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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Arzneimittel zur Prophylaxe, Unterdrückung oder
Eliminierung von allergischen Reaktionen bei Menschen.
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Allergische
Reaktionen auf Stoffe wie Blütenpollen
(Heuschnupfen) oder andere pflanzliche Bestandteile, Katzenhaare
und anderer Tierhaare, Staub mit darin enthaltenem Kot der Hausmilbe,
Insektengift, Nahrungsmittel wie Milch oder Nüsse oder Duftstoffe und andere
Bestandteile von Kosmetika sind weithin bekannt und ein zunehmendes
Problem für
immer mehr Menschen.
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Die
Ursache dafür
ist, dass das körpereigenen
Abwehrsystem auf diese Stoffe so reagiert, als handele es sich um
tatsächlich
schädliche
Eindringlinge wie z.B. Parasiten. Zudem ist das Ausmaß der Reaktion überhöht.
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Im
Ablauf dieser körpereigenen
Abwehrreaktion spielen die weißen
Blutkörperchen,
die Lymphozyten, eine wesentliche Rolle. Eine Form von Lymphozyten
sind die T-Lymphozyten oder Helferzellen (TH-Zellen), die zur Steuerung der Abwehrreaktionen verschiedene
Botenstoffe, die Cytokine, absondern. Es gibt – erstens – Cytokine, die die allergische
Reaktionen vermindern oder unterbinden und – zweitens – andere Cytokine, die entzündliche,
also auch allergische Reaktionen auslösen, indem sie als Moderatoren
auf Aktorzellen wie z.B. die Mastzellen, stimulierend wirken. Nach
dieser Wirkung werden alle TH-Zellen in zwei Gruppen aufgeteilt,
nämlich
die TH1- und die TH2-Zellen. Die TH1-Zellen bilden antiallergische
Cytokine, wie γ- Interferon (IFN-γ) oder Interleukin-2
(IL-2). Die TH2-Zellen bilden Botenstoffe, die allergische Reaktionen
auslösen,
wie z.B. die Interleukine IL-3, IL-4, IL-5 und IL-10. Interleukin-4
stimuliert die Mastzellen zur Bildung des Antikörpers Immunglobulin Typ E (IgE)
der bei Allergien in sehr großer
Anzahl auftritt.
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Das
Verhältnis
zwischen der Anzahl von TH1-Zellen und TH2-Zellen ist entscheidend
für die Immun-Antwort
des Körpers
auf eingedrungene Erreger. Bei allergisch reagierenden Patienten
ist es deutlich niedriger als bei gesunden Menschen. Bekannt ist,
dass soeben geborene Babys oder Frühgeburten ebenfalls einen sehr
niedrigen Wert haben, damit der mütterliche Organismus nicht
fälschlicherweise
Zellen des Kindes angreift.
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Deshalb
ist das TH1-TH2-Verhältnis
eine wichtige Kenngröße eines
jeden Menschen, die zunehmend auch einer breiteren Öffentlichkeit
bekannt ist.
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Es
wird allgemein vermutet, dass Änderungen
in der Darmflora und/oder das Fehlen von bakterieller Stimulation
in frühester
Kindheit durch allzu große
Hygiene sowie durch ein Abnehmen der Infektionskrankheiten die Prädisposition
für eine
Abweichung des Wertes des Verhältnisses
legen und damit für
allergische Überempfindlichkeiten
sorgen.
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Schon
im Kindesalter können
deshalb beim Eindringen von Allergenen entzündliche Reaktionen, wie Schnupfen
und geschwollene Schleimhäute
bis hin zu erhöhter
Köpertemperatur
auftreten.
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Es
sind zahlreiche Arzneimittel bekannt, die die auftretenden Symptome
bekämpfen
oder unterdrücken.
Sie haben den Nachteil, dass sie zum Teil sehr teuer sind, etliche
unerwünschte
Nebenwirkungen auslösen
und kontinuierlich vom Patienten eingenommen werden müssen.
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Auf
diesem Hintergrund hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt,
einen Wirkstoff zu identifizieren, der bereits bekannt und im industriellen
Maßstab
produzierbar, daher leicht erhältlich
und verarbeitbar ist, der geringe Kosten verursacht, der auch im
Umfeld von gesunden Personen bereits in marginalen Mengen vorkommt
und daher in gewissen Grenzen mit dem menschlichen Organismus verträglich ist
und der die allergischen Reaktionen nicht auf der Ebene der Symptome
angreift, sondern bei der Auslösung
durch Botenstoffe.
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Zur
Lösung
dieser Aufgabe schlägt
die Erfindung ein Arzneimittel vor, in dem als wesentlicher Wirkbestandteil
probiotische, Grampositive Bakterien wie Lactobacillus und Bifidobacterium
enthalten sind, und zwar als lebensfähige Bakterien und/oder inaktivierte
Bakterien und/oder deren genomischer DNA.
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Die
Eigenschaft „probiotisch" erklärt der Brockhaus
als das Zusammenleben von zwei Organismen zum Nutzen eines Partners
ohne Schädigung des
anderen. Im Falle dieser Erfindung nutzt dem menschlichen Organismus
ein zweiter Organismus, nämlich
das Bakterium. Dabei nimmt das Bakterium selbst keinen Schaden,
bleibt also lebensfähig.
Dazu gehört,
dass bei oraler Verabreichung möglichst
viele Bakterien den Magen mit seinen Säuren, Enzymen und anderen Verdauungswirkstoffen
unbeschadet passieren.
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Der
Begriff probiotisch impliziert ebenfalls, das nachteilige Wirkungen
auf den Menschen vernachlässigbar
oder zumindest sehr klein sind, sondern vorrangig Wirkungen eintreten,
die als nützlich einzustufende.
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Als
Probiotikum wird eine Präparation
aus Mikroorganismen verstanden, die bei Konsumierung ausreichender
Mengen einen Gesundheitsfördernden
Einfluss auf den Wirtsorganismus hat. Am längsten angewendet werden probiotische
Milchsäurebakterien
(Lactobacillus). Probiotika können
als speziell zubereitete Lebensmittel oder in Form von Arzneimitteln
dargereicht werden
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Die
gesundheitsfördernden
Wirkungen von Probiotika sind jeweils stammspezifisch. Es sind probiotische
Bakterienstämme
bekannt, die auf der Basis von Evidenz basierter Medizin nachweislich
die Lactose-Verdauung fördern,
krankheitserregende Keime im Darm unterdrücken und Durchfall begrenzen
oder unterdrücken.
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Andere
Bakterienstämme
vermehren den Infektionsschutz, senken den Cholesterinspiegel und reduzieren
das Risiko von Krebs im Dickdarm.
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Diese
Wirkungen sind vor der breiten Anwendung erfolgreich in vitro nachgewiesen
worden. Von daher ist es legitim, die gesundheitsfördernde Wirkung
dieser Erfindung mit einer im Labor durchgeführten Versuchsreihe zu begründen.
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Mit
den im folgenden geschilderten Versuchen wurde gemessen, welche
Cytokine aus einer Fraktion von menschlichen Blutzellen, den PBMC-Blutzellen
(Peripher Blood Mononuclear Cells), unter bestimmten Bedingungen
freigesetzt werden. Diese Blutzellen wurden für eine Versuchsreihe aus dem
Blut gesunder Menschen isoliert und für eine zweite Versuchsreihe
aus dem Blut von allergischen Patienten, die gegen Hausstaub allergisch waren
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Zur
Stimulation wurde Staphylokokken-Enterotoxin Typ A (SEA) sowie in
einer weiteren Reihe Dermatophagoides (Dpt) zugegeben, weil Hausstauballergiker
meistens auch dagegen allergisch sind. Damit wird das Eindringen
eines eine Allergie auslösenden
Stoffes simuliert.
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Stellvertretend
für die
TH1 Reaktion wurde das γ-Interferon gemessen. Das TH2-Muster wurde anhand der abgesonderten
Interleukine 4 und 5 (IL-4 und IL-5) erfasst.
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Unter
den Faktoren, die möglicherweise
an der gewachsenen Verbreitung von allergischen Krankheiten beteiligt
sind, wird vermutet, dass die Modifikation der Darmflora oder das
Fehlen von bakterieller Stimulation in der Kindheit beteiligt ist. TH2-Zytokine steigern die Produktion von IgE
und stimulieren Mastzellen. Hingegen tragen γ-Interferone (IFN-γ), ein TH1-Zytokin, dazu bei
die IgE Synthese zu unterdrücken.
