DE102005044530A1

DE102005044530A1 - Verfahren zur verbesserten Konservierung von Säugerspermatozoen und verbessertes Verfahren zur geschlechtsspezifischen Selektion von Säugerspermatozoen

Info

Publication number: DE102005044530A1
Application number: DE200510044530
Authority: DE
Inventors: Dettmar Dr. Frese; Detlef Prof. Dr. Rath; Primoz Klinc; Birgit Sieg
Original assignee: NORDRIND GmbH; Rath Detlef Profdr
Current assignee: Masterrind De GmbH; Sieg Birgit De
Priority date: 2004-09-16
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2025-09-17
Also published as: DE102005044530B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Konservierungsmittel für Säugerspermatozoen, das von jeder Vorbehandlung unabhängig ist, sowie auf ein neues Verfahren zur Konservierung von Spermatozoen und auf konservierte Spermatozoenpräparate. Die neuen Haltbarkeitsmittel verbessern die Qualität, d. h. die Motilität, Membranintegrität und Befruchtungsfähigkeit von Spermatozoen, die von männlichen Säugetieren erhältlich sind, sowohl für Frisch- als auch für Tiefkühlsperma. Das Konservierungsverfahren und die Konservierungsmittel können auch auf Spermatozoen angewendet werden, die in X- und Y-Chromosomen enthaltende Fraktionen sortiert sind. Unter einem anderen Gesichtspunkt beschreibt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Sortieren von Säugerspermatozoen in X- und Y-Chromosomen enthaltende Fraktionen sowie die Spermatozoenfraktionen, die durch das Verfahren erhältlich sind, wobei beide die Wirkungen der neuen Konservierungsmittel ausnutzen. Wenn Spermatozoen in X- und Y-Chromosomen enthaltende Fraktionen sortiert werden, führt die Messung ihres DNA-Gehalts und die nachfolgende Ablenkung in verschiedene Sammelgefäße dazu, Schädigungen der Spermatozoenzellen auszulösen. Das verbesserte Verfahren ergibt Spermatozoen, die weniger Schädigungen erlitten haben, was sich in einer verbesserten Befruchtungsfähigkeit wiederspiegelt, wenn die Wirkungen der Konservierungsmittel gemäß der Erfindung ausgenutzt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Mittel und Verfahren zur Konservierung von Säugerspermatozoen, unabhängig von deren Vorbehandlung sowie auf ein neues Verfahren zur Konservierung von Spermatozoen und auf konservierte Spermienpräparationen. Die neuen Konservierungsmittel verbessern die Qualität, z.B. Motilität, Membraneigenschaften und Befruchtungsfähigkeit (Fertilität) von Spermatozoen, die von männlichen Säugetieren erhältlich sind, sowohl in Form von Frischsamenpräparaten als auch tiefgekühlten Samenpräparationen. Das neue Konservierungsverfahren und die Konservierungsmittel sind auch auf Spermatozoen anwendbar, die in X- und Y- Chromosom tragende Populationen sortiert werden oder bereits sortiert worden sind.
Weiterhin beschreibt die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Sortieren von Säugerspermatozoen in X- und Y-Chromosom tragende Spermienfraktionen, sowie die verbesserte Konservierung der durch das Verfahren gewonnenen Spermienfraktionen, wobei die Wirkung der neuen Konservierungsmittel genutzt wird.
Während der Trennung der Spermatozoenpopulation in X- und Y- Chromosom tragende Spermienfraktionen führen Messung des DNA Gehaltes und Sortierung in Sammelgefäße zu Schädigungen an den Spermatozoen. Das verbesserte Verfahren schützt die Spermatozoen bereits während sowie nach dem Sortierprozess und während der nachfolgenden Frisch- oder Tiefkühlkonservierung. Hierdurch wird die Fruchtbarkeit der sortierten Spermatozoen deutlich verbessert.
In der Tierzucht werden biotechnische Verfahren wie die instrumentelle Samenübertragung mit dem Ziel eingesetzt, die Nutzung von Spermatozoen von solchen Vatertieren zu maximieren, die in ihren Eigenschaften über dem Zuchtdurchschnitt liegen. Die vorliegende Erfindung trägt hierzu bei. Die Erfindung ist nicht auf eine Säugertierart beschränkt sondern schließt beispielsweise Rinder, Schweine, Schafe, Pferde, Kamele und andere Säugertierarten incl. Mensch mit ein.
Im Zeitraum zwischen Spermagewinnung und Besamung bzw. In-vitro-Befruchtung wird Sperma bislang unter gekühlten Bedingungen als Flüssigsamen oder im tiefgefrorenen Zustand gelagert. Dabei beträgt die Dauer, über die Fruchtbarkeit von frischem Flüssigsamen in ausreichendem Maße aufrecht erhalten bleibt, max. 5 Tage, tiefgefrorenes Sperma muss unmittelbar nach dem Auftauen verwendet werden. Bei diesen beiden bekannten Präparaten wird die Fruchtbarkeit durch Absinken der Motilität, durch Membranveränderungen und durch Abnahme funktioneller Mechanismen herabgesetzt. Die Anwendung biotechnischer Verfahren wie der Tiefkühlung und dem Sortieren der Spermatozoen im X-und Y-Chromosom tragende Populationen beschleunigt die Abnahme der Spermienqualität.
Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein verbessertes Verfahren zum Sortieren von Säugerspermatozoen in X- und Y-Chromosom tragende Populationen und auf die Spermafraktionen, die durch das Sortierverfahren erhalten werden, wobei sowohl das Sortierverfahren als auch die hierdurch erhaltenen Spermienfraktionen von der Wirkung der neuen Konservierungsmittel profitieren. Denn die Aufbereitung der Spermatozoen für den Sortierprozess, die Anfärbung der DNA, die Exposition im elektrischen Feld und hoher Druck im laminaren Flüssigkeitsstrom wirken sich nachteilig auf die Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit aus. Das Verfahren der Erfindung reduziert die Schädigungen, was sich in einer höheren Fruchtbarkeit widerspiegelt, und erlaubt gleichzeitig eine höhere Durchsatzrate (sortierte Spermien/Zeiteinheit). Hierbei werden die schützenden und fixierenden Komponenten der neuen Konservierungsmittel genutzt.

