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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Spektralfilter-Set für LED-basierte
Mikroskopbeleuchtungen, insbesondere zur effektiven Durchführung von Fluoreszenzuntersuchungen.
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Nach
dem Stand der Technik bestehen bekannte Fluoreszenzeinrichtungen
an Lichtmikroskopen aus einer Lichtquelle, die in der Regel ein
multispektrales, kontinuierliches Spektrum (Xenonlampen – XBO) oder
ein Linienspektrum (Quecksilberhöchstdrucklampen – HBO) hoher
Intensität
emittiert, einem Auflichtstrahlengang mit Anregungsfilter, einem Strahlteiler,
zur Einkopplung des Anregungslichts in den Abbildungsstrahlengang
und einem Emissionsfilter im Abbildungsstrahlengang. Die Durchlass-
und Sperrbereiche von Anregungsfilter, Strahlteiler und Emissionsfilter
sind so angelegt, dass mit dem ausgewählten Spektralbereich der Lichtquelle
eine möglichst
effiziente Anregung und Detektion eines oder mehrerer Fluorophore
stattfindet.
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Die
im Beleuchtungsstrahlengang positionierten Anregungsfilter haben
eine möglichst
hohe Transmission für
die Wellenlängen,
welche die Fluoreszenz anregen, wobei insbesondere längenwellige Strahlung
zurückgehalten
wird. Die im Abbildungsstrahlengang positionierten Sperrfilter haben
hingegen eine hohe Transmission für die energieärmeren, längeren Wellenlängen des
Fluoreszenzlichts, wobei insbesondere das energiereiche Anregungslicht möglichst
vollständig
eliminiert wird. Die verwendeten Filter haben somit die Aufgabe,
die erwünschten Wellenlängen voll
durchzulassen und die unennrünschten
möglichst
vollständig
zu sperren. Erschwerend ist hierbei, dass die Intensitäten von
Anregungslichts und Emissionslicht sehr unterschiedlich ist. Während das
Anregungslicht hoher Intensität vom
mikroskopischen Bild fernzuhalten ist, muss das intensitätsarme Emissionslicht
möglichst
vollständig ankommen.
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Dazu
müssen
die Anregungsfilter alle anderen als den gewünschten Wellenlängenbereich
effizient unterdrücken,
wozu eine sehr hohe optische Dichte (OD > 5) im Sperrbereich notwendig. Gleiches gilt
für den
Sperrbereich von Strahlteiler und Emissionsfilter. Gleichzeitig
müssen
die Filter möglichst steile
Flanken haben, damit die Wellenlängenbereiche
von Anregung und Emission optimal genutzt werden können.
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Filter
die diese Voraussetzungen hinsichtlich der optischen Dichte und
der Flankensteilheit erfüllen sind
in ihrer Herstellung sehr aufwendig und teuer. Andererseits führt aber
eine zu geringe optische Dichte zum sogenannten „Durchschlagen" von nicht erwünschten
Wellenlängen
auf die Probe und den Detektor. Eine zu geringe Flankensteilheit
bei spektral dicht benachbarten Filtern kann zu Überschneidungen im Durchlassbereich,
dem sogenannten „Cross-talk" führen, wodurch
es zum Übersprechen von
Anregungslicht in das Band des Emissionslichts kommt. Das Fluoreszenzbild
verliert dadurch an Kontrast und durch Falschlicht entstehen Artefakte
im Bild.
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Um
ein möglich
kontrastreiches Fluoreszenzbild zu erhalten ist es zwar möglich die
Intensität der
Beleuchtungslichtquelle zu erhöhen,
allerdings führt
dies auch zu einer Erhöhung
der Intensität
in den Sperrbereichen und somit zu einer Verschlechterung des Signal/Rausch-Verhältnisses
im Bild und zu einer Begrenzung bei der Belichtungszeit.
