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Die
Erfindung bezieht sich auf die Probenvorbereitung für die massenspektrometrische
Bestimmung von Proteinprofilen aus Blut, wobei die zu messenden
Proteine mit möglichst
reproduzierbaren Verhältnissen
ihrer Konzentrationen durch eine Breitbandextraktion gewonnen werden.
Die Proteinprofile können
beispielsweise für
medizinische Diagnosen, aber auch zur Kontrolle der Wirksamkeit
von Medikationen verwendet werden.
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Die
Erfindung stellt ein Probenvorbereitungsverfahren bereit, das die
Breitbandextraktion durch reversible Immobilisierung an bindungsaktiven
Festkörper-Oberflächen nach
Entnahme des Blutes noch im ärztlichen
Labor aus dem frischen Vollblut, dem Blutplasma oder dem Blutserum
vornimmt und nur die extrahierten Substanzen, vorzugsweise im immobilisierten
Zustand, dem massenspektrometrischen Labor für die Messung des Substanzprofils
zuführt. Damit
wird weitgehend vermieden, dass sich die Substanzkonzentrationen
durch chemische oder enzymatische Prozesse im stets reaktiven Blut
während der
wechselnd langen Transportzeiten nichtreproduzierbar verändern, und
es kann auf den Zusatz von Enzymhemmern oder auf ein Einfrieren
auf minus 80 Grad Celsius für
den Transport zum massenspektrometrischen Laboratorium verzichtet
werden.
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Stand
der Technik
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Die
massenspektrometrische Diagnostik durch die Messung und Auswertung
von Substanzprofilen, die aus Körperflüssigkeiten
gewonnen wurden, ist sehr aussichtsreich, steckt aber noch in den Kinderschuhen.
Es kommen zur Zeit die ersten Massenspektrometer auf den Markt,
die entsprechende Zulassungen für
medizinische Diagnostik haben. Die Zulassung wird durch eine streng
von staatlichen Stellen überwachte
IVD-Kompatibilitätserklärung (CE)
der Hersteller-Firmen
bewirkt. Die Abkürzung IVD
steht für „in vitro
Diagnostik". In
Deutschland ist diese Zulassung durch das Medizinproduktegesetz (MPG)
geregelt, das auf der europäischen
Richtlinie 98/79/EG beruht.
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Besonders
aussichtsreich ist eine Diagnostik durch die Messung von Proteinprofilen
aus Körperflüssigkeiten,
insbesondere aus Blut. Die Abnahme von Blut aus einer Vene wird
routinemäßig in jeder allgemeinärztlichen
Praxis durchgeführt;
das Risiko durch Nebenwirkungen ist dabei sehr klein. Noch geringer
ist das Risiko, wenn überhaupt
nur ein Tropfen Blut aus der Fingerkuppe oder dem Ohrläppchen entnommen
wird.
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In
den Proteinprofilen aus dem Blut können signifikante Über- oder
Unterexprimierungen von bestimmten Proteinen gemessen werden, die
sich in zu hohen oder zu geringen Konzentrationen widerspiegeln.
Es können
des Weiteren chemische Veränderungen
von Proteinen gemessen werden, die dann mit anderem Molekulargewicht
an anderen Stellen des massenspektrometrischen Proteinprofils auftauchen.
Statistisch signifikante Veränderungen
dieser Art sind immer ein Zeichen für eine bestimmte Stresssituation
des Körpers,
in einigen Fällen
sogar charakteristisch für eine
bestimmte Erkrankung oder Anomalie des Körpers. Solche in ihrer Konzentration oder
in ihrem Molekulargewicht stressbedingt charakteristisch veränderliche
Proteine werden heute „Biomarker" genannt, wobei sich
der Begriff „Biomarker" aber in der Regel
nicht nur auf ein einzelnes Protein, sondern eher auf ein Muster
mehrerer Proteine in ihrem Konzentrationsverhältnis zueinander bezieht. Die
Messung solcher Biomarker oder Biomarkermuster kann für medizinische
Diagnosen auf Krankheiten oder Anomalien verwendet werden, aber
auch für
die Einstellung oder Überwachung
von Medikationen und viele andere Zwecke bis hin zu pharmakokinetischen
Untersuchungen.
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Blut
besteht hauptsächlich
aus Wasser (etwa 90%), aus den verschiedenartigen Blutpartikelchen, aus
geringen Mengen Salzen, einigen nicht-proteinischen organischen
Substanzen und aus etwa sieben Prozent Proteinen, unter denen die
Albumine, Globuline und Fibrinogene den größten Anteil bilden. Wenn im
Folgenden ganz allgemein von „Blutproben" gesprochen wird,
so kann es sich um „Vollblut", um „Blutserum" oder auch um „Blutplasma" handeln; die Unterschiede
werden unten näher
erläutert.
Die hier als mögliche
Biomarker interessierenden Proteine sind in den Blutproben mit geringeren
Konzentrationen von unter einem Prozent bis hinunter zu 10–8 Prozent
vorhanden, wobei sich aber die Proteine sehr geringer Konzentration
einer direkten Messung entziehen, wenn sie nicht in besonderer Weise
substanzspezifisch „gefischt" oder durch ihre
Wirkungen indirekt gemessen werden können.
