DE102006024058B4

DE102006024058B4 - Modulares System mit immobilisierten Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten an metallischen Oberflächen und Verfahren zu dessen Herstelung

Info

Publication number: DE102006024058B4
Application number: DE200610024058
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr.rer.nat. Schwenzer; Jan Dipl.-Chem. Michael; Ina Dipl.-Chem. Israel; Dieter Dr. Scharnweber; René Dipl.-Ing. Beutner
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2006-05-16
Publication date: 2010-06-10
Anticipated expiration: 2026-05-17
Also published as: DE102006024058A1; DE102006024058B8

Abstract

Modulares System mit immobilisierten Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten an metallischen Oberflächen, wobei
– die metallische Oberfläche (2) mit einer Metalloxidschicht (3) versehen ist, in die die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) eingebaut sind,
– die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) an ihrem 5'- oder 3'-Terminus anionische Gruppen (5) tragen,
– die anionische Gruppen (5) tragenden terminalen Bereiche (6) der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) sich innerhalb der Metalloxidschicht (3) befinden, wodurch Ankerstränge (7) gebildet werden,
dadurch gekennzeichnet, dass
an jedem Ankerstrang (7) im Stabilisationsbereich (8) ein komplementärer Stabilisationsstrang (9) gebunden ist und dass der Ankerstrang (7) mit dem Stabilisationsstrang (9) als Doppelstrangbereich in der Metalloxidschicht (3) fixiert ist, wobei der auf der Metalloberfläche (2) fixierte Terminus bereits ein doppelsträngiges Hybrid darstellt, während der der Metalloxidschicht (3) abgewandte Funktionalisierungsbereich (10) des Ankerstrangs (7) einzelsträngig ausgebildet ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein modulares System mit immobilisierten Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten an metallischen Oberflächen und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Potenzielle Anwendungsgebiete von Systemen nach dem Oberbegriff der Erfindung sind z. B. die Funktionalisierung von Implantatoberflächen mit biologisch aktiven Substanzen und die Herstellung von DNA-Chips.
In der DE 102 32 139 A1 wird ein gattungsgemäßes Immobilisierungsverfahren beschrieben. Zunächst wird ein metallischer Gegenstand bei einem leicht sauren pH-Wert, z. B. zwischen 3,5 und 5,0, mit Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten, die an einem Terminus mit anionischen Gruppen (bevorzugt Phosphat, aber beispielsweise auch Phosphonat, Sulfat, Sulfonat u. a.) modifiziert sind, in Kontakt gebracht. Dabei sind diese terminalen Gruppen negativ geladen, wogegen die Metall-Metalloxidschicht positiv geladen ist oder zumindest lokal positive Ladungszentren aufweist. Auf diese Weise wird erreicht, dass die modifizierten terminalen Bereiche der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate durch elektrostatische Interaktion auf der Metalloxidschicht adsorbieren. Entweder gleichzeitig damit oder anschließend an diesen Prozess erfolgt mittels anodischer Polarisation ein Wachstum der Oxidschicht. Somit gelingt ein orientierter terminaler Einbau der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate in die Metalloxidschicht.
Die auf diese Weise fixierten Stränge werden als so genannte Ankerstränge benutzt. Für die Anwendung bei Implantatoberflächen erfolgt die eigentliche Funktionalisierung durch die Hybridisierung an dem in der Lösung frei zugänglichen Sequenzbereich des Ankerstrangs mit komplementären Nukleinsäuresträngen, wobei dieser Sequenzbereich im Folgenden als Funktionalisierungsbereich bezeichnet wird. An die durch Hybridisierung gebundenen Gegenstränge sind die eigentlichen Wirkstoffe gekoppelt.
Als Nachteil dieses Verfahrens ist allerdings die Tatsache anzusehen, dass in Abhängigkeit von Sequenz und Länge des Ankerstrangs die gewünschte ausschließlich terminale Adsorption und Fixierung nicht hinreichend gesichert ist. Besonders bei längeren Ankersträngen kann infolge der relativ freien Beweglichkeit der Einzelstränge die Adsorption, statt wie gewünscht ausschließlich über die terminalen anionischen Gruppen, zusätzlich über das Zucker-Phosphat-Rückgrat und/oder über die Basen erfolgen.
Steel, A. B. u. a.: Immobilization of nucleic acids at solid surfaces: Effect of oligonucleotide length an layer assembly, Biophysical Journal, Volume 79, August 2000, Seiten 975 bis 981, stellten fest, dass terminal an Oberflächen gebundene einzelsträngige Oligonukleotide bis zu einer maximalen Kettenlänge von 25 Nukleotiden nahezu linear strukturiert, nur wenig gewunden und damit weitgehend senkrecht zur Oberfläche ausgerichtet sind. Demgegenüber sind Stränge mit größeren Kettenlängen räumlich komplex strukturiert (Loops, Windungen) und können dadurch mitunter an mehreren Stellen an die Oberfläche adsorbieren.
Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass durch die freie Beweglichkeit der einzelnen Ankerstränge aufgrund einer unspezifischen Adsorption an der Metall-/Metalloxid-Oberfläche, die über die Basen bzw. das Zucker-Phosphat-Rückgrat erfolgen kann, die Hybridisierung nach der Immobilisierung erschwert wird.
Zusätzlich kann es in Abhängigkeit von den elektrochemischen Parametern bei der Verdickung der Metalloxidschicht oberflächennah zu einer deutlichen pH-Absenkung kommen. Wird als Metall beispielsweise Titan verwendet, wie in der DE 102 32 139 A1 beschrieben, käme es infolge der Absenkung des pH-Werts zu einer erhöhten Löslichkeit von Titanyl-Ionen (TiO²⁺) in wässriger Lösung. Diese können von den funktionellen Gruppen (z. B. Hydroxylgruppen der Zucker, Aminogruppen der Basen u. a.) der adsorbierten bzw. immobilisierten Ankerstränge komplexiert werden. Die resultierende koordinative Blockierung der funktionellen Gruppen kann die gewünschte nachfolgende Hybridisierung mit Gegensträngen stark einschränken.
Ebenfalls zu einer Einschränkung der Hybridisierung mit Gegensträngen kann es durch das Auftreten von reaktiven Radikalen kommen. Diese werden während der elektrochemischen Polarisation infolge von Reaktionen, die parallel zur Oxidverdickung ablaufen, gebildet. Die reaktiven Radikale können mit adsorbierten Ankersträngen derart reagieren, dass Strangbrüche auftreten. Dadurch wird die Zahl intakter Ankerstränge reduziert, die für eine Hybridisierung mit Gegensträngen verfügbar sind.