Auf diese Weise kann das Ungleichgewicht in dem Ausdruck „TH1 zu
TH2" zur Auslösung und
Aufrechterhaltung von allergischen Krankheiten beitragen. Lactobacillus
Bakterien, die zum natürlichen
Mikroflora des Darminneren gehören,
sollen die Häufigkeit
und die Schwere von allergischen Manifestationen vermindern und
die TH1/TH2 Antwort modulieren. Der Funktionsmechanismus bleibt
noch aufzuklären.
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Ziel:
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Wir
haben das Versuchsziel gehabt, den Einfluss von probiotischen Bakterien
auf die Herstellung von Typ TH1 und TH2-Zytokinen von gesunden Menschen
und Patienten mit Allergien gegen Hausstaubmilben zu bestimmen und
die molekulare Grundlage der Einflüsse von bakterieller, genomischer
DNA auf die TH1/TH2 Antwort auf Staphylokocken Enterotoxin A (SEA)
und Dermatophagoides Pteronyssinus (DPT) aufzuklären und mit den Einflüssen von
lebenden Bakterien zu vergleichen.
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Methoden:
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PBMC's von Patienten mit
Allergien gegen Hausstaubmilben im Vergleich zu solchen von gesunden
Spendern wurden für
24 und 48 Stunden inkubatiert mit oder ohne SEA und DPT Allergenzien. Der
Einfluss einer Vorinkubation mit lebenden, probiotischen Bakterien
wie auch der Einfluss ihrer genomischen DNA, die simultan den Kulturen
hinzugefügt wurde
und für
24 Stunden ausgebrütet
wurde, wurde durch die Messung der TH1/TH2 Cytokinproduktion bewertet.
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Ergebnisse:
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Die
geprüften,
lebensfähigen,
gram-positiven, probiotischen Bakterien und ihre genomische DNA
zeigten, dass sie die SEA- und DPT-stimulierte Absonderung von TH2 Cytokinen
(EL4 und EL5) unterdrückten
und die Stimulation von IFN-γ erweiterten.
Dieser Effekt war sowohl von der Dosierung als auch vom gewählten Bakterienstamm
abhängig.
Keine signifikante Hemmung wurde von der Kontrolle, gram-negativen
Escherichia coli TG1 ausgelöst.
Probiotische Bakterien reduzierten die Produktion von IL-4 Cytokinen
von allergischen PBMCs insbesondere nach einer erneuten Stimulierung
mit SEA und DPT sogar noch wirkungsvoller als von gesunden Menschen.
Hingegen war eine IL-5 Hemmung bei gesunden Subjekten deutlicher
ausgeprägt.
Bakterielle DNA unterdrückte
die Freisetzung von IL-4 und IL-5 ebenfalls, jedoch nur in einem
etwas geringerem Umfang. Die Hemmung von EL4 war bei PBMCs von allergischen
Subjekten mehr ausgeprägt
als bei gesunden Subjekten wo hingegen dieses bei EL5 gegeben war.
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Zusammenfassung:
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Die
TH1/TH2 Antwort auf Allergenzien, moduliert durch die geprüften probiotischen
Bakterien, ebenso wie ihre genomische DNA, zeigte eine Anti-TH2
Aktivität.
Folgerichtig können
verschiedene Stämme
von probiotischen Bakterien und ihre genomische DNA nützlich bei
der Vorbeugung von allergischen Krankheiten sein.
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1. Einführung:
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Die
Lehre von den Krankheitsursachen allergischer Krankheiten bleibt
unklar, sogar wenn menschliche, experimentelle Studien anzeigen,
dass genetische Vorbedingungen, die Immunantwort der Darmschleimhaut
und enteritische Bakterien zu der Pathogenese von allergischen Krankheiten
beitragen. Einige Studien schlagen vor, dass TH2 Cytokine, insbesondere
IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13, lebenswichtige Rollen in der Pathogenese
spielen, indem sie die Produktion von IgE regeln und Mastzellen
stimulieren. Die Produktion von IL-4, IL-5, IL-9 oder IL-13 durch
TH2 Lymphoziten auf einem hohen Niveau kann eine entscheidende Rolle
in der Entwicklung und dem Verlauf von allergischen Antworten spielen.
Im Gegensatz dazu hat IFN-γ,
ein sogenanntes TH1 Cytokin, die Fähigkeit, die IGE-Synthese zu unterdrücken. Defekte
IFN-γ Ausdrücke sind
oft in Verbindung gebracht worden mit IgE vermittelten Allergien.
Die Disregulation in dem Verhältnis
von TH1/TH2 Cytokinen kann zu einem großen Teil für die Auslösung und Aufrechterhaltung
von allergischen entzündlichen
Prozessen bei Krankheiten wie z. B. bronchialem Asthma oder atobischer
Dermatitis verantwortlich gemacht werden.
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Es
ist vorgeschlagen worden, dass besondere TH2 Cytokinprofil von neugeborenen
Babys, das Altern, das normalerweise das TH1/TH2 Verhältnis herabsetzt,
moderne Hygieneregeln, intensive Sterilisation von Nahrungsmitteln
und/oder die Veränderungen
der Darmflora von neugeborenen Babys, die durch das Füttern nach
künstlichem
Rezept verursacht ist, eine herausragende Rolle bei den Änderungen
des TH1/TH2 Gleichgewichtes spielen. Das gewachsene Wissen auf diesem
Gebiet hat die Grundlage für
eine Anzahl von neuen Therapien bereitgestellt. Ein Ansatz ist es,
einfach probiotische Bakterien zu nutzen, um diejenigen Cytokine
zu vermehren, die nicht ausreichend gebildet werden oder diejenigen
Cytokine zu vermindern, die in zu großem Umfang produziert werden,
weil probiotische Bakterien die TH1/TH2 Balance modulieren.
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Probiotische
Bakterien sind allgemein als sicher eingestuft und von Menschen
oder Tieren verzehrt worden. Die Bakterien Lactobacillus und Bifidobacterium
sind die am weitesten verbreiteten Mikroorganismen im menschlichen
Magen-Darm-Trakt. Das Interesse an der immunstimulierenden Wirkung von
probiotischen Bakterien wächst,
insbesondere an der antiallergischen Wirkung. Die wichtige Rolle von
Bakterien bei allergischen Krankheiten legt die Möglichkeit
nahe, diese Abweichungen zu verhüten oder
zu behandeln, indem die Mikroflora des Darmes durch probiotischen
Behandlung verändert
wird. Die probiotischen Bakterien können direkt oder indirekt durch
die Modulation der endogenen Flora oder des Immunsystems wirken.
Es wurde vorgeschlagen, dass der neue Ausdruck „Immunobiotics" benutzt wird, um
Bakterien zu benennen, die Gesundheit über das mukosale Immunsystem
einbringen, im Gegensatz zu solchen mit nur lokal begrenzter Wirkung. Verschiedene
Immunantworten auf probiotix sind berichtet worden, wie die Absonderung
von entzündungsfördernden
Cytokinen, die Vermehrung von Lymphorcyten und die Bildung von Stickoxiden.
Weiterhin hat sich gezeigt, dass ganze Zellen, einige lösliche Komponenten,
die von LGG oder der DNA von LGG abgesondert wurden, Komponenten
der Zellwand wie z. B. Peptidoglykan oder Lipoteichionische Säuren von
Laktobacillen entzündliche
Immunantworten auslösen
und immunobiotische Aktivitäten zeigen.
Es wurde demonstriert, dass nicht nur lebende Bakterien, die in den
Darmtrakt verabreicht werden, sondern auch isolierte, probiotische
DNA aktiv ist, sogar wenn sie subcutan injiziert wird.
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Es
wurde berichtet, dass unvergällte
CpG Leitelemente in bakterieller DNA mitogen für B-Zellen von Mäusen sind
und die Herstellung von entzündungsbildenden
Cytokinen durch Makrophagen und dentritische Zellen (DC) auslösen. Und
CpG Oligodeoxinukleotide (ODNs) und bakterielle DNA die Produktion
von Interleukin 6 (EL-6), Interleukin 12 (EL-12) und Interpheron-γ (IFN-γ) durch B-Lymphozyten
und natürliche
Killerzellen von Mäusen
auslösen.