Bei der Spermakonservierung und Lagerung können reduzierende Sauerstoffspezies (ROS) z.B. durch Alterungsprozesse entstehen. Zur Konservierung nicht sortierten Flüssigsamens ist es bekannt, dass die Lebensfähigkeit der Spermatozoen sowohl durch Zugabe antioxidativer Verbindungen als auch durch Substanzen verlängert werden kann, die aggressive oder zerstörerische Sauerstoffspezies eliminieren. Für die Zwecke dieser Erfindung werden unter diese Substanzen auch Enzyme gefasst. Ein Beispiel ist Katalase, ein Enzym, das Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff umsetzt, oder alternativ Wasserstoffperoxid zu Wasser umsetzt, während Methanol oder Ethanol oxidiert wird. Weitere bekannte antioxidative Enzyme sind Superoxiddismutase (SOD), Glutathionreduktase (GR) und Glutathionperoxidase (GPx), sowie Mercaptoethanol und Natriumpyruvat.

Zur Bestimmung des Geschlechts von Nachkommen von Säugetieren in der Zucht werden Spermafraktionen von in natürlicher Weise gewonnenen Spermatozoen erzeugt, die mittels eines Sortierverfahrens in X- bzw. Y- Chromosomen-tragende Spermapopulationen angereichert werden. Die Verfahren zur Fraktionierung, auch Sortieren genannt, basieren auf der Unterscheidung der Spermatozoen entsprechend des unterschiedlichen relativen Gesamt-DNA-Gehaltes, der für das X- Chromosom geringer ist. Eine häufig angewandte Fraktionierung von Sperma verwendet das Fluoreszenz-aktivierte Zellsortieren (FACS) von gefärbten Spermatozoen.

