen T-Zelllinien in vitro durch Bcl11b Suppression dramatisch verringert werden kann. Daher wurden die Auswirkungen der Bcl11b-Inhibierung in normalen reifen T-Zellen untersucht, die ebenfalls Bcl11b exprimieren, wenn auch auf signifikant niedrigeren Niveaus. Interessanterweise wurde keine Abnahme der Lebensfähigkeit in Bcl11b-defizienten Zellen beobachtet. Obwohl eine auffällige Runterregulierung von Bcl-xL beobachtet wurde, war die TRAIL mRNA nur geringfügig erhöht, und das entsprechende Protein konnte nach Bcl11b Inhibierung nicht auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden.
Die vorliegenden Untersuchungen zeigen erstmals, dass Bcl11b ein anti-apoptotisches Protein in T-Zell-Malignomen ist.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verwendung eines Bcl11b-Inhibitors zur Behandlung von T-Zell-Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die T-Zell-Erkrankungen Precursor-T-lymphoblastische-Leukämie/lymphoblastisches-Lymphom und die reifzelligen T-Zellleukämien/-Lymphome sind.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bcl11b-Inhibitor ein Inhibitor der Bcl11b-Genexpression ist.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor siRNA mit der in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 gezeigten Sequenz ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die Bcl11b inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass man a) an malignen T-Zellen, bei denen die BCL11b-Expression erhöht ist, das Expressionsniveau bestimmt, b) man die Zellen mit der zu untersuchenden Substanz in Kontakt bringt und man c) die Bcl11b-Expression nach Zugabe der zu untersuchenden Substanz erneut bestimmt und mit dem in Stufe a) bestimmten Expressionsniveau vergleicht, wobei die Substanz Bcl11b inhibiert, wenn die Substanz zu einer Verminderung der Bcl11b-Expression führt.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von T-Zell-Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Verfahren nach Anspruch 5 durchführt und man die identifizierten Substanzen mit pharmazeutisch akzeptablen Hilfs- und/oder Trägerstoffen formuliert.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die T-Zell-Erkrankungen Precursor-T-lymphoblastische-Leukämie/lymphoblastisches-Lymphom und die reifzelligen T-Zellleukämien/-Lymphome sind.
Verwendung einer nach einem Verfahren des Anspruchs 5 identifizierten Substanz zur Behandlung von T-Zell-Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die T-Zell-Erkrankungen Precursor-T-lymphoblastische-Leukämie/lymphoblastisches-Lymphom und die reifzelligen T-Zellleukämien/-Lymphome sind.