Weiterhin induziert die CpG DNA die Vermehrung von B-Zellen und
die Teilungen von unbeeinflussten und aktivierten T-Zellen in T-Helferzellen
1 und 2. Bestimmte CpG ODNs (D-Typ) sind besonders leistungsfähig, um
NK-Zellen zu aktivieren
und die Produktion von α-Interferon
(IFN-α)
durch plasmacytoide, dentritische Zellen auszulösen, wohingegen andere ODNs
(K-Typ) besonders leistungsfähige Aktivatoren
von B-Zellen sind.
Es hat sich vor kurzem gezeigt, dass der abgabenähnliche Rezeptor 9 (TLR9) eine
kritische Rolle bei der Auslösung
einer zellularen Aktivation durch CpG DNA spielt.
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Experimente
die in Mäusen
ausgeführt
sind, welche auf Ovalbumin sensibilisiert sind, zeigten, dass nach
Verabreichung von Milchsäurebakterien
in den Magen die besonderen IgE- und TH2-Profilabhängigen,
entzündlichen
Antworten unterdrückt
wurden. Weiterhin schlagen neueste Berichte vor, dass der Lactobacillus
Rhamnosus GG die Symptome vom allergischen Krankheiten in menschlichen
Subjekten reduzieren kann, ebenso wie er angeborene Immunantworten
auslösen
kann durch die Aktivierung von Transcriptionsfaktoren, die in die
Signalisierungsfunktion von Cytokinen eingebunden sind. Die Gabe
dieses Bakterienstammes an stillende Mütter und neugeborenen Babys
führte
zur Unterdrückung des
Risikos von ato pischen Exzemen bei Babys. In-Vitro-Experimente haben
gezeigt, dass die Stimulierung von PBMCs oder Monocyten von gesunden Spendern
durch eine Vielfalt von Milchsäurebakterien
die Absonderung von IL-12 induziert, das ein lebenswichtiges Pro-TH1-Cytokin
ist, welches an der Kontrolle der Entwicklung von allergischen Krankheiten
beteiligt ist. Die Funktionsmechanismen, durch die LAB die Produktion
von TH2 Cytokinen beeinflusst, die für die Initiation der Entwicklung
von allergischen Krankheiten verantwortlich sind, bleibt noch zu
benennen. Unter Beachtung des Vorhandenseins von unvergällten DNA-Sequenzen
(CpG Leitelemente) in den Chromosomen der DNA von Bifidobacterium
und Lactobacillus in dieser Studie entschieden wir uns, die Wirkung
von vier Stämmen
der Bakterien Lactobacillus und Bifidobacterium ebenso wie ihre chromosomalen
DNA auf IL-4, IL-5 und IFN-γ Produktion
durch SEA und DPT stimulierte PBMCs von gesunden und allergischen
Probanden zu prüfen.
Die untersuchten Bakterien Lactobacillus und Bifidobacterium zeigten
Anti-TH2-Aktivitäten
und das Pro-TH1-Cytokin, IFN-γ.
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2. Methoden
und Material
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2.1. Bakterienkultur
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Die
Bakterienstämme,
die in dieser Studie gebraucht wurden, sind die folgenden:
Lactobacillus
rhamnosus GG (92164), Lactobacillus gasseri (PA 16/8), Bifidobacterium
bifidom (MG 20/5), Bifidobacterium longum (SP 07/3) und LgsB.bB.l
(eine Mischung von Lactobacillus gasseri, Bifidobacterium bifidom
und Bifidobacteriumg longum). Bifidobacterium und Lactobacillusstämme wurden
herangezogen (eine 0,02 inoculum von Stämmen, die bei minus 80°C in 30%
Glycerol gelagert wurden) in anaerober Weise (Anaerobisches System,
MACS – VA500 workstation
mit Luftschleuse und Luftschleuse, Don Whitley Scientific Limited
UK in einem MRS Medium (MRS; Merck, Darm stadt, Deutschland), ergänzt mit 0,05%
L-cystein bei 37°C
für 16
Stunden. Vor der Ernte und der Waschung in PBS wurden fortlaufende Lösungen von
frisch präparierten
Kulturen auf Platten aufgebracht, die MRS-agar Medien enthielten und
zur Zählung
kultiviert. Die Zählung
der Kolonie bildenden Einheiten (CFU ml–1)
der probiotischen Bakterien Gruppen wurde durch das Aufbringen von wiederholten
10-fachen Lösungen
auf die Platten abgeleitet. Die Platten wurden anaerob bei 37°C für 24-48
Stunden ausgebrütet.
Die Bakterien wurden dann 3 mal mit PBS gewaschen und auf die entgültige Konzentration
von 1010, 107 und
101 CFU ml–1 eingestellt.
Die bakterielle Suspension wurde bei –80°C in einer MRS Lösung gelagert,
die 30% Glycerol enthielt. Für
alle Bakterienstämme
wurden normale Wachstumskurven hergestellt durch die Aufzeichnung
von OD600 vs agar Platten-Zählungen
von frisch präparierten,
wiederholt gelösten
Kulturen. Um die Zählungen
von lebensfähigen
Bakterien in frisch präparierten
Kulturen zu berechnen, wurden die Kurven mit logarithmischen Ausdrücken ausgestattet, die
alle Werte über
98,5% gewannen (Daten nicht gezeigt). Gram-negative E. coli TG1
(Produktnummer BU-00035) wurde von Maxim Biothec Inc. gekauft und
wuchs im LB-medium für
18 Stunden bei 37°C und
wurde wie oben geerntet.
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2.2. Die Vorbereitung
von genomischer DNA aus Bakterien
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Genomische
DNA von reinen Kulturen probiotischer Bakterien wurde durch die
Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isomyl Alkohol (25:24:1) gereinigt.
Um einen vollständigen
Zellaufschluss zu erhalten, wurde die Methode geringfügig modifiziert,
indem die enzymatische Lyse von 2 auf 7 Stunden verlängert wurde.
Anschließend
wurde die DNA ausgefällt,
mit kaltem (–20°C) 95% Ethanol
sterilisiert und in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) gelöst. Die Konzentration
und die Reinheit von allen DNA Präparationen wurde durch die
Messung der OD260 Absorbierung, bzw. des
OD260/280 und 260/230 Verhältnisses
abgeleitet. Es wurden nur DNAs mit einem OD260/280 Verhältnis > 1,8 und 260/230 ≥ 2 benutzt. DNAs
wurden von Endotoxin mit TritonX-114D
gereinigt und auch auf ihren Gehalt an Lipopolysaccharide (LPS)
untersucht durch die Nutzung der Limulus-Amebocyten-Untersuchung (QCL-1000,
CAMBREX, Deutschland). Der LPS Gehalt betrug weniger als 0,01 U
Endotoxin μg–1.
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Um
eine Bioaktivität
von LPS oder anderen bakteriellen Kontaminanten in den DNA Präparationen
zu bestimmen, wurde die DNA mit DNase I (Sigma) abgebaut. Es gab
keine nachweisbare Unterdrückung
von Cytokinen durch PBMCs unterhalb des Basisniveaus, wenn die abgebaute
DNA mit einer Konzentration von 75 μg ml–1 hinzugefügt wurde
(gemessen vor der DANN-Aufschlussbehandlung).
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2.3. PBMC Isolation und
Kultur
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2.3.1. Vorinkubation von
PBMCs mit probiotischen Bakterien und weitere Stimulation mit SEA
und Dpt
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Acht
allergische Patienten und acht gesunde Spender wurden für die Studie
rekrutiert. Von allen Probanden wurde eine mündliche und schriftliche Zustimmung
vor ihrer Registrierung zu dieser Studie in Übereinstimmung mit der Ethik-Komission
der Universität
Kiel über
den Einsatz von menschlichen Probanden in der Forschung eingeholt.
Venöses
Blut wurde von den Spendern in heparinisierte Vakutianer geleitet
und 1:1 mit 0,9% NaCl verdünnt.