Aus dem US-Patent 5 135 759 von Johnson ist bekannt, Säugerspermatozoen unter Verwendung von FACS in Fraktionen zu sortieren, die vornehmlich X- oder Y-Chromosomen tragende Spermapopulationen enthalten. Dieses Verfahren misst den DNA-Gehalt von Spermatozoen nach Anfärbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, z.B. Hoechst Bisbenzimid H 33342 Fluorochrom, der DNA in lebenden Zellen reversibel anfärbt. Vor der eigentlichen Messung werden die Spermatozoen in einzelne Tropfen aufgetrennt, die vornehmlich von einer Hüllflüssigkeit gebildet werden, die jede Zelle einkapselt, wenn sie durch eine angeschrägte Probeneinspritzspitze hindurchtritt, die zur Erzeugung von Tropfen vibriert. Diese einzelnen Tropfen, die jeweils eine Samenzelle enthalten, passieren einen Laserstrahl, der als Anregungsquelle für den Fluoreszenzfarbstoff wirkt.

Gemäß der US 5 135 759 nimmt ein erster optischer Detektor, der im Pfad des Anregungslasers angeordnet ist, das von der flachen Oberfläche der Spermatozoen emittierte Licht auf. Sein Intensitätssignal wird dem DNA-Gehalt für X- und Y-Chromosomen-haltige Zellen zugeordnet und elektrische Ladungen werden entsprechend des jeweiligen DNA-Gehalts auf die Tröpfchen aufgebracht. Die Tröpfchen passieren dann ein elektrostatisches Feld und lenken die Zellen in getrennte Behälter ab.

Die Effizienz der Sortierung hängt von der Ausrichtung der Spermien vor dem Laserstrahl ab. Dabei kommt den hydrodynamischen Kräfte innerhalb der abgeschrägten Spitze der tröpfchenbildenden Einheit große Bedeutung zu, denn sie orientieren die Spermien mit ihrer flachen Seite senkrecht zum Laserstrahl. Diese Orientierung ist für die quantitative Messung ihrer Fluoreszenz wesentlich, da die Orientierung der Spermienköpfe in Beziehung zu dem Anregungslaser und dem optischen Detektor auf Grund ihrer flachen Form zu einem unterschiedlichen Intensitätssignal führt. Ein zusätzlicher zweiter optischer Detektor, der in 90° zu dem ersten Detektor angeordnet ist, dient dazu, die Fluoreszenzintensität zu messen, die die Orientierung der Spermienköpfe anzeigt. Spermien, die nicht genau ausgerichtet sind, werden verworfen, was zu wesentlichen Verlusten führt. Die verworfenen Spermien können aufgrund des hohen Verdünnungsgrades mit der Trägerflüssigkeit nicht für einen weiteren Sortierprozess verwendet werden.

Die Orientierung der Spermien vor dem Laserstrahl wird durch Eigenbewegungen der Spermien negativ beeinflusst. Wenn nur flache, ovoide Spermaköpfe sortiert werden, d.h. Spermatozoen, deren Schwänze z.B. durch Ultraschallbehandlung entfernt worden sind, werden durch die hydrodynamischen Kräfte innerhalb der abgeschrägten Spitze mehr als 80% der Spermienköpfe richtig ausgerichtet.