Aus der Publikation von Lemeshko S. V. u. a.: Oligonucleotides form a duplex with non-helical properties an a positively charged surface. Nucleic Acids Res. (2001) 29 (14) 3051–8. geht hervor, dass Duplexe unter bestimmten Bedingungen nichthelikal auf einer positiven Oberfläche vorliegen. Das in dieser Publikation beschriebene Verfahren beruht auf der elektrostatischen Anziehung zwischen dem gesamten Zucker-Phosphat-Rückgrat einerseits, welches unter den gewählten biochemischen Standardbedingungen, das heißt bei einem pH-Wert von ca. pH 7,5, negativ geladen ist, und einer Oberfläche mit kationischen, also positiven Gruppen, andererseits, was zu einer effektiven adsorptiven Bindung führt. Der Nachteil besteht darin, dass in diesem Fall die Bindung an die Oberfläche global über das Zucker-Phosphat-Rückgrat des gesamten Moleküls erfolgt, so dass auch bei der Hybridisierung das Oligonukleotid als Ganzes an die Oberfläche gebunden ist.
In der US 2005/0112605 A1 ist/sind eine wiederverwendbare bioelektronische DNA beziehungsweise andere Oligonukleotidsequenzsensoren offenbart. Der Sensor umfasst eine oligomere Sonde, die mit einer redoxaktiven, redoxfähigen Komponente versehen ist und selbstorganisierend auf oder nahe einer Elektrode angeordnet ist. Dabei erfolgt die Fixierung der Sensoren über Einzelstränge. Diese oberflächenbegrenzte Oligonukleotidsondenstruktur durchläuft in Anwesenheit der Zielnukleotidsequenz eine durch Hybridisierung induzierte Konformationsänderung, welche den Elektron-Transfer-Abstand zwischen der redoxfähigen Komponente und der Elektrode ändert, wobei die Elektrode dabei eine detektierbare Signaländerung hervorbringt. Der Gegenstand der US 2005/0112605 A1 dient vor allem der schnellen und günstigen Detektion und Authentifizierung. Zwar ist die Anwendung des Gegenstandes der US 2005/0112605 A1 auch in der Medizin denkbar. Dies betrifft aber vor allem mögliche Anwendungen im analytischen Bereich.
In der Publikation Moiseev L. u. a.: DNA conformation an surfaces measured by fluorescence self-interference. Proc Natl. Acad. Sci. USA (21. Februar 2006) 103(8): 2623–8 wird die Untersuchung der Konformation von DNA-Molekülen an einer Oberfläche mittels SSFM (spectral self interference fluorescence microscopy) beschrieben. Bei dieser Untersuchung wurde der Zustand an der Oberfläche analysiert und festgestellt, dass immobilisierte Einzelstrang-DNA durch ihre große intramolekulare Beweglichkeit geringere Schichtdicken ausbildet als die relativ starre Doppelstrang-DNA. Die Immobilisierung selbst erfolgte sowohl bei den Einzelsträngen als auch bei den Doppelsträngen ausschließlich über Einzelstränge.
Die US 2006/0068392 A1 beschreibt eine Immobilisierung von Nukleinsäuren auf Metallträgern, wobei die Metalle aus den Gruppen I, II, III, IV, V, VI und VII der zweiten bis zur siebenten Periode und den Übergangselementen im Periodensystem der Elemente ausgewählt werden. Dazu werden Oligonukleotide in einer Pufferlösung gelöst, die unter anderem EDTA oder Citrat als Puffer enthalten kann. Die Nukleinsäure wird auf dem Träger aufgetragen und zur Immobilisierung der Träger mit ultravioletter Strahlung behandelt. Diese Methode dient insbesondere Analyseverfahren für Nukleinsäuren auf der Grundlage einer Hybridisierung.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein System mit immobilisierten Nukleinsäuren und Nukleinsäurederivaten auf metallischen Oberflächen bereitzustellen, das in seiner Anwendung sicher zu handhaben und effektiv gestaltet ist, sowie ein entsprechendes Verfahren zur Herstellung von auf diese Weise verbesserten Systemen anzugeben.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein modulares System mit immobilisierten Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten an metallischen Oberflächen gelöst, wobei die metallische Oberfläche mit einer dünnen Metalloxidschicht versehen ist. In diese Metalloxidschicht sind die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate mit ihren terminalen Molekülbereichen eingebaut, wobei die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate an ihrem 5'- oder 3'-Terminus anionische Gruppen tragen. Diese anionische Gruppen tragenden terminalen Bereiche der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate befinden sich fest fixiert innerhalb der Metalloxidschicht, wodurch die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate stabil gebunden sind und als sogenannte Ankerstränge für eine Hybridisierung mit komplementären Strängen zur Verfügung stehen.
Erfindungsgemäß ist das Ankerstrang-System an dem Nukleinsäure-Bereich, dessen terminale Nukleotide in der Oxidschicht eingebaut sind, doppelsträngig ausgebildet. An jedem Ankerstrang ist im Stabilisationsbereich ein komplementärer Stabilisationsstrang durch Hybridisierung gebunden, so dass der Ankerstrang mit dem Stabilisationsstrang als Doppelstrangbereich in der Metalloxidschicht fixiert ist, wobei der auf der Metalloberfläche fixierte Terminus bereits ein doppelsträngiges Hybrid darstellt, während der der Metalloxidschicht abgewandte Funktionalisierungsbereich des Ankerstrangs einzelsträngig ausgebildet ist.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird die Stabilität dieses doppelsträngigen Ankerstrang-Systems durch eine chemisch-kovalente Verknüpfung der Einzelstränge verstärkt.
Die Doppelhelixstruktur weist im Vergleich zu Einzelsträngen eine wesentlich geringere molekular-dynamische Flexibilität auf. Infolge dessen wird die Beweglichkeit des Ankerstranges eingeschränkt, so dass durch sterische Hinderung auch das Eingehen unspezifischer Bindungen des einzelsträngigen, in die Lösung ragenden verbliebenen Funktionalisierungsbereichs des Ankerstranges mit der Metalloxidschicht minimiert wird.
Ein weiterer Vorteil dieser Lösung ergibt sich daraus, dass der auf der Metalloberfläche fixierte Terminus bereits ein doppelsträngiges Hybrid darstellt, während der entgegengesetzte, außen liegende Terminus einzelsträngig ausgebildet und zur späteren Hybridisierung vorgesehen ist. Wenn in unmittelbarer Nachbarschaft zum Funktionalisierungsbereich bereits Hybride bestehen, wie es durch das Vorhandensein des doppelsträngigen Bereichs des Ankerstrang-Systems an der Metalloberfläche der Fall ist, kommt es direkt anschließend an dem bereits bestehenden Doppelstrangbereich zu einer schnelleren Hybridisierung und zur Bildung stabilerer Hybride (sog. Facilitator-Effekt).