Dann wurden frische Periphere Blut Mononukleare Zellen (PBMCs) aus
heparinisiertem, verdünntem
Blut durch Zentrifugieren nach steigender Dichte isoliert (1,077
g ml–1)
(Lymphoprep, AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Norwegen). Die Zellen wurden
im RPMI-1640 Kulturmedium (Sigma, München, Deutschland), ergänzt mit
10% (v/v) hitzeaktivierten (56°C,
1 Stunde) fetalem Rinderserum, Gentamicin (50 μg ml–1)
(Sigma), penicillinstreptomycin (1%) und Sodium Pyruvatlösung (0,23
mmol l–1) (Sigma)
(bestellt als vollständiges
Medium) in eine Emulsion eingebracht. Alle Komponenten wurden Endotoxin
geprüft
eingekauft, wie es von LAL bestimmt ist. Die Zellen wurden in dem
vollständigem
Medium in einer Konzentration von 2 × 106 Zellen
ml–1 in
Gefäßen mit
24 Kammern kultiviert. Gleichzeitig wurden zwecks Stimulation vier
Stämme
von lebenden, probiotischen Bakterien und einem Gramnegativen Bakterium
(E-coli TG1) zu den Kulturen hinzugefügt. Wie für bakterielle Zählungen
erforderlich, waren die probiotischen und die anderen Bakterien
zum Zeitpunkt der Hinzugabe zu den Kulturen lebensfähig. Die
Zellen, die allein mit dem Medium kultiviert waren, dienten als
nicht stimulierte Kontrolle. Die Versuche zur Abhängigkeit
von der Dosierung, ausgeführt
für IL-4
und IL-5 als Kulturen mit einem Endvolumen von 200 μl/Kammer
wurden in flachbödigen
96-Kammern-Mikrotiter-Platten
(Nune, Roskilde, Dänemark)
vorbereitet mit 2 × 106 mononuclearen Zellen und 5 × 104, 5 × 105, 2 × 106, 5 × 106, 2 × 107 und 5 × 107 Bakterien/ml entsprechend 0,025, 0,25,
1, 2,5, 10 und 25 Bakterien pro mononucleare Zelle. Sie zeigten
an, dass die maximale Unterdrückung
mit 2 × 107 CFU von Bakterien/ml entsprechend einem
Verhältnis
von 10:1 (Bakterien zu PBMC) beobachtet wurde. Diese Konzentration
wurde bei weiteren Experimenten benutzt. Das endgültige Verhältnis zwischen
PBMC und Bakterien (Bakterien zu PMBC Verhältnis) war 10:1 für gesunde
Spender und für
allergische Patienten. Zur Kontrollbehandlung wurde nur Kulturmedium
zu der PBMC Lösung
hinzugegeben. Danach und nach drei Stunden Bebrütung bei 37°C wurden die PBMCs weiter stimuliert
mit SEA (2μg
ml–1)
oder Dpt (2000SQ-E ml–1 äquivalent zu 2 μg Gabe ml–1)
und in einem 5% CO2 befeuchteten Inkubator
bei 37°C
für 48
Stunden bebrütet.
Alle Experimente wurden doppelt ausgeführt. Nach einer Bebrütung von
48 Stunden wurde das Kulturmedium bei 4°C für 20 Minuten bei 1000 × g zentrifugiert.
Der zellfreie Überstand
wurde mittels passieren durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2 μm sterilisiert
(Millipore, Deutschland) und bei –80°C bis zum Gebrauch gelagert.
Die Lebensfähigkeit
der Zellen wurde vor und nach der Bebrütung mit Bakterien durch die
Ausschließung
mit Trypan Blau bestimmt.
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2.3.2. Stimulation mit
SEA, LPS und genomischer DNA
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Frische
PBMC wurden aus heparinisiertem, peripherem Blut von vier gesunden
Spendern durch Zentrifugierung nach steigender Dichte (1,077g ml–1) (Lymphoprep,
AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Norwegen) isoliert. Die Zellen wurden
in einem RPMI 1640 Kulturmedium (Sigma, München, Deutschland) mit 10%
(v/v) hitzeaktivierten (56°C,
1 Stunde) fetalem Rinderserum, Gentamicin (50 μg ml–1)
(Sigma), Penicillin-Streptomycin (1%) und Sodiumpyruvatlösung (0,23
mmol l–1)
(Sigma) (vollständiges
Medium). Alle Komponenten wurden Endotoxin getestet gekauft. Alle
Versuche zur Abhängigkeit
von der Dosierung, ausgeführt
für IL-4
und IL-5 als Kulturen mit einem letztendlichen Volumen von 200 μl/Kammer
wurden in einer flachbödigem
96-Kammer Mikrotiterplatte (Nune,
Roskilde, Dänemark)
mit 2 × 106 mononuklearen Zellen und 5, 10, 25, 50,
75 und 100 μg
genomischer DNA pro ml aufgesetzt. Sie zeigten an, dass die maximale
Unterdrückung
mit 75μg
DNA ml–1 zu beobachten
war. Diese Konzentration wurde im weiteren Experiment benutzt. Die
Zellen wurden in einem vollständigen
Medium in einer Konzentration von 2 × 106 Zellen
ml–1 in
einer 24-Kammer-Platte (Nunc, Roskilde, Dänemark) kultiviert. Gleichzeitig wurde
genomische DNA (75μg
ml–1)
von probiotischen Bakterien, genomische DNA vom Kalb (75μg ml–1),
Sigma, München,
Deutschland), SEA (2μg ml–1),
LPS von E. coli (20ng ml–1, Sigma, München, Deutschland)
der Kultur hinzugefügt
und bei 37°C, 5%
CO2-Befeuchtung für 24 Stunden bebrütet. Alle Experimente
wurden 3-fach ausgeführt.
Nach 24 Stunden Inkubation wurden die zellfreien Überstände gesammelt
und bei 1000 × g
für 20
Minuten, 4°C
zentri fugiert und sterilisiert mittels Passieren durch einen Filter
mit 0,2 μm
Poren (Millipore, Deutschland) und bei –80°C in Aliquoten bis zur Analyse
gelagert. Die Lebensfähigkeit
der Zellen wurde vor und nach der Inkubation mit genomischer DNA
durch die Ausschließung
mit Trypan Blau ermittelt. Bei allen Experimenten waren 95–98% der
PBMCs lebensfähig.
Die Experimente zur Abhängigkeit
von der Dosierung, die für
jedes Cytokine ausgeführt
wurden, zeigten an, dass die maximale Unterdrückung bei einer Konzentration
von 75 μgml–1 beobachtet
wird. Diese Konzentration wurde bei den weiteren Experimenten genutzt.
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2.4. Untersuchung der
Cytokine mittels Enzyme basierter immunosorbenter Untersuchung (ELISA)
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Der
Gehalt an IL-4, IL-5 und IFN-γ wurde
in den zellfreien Überständen mithilfe
von einer besonderen ELISA (BD OptEIATM set
menschliches IL-4, 5 und IFN-γ Heidelberg,
Deutschland) quantifiziert. Die Nachweisgrenze der Untersuchung
war 0,5 pg ml–1 für IL-4,
0,5 pg ml–1 für IL-5 und
1 pg ml–1 für IFN-γ. Die optischen
Dichtheitswerte der Proben wurden bei 450 und 570 nm auf einem ELISA
Plattenleser abgelesen. Die Experimente wurden wenigstens doppelt wiederholt
und dreifach ausgeführt.
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2.5. Statistische Analysen
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Die
Daten des Versuchs wurden mittels ± S.E.M ausgegeben und eine
nicht parametrisierte, statistische Analyse mit dem t-Test ausgeführt. P-Werte
von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.
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Ergebnisse
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Lactobacillus
und Bifidobacterium unterdrücken
IL-4 und IL-5 und lösen
eine IFN-γ Produktion durch
SEA oder Dpt-stimulierte PBMCs von gesunden Spendern aus. Es wurde
gezeigt, dass Streptokokken Superantigene einen hohen Gehalt von
IL-4 und IL-5 aus PBMCs von gesunden Spendern auslösen und
das durch Hitze abgetötete
Milchsäurebakterien
in der Lage waren, die Sekretion eines Typ 2 Cytokin-Profiles zu
unterdrücken.
Weiterhin hat eine Studie gezeigt, dass allergische Patienten einen
erhöhte
Gehalt an IL-4 und IL-5 hatten. Dermatophagoides Pteronyssinus,
Dpt (mit 83,8%) und Dermatophagoides farinae, Df (mit 78,4%) sind
die am meisten verbreiteten, kausativen Allergene bei Patienten mit
allergischer Rhinitis. Jetzt haben wir diese Beobachtungen t mit
einem anderen Superantigen bestätig:
Staphylokokken Enterotoxin A (SEA) und Dpt.