Wenn jedoch polyfunktionale Spermatozoen (intakte, motile Spermien) verwendet werden, reduzieren deren Eigenbewegungen die Ausrichtung vor dem Laser und ein erhöhter Anteil muss verworfen werden. So zeigt die US 5 135 759 , dass für einen wesentlichen Anteil intakter Spermatozoen eine hydrodynamische Ausrichtung nicht erreicht werden könne. Zur Falsch ausgerichtete Spermatozoen werden entsprechend des Randsignals, das von dem zweiten optischen Detektor erfasst wird, verworfen. Der Anteil korrekt ausgerichteter Spermatozoen beträgt ca. 15 bis 20% für intakte Spermatozoen, die korrekt gemessen und sortiert werden können, wohingegen die verbleibenden 80 bis 85% verworfen werden, wenn eine Strömungsrate von etwa 25.000 Ereignissen pro Sekunde verwendet wird. Für eine Erhöhung des Anteils von Spermatozoen mit der richtigen Ausrichtung zum Laser kann die Düsengeometrie entsprechend US 5 985 216 oder entsprechend US 2002/0129669 A1 verändert werden.

Von den gegenwärtigen Erfindern ist gefunden worden, dass die Lebensfähigkeit von polyfunktionalen Bullenspermatozoen, die entsprechend US 5 135 759 sortiert wurden, maximal für sechs Stunden eine für die künstliche Besamung ausreichende Lebensfähigkeit aufweisen, wenn sie bei 5 – 7 °C in TALP-Medium (10 mMol phosphatgepufferte Salzlösung bei pH 6,9, enthält 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin) nach Entfernung der Hüllflüssigkeit durch sanfte Zentrifugation gelagert werden. Eine längere Lagerdauer bei diesen Bedingungen, die ähnlich den Bedingungen im weiblichen Genitaltrakt sind, führt unvermeidbar zu einer drastisch reduzierten Motilität der Spermatozoen, die dann für die künstliche Besamung unzureichend ist. Weiterhin führt das Sortierverfahren nach US 5 135 759 zu beschädigten Acrosomen der Spermatozoen, was auch zu der beobachteten Verminderung der Befruchtungsfähigkeit beitragen kann.

Aufgabe der Erfindung

Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Konservierungsmittel für Säugerspermatozoen, die gekühlt gelagert werden, z.B. bei 3 bis 15 °C, oder durch Tiefkühlen, z.B. bei -10 bis -196 °C oder bei -20 bis -70 °C. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Präparate von Säugerspermatozoen bereitzustellen, die unabhängig von einem vorherigen Behandlungsverfahren ihre Lebens- und Befruchtungsfähigkeit für die künstliche Besamung oder für andere biotechnologische Verfahren, wie die In-vitro-Befruchtung oder die Injektion einer einzelnen Samenzelle in befruchtungsfähige Oozyten (ICSI), über wesentlich längere Zeitdauern unter Kühlung oder nach Tiefkühlung und Auftauen zu erhalten. Entsprechend zielt die vorliegende Erfindung auch darauf ab, neue Substanzen zur Verwendung als Konservierungsmittel für unsortierte und sortierte Spermapräparationen bereitzustellen, die bei Raumtemperatur oder unter Kühlung oder unter Tiefkühlung zu lagern sind.

Ein zweiter Aspekt der vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein verbessertes Fraktionierungsverfahren für Spermatozoen bereitzustellen, wobei das Verfahren weniger Schädigungen an den Spermatozoen während der Fraktionierung durch FACS verursacht bzw. induziert. Weiterhin ist es ein Ziel der Erfindung, neue Aufbereitungsverfahren für Spermien bereitzustellen, die nach Sortierung in X- und/oder Y- Chromosom tragende Spermienpopulationen angereichert sind und die ihre Motilität und Befruchtungsfähigkeit über wesentlich längere Zeitdauer beibehalten, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert werden, oder nach einer Tiefkühlung und anschließendem Auftauen. Diese sortierten Spermapräparate sind durch das Sortierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich.

Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist darauf ausgerichtet, die Effizienz des FACS-Sortierens von Säugerspermatozoen zu verbessern. Angesichts der Nachteile bekannter Verfahren zum Sortieren von Spermatozoen unter Verwendung von FACS gemäß US 5 135 759 ist es auch wünschenswert, die Ausbeute des Sortierverfahrens zu verbessern, und den Anteil verworfener Spermatozoen zu verringern. In dieser Hinsicht bezieht sich die vorliegende Erfindung auf intakte und fruchtbare Spermatozoen, die für die künstliche Besamung oder andere biotechnologische Verfahren verwendet werden können.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung löst die oben genannten Aufgaben durch die Bereitstellung neuer Konservierungsmittel für Spermapräparate von Säugetieren, die in der Form flüssiger oder tiefgekühlter Präparate vorliegen können, wobei die erfindungsgemäßen Konservierungsmittel unter Immobilisierungsmitteln für Spermatozoen ausgewählt sind. Die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten Immobilisierungsmittel immobilisieren Säugetierspermatozoen reversibel und sind unter Fluoriden ausgewählt, z.B. Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Ammoniumfluorid, Magnesiumfluorid, Calciumfluorid und weiteren Fluoriden von mono- oder bivalenten Kationen. In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet die vorliegende Erfindung eine Kombination von Immobilisierungsmitteln mit Antioxidantien zur Konservierung von Säugetierspermatozoen.

Im Allgemeinen wurde ein Bereich der Endkonzentration des Immobilisierungsmittels, insbesondere von Fluoridionen, im Bereich von 0,1 bis 100 mM, vorzugsweise von 10 nM bis 10 mM für geeignet befunden. Es wurde gefunden, dass die optimale Konzentration des bevorzugten Immobilisierungsmittels, nämlich eines Fluorids, zwischen verschiedenen Spezies und für Individuen abwich. Die optimale Konzentrationen für die Spezies ist spezifisch und konnte allgemein als die Konzentration bestimmt werden, die bei mikroskopischer Betrachtung eine Immobilisierung von wenigstens 90% der Spermatozoen ergab, vorzugsweise von im wesentlichen allen Spermatozoen. Entsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von Immobilisierungsmitteln, vorzugsweise in Kombination mit Antioxidationsmitteln, zur Konservierung von Spermapräparationen von Säugetieren.

Zur erfindungsgemäßen Konservierung sind Spermapräparate von Säugetieren unabhängig von ihrem Ursprung oder einer Vorbehandlung geeignet, z.B. Frischsamen, tiefgekühlter Samen, wobei beide optional in X- und Y- chromosom tragende Spermienfraktionen sortiert sein können. Vor der künstlichen Besamung oder der In-vitro-Fertilisation wird die Motilität in diesen Spermapräparaten vorzugsweise durch Abtrennen oder Entfernen des Immobilisierungsmittels von den Spermatozoen wieder hergestellt. Zum Entfernen können die Spermapräparate zentrifugiert werden und die Zellen gesammelt werden, um das Medium gegen frisches Medium auszutauschen, das keine Immobilisierungsmittel enthält. Als eine Alternative kann das Immobilisierungsmittel von den Spermatozoen durch Adsorption entfernt werden, z.B. durch Zugabe eines geeigneten Ionentauscher-Harzes zu dem Spermapräparat, oder durch Filtration, z.B. Kreuzstromfiltration. Dabei erfüllt die Erfindung die Vorbedingung, dass die Immobilisierungsmittel eine Reversibilität der Immobilisierung der Spermatozoen bereitstellen müssen, um nach der Konservierung die für die Befruchtungsfähigkeit erforderliche Motilität wiederherzustellen. Die Spermapräparate, die ein Immobilisierungsmittel entsprechend der Erfindung enthalten, können jedoch auch ohne vorherige Entfernung des Immobilisierungsmittels für die künstliche Besamung eingesetzt werden. Es wird angenommen, dass die bei der künstlichen Besamung beobachtete Befruchtungsfähigkeit in diesem Fall dadurch erreicht wird, dass das Immobilisierungsmittel im weiblichen Genitaltrakt ausreichend verdünnt wird oder diffundiert, und die Motilität der Spermatozoen wiederhergestellt wird.