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In
einem guten Massenspektrometer können hundert
Attomol eines Proteins (60 Millionen Moleküle) noch ein messbares Signal
ergeben; für
die Erkennbarkeit in einem Proteinprofil mit seinem Untergrundrauschen
liegt aber diese Grenze wegen des unvermeidlichen Untergrundrauschens
höher;
sie liegt bei etwa zehn Femtomol. Das entspricht für ein Peptid
des Molekülgewichts
von 1000 Dalton einer Menge von zehn Picogramm, für ein Protein
des Molekülgewichts
von 10 000 Dalton einer Menge von hundert Picogramm. In einem kleinen
Blutstropfen von nur zehn Mikroliter Blut (zehn Milligramm) können also
Proteine bis hinunter zu einer Konzentration von 10–6 Prozent
gemessen werden, falls es gelingt, die interessierenden Proteine
alle der Messung zuzuführen
und ein Proteinprofil zu messen, das nicht vollständig mit
Proteinen überladen
ist. Direkt über
der Nachweisgrenze ist jedoch die Genauigkeit der Messung nicht
sehr gut, daher beschränkt
sich die Messung und Ausweitung der Proteinprofile im Allgemeinen
auf den Konzentrationsbereich von 10–1 bis
10–4 Prozent.
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Die
kleineren Proteine mit Molekülgewichten bis
zu einigen Tausend Dalton, die aus nur einigen Zehn Aminosäuren bestehen,
werden Peptide genannt; sie werden jedoch hier in den Begriff „Proteine" mit eingeschlossen.
Die Grenze zwischen Peptiden und Proteinen ist sehr unscharf. Die
weit überwiegende
Anzahl der Peptide im Blut sind so genannte „Verdaupeptide", die durch den ständig stärker oder
schwächer
stattfindenden enzymatischen Abbau von größeren Proteinen, beispielsweise
von Albuminen und Fibrinogen, aber auch von Fremdproteinen, entstehen.
Diese Verdaupeptide wurden bis vor kurzem als „Müll" betrachtet, in dem keine Information über den Zustand
des Körpers
zu finden sei. In einer kürzlich
erschienenen Arbeit wurde jedoch nachgewiesen, dass in Blut, das
ein bis zwei Tage ohne Enzymhemmer bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde,
mit zeitlich ansteigender Konzentration charakteristische Muster
von Peptiden zu messen waren, die jeweils auf bestimmte Enzyme hinwiesen. Diese
Enzyme waren wiederum eindeutig bestimmten Arten von Krebserkrankungen
zuzuordnen. Die Muster dieser Verdaupeptide konnten auch im Blutserum
oder Blutplasma, beide ohne Enzymhemmer aufbewahrt, nachgewiesen
werden. Die Enzyme selbst entzogen sich der massenspektrometrischen Messung
durch ihre sehr niedrige Konzentration; sie verrieten sich nur durch
die Produkte ihrer Aktivität. Somit
können
diese Peptidmuster sehr wohl als Biomarker dienen, wenn auch nur
durch eine bestimmte Behandlung und Aufbewahrung des frischen Blutes.
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Die
Anzahl verschiedenartiger Proteine im Blut ist extrem hoch, sie übersteigt
den Wert 100 000 bei Weitem. Selbst im Messbereich der Proteinprofile sind
viele Tausend Proteine zu finden. Ein Profil mit einer so hohen
Anzahl von Proteinen würde
das einzelne Protein nicht mehr erkennen lassen, da sich die massenspektrometrischen
Signale unaufgelöst überlagern
würden.
Es ist also notwendig, vor einer Messung eines Proteinprofils die
Anzahl der Proteine drastisch zu reduzieren, jedoch immer noch viele Proteine
zur Messung anzubieten. Das geschieht durch Breitbandextraktionen,
die Proteine bestimmter gemeinsamer Eigenschaften aus dem Blut zu
extrahieren vermögen.
Solche Breitbandextraktionen können
in der Regel einige Zehn bis einige Hundert Proteine, deren Konzentrationen
im messbaren Bereich liegen, gemeinsam extrahieren. Der Begriff „Breitbandextraktion" soll hier aber nicht
zu eng verstanden werden, auch solche Extraktionen, die beispielsweise
nur zwei Proteine für
eine Bestimmung ihres Konzentrationsverhältnisses reproduzierbar extrahieren,
soll hier durchaus noch unter dem Begriff Breitbandextraktion verstanden
werden.
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Es
gibt verschiedenartige Breitbandextraktionen, verschiedenartig sowohl
nach dem „Was" (Arten der extrahierten
Proteine) wie auch nach dem „Wie" (Mechanismus der
Extraktion). Unter den Mechanismen der Extraktion ist die reversible
Immobilisierung von Proteinen an entsprechend bindungsaktiven Festkörperoberflächen am
bequemsten zu handhaben. Sie wird hier ausschließlich betrachtet. Die bindungsaktiven
Festkörperoberflächen werden in
der Regel durch eine feste Beschichtung der Festkörperoberflächen mit
geeigneten Substanzen hergestellt.