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Ein
möglich
kontrastreiches Fluoreszenzbild erhält man, wenn die im Mikroskop
verwendeten Linsen, Filter und Immersionsflüssigkeiten zum einen über keine
Eigenfluoreszenz verfügen
und zum anderen die für
Fluoreszenz geeigneten Objektive bis in den nahen UV-Bereich eine
hohe Transmission aufweisen.
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Da
die im Präparat
angeregte Fluoreszenz in alle Richtungen abgestrahlt wird, ist es
besonders wichtig, möglicht
viel davon "einzusammeln". Dazu werden Objektive
mit einem großen Öffnungswinkel verwendet.
Mit einer verdoppelten Apertur des Objektivs kann etwa viermal mehr
Fluoreszenzlicht einfangen werden. Durch den zusätzlichen Einsatz von Immersionsflüssigkeiten,
insbesonde re Öl
lassen sich zusätzliche
Lichtverluste durch Lichtreflexe an den Oberflächen beseitigen.
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Nach
dem Stand der Technik sind bereits LED-basierte Beleuchtungseinheiten
für Mikroskope bekannt,
bei denen eine Wellenlängenselektion durch
dichroitische Strahlteiler und/oder Filter erfolgt.
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So
beschreibt die
US 6,154,282
A eine LED-basierte Beleuchtungseinheit für Fluoreszenz- und
Phosphoreszenz-Mikroskope, bei der das von den LED's emittierte Licht über dichroitische Strahlteiler
in den Strahlengang eingekoppelt wird. Weiterhin ist auch hier die
Verwendung von Filtern für die
Selektion der Anregungs- und Emissionswellenlängen vorgesehen. Durch entsprechende
Auswahl der zum Ausstrahlen eines Anregungslichtes innerhalb eines
vorgewählten
Wellenlängenbandes
fähigen
Beleuchtungsquelle kann diese an die Eigenschaften des Fluoreszenz-
oder Phosphoreszenzfarbstoffes in der Probe angepasst werden.
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Mit
dieser Lösung
wird eine Belichtungseinheit zur Anregung von Fluoreszenz und/oder
Phosphoreszenz zur Verfügung
gestellt, die eine lange Lebensdauer hat und verhältnismäßig preiswert
ist. Außerdem
ist eine Intensitätsmodulation
der Belichtungsquelle ohne mechanische Blenden und/oder optische
Filter möglich.
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In
der
US 4,852,985 A1 wird
eine Beleuchtungseinheit für
Mikroskope beschrieben, bei der als Beleuchtungsquelle mehrere LED's bzw. LED-Arrays verwendet
werden. Die Einkopplung des von den monochromen LED's emittierten Lichtes
dreier unterschiedlicher Wellenlängen
in den optischen Strahlengang erfolgt über Strahlteiler, wobei die
verschiedenfarbigen Lichtanteile übereinander gekoppelt werden.
Dabei sind alle gleichfarbig emittierenden LED's zu Gruppen zusammengefasst und in
einer zu einer Kondensorlinse des Mikroskops konjugierten Ebene, konzentrisch
zur optischen Achse der Beleuchtungsvorrichtung angeordnet.
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Mit
der hier beschriebenen Lösung
wird eine Belichtungseinheit zur Verfügung gestellt, mit der verschiedene
Beleuchtungsarten, wie Hellfeld-, Dunkelfeld- und Schräglichtbeleuchtung
sowie ringförmige
Beleuchtungen für
mikroskopische Anwendungen auf einfache Art realisiert werden können.