Im Allgemeinen kann die künstliche Besamung mit Spermatozoen praktiziert werden, die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels sortiert und/oder gelagert wurden, wahlweise mit zusätzlichem Antioxidationsmittel, unter Verwendung bekannter Geräte und Verfahren zur Besamung zu im Verhältnis zur Ovulation speziesspezifischen Zeiten. Auf ähnliche Weise können gemäß der Erfindung behandelte Spermatozoen zur In-vitro-Fertilisation (IVF) eingesetzt werden, oder für ein Injektionsverfahren einzelner Spermazellen (ICSI), einschließlich spezifischer Behandlungen wie der Zentrifugation, Verdünnung und Kapazitierung.

Die Verwendung von Immobilisierungsmitteln entsprechend der Erfindung ist unabhängig von besonderen Verdünnerflüssigkeiten und Medien und daher können bekannte speziesspezifische Verdünnungsmittel und Medien für Spermatozoen in Kombination mit den erfindungsgemäßen Immobilisierungsmitteln verwendet werden.

Es wird angenommen, dass die als Immobilisierungsmittel verwendeten Fluoride ihren Einfluss auf die Spermatozoen entweder durch die Beeinflussung des Calciumstoffwechsels oder durch Beeinflussung der Konzentration von Calcium, das den Zellen zur Verfügung steht, ausüben. Entsprechend sind bevorzugte Immobilisierungsmittel in der Ausdrucksweise dieser Offenbarung Substanzen, die die Motilität von Spermatozoen reversibel vermindern.

Zusätzlich zu oder als Alternative zu Fluoriden können weitere Verbindungen zur Immobilisierung von Spermatozoen für die Zwecke der Konservierung und/oder Sortierung von Spermapräparaten verwendet werden, solange die Verbindung die Spermatozoen auch reversibel immobilisiert und nicht die Befruchtungsfähigkeit beeinträchtigt und keine Schädigung der Spermatozoen verursacht.

Gegenwärtig wird von den Erfindern angenommen, dass der konservierende Effekt der Immobilisierungsmittel sowohl bei Raumtemperatur als auch unter Kühlung oder beim Tiefkühlen für alle motilen Spermapräparate den Effekt einer Verminderung des Energieverbrauchs der Spermatozoen während der Lagerung als eine direkte Folge der Immobilisierung ausnutzt.

Die Verwendung von Antioxidantien zusätzlich zu den Immobilisierungsmitteln zur Konservierung von Spermatozoen erhöht weiterhin die Lebensfähigkeit und Befruchtungsfähigkeit der Spermatozoen. Es wird angenommen, dass die zuträgliche Wirkung von Antioxidantien auf der Eliminierung von Radikalen beruht, insbesondere Sauerstoffradikalen, die z.B. während der Lagerung aus der Hydrolyse von Fettsäuren entstehen.

Weiterhin ist von den vorliegenden Erfindern gefunden worden, dass Immobilisierungsmittel vorzugsweise verwendet werden können, um die Fraktionierung von Sperma in X- und Y-Chromosom tragenden Spermafraktionen zu verbessern. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Verbesserung des bekannten Sortierverfahrens, das FACS verwendet, bereit und ist durch die Immobilisierung polyfunktionaler Spermatozoen wenigstens während des tatsächlichen Sortierverfahrens gekennzeichnet, wie mit Bezugnahme auf US 5 135 759 beschrieben werden wird. Als ein Ergebnis der Verwendung des Immobilisierungsmittels beim Sortierverfahren ist es nun auch möglich, Spermatozoen unter Ausnutzung der Fluiddynamik einer angeschrägten Spitze exakt auszurichten. Auf Grund der Wirkung der erfindungsgemäßen Verwendung reversibel wirkender Immobilisierungsmittel wird eine solche exakte Ausrichtung anschließend nicht mehr durch aktive Bewegungen der Spermatozoen zunichte gemacht.