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Die
verschiedenen Wirkungsarten der Breitbandextraktionen zeichnen sich
durch unterschiedlich beschichtete bindungsaktive Festkörperoberflächen aus,
sie ziehen ganz verschiedenartige Proteine aus der Blutprobe. Die
Proteine können
beispielsweise über
elektrische Wechselwirkungen an der Oberfläche gebunden werden, so durch
die feste Beschichtung der Oberflächen mit Anionen- oder Kationenaustauschern.
Dadurch werden Proteine verschiedener Ionenladung aus dem Blut extrahiert.
Andere Proteine können über hydrophobe
Bindungen affin gebunden werden, wie in der Umkehrphasen-Chromatographie
(reversed phase chromatography). Wiederum andere Arten von Proteinen
können über chelatartige
Bindungen verschiedener Art, über Ligandenbin dungen,
aber auch durch maßgeschneiderte,
proteinspezifische Bindungen nach Art der Antigen-Antikörperbindung
an der Oberfläche
festgehalten werden. Dabei lassen sich durch eine Mischung von verschiedenen
fest an Festkörperoberflächen gebundenen
Antikörpern
ebenfalls Proteinprofile extrahieren, nicht nur einzelne Proteine.
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Verschiedene
Arten der Breitbandextraktion ergeben in der Regel völlig verschiedene
Proteinprofile, da jeweils ganz andere Arten von Proteinen durch
reversible Immobilisierung an der Festkörperoberfläche extrahiert werden. Muster
von charakteristischen Biomarkern können sich aus Signalen in verschiedenartigen
Proteinprofilen zusammensetzen, sie brauchen also nicht einem einzigen
Proteinprofil zu entstammen.
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Die
bindungsaktiven Festkörperoberflächen für diese
Breitbandextraktion können
zu verschiedenartigen Festkörpern
gehören.
So können
die Gefäßwände der
Probenbehälter
selbst aktiv beschichtet sein oder es können sich bindungsaktive Beprobungsflecken
auf speziellen Probenträgern
befinden. Die Beschichtungen sollen fest, also irreversibel gebunden
sein. Es können
die Proben durch bindungsaktives Filtermaterial in Form von Vliesen,
offenporigen Schäumen
oder partikelgefüllten
Hohlräumen gepresst
werden. Es können
makroskopische Kügelchen
oder Körperchen,
aber auch Suspensionen von Mikro- oder Nanoteilchen mit bindungsaktiven
Oberflächen
zur flüssigen
Probe zugegeben und später durch
Filtration, durch Zentrifugieren oder durch magnetische Kräfte wieder
aus der Probenflüssigkeit herausgeholt
werden.
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Ein
Problem der Diagnostik anhand von Proteinen aus Blutproben ist die
ungewollte, stetige Veränderung
mindestens einiger Proteine während
der Lagerung und des Transports. Blut ist eine stets reaktive Flüssigkeit,
die in ihr enthaltenen Enzyme verlieren ihre Wirksamkeit nicht zum
Zeitpunkt der Blutentnahme. Die Enzyme verdauen andere Proteine,
oder sie verändern
sie in charakteristischer Weise. Hinzu kommen chemische Prozesse,
wie beispielsweise Oxidation, oft ebenfalls enzymatisch gesteuert.
Eine weitere Rolle spielt die Gerinnung, die durch die Veränderung
der Fibrinogene zu faserartigem Fibrin erzeugt wird, ebenfalls durch
Enzyme wie beispielsweise Thrombin gesteuert. Das Thrombin entsteht
durch den Zerfall der Thrombozyten, die zu den Blutpartikelchen
gehören.
Die Geschwindigkeit der Veränderung
der Proteine in Blut ist von vielen Faktoren abhängig: unter anderem spielt
die Temperatur der Probe eine Rolle, ihr Bewegungszustand und die
individuelle Zusammensetzung des Blutes selbst. Das Blut muss also
stets für
einen Transport oder eine Lagerung stabilisiert werden.
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Eine
erste Maßnahme
zur Stabilisierung ist die Zugabe von Gerinnungshemmern wie Heparin, Hirudin,
EDTH, Zitronensäure
oder anderen. Diese Art der Gerinnungsstabilisierung ist aber befristet
und stellt einen erheblichen Eingriff in die Probe dar. Eine daher
meist gewählte
und längerfristig
wirksame Maßnahme
ist die Entfernung der Blutpartikel, in der Regel durch leichtes
Zentrifugieren in Zentrifugen, wie sie in praktisch jeder ärztlichen
Praxis vorhanden sind. Dabei bleibt das farblose (leicht gelbliche)
Blutserum übrig,
das aber ebenfalls vor Gerinnung geschützt werden muss. Werden durch
künstlich
eingeleitete Gerinnung auch die Fibrinogene entfernt, so erhält man das
Blutplasma, das an sich als sehr stabil gilt, dessen Proteine aber
immer noch durch Enzyme laufend verändert werden. Für längere Lagerungen oder
Transporte ist es daher immer noch notwendig, auch dem Blutserum
oder dem Blutplasma Enzymhemmer, weitere chemische Stabilisatoren
und auch Antibiotika zuzugeben. Die Zugabe von Substanzen ist jedoch
immer auch eine Verfälschung
der originalen Probe.
