DE102006006893B3 - Aspoquinolone, zytotoxische Verbindungen aus Aspergillus nidulans - Google Patents

Aspoquinolone, zytotoxische Verbindungen aus Aspergillus nidulans Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft vier neue Verbindungen (1-4) und ein Verfahren zur Isolation der Substanzen aus Kulturen der Pilzart Aspergillus nidulans. Die Verbindungen 1 und 2 weisen antiproliferative Wirkungen auf. DOLLAR A DOLLAR F1, DOLLAR F2, DOLLAR F3, DOLLAR F4

Description

  • Die Erfindung betrifft vier neue Pilzmetabolite (Aspoquinolone A-D), ein Verfahren zur Isolation dieser Substanzen (1–4) aus Kulturen der Pilzart Aspergillus nidulans und die Verwendung der Substanzen für die Herstellung von antiproliferativen Therapeutika.
  • Sekundärmetabolite von Mikroorganismen und Pflanzen stellen eine wichtige Quelle für die Suche nach neuen Arzneistoffen dar. Etwa ein Drittel der heute verfügbaren Wirkstoffe sind Naturstoffe oder leiten sich von solchen ab. Pharmakotherapeutisch verwendete Pilzmetabolite sind z.B. Penicilline und Cephalosporine (aus Penicillium-Arten), Griseofulvin (Penicillium griseofulvum) und das Immunsuppressivum Cyclosporin A (Tolypocladium inflatum).
  • Aspergillus nidulans ist einer der zur Zeit am stärksten untersuchten filamentösen Pilze und dient als Modellorganismus zur Studie molekular- und zellbiologischer Fragestellungen. Das Genom des Pilzes wurde kürzlich sequenziert, die dadurch verfügbaren genomischen Daten weisen auf potentielle Biosynthesewege für neuartige Sekundärmetabolite hin (W. C. Nierman, G. May, H. S. Kims, M. J. Anderson, D. Chen, D. W. Denning, Med. Mycol. 2005, 43, S3). Die gezielte Isolation dieser Metabolite auf Grundlage genetischer Information ermöglicht eine Charakterisierung ihrer biologischen Aktivität und kann somit zum Auffinden von Leitstrukturen für die Entwicklung neuer Arzneistoffe führen.
    •
  • Aufgabe der Erfindung ist es, neue bioaktive Sekundärmetabolite zur Verfügung zu stellen.
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Kombination einer Analyse des Genoms von Aspergillus nidulans mit einem Screening des Sekundärmetabolitenspektrums unter verschiedenen Fermentationsbedingungen gelöst. Die Herstellung der Substanzen gemäß der Formeln 1–4 erfolgt durch Kultivierung des Pilzstammes Aspergillus nidulans, anschließender Extraktion des Kulturansatzes mit organischen Lösungsmitteln und Isolation der Verbindungen mittels chromatographischer Verfahren.
    •
  • Beschreibung der Herstellung der Substanzen 1-4
  • Der Pilz Aspergillus nidulans wird auf einem festen Reismedium kultiviert. Die Kultivierung erfolgt als Standkultur für 49 Tage bei 25°C. Anschließend wird der Kulturansatz mit organischen Lösungsmitteln (Chloroform, Ethylacetat) extrahiert. Bevorzugt kommt der Pilzstamm Aspergillus nidulans DSM 17772 zum Einsatz. Der Extrakt wird mittels Flash-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Methanol-Gemischen steigender Polarität als Eluenten sowie anschließender Größenausschlußchromatographie an Dextrangelen (Sephadex LH-20) fraktioniert. Eine Endreinigung der Substanzen erfolgt mittels präparativer HPLC unter Verwendung einer RP-18 Phase und Acetonitril/Wasser-Gemischen. Die Substanzen 3 und 4 werden als Diastereomerengemisch gewonnen. Die Struktur der Verbindungen 1–4 wurde durch IR-Spektroskopie, hochaufgelöste Massenspektrometrie und 1D und 2D NMR-Spektroskopie aufgeklärt.