Schließlich hat eine Doppelstrang-Struktur an der Metalloberfläche den Vorteil, dass destabilisierende Effekte durch Einzelstrangbrüche, die infolge von Reaktionen mit Radikalen in diesem Bereich auftreten können, weitgehend kompensiert werden, da die Doppelhelixstruktur derartige Einzelstrangbrüche stabilisiert.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung trägt der doppelsträngige helikale Abschnitt des Ankerstranges an beiden Einzelstrangtermini des einzubauenden Endes anionische Gruppen. Auf diese Weise wird die gerichtete Adsorption durch erhöhte Affinität und Bindungsstabilität zusätzlich unterstützt. Vorzugsweise handelt es sich dabei um die gleichen anionischen Gruppen.
Als bevorzugte anionische Gruppen an den Termini der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate werden Phosphat-, Phosphonat-, Sulfat- oder Sulfonatgruppen eingesetzt, die der Bindung der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate an die Metall-Metalloxidschicht dienen, welche wiederum über positive Ladungsträger verfügt.
Die Metallschicht kann entweder auf einem nichtmetallischen Substrat angeordnet sein oder das Substrat selbst kann aus dem Metall bestehen und auf diese Weise die Metallschicht bereitstellen. Vorzugsweise besteht die Metallschicht aus einem Ventilmetall oder einer Ventilmetalllegierung, wie z. B. Aluminium, Titan, Tantal, Zirkonium oder Niob. Anderseits sind auch Legierungen, einschließlich intermetallischer Phasen eines oder mehrerer der genannten Metalle, möglich.
Alternativ ist die Metallschicht auf einem nichtmetallischen Substrat angeordnet, oder das Substrat selbst besteht aus einem Ventilmetall oder einer Ventilmetalllegierung.
Der Begriff Nukleinsäure schließt im Sinne dieser Beschreibung Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA) und Peptidische Nukleinsäuren (PNA) ein. Unter Nukleinsäurederivaten versteht man alle aus diesen Grundstrukturen (DNA, RNA oder PNA) ableitbaren Modifikationen, wie z. B. Phosphothioate, Phosphoramidate, O-Methyl-Derivate, „Locked Nucleic Acids” (LNA), „Hexitol Nucleic Acids” (HNA) oder gemischte Moleküle aus diesen.
Die Sequenzen der an den 5'-Termini immobilisierten Nukleinsäuren werden vorteilhaft so ausgewählt, dass die für anschließende Prozesse, wie z. B. die Hybridisierung, relevanten Sequenzen auch bei einem Schichtwachstum von über 2 nm noch zugänglich sind. Die Sequenzen in der direkten Nähe der 5'-Termini sind dabei beliebig, da diese in die Oxidschicht eingebaut werden bzw. Teil des Doppelstrangabschnitts sind. Die Sequenzen in der Nähe der 3'-Termini können dagegen vorteilhaft spezifische Erkennungssequenzen, z. B. für eine anschließende Hybridisierung mit komplementären Strängen, enthalten. Gleiches gilt analog bei 3'-terminal immobilisierten Nukleinsäuren, zum Beispiel im Falle der Stabilisationsstränge, für die freien 5'-Termini.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung enthalten die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate zusätzliche Modifikationen des Zucker-Phosphat-Rückgrates. Diese können z. B. Phosphothioat- oder O-Methylgruppen und/oder unkonventionelle Basen wie Inosin sein.
Vorzugsweise können an den Einzelstrang-Abschnitten der Ankerstränge durch die Hybridisierung über komplementäre Basenpaarung komplementäre Nukleinsäurestränge gebunden sein. Die Sequenz des jeweiligen Einzelstrang-Abschnitts des immobilisierten Stranges im modularen System bestimmt dabei, welche Sequenzen an diesen Einzelstrang-Abschnitt komplementär binden können. Die komplementären Nukleinsäurestränge dienen bevorzugt der Modifikation der Metalloberflächen mit verschiedensten biologischen und chemischen Wirkstoffen, welche zuvor kovalent an die Komplementärstränge gebunden wurden (Konjugation). Diese Wirkstoffe können anorganische, organische oder biochemische Moleküle sein. Es können aber auch Zell- oder Gewebekomponenten an die Komplementärstränge gebunden sein. Vorteilhaft werden dabei die biologischen bzw. chemischen Eigenschaften der entsprechend modifizierten Oberfläche weitgehend von den an die Nukleinsäuren gekoppelten Wirkstoffen bestimmt.
Die Bindung der komplementären Stränge kann vorteilhaft auch vom Anwender durchgeführt werden. Durch die Auswahl komplementärer Stränge mit geeigneten Wirkstoffen kann der Anwender die biologischen bzw. chemischen Eigenschaften der Metalloberfläche an die Bedürfnisse, die seine spezielle Anwendung erfordert, anpassen.
Die Modularität des Systems garantiert eine nahezu uneingeschränkte Variabilität beim Aufbau „biologisierter” Oberflächen. Ausgehend von einer Metall-Metalloxidoberfläche, die mit Ankersträngen, die Einzelstrang-Abschnitte aufweisen, beschichtet ist, können die biologischen Eigenschaften der Oberfläche durch folgende Faktoren vielseitig variiert werden:

– Die Sequenzen der Einzelstrang-Abschnitte an den immobilisierten Ankersträngen bestimmen, welche Nukleinsäuresequenzen komplementär binden können.
– Ankerstränge mit unterschiedlichen Sequenzen der Einzelstrang-Abschnitte können statistisch verteilt oder lateral strukturiert an der Metalloxidoberfläche immobilisiert werden.
– Die Stabilität der Bindung zwischen immobilisierten und komplementären Strängen bestimmt das Freisetzungsverhalten der an den komplementären Strängen gebundenen Wirkstoffe.
– An den immobilisierten Ankersträngen, d. h. an den Einzelstrang-Abschnitten mit identischer Sequenz, können komplementäre Stränge binden, die unterschiedliche Wirkstoffe tragen.
– An immobilisierten Ankersträngen können lateral definiert oder statistisch verteilt verschiedene Nukleinsäure-Wirkstoff-Konjugate gleichzeitig hybridisiert werden, bei gleicher Flexibilität in der Gestaltung der in den drei Punkten zuvor beschriebenen Eigenschaften.
– Durch die variable Gestaltung der Hybridstabilität auf ein und derselben Oberfläche kann das Freisetzungsverhalten der assoziativ gebundenen und Wirkstoff-tragenden komplementären Nukleinsäuren gesteuert werden.