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Bei
dem in der
JP 7333516
A beschriebenen Fluoreszenzmikroskop wird eine Probe von
mehreren Lichtquellen, die Anregungslicht einer über dichroitische Spiegel separierten
Wellenlänge
emittieren, beleuchtet. Das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht
wird ebenfalls wellenlängenmäßig separiert
und detektiert. Durch die wellenlängenmäßige Aufspaltung des Fluoreszenlichtes,
bei gleichzeitiger Herausfilterung des Anregungslichtes, können Fluoreszenzbilder
hoher Helligkeit erzeugt werden.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Eigenschaften
der Filter derart an die Lichtquelle bzw. das Emissionslicht anzupassen, dass
durch eine hohe Flankensteilheit und Transmission in den Durchlassbereichen
und eine ausreichende optische Dichte in den Sperrbereichen Fluoreszenzbilder
mit hohem Kontrast und verbessertem Signal/Rausch-Verhältnis erzeugt
werden können.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte
Weiterbildungen und Ausgestaltungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Obwohl
die vorgeschlagene Lösung
eines Spektralfilter-Sets für
LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen insbesondere für Mikroskope
zur Durchführung
von Fluoreszenzuntersuchungen vorgesehen ist, wäre eine Verwendung auch dort
sinnvoll, wo das Licht einer ohnehin schon schmalbandigen Beleuchtungsquelle
zusätzlich
eingegrenzt werden soll und/oder um störende Lichteffekte durch Fremdlicht zu
unterdrücken.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben.
Dazu zeigen
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1:
den grafischen Verlauf der Transmission über der Wellenlänge für ein Spektralfilter-Sets bei
multispektraler Beleuchtung,
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2:
den grafischen Verlauf der Transmission über der Wellenlänge für ein Spektralfilter-Sets bei
LED-basierter Beleuchtung,
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3: ein inverses Fluoreszenzbild und den Grauwerteverlauf
für eine
multispektral beleuchtete Probe und
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4: ein inverses Fluoreszenzbild und den Grauwerteverlauf
für eine
schmalbandig beleuchtete Probe.
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Bei
dem erfindungsgemäßen, aus
einem im Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops angeordneten Anregungsfilter,
einem Strahlteiler zur Einkopplung des Anregungslichts in den Abbildungsstrahlengang
und einem im Abbildungsstrahlengang angeordneten Emissionsfilter
bestehenden Spektralfilter-Set für
LED-basierte Mikroskopbeleuchtungen zur Durchführung von Fluoreszenzuntersuchungen, ist
das Anregungsfilter als Bandpassfilter, der Strahlteiler spektralselektiv,
mit einem Transmissionsbereich außerhalb des Bandpassbereiches
des Anregungsfilters und das Emissionsfilter mit einem, dem Emissionsspektrum
entsprechenden Transmissionsbereich ausgebildet. Dabei können insbesondere
durch Anpassung an die LED-basierte Mikroskopbeleuchtung Anregungsfilter
mit einer höheren Transmission
und einer steileren Flanke im Durchlassbereich, sowie geringeren
Anforderungen an die optische Dichte OD im Sperrbereich und Emissionsfilter
mit einer hohen optischen Dichte OD im Bereich der Beleuchtungsstrahlung
verwendet werden.
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Von
der LED-basierten Mikroskopbeleuchtung wird Licht mit einer Bandbreite
von etwa 10nm bis 100nm, vorzugsweise 30–50nm abgestrahlt. Aus diesem Licht
mit bereits sehr schmaler Bandbreite wird mit Hilfe eines als Bandpassfilter
ausgelegtes Anregungsfilters unerwünschtes Restlicht herausgefiltert,
so dass das Lichtband der Mikroskopbeleuchtung nur noch eine Breits
von etwa 20–40
nm aufweist.
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Diese
sehr schmalbandige Beleuchtungsstrahlung wird über den im Abbildungsstrahlengang angeordneten
spektralselektiven Strahlteiler in diesen eingekoppelt und auf die
zu untersuchende Probe geleitet. Der spektralselektive Strahlteiler
weist dazu einen Transmissionsbereich außerhalb des Bandpassbereiches
des Anregungsfilters auf.