  • Aspoquinolone A (1) und B (2) weisen antiproliferative Wirkung auf L-929 Mausfibroblasten (Gl50 10,6 μg/ml und 11,4 μg/ml) und K-562 Humanleukämiezellen (Gl50 17,8 μg/ml und 21,2 μg/ml) auf.
  • Ausführungsbeispiele
  • Die Kultivierung von Aspergillus nidulans DSM 17772 erfolgt mittels Festphasenfermentation auf Reis. Zur Herstellung des Mediums wird geschälter Reis (500 g) mit destilliertem Wasser zwei Stunden quellen gelassen. Anschließend wird ausreichend Wasser ergänzt, um den Reis gleichmäßig zu durchfeuchten. Das Medium wird sterilisiert und anschließend mit Stücken einer Agarplattenkultur des Pilzes beimpft. Die Kultivierung erfolgt als Standkultur bei 25 °C für 7 Wochen.
  • Die Extraktion der Kultur erfolgt durch Mazeration mit Chloroform (3 × 800 ml). Die vereinigten Extrakte werden getrocknet (Natriumsulfat) und eingeengt. Der Rohextrakt (5 g) wird mittels Flash-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Chloroform/Methanol-Gemischen steigender Polarität (1. CHCl3 100 %, 2. CHCl3/MeOH 95:5, 3. CHCl3/MeOH 90:10, 4. CHCl3/MeOH 70:30) als Eluenten fraktioniert. Die metabolithaltigen Fraktionen werden vereinigt und durch Größenausschlußchromatographie an Dextrangelen (Sephadex LH-20) unter Verwendung von Chloroform/Methanol (90:10) als Eluent weiter aufgereinigt. Eine Endreinigung der Substanzen erfolgt mittels präparativer HPLC unter Verwendung einer RP-18 Phase und Acetonitril/Wasser-Gemischen (1. Gradientenmodus MeCN/H2O 1/99 in 30 min auf MeCN/H2O 83/17, 2. Isokratisch MeCN/H2O 50/50). Die Detektion erfolgt bei 232 nm. Die Substanzen 1 (31 mg) und 2 (8.5 mg) werden somit rein, 3 und 4 als Diastereomerengemisch (2 mg) gewonnen. Die nachfolgend aufgeführten physikochemischen Daten charakterisieren die Substanzen hinreichend.
    • Aspoquinolone A (1): Weiße amorphe Substanz: UV λmax(MeOH)/nm (ε): 201 (34200), 217 (27900), 279 (15100), 323 (14000). IR (ATR, Festsubstanz) νmax/cm–1 3400, 2970, 2935, 1685, 1600, 1509. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH [ppm] (J [Hz]) 0.46 (2 H, m, 23-H), 1.20 (3 H, s, 26-H), 1.29 (3 H, s, 24-H), 1.30 (3 H, s, 25-H), 1.45 (1 H, m, 21-H), 1.77 (1 H, m, 20-H), 3.58 (3 H, s, 3-OCH3), 3.67 (1 H, d, J 1.5, 3-H), 3.74 (3 H, s, 14-OCH3), 4.51 (1 H, s, 4-OH), 6.30 (1 H, d, J 8.2, 9-H), 6.39 (1 H, d, J 16.6, 18-H), 6.80 (2 H, d, J 8.9, 13-H, 15-H), 6.80 (1 H, d, J 16.6, 17-H), 7.16 (2 H, d, J 8.8, H-12, H-16), 7.30 (1 H, br s, NH), 7.34 (1 H, d, J 8.3, 8-H), 9.07 (1 H, s, 6-OH). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC [ppm] 5.9 (C-23), 26.0 (C-24), 26.0 (C-26), 26.2 (C-20), 28.3 (C-21), 29.2 (C-25), 55.3 (14-OCH3), 58.8 (3-OCH3), 78.8 (C-4), 81.4 (C-22), 82.5 (C-19), 84.3 (C-3), 106.7 (C-9), 110.8 (C-5), 114.3 (C-13/C-15), 121.0 (C-17), 122.3 (C-7), 127.5 (C-8), 127.8 (C-12/C-16), 129.1 (C-11), 134.1 (C-10), 137.7 (C-18), 155.3 (C-6), 160.3 (C-14), 165.2 (C-2). (+)-ESI-MS m/z 466 [M+H]+, m/z 488 [M+Na]+. HRESI-MS: m/z [M+H]+ = 466.2217 (berechnet für C27H32NO6 466.2204)