– Durch Modifizierung der Basen, wie beispielsweise Inosin, bzw. des Rückgrats der Nukleinsäuren, wie z. B. ein Peptid-, Phosphothioat- oder Methylphosphonat-Rückgrat, kann die chemische Stabilität und die Stabilität gegenüber dem Abbau durch Nukleasen gezielt beeinflusst werden. Die oben genannten Eigenschaften werden dadurch nicht maßgeblich beeinträchtigt.
– Die Sequenz der immobilisierten Nukleinsäuren kann spezielle Erkennungssequenzen für Antikörper, Nukleinsäure-bindende Proteine oder Nukleasen enthalten.

Die Stabilität der Bindung zwischen immobilisierten Ankersträngen und komplementären Strängen ist dabei im Wesentlichen abhängig von der Länge des Hybridbereiches, dessen G-C-Gehalt und der Anzahl von sogenannten „Mismatches”, d. h. von nicht komplementären Basenpaaren. Dabei steigt die Stabilität mit dem G-C-Gehalt, durch eine größere Zahl von Wasserstoffbrücken, denn jedes C-G-Paar weist drei Wasserstoffbrücken auf, während die Bindung eines A-T-Paares jeweils über zwei Wasserstoffbrücken erfolgt. Dagegen bilden „Mismatch”-Paare keine stabilitätsrelevanten Wasserstoffbrücken aus, da sie nicht komplementär sind. Daraus folgt, dass das Hybrid umso instabiler wird, je größer die Anzahl der „Mismatch”-Paare ist.
Ist die Freisetzung der komplementären Stränge und der an diese gekoppelten Wirkstoffe nicht erwünscht, kann diese vorteilhaft durch kovalente Bindung des komplementären Strangs an den Einzelstrang-Abschnitt des immobilisierten Ankerstranges verhindert werden. Eine solche kovalente Bindung wird z. B. durch Vernetzung mit UV-Licht oder durch chemische Reaktionen erreicht.
Ist eine besonders schnelle Freisetzung der an die komplementären Stränge gebundenen Wirkstoffe in einem biologischen Milieu erwünscht, kann dies durch den Einbau von Erkennungssequenzen für Nukleasen erreicht werden.
Vorteile des erfindungsgemäßen modularen Systems sind insbesondere:

– Stabilität der Nukleinsäure-Beschichtung, z. B. gegenüber Radikalen,
– optimale Zugänglichkeit für anschließende Prozesse, wie beispielsweise Hybridisierung, durch die Orientierung der Nukleinsäuren,
– Möglichkeit zur variablen und modularen Modifizierung der Metalloberfläche durch Binden von komplementären Strängen und an diese gebundene Wirkstoffe,
– Möglichkeit der Beeinflussung des Freisetzungsverhaltens und damit der Bioverfügbarkeit der Wirkstoffe durch die molekulare Struktur des Nukleinsäure-Hybrids,
– Möglichkeit der einfachen Anpassung der Beschichtung durch den Anwender.

Ein weiterer Aspekt der Lösung der Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines solchen modularen Systems zur Immobilisierung von Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten an einer metallischen Oberfläche, das aus einer Metalloxidschicht und Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten besteht. Dabei wird eine metallische Oberfläche mit Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten in Kontakt gebracht, die als Ankerstränge vorgesehen sind, die an ihrem 5'- oder 3'-Terminus anionische Gruppen tragen. Dagegen weist die Metalloxid-Metalloxidschicht positive Ladungszentren auf. Erfindungsgemäß ist an jedem Ankerstrang im Stabilisationsbereich ein komplementärer Stabilisationsstrang gebunden. Der helikale Doppelstrang, der durch den Ankerstrang mit dem komplementären Stabilisationsstrang gebildet wird, adsorbiert durch elektrostatische Interaktion mit seinem modifizierten terminalen Molekülbereich, welcher anionische Gruppen aufweist, auf der Metalloxidschicht. Der Abschnitt des Ankerstranges, der sich außerhalb des doppelsträngigen Stabilisationsbereiches befindet, ist einzelsträngig ausgebildet und daher frei zugänglich für anschließende Prozesse und wird entsprechend der bereits verwendeten Terminologie als Funktionalisierungsbereich bezeichnet. Zeitgleich zur Adsorption durch elektrostatische Interaktion oder anschließend erfolgt mittels anodischer Polarisation ein Wachstum der Oxidschicht. Dabei findet ein orientierter terminaler Einbau der anionische Gruppen tragenden terminalen Bereiche der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate in die Metalloxidschicht statt.
Es wurde festgestellt, dass eine terminale Modifikation der Nukleinsäuren am Stabilisationsbereich mit anionischen Gruppen eines geeigneten pK_S-Wertes die Immobilisierung von Nukleinsäuren ermöglicht. Dabei bestehen die anionischen Gruppen aus Molekülstrukturen, die bei dem pH-Wert und der Ionenstärke des Verfahrens eine negative Ladung besitzen. Vorzugsweise sind die anionischen Gruppen Phosphat-, Phosphonat- oder Sulfonatgruppen. Die Verbindung der anionischen Gruppen mit den terminalen Molekülbereichen erfolgt vorzugsweise kovalent an den 3'- oder 5'-Termini.
Vorteilhaft sind kommerziell erhältliche, terminal phosphorylierte Oligonukleotide einsetzbar. Die Bedingungen für die Adsorption werden so gewählt, dass die anionischen Gruppen noch mindestens eine negative Ladung tragen, während die Metall-Metalloxid-Oberfläche zumindest einige positive Ladungszentren aufweist. Dadurch wird eine Anlagerung der modifizierten terminalen Bereiche der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate auf der Metalloxidschicht durch elektrostatische Interaktion ermöglicht.
Nach der adsorptiven Anlagerung erfolgt der anschließende Einbau erfindungsgemäß durch anodische Polarisation bei pH 3 bis 6, vorzugsweise bei pH 4 in einem Acetatpuffer-System.
Das Wachstum der Oxidschicht kann durch die Wahl der elektrochemischen Parameter, vorzugsweise Potenzial, Stromdichte und Potenzialänderungsgeschwindigkeit, kontrolliert werden. Dabei bestimmen die elektrochemischen Parameter die auftretende Tiefe des Einbaus, die Größe der Moleküle determiniert die zulässige Tiefe des Einbaus. Um das Wachstum der Oxidschicht in einen für andere Prozesse notwendigen Erkennungsbereich der Nukleinsäure zu verhindern, wird das erreichte Potenzial bei der anodischen Polarisation vorzugsweise auf einen Wert im Bereich zwischen 2 und 200 V_SCE begrenzt.