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In
der Probe wird durch die als Anregungsstrahlung dienende schmalbandige
Beleuchtungsstrahlung Fluoreszenz ausgelöst. Diese Fluoreszenzstrahlung
geringer Intensität
wird über
den Transmissionsbereich des spektralselektiven Strahlteiler auf
eine Bildausgabeeinheit, die ein Detektor und/oder ein Okular sein
kann, abgebildet.
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Von
der Probe wird allerdings nicht nur Fluoreszenzstrahlung emittiert,
sondern auch Beleuchtungsstrahlung reflektiert. Die reflektierte
Beleuchtungsstrahlung ist aus dem Abbildungsstrahlengang zu eliminieren
um auf der Bildausgabeeinheit ein reines Fluoreszenzbild zu erhalten.
Dazu wird im Abbildungsstrahlengang ein Emissionsfilter angeordnet, dessen
Sperrbereich auf die Beleuchtungsstrahlung abgestimmt ist und dessen
optische Dichte OD im gesamten Bereich der Beleuchtungsstrahlung
hoch ist.
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Dazu
zeigt 1 den grafischen Verlauf der Transmission über der
Wellenlänge
für ein
Spektralfilter-Set bei multispektraler Beleuchtung. Hierbei wird
von der Mikroskopbeleuchtung eine multispektrale Beleuchtung in
Form eines kontinuierlichen bzw. Linienspektrums abgestrahlt. Da
hierbei ein kontinuierliches bzw. Linienspektrum gleicher oder ähnlicher Intensität gleichzeitig
abgestrahlt wird, müssen
alle nicht erwünschten
Wellenlängen
auch hier durch ein Anregungsfilter unterdrückt werden. Allerdings sind die
Anforderungen an dessen Sperrbereich durch die zu unterdrückenden,
intensitätsreichen
Wellenlängen
doch recht hoch.
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Da
von einem Anregungsfilter alle anderen als der gewünschte Wellenlängenbereich
effizient unterdrückt
werden soll, ist in dessen Sperrbereich eine sehr hohe optische
Dichte von OD > 5
notwendig. Gleiches gilt hierbei für den Strahlteiler und das Emissionsfilter.
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In 1 ist
der grafische Verlauf der Transmission für das Anregungsfilter 1,
den Strahlteiler 2 und das Emissionsfilter 3 bei
multispektraler Beleuchtung dargestellt. Das von der Beleuchtungsquelle
abgestrahlte, multispektrale Licht wird durch das Anregungsfilter 1 auf
die Wellenlängen
des Transmissionsbereiches 4 eingeschränkt. Für das Anregungsfilter 1 bestehen
entsprechend hohe Anforderungen an die optische Dichte OD in den
Sperrbereichen 5 und 6 unter- und oberhalb des
Transmissionsbereiches 4. Durch die Darstellung eines Spektralbereiches
von 300–750nm
soll die erforderliche hohe Flankensteilheit für das Anregungsfilter 1 hervorgehoben
werden. Je schmaler dieser Bereich ist, desto steiler muss die Flankensteilheit
des Filters ausgeprägt
sein.
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Der
sehr komplexe, schichtenweise Aufbau eines für das Anregungsfilter 1,
den Strahlteiler 2 und auch das Emissionsfilter 3 für multispektrale
Beleuchtung kann dazu führen,
dass auch außerhalb der
definierten Transmissionsbereiche Lichtdurchlässe auftreten. Im Transmissionsverlauf
des Strahlteilers 2 zeigt 1 dazu einen
undefinierten Durchlassbereich 7, der sich mit unter nicht
vermeiden lässt.
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2 zeigt
hingegen den grafischen Verlauf der Transmission über der
Wellenlänge
für ein
Spektralfilter-Sets bei LED-basierter Beleuchtung.