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Wenn
lebende Stämme
von den Bakterien Lactobacillus und Bifidobacterium mit PBMCs vorinkubatiert
wurden, wurde die sich daraus ergebende Produktion von IL-4 durch
SEA und Dpt in hohem Maße
vermindert, verglchen mit dem, was durch die positive Kontrolle
ausgelöst
worden ist (keine Vorinkubation mit den Lactobacillus und Bifidobacterium). Interessanter
Weise wurde keine signifikante Unterdrückung beabachtet wenn PBMCs
mit den grammnegativen Kontrollstämmen TG1 vorinkubatiert wurde
(1).
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Obwohl
weder die vier Stämme
Lactobacillus und Bifidobacterium noch TG1 eine Basis-IL-4 Produktion
auslösten,
induzierten alle 4 Stämme
die Produktion von IFN-γ.
Wenn PBMCs mit SEA und Dpt stimuliert wurden, wurde zusätzlich der
Gehalt an IFN-γ Freisetzungen
stark erhöht.
Ein synergistischer Effekt wurde nicht nur mit den Bakterien Lactobacillus
und Bifidobacterium beobachtet, sondern auch mit TG1. Folglich erscheinen
Lactobacillus und Bifidobacterium in der Lage zu sein, sowohl die
Absonderung von TH1 als auch von TH2 Cytokinen in entgegengesetzter
Weise zu beeinflussen.
-
Die
Produktion von Cytokinen hängt
ab von der Zeit und der Dosierung.
-
Weitere
Experimente, die mit vier Lactobacillus- und Bifidobacteriumstämmen ausgeführt wurden,
zeigten, dass die Unterdrückung
von TH2 Cytokinen von der Zeit und der Dosis abhängen. Wenn PBMCs vor der Hinzugabe
von SEA mit probiotischen Bakterien stimuliert wurden, nahm der
wachstumshemmende Einfluss auf die TH2 Cytokinproduktion mit dem
Verhältnis
von Bakterien zu PBMC zu. Die maximale Wachstumshemmung wurde bei
2 × 107 CFU von Bakterien ml–1 entsprechend
einem Verhältnis
von 10:1 (Bakterien zu BMC) (2, A und
B) beobachtet.
-
Dieser
Effekt wurde ebenso für
die Produktion von IL-4 und IL-5 beobachtet. Zum Beispiel wurde für die L-gasseri
Stämme
der Prozentsatz der Wachstumshemmung von der IL-4 Produktion in
Antwort auf SEA von 40,19% ± 3%
(1:1 Verhältnis)
auf 54,22% ± (10:1
Verhältnis)
angehoben. Der Prozentsatz der Unterdrückung der IL-5 Produktion wuchs von
43,77% ± 8%
(1:1 Verhältnis)
auf 73,17% ± 5% (10:1
Verhältnis).
Zusätzlich
erhöhte
sich der Prozentsatz der Hemmung der IL-4 Produktion in Antwort
auf Dpt. bei PBMC von gesunden Spendern von 34,61% ± 4% (1:1
Verhältnis)
auf 47,33% ± 5%
(10:1 Verhältnis).
Der Prozentsatz der Wachstumshemmung der IL-5 Produktion wuchs von
45,72% ± 4% auf
77,59% ± 6%.
Im Gegensatz zu TH2-Cytokin induzierten unsere getesteten Stämme eine
Grundproduktion von IFN- γ,
die von dem Bakterien-/Zellenverhältnis abzuhängen scheint. Es ist bemerkenswert, dass
gezeigt werden konnte, dass probiotische Bakterien in hohem Maße die Produktion von
IFN-γ als Antwort
auf eine Stimulation mit SEA beeinflussen (1 und 2,
C)
-
Zeitabhängige, wachstumshemmende
Wirkung von lebenden probiotischen Bakterien auf die Produktion von
IL-4 und IL-5.
-
PBMCs
von gesunden Spendern (n = 4, bei 2 × 106ml–1)
wurden mit SEA (2 μg/ml)
stimuliert. Mononuclearzellen wurden entweder für 1,3 und 5 Stunden mit L-GG
(10:1 Verhältnis)
vor Inkubation vor der SEA-Stimulierung vorinkubatiert oder sie
wurden simultan stimuliert mit den L-GG Stämmen und das Superantigen oder
L-GG wurde 1,3 und 5 Stunden nach der SEA Stimulierung hinzugegeben
und die Zellkulturen wurden über
eine Periode von 24,48 und 72 Stunden vorbebrütet. Zu den genannten Zeitpunkten wurden
die zellfreien Überstände geerntet
und nach Zentrifugierung und Sterilisation bei –20°C gelagert. Die Konzentration
an IL-4 und IL-5 wurde gemessen und zeigte, dass eine maximale Wachstumsunterdrückung beobachtet
wurde bei einer 3-stündigen
Vorinkubation von PBMCs mit lebenden Bakterien vor der Stimulation
mit SEA. Eben so wurde eine maximale Wachstumshemmung bei einer
48-stündigen
Inkubation beobachtet (Daten nicht gezeigt). Diese Zeitspanne wurde
in den mweiteren Experimente gebraucht.
-
Lactobacillus und Bifidobacterium
unterdrücken
die Produktion von TH2 Cytokinen von allergenstimulierten PBMCs
von allergischen Patienten
-
Die
Fähigkeit
von Lactobacillus und Bifidobacterium, das Ungleichgewicht zwischen
TH1- und TH2-Cytokinen zu korrigieren, wurde als nächstes in einem
noch relevanterem Modell der Stimulation durch Allergene bewertet.
Wenn PBMCs von Patienten (allergisch auf D. pteronyssinus) mit verschiedenen,
lebensfähigen
Stämmen
von Lactobacillus und Bifidobacterium vorbebrütet wurden, wurde die Produktion
von IL-4 und IL-5, ausgelöst
nach einer spezifischen Stimulation mit D. pternonyssinus Allergenen,
in großem
Umfang reduziert und zwar in einer Weise, die von dem Bakterien-/Zellverhältnis abhängt. Diese
Wirkung auf IL-5 war unabhängig
von der Stammart der untersuchten probiotischen Bakterien. Die Unterdrückung von
IL-5 entsprach beispielsweise bei B.b. 57,31% ± 4,52% und bei B.l. 63,77% ± 5% (1).
Weiterhin wurden ähnliche
Effekte beobachtet, wenn PBMCs von allergischen Patienten mit SEA
stimuliert wurden. In diesem Fall, obwohl die IL-4 und IL-5 Produktion
sehr hoch war im Vergleich mit der Produktion die mit D pteronyssinus
beobachtet wurde (1), reduzierten die getesteten
probiotischen Bakterien die Absonderung von IL-5 um 71,29% ± 4,10%
für L-GG
und 77,63% ± 3,52%
für L-gasseri
(1). Koinkubation mit Lactobacillus und Bifidobacterium
erhöhte
die Produktion von IFN-γ in
hohem Maße
(1). Auf diese Weise durch die Reduzierung der
Produktion von TH2 Cytokinen und durch die Verstärkung der IFN-γ Produktion
von PBMCs von allergischen Patienten scheinen Lactobacillus und
Bifidobacterium eine Anti-TH2-Aktivität aufzuweisen. In diesem Zusammenhang
ist es interessant zu bemerken, dass die wachstumshemmende Wirkung
von Lactobacillus und Bifidobacterium auf die IL-4 Produktion durch
PBMCs von allergischen Probanden höher ist als bei gesunden Probanden.
Im Gegensatz dazu ist die wachstumshemmende Wirkung dieser Bakterien
auf die IL-5 Produktion durch PBMC von gesunden Spendern höher als
bei allergischen Probanden (1). Im Vergleich
dazu war der wachstumshemmende Effekt von B. l. und LgsBbBl auf
IL-4 Produktion durch Dpt stimulierte PBMC von allergischen Probanden
höher als
von gesunden Probanden (p < 0,05)
und die hemmende Wirkung von L-GG, B. b und B. l auf IL-4 Produktion
durch SEA-stimulierte PBMC von allergischen Probanden war höher als
bei gesunden Probanden (p < 0,01).
Im Gegensatz dazu war der wachstumshemmende Effekt von L-Gassery,
B.b und B.l auf die IL-5 Produktion durch Dpt-stimulierte PBMC von gesunden Probanden
größer als
bei allergischen Probanden (p < 0,05) und
der unterdrückende
Effekt von LgsBbBl auf die IL-5 Produtkion von SEA-stimulierten
PBMC von gesunden Probanten war größer als bei allergischen Patienten
(p < 0,01, 1).