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Als
eine wesentlich bessere Art der Stabilisierung hat sich daher das
Einfrieren der Vollblutprobe, des Blutserums oder des Blutplasmas
bei minus 80° Celsius
durchgesetzt, das aber nur in wenigen ärztlichen Praxen, meist nur
in Krankenhäusern, durchgeführt werden
kann. Für
den Transport über längere Strecken
müssen
dann auf Kältetransporte spezialisierte
Transportfirmen eingeschaltet werden; der Transport wird dadurch
teuer.
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Für eine massenspektrometrische
Diagnostik sind stets weiträumige
Probentransporte notwendig, da Massenspektrometer in Kosten und
Bedienung aufwändig
und nur in zentralen Einrichtungen zu finden sind. Die massenspektrometrische
Diagnostik ist daher bislang auf Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius
und Spezialtransporte eingestellt, was einer Verbreitung dieser
Diagnostik entgegensteht.
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Aufgabe
der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, ein preiswertes Verfahren der Probenvorbereitung
und des Probentransports für
die reproduzierbare Messung von Proteinprofilen aus Blutproben bereitzustellen. Dabei
soll das Blut in ärztlichen
Praxen abgenommen und die Proteinprofile sollen in massenspektrometrischen
Laboratorien gemessen werden. Im Regelfall befinden sich die massenspektrometrischen
Laboratorien nicht am Ort der ärztlichen
Praxis, es müssen also
die Proben so vorbereitet werden, dass ein preiswerter Transport
der Proben bei Normaltemperatur ohne transportabhängige Verfälschungen
ermöglicht
wird.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Die
Erfindung wird durch das Probenvorbereitungsverfahren des Anspruchs
1 dargestellt. Günstige
Ausführungsformen
und Gerätschaften sind
durch die weiteren Ansprüche
gegeben.
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Es
ist der Kerngedanke der Erfindung, die Breitbandextraktionen durch
reversible Immobilisierung an bindungsaktiven Festkörperoberflächen bereits
in der ärztlichen
Praxis in fertig konfektionierten Gefäßen vorzunehmen und die extrahierten
Proteine bei Normaltemperatur in gereinigtem und vorzugsweise immobilisiertem
Zustand an das massenspektrometrische Laboratorium zu versenden.
Der immobilisierte Zustand verhindert Reaktionen der Proteine untereinander.
Die Extraktion mit reversibler Immobilisierung an Oberflächen und
das anschließende
Waschen kann direkt in den Gefäßen für die Blutentnahme
am Vollblut vorgenommen werden, aber auch in besonderen Gefäßen, in
die verfahrensspezifisch in der ärztlichen
Praxis erzeugtes Blutserum oder Blutplasma eingefüllt wird.
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So
können
die Gefäße zur Blutabnahme oder
die Gefäße zur Extraktion
aus Blutserum oder Blutplasma durch eine fest gebundene Beschichtung mit
einer entsprechenden Extraktionsschicht für die Breitbandextraktion der
gewünschten
Art vorbereitet sein. Die Beschichtung kann sich beispielsweise
an der Innenoberfläche
der Gefäße befinden,
aber auch an makroskopischen oder mikroskopischen Füllkörpern oder
andersartigem Füllmaterial
wie Vliesen, offenporigen Kunststoffschäumen oder Fritten. Verschiedenartige
makroskopische Füllkörper, unterscheidbar
durch Form, Größe oder
Farbe, oder verschiedene Füllzonen
der Gefäße können verschiedenartige
Proteine für
verschiedenartige Proteinprofile extrahieren.
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Die
röhrchenförmigen Gefäße zur Blutabnahme
in der ärztlichen
Praxis sind üblicherweise evakuiert
und mit einer Membran versehen, die von einer einfachen Blutentnahme-Doppelnadel
durchstochen werden kann. Der Unterdruck befällt das Gefäß durch Ansaugen. Für die Extraktion
aus dem Vollblut kann dann die bindungsaktive Beschichtung die erwünschten
Proteine in einfacher Weise binden. Es ist allerdings dafür zu sorgen,
dass das Blut möglichst
intensiv mit den beschichteten Oberflächen in Kontakt kommt, die
einfache Diffusion dauert im doch recht viskosen Blut in der Regel
zu lange. Der innige Kontakt kann beispielsweise durch ständiges Wenden
(wie bei einer Sanduhr) oder durch Rühren hergestellt werden (beispielsweise
mit magnetischen Rührkörpern, deren
Oberfläche
auch wiederum bindungsaktiv beschichtet sein kann).
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Für die Breitbandextraktion
von Proteinen aus nur jeweils einem Tropfen Blut, beispielsweise
einem Blutstropfen nach Anstich der Fingerkuppe oder des Ohrläppchens,
können
besonders vorbereitete Extraktionspipetten vorzugsweise aus Kunststoff
verwendet werden, die einerseits einen kleinen Gummiball zum Ansaugen
von Flüssigkeiten
und andererseits interne bindungsaktive Beschichtungen der Innenoberfläche oder
Füllung
besitzen. Durch mehrmaliges Aufziehen kann ein guter Oberflächenkontakt
hergestellt werden.