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Hierbei
wird von der LED-basierter Mikroskopbeleuchtung ein schmalbandiges
Beleuchtungsspektrum (440–540nm)
mit einer Bandbreite von 100nm abgestrahlt. Von dem als Bandpassfilter
mit einer Bandbreite von etwa 40nm ausge legten Anregungsfilter wird
nur das unerwünschte
Restlicht herausgefiltert. Durch Anpassung an die LED-basierte Mikroskopbeleuchtung
hat das Anregungsfilter eine höhere
Transmission und eine steilere Flanke im Durchlassbereich, sowie
geringeren Anforderungen an die optische Dichte OD im Sperrbereich
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Auch
hier wird diese sehr schmalbandige Beleuchtungsstrahlung über den
im Abbildungsstrahlengang angeordneten spektralselektiven Strahlteiler in
diesen eingekoppelt und auf die zu untersuchende Probe geleitet.
Der spektralselektive Strahlteiler weist dazu einen Transmissionsbereich
außerhalb des
Bandpassbereiches des Anregungsfilters auf.
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Von
der Probe wird Fluoreszenzstrahlung emittiert und Beleuchtungsstrahlung
reflektiert. Um die reflektierte Beleuchtungsstrahlung aus dem Abbildungsstrahlengang
zu eliminieren wird auch hier ein Emissionsfilter angeordnet, dessen
Sperrbereich auf die Beleuchtungsstrahlung abgestimmt ist und dessen
optische Dichte OD im Bereich der Beleuchtungsstrahlung hoch ist,
jedoch in den anderen Sperrbereichen geringer sein kann.
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Die
somit selektierte Fluoreszenzstrahlung geringer Intensität wird über den
Transmissionsbereich des spektralselektiven Strahlteiler auf eine
Bildausgabeeinheit, die ein Detektor und/oder ein Okular sein kann,
abgebildet.
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Die
grafische Darstellung gemäß 2 zeigt den
Verlauf der Transmission für
das Anregungsfilter 1',
den Strahlteiler 2' und
das Emissionsfilter 3' bei schmalbandiger
LED-basierter Beleuchtung. Das von der Beleuchtungsquelle abgestrahlte,
ohnehin schon schmalbandige Licht wird durch das Anregungsfilter 1' nur noch geringfügig auf
die Wellenlängen
des Transmissionsbereiches 4' eingeschränkt. Zur
Verdeutlichung ist hierzu auch das von der LED-basierter Beleuchtungsquelle
abgestrahlte Spektrum 8' dargestellt.
Für das
Anregungsfilter 1' bestehen
hierbei nur in den Sperrbereichen 9' und 10' unter- und oberhalb des Transmissionsbereiches 4' entsprechend
hohe Anforderungen an die optische Dichte OD. In den restlichen
Sperrbereichen 5' und 6' sind die Anforderungen
an die optische Dichte OD wesentlich geringer. Durch die wesentlich
geringeren Anforderungen an die optische Dichte OD in den Sperrbereichen
kann die Flankensteilheit erhöht
und gleichzeitig der komplexe, schichtenweise Aufbau vereinfacht
werden.
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Um
die Vorteile der vorgeschlagenen Lösung zu verdeutlichen zeigt
die 3a das Fluoreszenzbild einer zu untersuchen Probe
und 3b den zugehörigen
Verlauf der Grauwerte entlang der in 3a dargestellten
diagonalen Linie von links oben nach rechts unten. In dem vorliegenden
Fall wurde die Probe mit einer multispektralen Quecksilberhöchstdrucklampe
(HBO) bestrahlt. Zum Einsatz kam weiterhin ein übliches Spektralfilter-Set
zur Blockung der nicht erwünschten
Wellenlängen.
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Im übrigen zeigen
die 3a und 3b Bilder
der Microtuboli von Zellen, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff
angefärbt
sind. Mikrotubuli sind zum einen ein wesentlicher Bestandteil des
Cytoskeletts und somit für
Gestalt und Form der Zelle verantwortlich und zum anderen sind sie
wichtig für die
intrazelluläre
Organisation, den Transport von Vesikeln, das Positionieren von
Organellen und für
die Chromosomen-Trennung während
der Kernteilung.