In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens werden während des Einbaus der Ankerstränge in die Metalloxidschicht Komplexbildner zugesetzt. Dabei werden Kationen gebunden, die zuvor aus der Metallschicht freigesetzt worden sind, wie z. B. Titanyl-Ionen (TiO²⁺) im Falle der Verwendung von Titan als Metalloberfläche, bevor sie an die funktionellen Gruppen der Nukleinsäuren binden können. Als bevorzugte Komplexbildner werden z. B. EDTA, Oxalat, Citrat u. a. eingesetzt.
Eine weitere vorteilhafte Maßnahme im Verfahren besteht in der Zugabe von Radikalfängern. Damit können reaktive Radikale, die im Laufe der anodischen Polarisation infolge Parallelreaktionen gebildet werden, abgefangen und deren Reaktion mit Ankerstrangmolekülen weitgehend verhindert werden. Als bevorzugte Radikalfänger dienen Verbindungen wie Ascorbinsäure, Chinon/Hydrochinon, Carotinoide, Flavonoide u. a.
Nach der Immobilisierung wird das System in Acetat-Puffer (pH 4) und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS = Phosphate Buffered Saline) (pH-Wert = pH 7,5) gewaschen und mit destilliertem Wasser gespült, um nicht fixierte Ankerstränge zu entfernen. Die Probe kann sofort weiterverarbeitet oder getrocknet bei kühlen Temperaturen (< 10°C) unter Lichtausschluss gelagert werden.
Beim Schritt der Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuren an die Einzelstrang-Abschnitte im Funktionalisierungsbereich der durch Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate gebildeten Ankerstränge werden der pH-Wert und die Ionenstärke bevorzugt so gewählt, dass die Metall-Metalloxidoberfläche negativ geladen ist, während das Nukleinsäure-Rückgrat der Nukleinsäuren negativ geladen ist oder keine Ladung aufweist. Wenn sowohl die Metall-Metalloxidoberfläche als auch das Nukleinsäure-Rückgrat negativ geladen sind, kommt es zu einer elektrostatischen Abstoßung zwischen beiden. Durch diese Abstoßung wird eine unspezifische Adsorption der komplementären Stränge vermieden.
In Abhängigkeit von Länge und Basenzusammensetzung der zu hybridisierenden Sequenzen wird ein Puffersystem geeigneter Ionenstärke, üblicherweise im Bereich zwischen 0,1 und 1,5 mol/Liter an einwertigen Kationen, gewählt. Der pH-Wert liegt zwischen 4 und 10, der bevorzugte pH-Bereich ist zwischen pH 7 bis pH 7,5 angesiedelt. An die komplementären Nukleinsäurestränge, die sich zur Hybridisierung an die Einzelstrang-Abschnitte im Funktionalisierungsbereich der Ankerstränge in der Pufferlösung befinden, sind vorzugsweise Wirkstoffe gebunden. Diese Wirkstoffe können aus anorganischen, organischen oder biochemischen Molekülen bestehen. Es können aber auch Zell- oder Gewebekomponenten an die komplementären Nukleinsäurestränge gebunden sein.
Für die Hybridisierung wird die mit Ankersträngen beschichtete Substratoberfläche in Abhängigkeit des zu erzeugenden Systems und der angewandten Parameter inkubiert. Für die beschriebene Ausgestaltung der Erfindung wird vorzugsweise zwischen zehn Minuten und zwei Stunden inkubiert und anschließend mit Pufferlösung und Wasser gespült.
Vorteilhaft werden die Bedingungen der Hybridisierung so gewählt, dass sie nahezu physiologischen Bedingungen entsprechen. Dadurch wird eine bestmögliche molekulare und funktionelle Unversehrtheit von biologischen Wirkstoffen, die an komplementäre Stränge gebunden sind, gewährleistet.
Modulare Systeme zur Immobilisierung von Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten auf metallischen Oberflächen, die auf die oben genannte Weise hergestellt werden können, sind für die Funktionalisierung von Implantatoberflächen in der Medizin mit biologisch aktiven Substanzen geeignet. Weitere Anwendungsmöglichkeiten existieren in der Biotechnologie und Sensorik, d. h. der Funktionalisierung von Sensoroberflächen in der medizinischen, biologischen, molekulargenetischen und biochemischen Analytik mit biologisch aktiven Substanzen, z. B. zur Herstellung von Biochips bzw. DNA-Chips, Microarrays und dergleichen mehr.
Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen modularen Systems für Implantate in der Medizin erlauben die genannten Variationsmöglichkeiten die alternative oder gleichzeitige Beschichtung des Implantats mit Substanzen unterschiedlicher biologischer Wirksamkeit, wie beispielsweise Zytokinen, Botenstoffen, Antikörpern.
Vorteilhaft kann das Freisetzungsverhalten dieser Wirkstoffe durch Variation in der Hybridstabilität beeinflusst werden. Die gleichzeitige oder zeitlich versetzte Freisetzung eines oder mehrerer Wirkstoffe von ein und derselben Oberfläche ist dadurch möglich.
Eine denkbare medizinische Anwendungsmöglichkeit ist die osteoinduktive Ausrüstung einer Implantatoberfläche mit dem „bone morphogenetic Protein” Typ 4 (BMP-4) als an die Nukleinsäuren gekoppeltem Wirkstoff.
Eine andere Anwendungsmöglichkeit ist die Beschichtung der Implantatoberfläche mit dem die Zellproliferation positiv beeinflussenden Wachstumsfaktor TGF-β (tissue growth factor Beta) als an die Nukleinsäuren gekoppeltem Wirkstoff.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen. Es zeigen:
1: ein modulares System zur Immobilisierung von Nukleinsäuren und Nukleinsäurederivaten an metallischen Oberflächen mit Darstellung der Adsorption und Immobilisierung sowie der anschließenden Hybridisierung der Ankerstränge (1a, 1b und 1c),
2: ein Fließschema eines Verfahrens zur Herstellung eines modularen Systems zur Immobilisierung von Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten auf einer metallischen Oberfläche,
3a: die Belegungsdichte des Funktionalisierungsstranges nach der Probenbehandlung entsprechend der Ausführungsbeispiele I bis III, und
3b: die Belegungsdichte des Nonsensestranges (3b) nach der Probenbehandlung entsprechend der Ausführungsbeispiele I bis III.
Gemäß den 1a, 1b und 1c besitzt ein modulares System 1 mit immobilisierten Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten an metallischen Oberflächen eine metallische Oberfläche 2 (Ventilmetalllegierung) mit einer dünnen nativen Metalloxidschicht 3 (native Oxidschicht). In diese Metalloxidschicht 3 sind die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate 4 mit ihren terminalen Molekülbereichen eingebaut, wobei die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate 4 an ihrem 5'- oder 3'-Terminus anionische Gruppen 5 tragen. Diese anionische Gruppen 5 tragenden terminalen Bereiche 6 der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate 4 befinden sich fest fixiert innerhalb der Metalloxidschicht 3, wodurch die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate 4 stabil gebunden sind und als Ankerstränge 7 für eine Hybridisierung mit komplementären Funktionalisierungssträngen 11 zur Verfügung stehen.