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In
allen so für
die Breitbandextraktion vorbereiteten Gefäßen werden die immobilisierten
Proteine anschließend
mit einer geeigneten Waschflüssigkeit
mehrfach gewaschen. Die Waschflüssigkeit
ist ebenfalls konfektioniert. Die Gefäße werden anschließend mit
einer Verschlusskappe verschlossen und an das massenspektrometrische
Laboratorium eingeschickt. Dabei kann, je nach Verfahren, die Waschflüssigkeit
im Gefäß verbleiben,
oder eine ebenfalls konfektionierte Stabilisierungsflüssigkeit eingefüllt werden,
oder aber das Gefäß leer in
feuchtem oder getrocknetem Zustand verschlossen werden.
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Kurze
Beschreibung der Abbildung
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1 zeigt
eine Extraktionspipette für
die Breitbandextraktion von Proteinen aus einem Blutstropfen mit
Saugball (7) und zwei verschiedenen Füllzonen (2) und (5)
für zwei
verschiedenartige Breitbandextraktionen.
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Besonders
günstige
Ausführungsformen
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Eine
erste, sehr einfach Ausfährungsform bezieht
sich auf eine Breitbandextraktion von Proteinen aus einem Tröpfchen Blut,
das durch Anstich der Fingerkuppe oder des Ohrläppchens austritt und sehr einfach
in einer Extraktionspipette aus unzerbrechlichem Kunststoff aufgenommen
werden kann.
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Hier
wird die Breitbandextraktion der Proteine aus Vollblut in der ärztlichen
Praxis sofort beim Aufziehen des Blutes in der Extraktionspipette
durchgeführt.
Die Innenoberfläche
der Extraktionspipette ist bereits vorkonfektioniert mit der bindungsaktiven Extraktionsschicht
versehen. Das eine Ende der Extraktionspipette trägt zur Handhabung
einen kleinen Gummiball; das anderen Ende ist zum Versand mit einer
gasdichten Verschlusskappe versehen. Die Extraktionspipette ist
konfektioniert mit einem Schutzgas befällt.
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Eine
nicht mit anderem Material befüllte
Extraktionspipette von etwa acht Zentimeter Länge mit einem Innendurchmesser
von 0,4 Millimeter kann etwa 10 Mikroliter Blut aus einem kleinem
Blutstropfen aufsaugen, wie er durch Anstich der Fingerkuppe oder
des Ohrläppchens
austritt. Die Innenoberfläche dieser
sehr einfachen, nicht befüllten
Extraktionspipette beträgt
etwa 100 Quadratmillimeter. Sie kann in monomolekularer Bedeckung
etwa 100 Nanogramm einer Substanz eines Molekulargewichts von 1000 Dalton
aufnehmen, das entspricht rund 100 Picomol. Sind die extrahierten
Substanzen schwerer, so kann mehr aufgenommen werden, weil die Molekülschicht dicker
ist. Diese maximale Extraktionsmenge verteilt sich allerdings auf
alle 50 bis 200 Proteine, die üblicherweise
in einem Extraktionsschritt extrahiert werden. Da die Nachweisgrenze
im Massenspektrometer bei etwa zehn Femtomol liegt, kann mit dieser
einfachen, nicht befüllten
Extraktionspipette der interessierende Konzentrationsbereich durchaus
abgedeckt werden. (Konkurrierende Systeme arbeiten mit ebenen Extraktionsflächen von
nur etwa vier Millimeter Durchmesser auf metallenen Probenträgern, das entspricht
einem kleinem Bruchteil der Fläche
in den Kapillarpipetten.)
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1 zeigt
eine Extraktionspipette, die mit Füllmaterial versehen ist, hier
sogar mit zwei Arten von Füllmaterial
in zwei Kapillarfüllzonen
(3) und (4). Vor der ersten Kapillarfüllzone (3)
befindet sich ein Leerraum (1), der beispielsweise genau
10 Mikroliter groß ist
und zunächst
mit Vollblut befällt
wird. Sodann wird das Blut durch Entspannen des Saugballs (7) durch
die beiden Kapillarfüllzonen
(3) und (4) in einen weiteren Leerraum (6)
gezogen und wieder zurück
in den Leerraum (1) gedrückt. Dieser Vorgang kann mehrfach
wiederholt werden. Die Füllung
in den Kapillarfüllzonen
(3) und (4) kann beispielsweise aus Kunststoffschaum,
aus Vlies oder gepackten Teilchen bestehen, damit kann die bindungsaktive
Oberfläche
gegenüber
einer nicht befüllten
Extraktionspipette leicht auf das zehn- bis tausendfache vergrößert werden. Die Füllungen der beiden Kapillarfüllzonen
(3) und (4) bestehen aus verschiedenartig bindungsaktiv
beschichtetem Füllmaterial,
um zwei oder mehrere verschiedenartige Breitbandextraktionen aus
nur einem Blutstropfen vornehmen zu können. So kann beispielsweise
eine Kapillarfüllzone
mit einer hyd rophoben Beschichtung aus kovalent gebundenen Alkanen
mit je acht Kohlenstoffatomen Länge („C8"), die andere Kapillarfüllzone mit
schwach bindendem Anionenaustauscher („WAX" = weak anion exchanger) versehen sein.