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Im
Vergleich dazu zeigt die 4a das
Fluoreszenzbild der gleichen zu untersuchen Probe und 4b den
zugehörigen
Verlauf der Grauwerte ebenfalls entlang der in 4a dargestellten
diagonalen Linie, wobei hier die Probe mit einer schmalbandigen
LED-basierten Mikroskopbeleuchtung bestrahlt wurde. Zur Blockung
der nicht erwünschten Wellenlängen kam
hier das erfindungsgemäße Spektralfilter-Set
zum Einsatz.
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Die
in 3a und 4a dargestellten
Fluoreszenzbilder der zu untersuchenden Probe wurden unter sonst
gleichen Bedingungen und unter Verwendung der gleichen Bildausgabeeinheit
in Form einer digitalen Kamera aufgenommen.
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Es
ist zu erkennen, dass der Grauwertebereich in 4b etwa
1,5-mal so groß ist
wie der in 3b. Daraus ergibt sich ein wesentlich
deutlicheres Fluoreszenzbild, da der Hintergrund schwärzer ist
und Strukturen besser adaptieren und voneinander unterschieden werden
können.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Spektralfilter-Set
für LED-basierte
Mikroskopbeleuchtungen wird eine Lösung zur Verfügung gestellt,
mit dem kontrastreiche Fluoreszenzbilder mit verbessertem Signal/Rausch-Verhältnis erzeugt
werden können.
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Während bei
multispektralen Lichtquellen alle nicht erwünschten Wellenlängen unterdrückt werden
müssen
und die dafür
erforderlichen Anforderungen an die entsprechenden Filter sehr hoch sind,
können
bei der vorgeschlagenen technischen Lösung Filter mit weit geringeren
Anforderungen verwendet werden.
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Von
der LED-basierten Mikroskopbeleuchtung kann jedes beliebige Spektrum
als sehr schmalbandiges Band abgestrahlt werden, da die LED's einzeln ansteuer-
und regelbar sind. Durch die LED-basierten Mikroskopbeleuchtung
wird somit nur Anregungslicht der gewünschten Farbe in den Fluoreszenzstrahlengang
eingekoppelt und das Anregungsfilter dient lediglich dazu, unerwünschtes
Restlicht aus dem LED-Spektrum herauszufiltern. Dadurch sind die
Anforderungen an die optische Dichte OD des Anregungsfilters entsprechend
geringer. Da durch das Anregungsfilter kein Licht hoher Intensität herausgefiltert
werden muss, sind wesentlich längere Belichtungszeiten
von bis zu 20 Sekunden möglich, ohne
dass es zu thermischen Reaktionen am Anregungsfilter kommt. Außerdem ist
der Falsch- und Streulichtanteil im Fluosrezenzbild wesentlich geringer
als bei der Verwendung multispektraler Lichtquellen in Verbindung
mit herkömmlichen
Filtersätzen.
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Aufgrund
dessen wurde es möglich
für LED-basierte
Mikroskopbeleuchtungen insbesondere Anregungsfilter zu entwickeln,
die eine höherer Transmission
und Flankensteilheit aufweisen und somit eine wesentlich effektivere
Einkopplung von Anregungslicht ermöglichen, was wiederum zu kontrastreichen
und rauschärmeren
Fluoreszenzbilder führt.
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Die
LED-Filtersätze
mit ihren geringeren Anforderungen an die optische Dichte (OD) im
Sperrbereich sind leichter mit einer hohen Transmission im Durchlassbereich
und einer steileren Flanke herzustellen, als das bei vergleichbaren
herkömmlichen Filtersätzen der
Fall ist, da die Zahl der Schichten kleiner ist. Daher sind die
LED-Filtersätze
weniger aufwendig und kostengünstiger
herstellbar.