Entsprechend 1 ist ein Teil des aus Ankerstrang 7 und Stabilisierungsstrang 9 bestehenden Ankerstrang-Systems in dem Nukleinsäure-Bereich, dessen terminale Nukleotide in der Metalloxidschicht 3 eingebaut sind, doppelsträngig ausgebildet. An jedem Ankerstrang 7 ist im Stabilisationsbereich 8 ein komplementärer Stabilisationsstrang 9 durch Hybridisierung gebunden, so dass der Ankerstrang 7 mit dem Stabilisationsstrang 9 als helikaler Doppelstrang in der Metalloxidschicht 3 fixiert ist. Gemäß 1 befinden sich an den Einzelstrangtermini 6a, 6b, die einerseits zu den Ankersträngen 7 und andererseits zu den Stabilisationssträngen 9 gehören, jeweils anionische Gruppen 5. Der andere Teil des in 1 dargestellten Ankerstrang-Systems besitzt dagegen keinen Stabilisationsstrang 9 und ist daher komplett einzelsträngig ausgebildet. Infolge der relativ freien Beweglichkeit der Einzelstränge findet die Adsorption, statt wie gewünscht ausschließlich über die terminalen anionischen Gruppen, bereits über das Zucker-Phosphat-Rückgrat und/oder über die Basen statt. Ein Stabilisationsstrang 9 schränkt die Flexibilität des Ankerstranges 7 in der Weise ein, dass der Ankerstrang 7 im Stabilisationsbereich 8 im Wesentlichen senkrecht ausgerichtet ist.
Bei der Verdickung der Metalloxidschicht 3 (anodische Oxidschicht) während der Immobilisierung kann es daher dazu kommen, dass zahlreiche einzelsträngige Ankerstränge 7, wie in 1 dargestellt, samt ihres Funktionalisierungsbereiches 10 von der Metalloxidschicht 3 regelrecht „verschluckt” werden und für eine Hybridisierung somit nicht mehr zur Verfügung stehen.
Letzteres wird bei den Ankersträngen 7 mit dem doppelhelikalen Stabilisierungsbereich 8 durch deren eingeschränkte Flexibilität verhindert, so dass eine Hybridisierung des Funktionalisierungsbereichs 10 mit Funktionalisierungssträngen 11 auch nach der Immobilisierung dieser Ankerstränge 7 und der Verdickung der Metalloxidschicht 3 (anodische Oxidschicht) möglich ist. Die komplementären Funktionalisierungsstränge 11 dienen der Modifikation der Metalloberfläche 2 mit verschiedensten biologischen und chemischen Wirkstoffen 12, welche zuvor kovalent an die komplementären Funktionalisierungsstränge 11 gebunden wurden.
In 2 ist ein Fließschema eines Verfahrens zur Herstellung eines modularen Systems 1 zur Immobilisierung von Nukleinsäuren und Nukleinsäurederivaten 4 an metallischen Oberflächen 2 dargestellt. Dabei wird die Beschichtung der metallischen Oberfläche 2 einerseits zunächst durch die mechanische Bearbeitung und chemische Behandlung, beispielsweise durch einen Ätzprozess, vorbereitet. Andererseits erfolgt eine Hybridisierung der Ankerstränge 7, AS mit den Stabilisierungssträngen 9, StS, so dass der Ankerstrang 7, AS, einen Stabilisationsbereich 8 besitzt, wie auch in 1 dargestellt. Im nächsten Schritt gemäß 2 findet dann die Beschichtung der Oberfläche mit Ankersträngen 7, AS, und die anschließende Funktionalisierung mit Funktionalisierungssträngen 11, FS, statt.
Anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele I bis III werden diese Verfahrenschritte der Beschichtung der Oberfläche mit Ankersträngen AS, 7, und Funktionalisierung der Oberfläche gemäß 2 näher erläutert. Ausführungsbeispiel I entspricht weitestgehend der in DE 102 32 139 A1 beschriebenen Vorgehensweise. Ausführungsbeispiele II und III stellen Modifizierungen des Verfahrens dar, bei denen Radikalfänger und Komplexbildner als Einzelkomponenten (Ausführungsbeispiel II) und in Kombination (Ausführungsbeispiel III) während der Immobilisierung des Ankerstranges 7, AS, zugesetzt wurden.
Die in den folgenden Ausführungsbeispielen für das Verfahren verwendeten DNA-Oligonukleotide wurden von der Firma Thermo Electron GmbH Ulm bezogen. Zur Detektion und Quantifizierung der an die metallischen Oberflächen 2 gebundenen Stoffmengen wurden die Stränge 7, 9, 10 teilweise im Phosphat-Zucker-Rückgrat bzw. an der terminalen Phosphatgruppe durch die Firma Hartmann Analytic GmbH Braunschweig mit ³²P radioaktiv markiert. Die Sequenzen und Positionen für die radioaktive Markierung sind nachfolgend angegeben. Ankerstrang 7, AS:
→ radioaktive Markierung am 5'-Phosphat (*) oder 3'-terminal zwischen Nukleotid 59 und 60 (**). Stabilisierungsstrang 9, StS:
→ keine radioaktive Markierung. Funktionalisierungsstrang 10, FS:
→ radioaktive Markierung 3'-terminal zwischen Nukleotid 30 und 31 (**). Nonsensestrang NS (Negativkontrolle):
→ radioaktive Markierung 3'-terminal zwischen Nukleotid 30 und 31 (**).
Probenvorbehandlung, Vorbereitung der Beschichtung:
Eine scheibenförmige Probe aus Ti6Al7Nb mit einem Durchmesser von 16 mm und einer Dicke von 2 mm wird geschliffen (Körnung P600), in einer Lösung aus 0,4 mol/l HF und 1 mol/l HNO₃ für 2 min geätzt und danach mit sterilem Wasser für 30 min im Ultraschallbad gereinigt. Bis zur Verwendung werden die Proben in sterilem Wasser gelagert.
Ausführungsbeispiel I:
I a) Immobilisierung der Ankerstränge 7, AS
Eine vorbereitete Probe wird als Substratelektrode in eine geeignete elektrochemische Messzelle mit einem Mindestvolumen von 3 ml eingebracht, so dass die zu beschichtende metallische Oberfläche 2 der Probe horizontal nach oben zeigt.