Die Pipettenkapillare aus Kunststoff kann später im massenspektrometrischen Laboratorium
zerschnitten werden, um die einzelnen Proteinextraktionen getrennt
zu eluieren und zu messen.
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Die
Extraktionspipette ist für
eindeutige Identifizierungen mit Kennungen versehen, wobei die verschiedenen
Kapillarfüllzonen
(3), (4) jeweils solche Kennungen tragen, um auch
nach einem Zerschneiden noch identifizierbar zu sein. Die Kennungen
können
aus aufgedruckten Barcodes, angeklebten bedruckten Fahnen (2),
(5) aus Papier oder Kunststoff mit Barcodes oder anderen
Informationen, oder aus Chips mit elektronisch auslesbaren Informationen (RFID
= radio frequency identification) bestehen.
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Das
Blut kann durch mehrmaliges Aufziehen in guten und innigen Kontakt
mit den Innenoberflächen
gebracht werden. Anschließend
kann das Blut entfernt und eine konfektioniert gelieferte Waschflüssigkeit
aufgezogen werden. Mehrfaches Waschen führt zur restlosen Entfernung
der Blutflüssigkeit.
Die Extraktionspipette kann nun mit der Verschlusskappe verschlossen
und zum massenspektrometrischen Labor versandt werden. Dabei kann,
je nach Verfahrensvorschrift, die letzteingefüllte Waschflüssigkeit
in der Extraktionspipette verbleiben, eine besondere, ebenfalls
konfektioniert gelieferte Transportflüssigkeit eingefüllt werden,
oder die gezielt entleerte Extraktionspipette feucht oder getrocknet,
dann vorzugsweise mit Schutzgas befüllt, zum Versand kommen. Die
Wasch- oder Transportflüssigkeit
kann antibiotische Stoffe, beispielsweise Bleiacid, enthalten.
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Außerdem können sich
in der Extraktionspipette eine oder mehrere Substanzen befinden,
vorzugsweise ebenfalls Proteine, die sich sofort im Blut lösen, und
die ebenfalls extrahiert werden und bei der massenspektrometrischen
Messung als Konzentrationsreferenz dienen können. Diese Referenzproteine sollen
dabei nach Möglichkeit
nicht bereits an der bindungsaktiven Beschichtung immobilisiert
sein, sondern sich zunächst
frei im aufgenommenen Blut lösen
können,
um später
die extrahierte Menge widerspiegeln zu können. Sie können sich beispielsweise vor
der Benutzung im Leerraum (1) befinden.
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Im
massenspektrometrischen Labor können die
reversibel immobilisierten Proteine einfach durch Aufnehmen mit
etwa einem Mikroliter eines scharfen organischen Lösungsmittels,
beispielsweise Aceton, Acetonitril oder Methanol, aus der Extraktionspipette oder
ihren Teilstücken
entfernt und auf den massenspektrometrischen Probenträger aufgegeben
werden. Die Menge des Lösungsmittels
ist unkritisch, da es anschließend
eingedampft wird. Das Lösungsmittel
kann dabei bereits mit einer Matrixsubstanz versehen sein, wie sie
zur Ionisierung im MALDI-Massenspektrometer
benötigt
wird, diese kann sich aber auch bereits auf dem Probenträger befinden
oder nachträglich
zugegeben werden. Dieser Vorgang kann leicht automatisiert werden.
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Dabei
kann auch leicht eine Barcode-Kennung ausgelesen werden, die sich
auf der Kapillarpipette befindet, damit Probenverwechslungen möglichst
gut ausgeschlossen werden können.
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Als
Massenspektrometer können
sowohl solche mit MALDI-Ionenquellen wie auch mit Elektrosprühionenquellen
(ESI) zur Anwendung kommen. Im Falle von MALDI-Massenspektrometern
wird das der Extraktionspipette entnommene Eluat mit einer geeigneten
Matrix versetzt und auf einem Probenträger eingetrocknet. Die feste
Probe auf dem Probenträger
wird dann in der Ionenquelle des Massenspektrometers mit Laserlichtblitzen
beschossen; die entstehenden Ionen werden durch ihre Flugzeit im
Flugzeitmassenspektrometer nach Massen getrennt, in einem Ionendetektor
nachgewiesen und der Menge nach gemessen. Dieser Ionisierungsprozess
durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI) liefert nur einfach geladene, unzerstörte Ionen
der Moleküle;
das Massenspektrum ist daher ein getreues Abbild des Proteinprofils.
Einem Massenspektrometer mit Elektrosprühionenquelle (ESI) kann das
Eluat entweder direkt oder aber nochmals über einen Chromatographen aufgetrennt
dem Massenspektrometer zugeführt
werden. Diese Art der Ionisierung liefert aber auch mehrfach geladene
Ionen der Analytmoleküle;
das Massenspektrum ist daher schwieriger auszuwerten. Im Allgemeinen
wird daher die MALDI-Massenspektrometrie bevorzugt.