-
Genomische DNA von probiotischen
Bakterien hemmen die Produktion von IL-4 und IL-5 durch SEA-stimulierte
PBMC von gesunden Probanden in Abhängigkeit von der Zeit und der
Dosierung.
-
Um
den wachstumshemmenden Effekt von bakterieller DNA in Vergleich
zu tierischer DNA und LPS abzuschätzen wurden PBMCs von vier
gesunden Probanden mit genomischer DNA von vier Stämmen probiotischer
Bakterien, L-GG, L-gasseri, B.b, B.l and LgsBbBl (eine Mischung
von L-gasseri, B.b and B.l), LPS und tierischer DNA (kalbs thymus
DNA) inkubatiert. Die Unterdrückung
von TH2 Cytokinen wurde überwacht
durch die Anwendung von BDoptElA Untersuchungssets um die Produktion
von Cytokinen nachzuweisen und zu quantifizieren. Wie in 4 dargestellt,
hindert die DNA von probiotischen Bakterien normale PBMCs daran,
IL-4 und IL-5 als Antwort auf die Stimulation durch SEA oder Dpt
zu produzieren. Im Gegensatz dazu reduzierte LPS nicht die Produktion
von IL-4 und IL-5 ebenso wie LPS-freie Kalbsthymus DNA die Produktion
von IL-4 und IL-5 nicht vermindert (Daten nicht gezeigt).
-
Zeitabhängige, wachstumshemmende
Wirkung von bakterieller DNA auf die Produktion von IL-4 und IL-5 durch
SEA-stimulierte PBMC von gesunden Probanten
-
Einige
Experimente wurden durchgeführt
um den zeitlichen Verlauf der Antwort auf genomische DNA zu bestimmen.
PBMCs von gesunden Spendern (n = 4, bei 2 × 106ml–1)
wurden mit SEA (2 μgml–1)
stimuliert und wurden entweder für
eine, drei und sechs Stunden mit genomischer DNA von der L-GG oder
B. b. (30 μgml–1)
vor dem SEA Stimulus vorinkubatiert oder zugleich mit genomischen
DNAs stimuliert. Superantigene oder genomische DNAs wurden 1, 3
und 6 Stunden nach dem SEA Stimulus hinzugefügt und Zellkulturen wurden über eine
Zeitdauer von 24, 48 und 72 Stunden inkubatiert. Die genomischen
DNA von L-GG und B. b. wurde als repräsentativ für die beiden Lactobacillus-
und Bifidobacteriumstämme
ausgewählt.
Zu den genannten Zeitpunkten wurden die zellfreien Überstände geerntet und
nach Zentrifugierung und Sterilisation bei –80°C gelagert. Die Konzentration
von IL-4 und IL-5 wurde gemessen und es zeigte sich, dass die maximale Hemmung
bei t0 Stunden der Inkubation von PBMC mit
genomischen DNAs und SEA (Daten nicht gezeigt) beobachtet wurde
ebenso wie maximale Unterdrückung
nach 24-stündiger Inkubation
erreicht wurde. Diese Zeitdauer wurde bei weiteren Experimenten
benutzt. Genomische DNA von B. b wurde als leistungsfähigerer
Hemmer von IL-4 bestätigt
als genomische DNA von L-GG. Im Gegensatz dazu wurde bestätigt, dass
genomische DNA von L-GG ein leistungsfähigerer Hemmer von IL-5 ist
als die genomische DNA von B. b.
-
Dosierungsabhängiger,
wachstumshemmender Effekt von bakterieller DNA auf die Produktion
von IL-4 und IL-5 von SEA-stimulierten
PBMCs von gesunden Probanten.
-
Um
den wachstumshemmenden Effekt von bakterieller DNA auf die Hemmung
von IL-4 und IL-5 durch SEA-stimulierte PBMC von gesunden Probanden
zu untersuchen, wurde die genomische DNA von jedem Stamm in die
PBMC-Kultur in verschiedenen Konzentrationen eingebracht, und zwar
im Bereich von 5-105 μgml–1,
um zu bestimmen, welche Dosierung die größte hemmende Wirkung auf IL-4
und IL-5 Produktion hat (4). Dieser Dosierungsbereich wurde
auf der Basis von zuvor beschriebenen Versuchsergebnissen gewählt, die
zeigten, dass die Produktion von Cytokinen durch Immunzellen nach
der Eingabe von wenigstens 3 μgml–1 E-coli
nachgewiesen werden konnte. DNA und die optimale Stimulation benötigten eine
bakterielle DNA in einer Konzentration von > 50 μgml–1.
Wie in 4 gezeigt, wurde die maximale Hemmung von IL-4
und IL-5 dann beobachtet wenn genomische DNA in einer Konzentration
von 75 μgml–1 benutzt
wurde. Drei verschiedene Muster von Cytokinantworten konnten klar
unterschieden werden.
-
Genomische
DNA: Alle Stämmen
unterdrückten
die Produktion von IL-4 und IL-5 bei einer Konzentration von 75 μg ML–1,
mit Ausnahme von B. b-DNA und L-gg DANN, die die Produktion von
EL-4 und EL-5 bei einer Konzentration von 65 μg ML–1 unterdrücken.
-
Alle
genomischen DNAs unterdrücken
die Produktion IL-4 und IL-5
auf niedrigeren, stationären Pegeln,
wenn sie in einem Konzentrationsbereich von 5 bis 45 μg ML–1 zugegeben
werden. Im Gegensatz dazu zeigten alle genomischen DNAs eine dosierungsabhängige Verstärkung der
IL-4 und EL-5-Produktion, wenn sie in einem Kon zentrationsbereich
von 85 bis 105 μg
ML–1angewendet
wurden. Im Vergleich mit den anderen genomischen DNAs erscheinen
B. b und L-gg DNAs leistungsfähigere
Hemmer der IL-4 und IL-5-Produktion
in Antwort auf eine SEA-Stimulation zu sein. Weiterhin zeigte die
genomische DNA von B. b. den geringsten, hemmenden Einfluss auf
IL-5-Produktion bei einer Konzentration von 105 μg ml–1.
-
Wachstumshemmende Wirkung
von genomischer DNA von probiotischen Bakterien auf die Produktion von
EL-4 und EL-5 durch
SEA-stimulierte PBMC von allergischen Probanten.
-
Um
die wachstumshemmende Wirkung von genomischer DNA von probiotischen
Bakterien zu erforschen, wurde PBMC (2 × 106 ml–1)
mit 75 μg
ml–1 von
L-gg DNA, Bl DNA und LgsBbBE DNA für 24 Stunden inkubatiert. Drei
verschiedene Muster der Hemmung der IL-4-Produktion als Antwort auf die SEA-Stimulation
konnten klar unterschieden werden: Genomische DNAs von L-G und LgsBBL
zeigte den stärksten,
hemmenden Effekt, nämlich
37,4% +/– 4% respektive
39,56% +/– 5,1%.
L-Gasseri DNA zeigte den geringsten hemmenden Effekt (19,14% +/– 2%) und
B.b.B.l. zeigten ein gleiches Muster (24,47% +/– 3,28%). Umgekehrt zeigte
L-Gasseri DNA den höchsten,
wachstumshemmenden Einfluss auf die IL-S-Produktion als Antwort
auf SEA-Stimulation (61,41% +/– 3,74%),
LgsBbBl DNA zeigte die geringste Unterdrückung (46,31% +/– 4%) und
genomische DNA von L-GG, B.b. und B.i. zeigte ein gleiches Unterdrückungsmuster,
(Daten nicht gezeigt). Weiterhin verglichen wir den hemmenden Effekt
von genomischen DNAs mit lebenden Bakterien ebenso wie den unterdrückenden
Effekt von genomischen DNA auf die IL-4 und IL-5-Produktion als Antwort auf die SEA-Stimulation
zwischen gesunden und allergischen Probanden. Die wachstumshemmende
Wirkung von lebenden Bakterien auf die IL-4-Produktion durch gesunde
und allergische Probanden ist höher als
der Einfluss ihrer genomischen DNA. Im Gegensatz dazu ist der wachstumshemmende
Effekt von genomischer DNA in allergischen Probanden größer als
in gesunden Probanten (mit Ausnahme von L-Gasseri). Folglich sind
genomische DNAs leistungsfähiger
bei der Reduzierung der IL-4-Produktion als Antwort auf die SEA-Stimulation
bei allergischen Probanden.