800 μl einer 400 nmol/Liter Lösung des 5'-phosphorylierten Ankerstrangs 7, AS, in sterilem Acetatpuffer (0,04 mol/Liter, pH = 4) wird bei 95°C denaturiert und für mindestens 5 min auf Eis gestellt. Anschließend wird diese Lösung auf die Probe gegeben.
Nach einer Adsorptionsdauer von 15 min bei Raumtemperatur wird die Messzelle mit 0,04 mol/Liter Acetatpuffer (pH = 4,0) auf 3 ml aufgefüllt und mit einer Gold-Gegenelektrode und einer Silber/Silberchloridelektrode als Bezugselektrode zu einer Drei-Elektroden-Anordnung komplettiert.
Innerhalb einer Minute nach Auffüllen der Messzelle wird die Probe mit 8 V_SCE für 100 s anodisch polarisiert. Anschließend wird die gesamte Zelle dreimal für 2 min mit 3 ml 0,04 mol/Liter Acetatpuffer gespült.
Um nicht ausreichend fest in die Metalloxidschicht 3 eingebaute bzw. im Zeitraum zwischen Ende der anodischen Polarisation und Spülung der Messzelle lediglich durch unspezifische Adsorption gebundene Ankerstränge zu entfernen, wird die Probe bis zu 24 h in 3 ml PBS (Phosphate Buffered Saline) bei pH = 7,5 gewaschen, wobei nach 15, 30 und 60 Minuten ein Wechsel der Waschlösung erfolgt.
I b) Hybridisierung mit radioaktiv markierten Gegensträngen:
Eine 400 nmol/Liter Lösung des Funktionalisierungsstranges 11, FS, in sterilem PBS (50 mmol/Liter; pH = 7,5) wird bei 95°C denaturiert und anschließend für mindestens 5 min auf Eis gestellt.
Von der auf diese Weise vorbereiteten Lösung werden 100 μl auf die gemäß dem Ausführungsbeispiel I a) hergestellte Probe gegeben und für eine Stunde lang dort belassen. Anschließend wird dreimal mit 3 ml PBS (50 mmol/Liter, pH = 7,5) und einmal mit 3 ml sterilem Wasser gespült und steril und staubfrei an der Luft getrocknet. Der Hybridisierungsschritt kann wiederholt werden (z. B. mit einer Dauer von 24 Stunden), um die Absättigung von Ankersträngen 7, AS, mit Funktionalisierungssträngen 11, FS, zu erhöhen. Am Ende der Behandlung sollte durch Lagern der Probe in 3 ml PBS (50 mmol/Liter, pH = 7,5) bei 37°C für eine Stunde unspezifisch an die metallische Oberfläche 2 gebundener (nicht hybridisierter) bzw. infolge Schädigung von Ankersträngen 7, AS, instabil gebundener Funktionalisierungsstränge 11, FS, desorbiert werden.
Nach jedem Hybridisierungsschritt und nach der abschließenden Desorption kann die Zählrate des ³²P und bei entsprechender Kalibrierung daraus die gebundene Stoffmenge an den Funktionalisierungssträngen 11, FS, mit Hilfe eines Strahlungsmessgerätes (z. B. eines PIPS-basierten Betaspektrometers) bestimmt werden.
Ausführungsbeispiel II:
Eine vorbereitete Probe wird analog zu Ausführungsbeispiel I behandelt, mit dem Unterschied, dass die Adsorptionslösung und der zum Auffüllen verwendete Acetatpuffer entweder 10 mmol/Liter EDTA als Komplexbildner oder 10 mmol/Liter Ascorbinsäure als Radikalfänger enthalten.
Ausführungsbeispiel III:
Eine vorbereitete Probe wird analog zu Ausführungsbeispiel I behandelt, wobei die Adsorptionslösung und der zum Auffüllen verwendete Acetatpuffer 10 mmol/Liter EDTA und 10 mmol/Liter Ascorbinsäure (Kombination aus Komplexbildner und Radikalfänger) enthalten.
Vergleich der nach den Ausführungsbeispielen I–III behandelten Proben:
In 3a sind die Belegungsdichten nach den Hybridisierungsschritten und der abschließenden Desorption der entsprechend den Ausführungsbeispielen I–III behandelten Proben dargestellt. Für jeden Balken wurden drei Proben hergestellt; die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung der Messwerte. Um eine unspezifische Bindung des Funktionalisierungsstrangs FS an die metallische Oberfläche 2 auszuschließen, wurden für 3b bei sonst analoger Probenbehandlung statt des zu Ankersträngen AS komplementären Funktionalisierungsstranges FS ein nicht komplementärer Nonsensestrang NS als Negativkontrolle verwendet.
Es zeigt sich, dass bei Immobilisierung von Ankersträngen AS ohne Zusatz von Radikalfängern und Komplexbildnern nur in der initialen Phase der Hybridisierung (eine Stunde lang) eine größere Stoffmenge an Funktionalisierungssträngen FS im Vergleich zu den anderen Zuständen gebunden wird. Bei Zugabe von Radikalfängern oder Komplexbildnern als Einzelkomponenten ist eine Inhibierung der Bindung von Funktionalisierungssträngen FS zu beobachten. Ausschließlich bei Kombination von Radikalfängern und Komplexbildnern ist sowohl eine deutliche Steigerung der Belegungsdichte als auch eine verbesserte Stabilität von Funktionalisierungssträngen FS nachweisbar. Aus der gleich bleibend niedrigen Belegungsdichte von Nonsensesträngen NS lässt sich ableiten, dass die detektierte Stoffmenge an Funktionalisierungssträngen FS durch Hybridisierung an die metallische Oberfläche 2 gebunden wurde, eine unspezifische Bindung also vernachlässigbar ist.
Zusammengefasst wird im erfindungsgemäßen System eine erhöhte Wechselwirkungsstabilität durch zwei Verankerungspunkte auf der Metalloberfläche 2 erreicht. Weiterhin wird die Steifheit der hybridisierbaren Ankerstränge 7 gegen Abknicken signifikant erhöht. Auch die Stabilität der Ankerstränge 7 bei Strangbruch ist deutlich erhöht, da rein statistisch eine doppelte Sicherheit durch den zusätzlichen und parallel wirkenden Stabilisierungsstrang 9 erreicht wird.
Besonders vorteilhaft ist zudem, dass die Hybridisierung aufgrund der Anwesenheit des helikalen Doppelstrangs am Stabilisationsbereich 8, der sich in Nachbarschaft zum Funktionalisierungsbereich 8 befindet, besser initiiert wird.