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Eine
weitere, ebenfalls noch sehr einfache Ausführungsform besteht darin, die
in jeder ärztlichen
Praxis vorhandene Technik der Blutabnahme mit Einstich in die Vene
zu verwenden. Es wird dabei ein evakuiertes Blutentnahmegefäß mit einigen
zehn Millilitern Blut befüllt.
Soll die Breitbandextraktion aus dem Vollblut vorgenommen werden,
so ist dieses Gefäß bereits
für die
Breitbandextraktion vorbereitet. Das kann durch eine Aktivschicht
an der Innenoberfläche,
aber auch durch Füllkörper oder
Füllmaterial mit
bindungsaktiven Oberflächen
im Gefäß oder durch
beides bewirkt werden.
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Wird
die Breitbandextraktion durch eine Aktivschicht an der Innenoberfläche des
Entnahmegefäßes durchgeführt, so ähnelt das
Verfahren dem oben geschilderten Verfahren mit Kapillarpipetten.
Es ist aber dafür
zu sorgen, dass der Kontakt des Blutes mit der Gefäßwand sehr
innig ist. Das kann durch häufiges
Umwenden, gegebenenfalls in einem kleinen Wendeautomaten, insbesondere
aber auch durch eine Befüllung
des Entnahmegefäßes mit
geeigneten Füllkörpern geschehen.
Die Füllkörper sinken
beim Umwenden jeweils ab und rühren
so das Blut ständig
um. Magnetische Rührkörper können in einem
magnetischen Drehfeld eine andauernde Rührbewegung erzeugen.
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Die
Füllkörper können aber
auch ihrerseits mit aktiven Oberflächen zur Breitbandextraktion
versehen sein. Dabei können
Füllkörper verschiedener Form
oder verschiedener Farbe sogar mit verschiedenartigen Schichten
für die
Extraktion verschiedener Proteinprofile versehen sein. Es können sich auch
bindungsaktive Oberflächen
für die
Extraktion von Globulinen und Albuminen darunter befinden, die eine
Abreicherung dieser hoch konzentrierten Proteine bewirken.
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Die
Füllkörper können makroskopisch
groß, aber
auch mikroskopisch klein sein. Mikropartikelchen mit magnetischem
Kern lassen sich besonders gut mit einfachen Permanentmagneten an
der Gefäßwand sammeln
oder durch die Flüssigkeit
ziehen. Die Mikropartikel zeichnen sich durch eine besonders große aktive
Oberfläche
aus, sind aber wegen der Gefahr einer Koalgulation mit den Blutkörperchen nicht
gut für
eine Vollblutextraktion einsetzbar.
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Diesen
Breitbandextraktionen am Vollblut stehen die Breitbandextraktionen
am Blutserum und Blutplasma gegenüber, die in der Regel ebenfalls
in jeder ärztlichen
Praxis aus dem Vollblut gewonnen werden können. Diese Extraktionen werden
ebenfalls in konfektioniert gelieferten Gefäßen durchgeführt. Auch
hier können
die Innenoberflächen
der Gefäße, aber
auch Befüllungen
mit Füllkörpern oder
anderem Füllmaterial
für die
Extraktion eingesetzt werden. Hier können beispielsweise sehr gut
magnetische Mikropartikel eingesetzt werden.
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Für die Breitbandextraktion
aus Blutserum oder Blutplasma können
natürlich
auch die oben geschilderten Extraktionspipetten eingesetzt werden.
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Ein
besonderes Diagnoseverfahren besteht darin, die charakteristischen
Enzyme, die bei besonderen Krankheiten gebildet werden, zunächst nach der
Abnahme des Blutes im Vollblut, im Blutserum oder im Blutplasma
ohne die Zugabe von Enzymhemmern wirken zu lassen. Die Verfahrensvorschrift enthält genaue
Angaben über
Temperatur und Dauer der Lagerung, die in der Regel bei etwa 48
Stunden liegt. Erst dann wird das Vollblut, das Blutserum oder das
Blutplasma in die Gefäße für die Breitbandextraktion
eingefüllt,
und es werden insbesondere die Verdaupeptide der Enzymarbeit extrahiert.
Diese lassen sich häufig
besonders gut mit hydrophoben Oberflächen extrahieren, die mit Alkanmolekülen einer
Länge von
18 Kohlenstoffatomen („C18") kovalent gebunden
belegt sind. Dadurch können
anhand ihrer Verdauungsprodukte solche Enzyme nachgewiesen werden,
die sich wegen ihrer viel zu geringen Konzentration jeder normalen
massenspektrometrischen Messung eines Proteinprofils entziehen.
Dieses sehr viel versprechende Verfahren wird durch die vorliegende
Erfindung in besonderer Weise unterstützt, da die Arbeit der Enzyme
direkt nach der Abnahme des Blutes, gegebenenfalls nach Entfernung der
Blutkörperchen
und Gerinnungsstoffe, in gut kontrollierter Weise noch in der ärztlichen
Praxis ablaufen muss.