-
Zusammenfassend
gesagt war der wachstumshemmende Effekt von lebenden Bakterien auf die
IL 5-Produktion als Antwort auf eine SEA-Stimulation bei PBMCs von gesunden und
allergischen Patienten gleich wie der Effekt auf die IL-4-Produktion (z.
B. war der hemmende Effekt von lebenden Bakterien höher als
der ihrer genomischen DNA sowohl bei gesunden als auch allergischen
Probanden). Aber die wachstumshemmende Wirkung von genomischen DNAs
auf die IL-5-Produktion bei gesunden Spendern war größer als
bei allergischen Probanden. Folglich sind genomische DNAs leistungsfähigere Hemmer
für IL-5
in gesunden Spendern. In Bezug auf eine DPT-Stimulation war der hemmende Effekt
von genomischer DNA von L-GG
und LgsBbBl auf die IL-4-Produktion durch DPT stimulierte PBMC von
allergischen Probanden höher
als bei gesunden Probanden (p > 0,05).
Ein gleiches Muster wurde für genomische
DNA von L-Gassery
B. b und B. l. erhalten. Weiterhin war der hemmende Effekt von genomischer
DNA von L-Gassery B.b B.l und LgsB.bB.l auf die IL 5-Produktion
von DPT-stimulierter PBMC von gesunden Probanden höher als
von allergischen Probanden. Aber der wachstumshemmende Einfluss von
L-GG DNA auf die IL-5-Produktion bei gesunden Probanden war derselbe
wie bei allergischen Probanden (3).
Folglich kann die genomische DNA von L-GG die IL 5-Produktion von DPT-stimulierter PBMC
von gesunden und allergischen Probanden in der gleichen Weise modulieren.
-
Diskussion
-
Allergien
sind hypersensitive Reaktionen des Immunsystems auf besondere Substanzen,
die Allergene genannt werden (wie Pollen, Insekten, Gift, Arzneimittel
oder Nahrungsmittel). Einige experimentelle Studien zeigen an, dass
die allergischen Krankheiten in Verbindung gebracht werden könnten mit
einer Störung
der TH1/TH2 Cytokinebalance mit einer relativen Übergewichtung von TH2 Cytokinen
und einem Fehlen von TH1 Cytokinen. In der Tat sind IL-4, IL-5, IL-3
und IL-9 an der Auslösung
und der Aufrechterhaltung von allergischen Reaktionen beteiligt.
Es wurde angenommen, dass TH2 Typ Cytokine bevorzugt in allergischen
Krankheiten beteiligt sind, weil die „TH2 zu TH1 Immun-Antwort-Verschiebung" weithin sichtbar
wird bei den meisten Typen von allergischen Erkrankungen. Die ermutigenden
Ergebnisse bei der Behandlung von allergischen Patienten mit probiotischen
Bakterien haben uns dazu veranlasst, die Wechselwirkung zwischen
TH1/TH2 Cytokinen und Allergien zu erklären. Folglich ist eine Strategie bei
der Therapie von Allergien die Veränderung der TH1/TH2 Balance
durch die Eingabe von probiotischen Bakterien, um das TH1/TH2-Gleichgewicht wieder
herzustellen. Von besonderem Interesse sind die Ergebnisse in Bezug
auf die Fähigkeit
von lebenden oder abgetöteten,
probiotischen Bakterien, die Menge von IL-4 signifikant zu vermindern
und die IFN-γ Cytokinmengen
zu erhöhen.
Weiterhin bewies eine aktuelle Studie, dass der schützende Effekt
von probiotischen Bakterien durch die Freisetzung von löslichen
Faktoren vermittelt werden könnte,
die die Durchlässigkeit
des Epithels ändern
und gegen pathogene, bakterielle Invasionen schützen. Diese Daten erheben die
Frage, ob dieser lösliche
Faktor oder andere verschiedene Cytoplasmische Bakterienkomponenten,
wie z. B. DNA, an der Auslösung
und Modulation von Cytokinen beteiligt sein könnte. Aus diesem Blickwinkel
erforschten wir die Auswirkung von lebenden Bakterien und reiner
genomischer DNA von L-GG, L-gasseri,
B. b, B.l. Stämmen
und LgasBbBL (eine Mischung von L-gasserie B.b. und B.l.) auf die Freisetzung
von den Cytokinen IL-4 und IL-5 unter Benutzung eines menschlichen
Kulturmodelles. Die Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Stämme von
probiotischen Bakterien ebenso wie ihre genomischen DNA signifikante
Wechsel im Profil der Cytokine auslösen, die in vitro von SEA oder
Dpt-stimulierten
PBMCs aktiv abgesondert werden. Weiterhin können sie die Th1/TH2 Balance
modulieren indem sie die Produktion von TH2 Cytokinen vermindern
und die von TH1 Cytokinen anwachsen lassen. Folglich können solche
probiotischen Bakterien einen nützlichen
Effekt bei allergischen Erkrankungen durch ihren hemmenden Effekt
auf die Produktion von TH2 Cytokinen ausüben.
-
Um
diesen Effekt zu untersuchen, haben wir zuerst PBMC von gesunden
und allergischen Probanten mit SEA oder Dpt-stimuliert (als ein
TH2-Cytokine-produzierendes Zellmodell). Zahlreiche Untersuchende
haben berichtet, dass PBMCs TH2 Cytokine nach der Stimulation mit
Superantigenen absondern. Wenn in dieser Studie SEA oder Dpt-stimulierte PBMCs
mit lebenden, probiotischen Bakterien und ihren genomischen DNA
vorinkubatiert wurden, wurde die Produktion von TH2 Cytokinen vermindert, aber
nicht in der Gegenwart von E-coli. Zusätzlich war dieser hemmende
Effekt abhängig
von der Dosis, so dass in einer Konzentration von 2 × 107 CFUml–1 (entsprechend zu einem
Verhältnis
von 10:1 von Bakterien zu PBMC) der hemmende Effekt von lebenden
Bakterien seinen Maximalwert in Bezug auf die IL-4 und IL-5 Produktion
erreichte. Ein solcher dosierungsabhängiger Effekt wird in Vitro
auch für
die Produktion von IL-10
und IL-12 durch Monozyten von gesunden Probanden nach der Inkubation
mit einigen Stämmen
von Gram-positiven Bakterien berichtet. Diese Studie zeigte auch,
dass nicht nur lebende probiotische Bakterien, sondern auch ihre
genomische DNA die IL-4 und IL-5-Produktion
durch SEA oder Dpt stimulierte PBMCs hemmen kann. Der wichtigste
Punkt dieser Studie ist, dass erstmals eine vorteilhafte Wirkung
von genomischer DNA oder probiotischen Bakterien auf die Zellen
von allergischen Patienten vorgestellt wird, die auf Hausstaubmilben sensibilisiert
sind; das sind mikroskopische Organismen, die in Wohnungen gefunden
werden. Sie sind die vorrangige Ursache von Allergien in Bezug auf Staub.
-
Andere
Berichte sind alle nur auf vorteilhafte Wirkungen von lebenden oder
abgetöteten
probiotischen Bakterien auf allergische Krankheiten bezogen, die
von Nahrungsmittelallergien oder Aeroallergenen verursacht werden.
Unsere Daten legen nahe, dass probiotische Bakterien und ihre genomische DNA
durch direkte oder indirekte Regulation des Signalpfades wirken,
der für
die Unterdrückung
von TH2 Cytokinen benötigt
wird, weil der hemmende Effekt sogar dann beobachtet wurde, wenn
die probiotischen Bakterien und ihre genomische DNA vor oder zugleich
(für genomische
DNA) mit der SEA oder Dpt Stimulation hinzugefügt wurden. Einige experimentelle
Studien zeigen an, dass die Modulation der Produktion von IL-4 und
IL-5 ein Multifaktor-Prozess ist und einige Cytokine wie z. B. IFN-γ als mögliche Regulatoren
der IL-4 Produktion beschrieben werden. Weiterhin wird berichtet,
dass IL-12 ein vorrangiges Cytokin bei der Auslösung der Produktion von IFN-γ durch menschliche
PBMCs ist. In unserer Studie waren probiotische Bakterien und ihre
genomische DNA in der Lage, die IL-12 Produktion durch PBMC zu steigern
(Daten nicht gezeigt).