1: modulares System
2: metallische Oberfläche, Metallschicht, Metalloberfläche
3: Metalloxidschicht
4: Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate
5: anionische Gruppen
6: terminale Bereiche
6a: Einzelstrangtermini
6b: Einzelstrangtermini
7: Ankerstränge
8: Stabilisationsbereich
9: Stabilisationsstrang
10: Funktionalisierungsbereich
11: Funktionalisierungsstrang
12: Wirkstoff
AS: Ankerstrang
FS: Funktionalisierungsstrang
NS: Nonsensestrang
StS: Stabilisierungsstrang

SEQUENCE LISTING

Claims

Modulares System mit immobilisierten Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten an metallischen Oberflächen, wobei – die metallische Oberfläche (2) mit einer Metalloxidschicht (3) versehen ist, in die die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) eingebaut sind, – die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) an ihrem 5'- oder 3'-Terminus anionische Gruppen (5) tragen, – die anionische Gruppen (5) tragenden terminalen Bereiche (6) der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) sich innerhalb der Metalloxidschicht (3) befinden, wodurch Ankerstränge (7) gebildet werden, dadurch gekennzeichnet, dass an jedem Ankerstrang (7) im Stabilisationsbereich (8) ein komplementärer Stabilisationsstrang (9) gebunden ist und dass der Ankerstrang (7) mit dem Stabilisationsstrang (9) als Doppelstrangbereich in der Metalloxidschicht (3) fixiert ist, wobei der auf der Metalloberfläche (2) fixierte Terminus bereits ein doppelsträngiges Hybrid darstellt, während der der Metalloxidschicht (3) abgewandte Funktionalisierungsbereich (10) des Ankerstrangs (7) einzelsträngig ausgebildet ist.
Modulares System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ankerstrang (7) und der Stabilisationsstrang (9) an beiden Einzelstrangtermini (6a, 6b) des einzubauenden Endes anionische Gruppen (5) aufweisen.
Modulares System nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Ankerstrang (7) und der Stabilisationsstrang (9) an beiden Einzelstrangtermini (6a, 6b) des einzubauenden Endes die gleichen anionischen Gruppen (5) aufweisen.
Modulares System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als anionische Gruppen (5) an den Termini der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) Phosphat-, Phosphonat-, Sulfat- oder Sulfonatgruppen vorgesehen sind.
Modulares System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallschicht (2) auf einem nichtmetallischen Substrat oder das Substrat selbst aus einem Ventilmetall oder einer Ventilmetalllegierung besteht.
Modulares System nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallschicht (2) auf einem nichtmetallischen Substrat oder das Substrat selbst aus Aluminium, Titan, Tantal, Zirkonium oder Niob oder Legierungen daraus, einschließlich intermetallischer Phasen eines oder mehrerer der genannten Metalle, besteht.
Modulares System nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA) oder Peptidische Nukleinsäuren (PNA) oder aus diesen Grundstrukturen (DNA, RNA oder PNA) ableitbare Modifikationen, wie „Locked Nucleic Acids” (LNA), „Hexitol Nucleic Acids” (HNA), oder gemischte Moleküle aus diesen sind.
Modulares System nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) zusätzliche Modifikationen des Zucker- Phosphat-Rückgrates wie Phosphothioat- oder O-Methylgruppen und/oder unkonventionelle Basen wie Inosin enthalten.
Modulares System nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass durch Hybridisierung eine Funktionalisierung vorliegt, bei der an den Einzelstrang-Abschnitten der Ankerstränge (7) am Funktionalisierungsbereich (10) komplementäre Nukleinsäurestränge durch komplementäre Basenpaarung gebunden sind.
Modulares System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass an die komplementären Nukleinsäurestränge Wirkstoffe wie anorganische oder organische oder biochemische Moleküle oder Zell- oder Gewebekomponenten gebunden sind.
Modulares System nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der an der Metalloberfläche (2) immobilisierte Strang und der zu diesem jeweils komplementäre Strang miteinander kovalent verbunden sind.
Verfahren zur Herstellung eines modularen Systems zur Immobilisierung von Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivaten (4) auf einer metallischen Oberfläche (2), dadurch gekennzeichnet, dass a) an jedem Ankerstrang (7) im Stabilisationsbereich (8) ein komplementärer Stabilisationsstrang (9) ausgebildet wird, während der außerhalb des Stabilisationsbereichs (8) liegende Funktionalisierungsbereich (10) des Ankerstrangs (7) einzelsträngig ausgebildet ist und dass b) der durch den Ankerstrang (7) mit dem komplementären Stabilisationsstrang (9) gebildete helikale Doppelstrang mit seinem anionische Gruppen (5) aufweisenden terminalen Molekülbereich (6a, 6b) durch elektrostatische Interaktion auf der Metalloxidschicht (3) adsorbiert wird und dass c) zeitgleich dazu oder anschließend mittels anodischer Polarisation in einer Elektrolytlösung mit einem pH-Wert im Bereich zwischen pH 3 und pH 6 ein Wachstum der Metalloxidschicht (3) und dabei ein orientierter terminaler Einbau der Ankerstränge (7) in die Metalloxidschicht (3) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert pH 4,0 ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das erreichte Potenzial auf einen Wert zwischen 2 und 200 V_SCE begrenzt wird, der das Wachstum der Oxidschicht in einen für andere Prozesse notwendigen Erkennungsbereich der Nukleinsäure verhindert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder während der Immobilisierung Komplexbildner zugesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Komplexbildner EDTA, Oxalat, Citrat zugesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder während der Immobilisierung Radikalfänger zugesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Radikalfänger Ascorbinsäure, Chinon/Hydrochinon, Carotinoide, Flavonoide zugesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Funktionalisierung durch Hybridisierung erfolgt, bei der an den Einzelstrang-Abschnitten der Ankerstränge (7) komplementäre Nukleinsäurestränge durch komplementäre Basenpaarung gebunden werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert und die Ionenstärke zur Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuren an den Ankerstrang (7) so gewählt werden, dass die Metall-Metalloxidoberfläche negativ geladen und das Rückgrat der Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäurederivate (4) negativ geladen oder ungeladen ist.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren bei einer Ionenstärke im Bereich von 0,1 bis 1,5 mol/Liter und einem pH-Wert im Bereich pH 7,0 bis 7,5 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass an die komplementären Nukleinsäurestränge Wirkstoffe wie anorganische oder organische oder biochemische Moleküle oder Zell- oder Gewebekomponenten gebunden werden.
Verwendung eines Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Funktionalisierung von Implantatoberflächen in der Medizin mit biologisch aktiven Substanzen.
Verwendung eines Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Funktionalisierung von Sensoroberflächen in der medizinischen, biologischen, molekulargenetischen und biochemischen Analytik mit biologisch aktiven Substanzen zur Herstellung von Biochips und Microarrays.