    • Aspoquinolone B (2): Weiße amorphe Substanz: UV λmax (MeOH)/nm (ε): 201 (33000), 217 (27100), 279 (14400), 323 (13200). IR (ATR, Festsubstanz) νmax/cm–1 3400, 2970, 2935, 1685, 1600, 1509. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δH [ppm] (J [Hz]) 0.40 (1 H, m, 23-Hα), 0.47 (1 H, m, 23-Hβ), 1.21 (3 H, s, 25-H), 1.41 (3 H, s, 26-H), 1.49 (3 H, s, 24-H), 1.56 (1 H, m, 21-H), 1.60 (1 H, m, H-20), 3.58 (3 H, s, 3-OCH3), 3.66 (1 H, d, J 1.5, 3-H), 3.74 (3 H, s, 14-OCH3), 4.49 (1 H, s, 4-OH), 6.19 (1 H, d, J 16.2, 18-H), 6.28 (1 H, d, J 8.2, 9-H), 6.74 (1 H, d, J 16.2, 17-H), 6.80 (2 H, d, J 8.9, 13-H, 15-H), 7.15 (2 H, d, J 8.9, H-12, H-16), 7.25 (1 H, br s, NH), 7.34 (1 H, d, J 8.2, 8-H), 9.06 (1 H, s, 6-OH). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δc [ppm] 7.2 (C-23), 26.6 (C-25), 28.1 (C-20), 28.7 (C-24), 29.0 (C-21), 30.2 (C-26), 55.3 (14-OCH3), 58.8 (3-OCH3), 78.8 (C-4), 81.2 (C-22), 83.3 (C-19), 84.3 (C-3), 106.6 (C-9), 110.7 (C-5), 114.3 (C-13/C-15), 121.1 (C-17), 122.4 (C-7), 127.9 (C-8), 127.9 (C-12/C-16), 129.1 (C-11), 134.0 (C-10), 134.3 (C-18), 155.4 (C-6), 160.3 (C-14), 165.2 (C-2). (+)-ESI-MS m/z 466 [M+H]+, m/z 488 [M+Na]+. HRESI-MS: m/z [M+Na]+ = 488.2060 (berechnet für C27H31NO6Na 488.2044)
    • Aspoquinolone C/D (3/4): Weiße amorphe Substanz: UV λmax (MeOH)/nm (ε): 201 (30600), 279 (11800), 323 (10600). IR (ATR, fester Film) νmax/cm–1 2991, 2950, 1748, 1700, 1509. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH [ppm] (J [Hz]) 1.12 (3 H, s, 26-H), 1.22/1.24 (3H, s, 25-H), 1.38/1.39 (3 H, s, 24-H), 1.72 (1 H, m, 20-Hα), 1.88 (2 H, m, H-21), 1.98 (1 H, m, 20-Hβ), 3.59/3.58 (3 H, s, 3-OCH3), 3.67 (1 H, d, J 1.5, 3-H), 3.74 (3 H, s, 14-OCH3), 3.83/3.86 (1 H, m, H-22), 4.51/4.50 (1 H, s, 4-OH), 6.25/6.24 (1 H, d, J 16.6, 18-H), 6.30 (1 H, d, J 8.2, 9-H), 6.74 (1 H, d, J 16.6, 17-H), 6.80 (2 H, d, J 8.9, 13-H, 15-H), 7.15 (2 H, d, J 8.8, H-12, H-16), 7.30 (1 H, br s, NH), 7.34 (1 H, d, J 8.3, 8-H), 9.08/9.10 (1 H, s, 6-OH). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC [ppm] 24.2/24.4 (C-26), 26.4 (C-21 ), 27.3 (C-25), 27.4/27.5 (C-24), 38.0/38.5 (C-20), 55.3 (14-OCH3), 58.8 (3-OCH3), 71.1/71.2 (C-23), 78.8 (C-4), 83.2/83.0 (C-19), 84.2 (C-3), 85.5/85.6 (C-22), 106.7 (C-9), 110.8 (C-5), 114.3 (C-13/C-15), 120.8/121.1 (C-17), 121.9 (C-7), 127.9 (C-8), 127.9 (C-12/C-16), 129.0 (C-11), 134.1/134.3 (C-10), 135.3/135.5 (C-18), 155.4 (C-6), 160.3 (C-14), 165.2 (C-2). (+)-ESI-MS m/z 506 [M+Na]+, (–)-ESI-MS m/z 482 [M–H]–, HRESI-MS: m/z [M+Na]+ = 506.2180 (berechnet für C27H33NO7Na 506.2149)
  • Die Untersuchung der antiproliferativen Wirksamkeit der Substanzen 1 und 2 wurde entsprechend der in der Literatur beschriebenen Methode durchgeführt (H.M. Dahse, B. Schlegel, U. Gräfe, Pharmazie 2001, 56, 489–491).

Claims (5)

  1. Substanzen der Formeln 1–4
    Figure 00040001
  2. Verfahren zur Herstellung der Substanzen (1–4) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilzstamm Aspergillus nidulans mittels Festphasenfermentation kultiviert wird, anschließend eine Extraktion der Kultur erfolgt und die Verbindungen aus dem Kulturansatz isoliert werden.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Pilzstamm Aspergillus nidulans DSM 17772 verwendet wird.
  4. Pharmazeutische Formulierungen, welche die Substanzen 1–4 enthalten
  5. Verwendung der Verbindungen der Formeln 1–4 für die Herstellung von antiproliferativ wirksamen Therapeutika.
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