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Es
gibt jedoch noch weitere Verfahren, auch Proteine sehr geringer
Konzentration noch sicher zu messen. Dazu müssen diese Proteine allerdings
genau bekannt sein. Sie können
dann durch fest kovalent gebundene, also nicht nur reversibel immobilisierte,
monoklonale Antikörper
für genau
diese Proteine aus dem Blutserum oder dem Blutplasma gezielt herausextrahiert
(„gefischt") werden. Die Antikörper zur
Extraktion einer Reihe von interessierenden Proteinen können sich
beispielsweise auf der Oberfläche
von Magnetpartikelchen befinden. Da hier nur einige wenige Proteine
sauber extrahiert werden, ist das Proteinprofil, das so massenspektrometrische
gemessen wird, ebenfalls sehr sauber; es können so Konzentrationen an
Mengen bis herunter zu 100 Femtomol (etwa 10–10 bis
10–9 Gramm)
gut vermessen werden. Aus nur zehn Millilitern Blut (10 Gramm) können also
Proteine mit Konzentrationen von nur 10–9 bis
10–8 Prozent
gemessen werden, wenn es gelingt, diese Proteine restlos zu extrahieren.
An diesen Verfahren wird zur Zeit gearbeitet. Es ist noch nicht
bekannt, ob die theoretischen Vorhersagen auch eintreffen. Es ist
ebenfalls nicht bekannt, inwieweit sich in diesen Konzentrationsbereichen wirklich
Biomarker finden lassen.
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Seit
Neuestem ist es auch möglich,
die Wirkung der Antikörper,
die im Bereich der Molekulargewichte von 150 000 bis 190 000 atomaren
Masseneinheiten liegen, durch computermodellierte Peptide im Bereich
von nur 20 Aminosäuren
(nur etwa 2400 atomaren Masseneinheiten) zu erzielen und damit die
teueren Antikörper
durch preiswert synthetisierbare Peptide zu ersetzen. Es besteht
aber die Gefahr erhöhter
Kreuzreaktivität,
die jedoch massenspektrometrisch leicht erkannt wird. Es sind auch
andere spezifisch wirksame Interaktionspartner bekannt, wie Lektine,
Metallchelate zur Phosphatbindung (IMAC), Protein Nucleic Acids
(PNA), Oligonukleotide, Inhibitoren, Rezeptoren, Liganden und andere.
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Um
also die Konzentrationsverhältnisse
verschiedener Proteinabkömmlinge
in einer flüssigen Probe
zu messen, wird der Probe eine festgelegte Menge einer Suspension
mit Mikropartikeln zupipettiert, wobei die Mikropartikel mit Fängermolekülen in fester
Bindung belegt sind. Die Mikropartikel sind vorzugsweise magnetisierbar.
Es haben sich Suspensionen aus magnetisierbaren Mikrokügelchen
(„magnetic
beads") mit 900
Nanometern Durchmesser bereits für
andere Anwendungen bestens bewährt;
Suspensionen dieser Kügelchen
bleiben lange brauchbar. Die Fängermoleküle können beispielsweise
monoklonale Antikörper
oder Moleküle ähnlicher
Spezifität
sein. Es ist dabei in diesem Fall sorgfältig darauf zu achten, dass
die Mikropartikel für
keine der zu messenden Proteinabkömmlinge bis zur Sättigung belegt
werden, da sonst die Verhältnisse
der Konzentrationen nicht mehr richtig gemessen werden können.
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Anschließend werden
die Partikelchen von der Flüssigkeit
separiert. Magnetisierbare Partikelchen können beispielsweise durch einen
starken Permanentmagneten an die Wand des Gefäßes gezogen werden. Das Gefäß sollte
zu diesem Zweck nicht allzu ausgedehnt sein, da die Magnetwirkung sich
nur über
etwa fünf
bis zehn Millimeter erstreckt. Auch hier hilft ein vorsichtiges
Rühren
oder Schwenken, um alle Partikel langsam in den Wirkungsbereich
des Magneten zu bringen und so schließlich in Büscheln an der Wand einzufangen.
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Die
wandverhafteten oder sedimentierten Partikelansammlungen werden
dann durch Abgießen
oder Pipettieren von der Probenlösung
befreit, und es wird eine Waschflüssigkeit zugegeben. Die Partikel
werden durch Entfernen des Magneten und durch Umrühren gewaschen.
Der Waschvorgang kann erforderlichenfalls mehrmals wiederholt werden.
Zuletzt wird der weitgehend flüssigkeitsfreien Partikelansammlung
eine Eluierungsflüssigkeit
zugegeben, die die Proteine von den Antikörpern oder den andersartigen
Fängermolekülen trennt.
Solche Eluierungsflüssigkeiten
sind in der Regel scharfe, polare organische Lösungsmittel wie Aceton, Acetonitril oder
Alkohole.
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Die
Eluierungsflüssigkeiten
mit den Proteinen werden dann der massenspektrometrischen Messung
zugeführt.
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Der
Fachmann auf diesem Gebiet kann sich in Kenntnis dieser Erfindung
weitere Ausführungsformen
der Verfahren und Gerätschaften
entwickeln. Alle diese Ausführungsformen
sollen im Erfindungsgedanken eingeschlossen sein.