-
In
dieser Beziehung wurde bakterielle DNA zu der SEA stimulierten PBMC-Kultur
hinzugegeben und interessanter Weise zeigten diese Experimente eine
manigfaltige IL-4 und IL-5 Cytokinproduktion nach der Stimulation
mit bakterieller DNA und der SEA-Behandlung. Bak terielle DNA von
probiotischen Bakterien reduzierte die IL-5-Absonderung stärker als die von IL-4. Unsere
Daten legen nahe, dass genomische DNA von probiotischen Bakterien
als Hemmer für
die Produktion von IL-4 und IL-5 von SEA und Dpt stimulierten PBMC
von gesunden und allergischen Probanden arbeiten können. Weiterhin
berichtet eine aktuelle Studie, dass durch Hitze abgetötete, probiotische
Bakterien die IL-4 und IL-5 Produktion durch SEA stimuliere PBMCs
vermindern. Unter der Beachtung davon, dass der Herstellungsprozess,
die Magen-Darm-Passage und hohe Temperaturen (70°C) die Lebensfähigkeit
der Bakterien beeinflussen, zeigen die Ergebnisse dieser Studien
einen möglichen
hemmenden Effekt von genomischer DANN, die von durch Hitze getöteten Bakterien
freigesetzt wird, welche zu PBMC hinzugegeben werden. Verschiedene
Artikel beschreiben die Antwort von verschieden Cytokinen auf CPG-Leitelemente die
in der bakteriellen DNA enthalten sind, wie z. B. genomische DNA
von L-GG. Es wäre
interessant zu wissen, ob die stammspezifische Freisetzung von Cytonkinen,
die in dieser Studie demonstriert wurde, in Beziehung zu der genomischen
Sequenz und den CPG-Leitelementen jedes Stammes steht.
-
Unserem
Wissen nach ist dieser Bericht der erste, der immunomodulierende
Wirkungen von genomischen DNAs von probiotischen Bakterien von SEA
oder Dpt-stimulierten PBMCs von gesunden und allergischen Probanden
zeigt. Die beobachteten Unterschiede bei Geschwindigkeit und Größe der Hemmung
von IL-4 und IL-5 als Antwort auf bakterielle DNAs und die SEA oder
Dpt-Stimulation sind interessante Informationen über den Einfluss von lebenden
oder abgetöteten
Probiotischen Bakterien und/oder bakteriellen Komponenten auf die
Immunantwort. Das wachsende Wissen über Probiotik ist anregend,
aber in naher Zukunft muss festgelegt werden, welche probiotische
DNA (einzelne Stämme oder
eine Kombination) die stärkste Wirkung
bei besonderen Krankheiten hat. Gut organisierte, klinische Versuche
nach dem Zufallsprinzip werden noch benötigt, um die Rolle von genomischen
DNA von probiotischen Bakterien als Vorbeugungs- und Therapiemittel
zukünftig
zu definieren.
-
Im
Folgenden sollen weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindungen
anhand von Beispielen mit Ergebnissen der Versuchsreihen näher erläutert werden.
Diese sollen die Erfindung jedoch nicht einschränken, sondern nur erläutern. Es
zeigt in schematischer Darstellung:
-
1 Zytokinmodulation
von PBMC ohne (Medium) oder mit Stimulation von SEA und DPT.
-
2 Dosierungsabhängiger,
hemmender Effekt von lebenden probiotischen Bakterien auf die Produktion
von IL-4 (A), IL-5 (B) und (IFN-γ) durch SEA-Stimulation
der PBMC von gesunden Probanden.
-
3 entfällt
-
4 Wachstumshemmende
Wirkung von genomischen DNA von probiotischen Bakterien auf die
Produktion von IL-4, IL-5 und IFN-γ durch SEA oder durch DPT stimulierte
PBMC von gesunden (A, n = 5) und allergischen (B, n = 5) Probanden.
-
5 Dosierungsabhängige, wachstumshemmende
Wirkung von genomischer DNA auf die Produktion von IL-4 (A), IL-5
(B) und IFN-γ (C)
durch PBMC von gesunden Probanden.
-
Die
Figuren zeigen im Einzelnen:
-
1
-
- Zytokinmodulation von PBMC ohne (Medium) oder mit Stimulation
von SEA und DPT.
- PBMC's von gesunden
(A, n = 8) und allergischen (B, n = 8) Probanden wurden vorinkubiert
für 3 Stunden (bei
2 × 106 Zellen/ml) mit Medium ohne (PBMC) oder mit
vier Stämmen
von probiotischen Bakterien, LgB.bB.L (eine Mischung von probiotischen
Bakterien und einem Gram-negativem Kontrollbakterium (e-coli TG1)
bei einem Bakterien zu Zellen Verhältnis von 10:1 vor entweder
Stimulation mit dem SEA-Superantigen
(2 μg/ML),
DPT (2 μg/ML)
oder nicht.
- IL-4, IL-5 und IFN-γ wurde
quantifiziert nach Stunden von Inkubation in Überständen durch eine spezifische
ELISA-Untersuchung. Die Sterne zeigen eine besondere Unterdrückung oder
Stimulation an (*p ≤ 0,05,
**p ≤ 0,01)
von TH2 und TH1 Zytokinproduktion im
Vergleich mit der Kontrolle.
-
2
-
- Dosierungsabhängiger,
hemmender Effekt von lebenden probiotischen Bakterien auf die Produktion von
IL-4 (A), IL-5 (B) und (IFN -γ)
durch SEA-Stimulation der PBMC von gesunden Probanden. PBMC von
vier gesunden Spendern (2 × 106 Zellen/ml–1 wurde
kultiviert mit vier Stämmen
von probiotischen Bakterien, L-GG, L- Gassery, B. b. b. l. in Konzentrationen von
5 × 104, 5 × 105, 2 × 106, 5 × 106, 2 × 107, 5 × 107 entsprechend zu 0,025, 0,25, 1, 2,5, 5,10
und 25 Bakterien zu Zellenverhältnis
für 3 Stunden
vor der Stimulation mit 2 μg
ml–1 von
SEA. Nach 48-stündiger Inkubation
wurde IL-4 , IL-5
und IFN-γ mit
spezifischer ELISA gemessen. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler
des Mittelwertes dar.
-
3
-
-
4
-
- Wachstumshemmende Wirkung von genomischen DNA von probiotischen
Bakterien auf die Produktion von IL-4, IL-5 und IFN-γ durch SEA
oder durch DPT stimulierte PBMC von gesunden (A, n = 5) und allergischen
(B, n = 5) Probanden.
- PBMC von fünf
gesunden und fünf
allergischen Probanden wurde für
48 Stunden (bei 2 × 106 Zellen ml–1) inkubatiert
mit genomischer DNA von 4 Stämmen von
probiotischen Bakterien, L-GG, L-Gasseri, B.b., B.l. und LGBBBL
(eine Mischung von L-Gasseri, B.b und B. l.). Bei einer Konzentration
von 75 μg
ml–1 vor der
Stimulation mit SEA (2 μg
ML–1)
oder DPT (2000 SQ – EML–1 entsprechend
einer 2 μg
Gabe ml–1).
- Als Kontrolle wurden das Medium und LPS (100 ng ml–1)
benutzt. Die Produktion von IL-4 , IL-5 und IFN-γ wurde nach einer Inkubationszeit
von 24 Stunden quantifiziert durch eine spezifische ELISA-Untersuchung. Die
Sterne bezeichnen eine herausragende Hemmung (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01) der
Zytokinproduktion in Vergleich zu der Kontrolle (Medium). Die Daten
sind ausgedrückt
als der Mittelwert +/– SEM.
-
5
-
- Dosierungsabhängige,
wachstumshemmende Wirkung von genomischer DNA auf die Produktion
von IL-4 (A), IL-5 (B) und IFN-γ (C)
durch PBMC von gesunden Probanden.
- PBMC von 4 gesunden Spendern wurde kultiviert mit verschiedenen
Konzentrationen (5–105 μg ml–1)
von bakterieller, genomischer DNA. Die Produktion von IL-4 (A) und
IL-5 (B) wurde nach 24-stündiger Inkubation
gemessen. Die Daten sind ausgedrückt
als Mittelwert +/– SEM.