Für das durchflußzytometrische Sortieren kontaktiert das Immobilisierungsmittel die Spermatozoen vor deren Ausrichtung innerhalb der tropfenformenden Düse des FACS-Geräts. Vorzugsweise ist das Immobilisierungsmittel in dem Medium enthalten, das die Spermatozoen enthält, die für das Sortieren vorgesehen sind. Bevorzugter sind Fluoride als das Immobilisierungsmittel in dem Medium enthalten, das die Spermatozoen von der Zeit des Färbens mit Hoechst Bisbenzimid H 33342 enthält und während des Sortierverfahrens, wenigstens bis sie fraktioniert sind. Nach der Fraktionierung können die Spermatozoen von einer Sammelflüssigkeit aufgenommen werden, z.B. TEST-yolk-Verdünner, der vorzugsweise auch ein Immobilisierungsmittel für den Fall enthält, dass eine Lagerdauer vor der Besamung oder IVF bzw. ICSI auftritt.

Als Alternative, vorzugsweise als Zusatz zu den vorgenannten Immobilisierungsmitteln zur erfindungsgemäßen Verbesserung eines Sortierverfahrens, das FACS verwendet, wird die Qualität der erhaltenen fraktionierten Spermatozoen durch die Gegenwart eines Antioxidationsmittels während der Durchführung des Sortierverfahrens in Kontakt mit den Spermatozoen verbessert.

Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung unter einem zweiten Gesichtspunkt ein neues Sortierverfahren für Säugerspermatozoen in Fraktionen bereit, die vorzugsweise X- oder Y-Chromosom tragende Spermien enthalten, das gekennzeichnet ist durch das Kontaktieren der Spermatozoen wenigstens während des Sortierverfahrens mit einem Immobilisierungsmittel und/oder einem Antioxidationsmittel. In der Folge stellt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des Immobilisierungsmittels und/oder Antioxidationsmittels zur Verwendung in einem Sortierverfahren unter Verwendung von FACS bereit, dass Spermapräparate, die mit X- oder Y- Chromosom tragenden Spermien angereichert sind, erzeugt. Zusätzlich zu dem Medium, das die Spermatozoen enthält und das Immobilisierungsmittel und/oder Antioxidationsmittel aufweist, kann die Hüllflüssigkeit, die für das Sortierverfahren verwendet wird, auch unabhängig ein Immobilisierungsmittel und/oder Antioxidationsmittel aufweisen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Spermapräparate bereitgestellt, die durch das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung wenigstens eines Immobilisierungsmittels und/oder Antioxidationsmittels während des Sortierverfahrens in X- oder Y- Chromosomen-haltige Spezies fraktioniert sind, welche ein Lagermedium aufweisen, das auch ein reversibel immobilisierendes Mittel und/oder Antioxidationsmittel enthält.

Es ist weiterhin gefunden worden, dass die durch das erfinderische Sortierverfahren erhältlichen Fraktionen verbesserte Eigenschaften der Vitalität und Befruchtungsfähigkeit im Vergleich zu Spermafraktionen aufweisen, die unter identischen Bedingungen durch das FACS-Sortierverfahren, jedoch ohne während des Sortierens vorliegendes Immobilisierungsmittel und/oder Antioxidationsmittel erhältlich sind. Als ein weiterer Vorteil ist gefunden worden, dass das Sortierverfahren bei höheren Sortiergeschwindigkeiten der Spermatozoen enthaltenden Tropfen durchgeführt werden kann, was zu einer verbesserten Leistung des Sortierverfahrens führt.

Daher gründet sich sowohl die Verwendung von reversibel wirkenden Immobilisierungsmitteln als Konservierungsmittel für sortierte und unsortierte Spermapräparate als auch die Verwendung von Immobilisierungsmitteln für das Sortierverfahren von Spermatozoen durch FACS auf den selben Einfluss der Immobilisierungsmittel auf die Spermatozoen. Dieser immobilisierende Effekt ermöglicht einerseits die Orientierung vollständiger funktionaler Spermatozoen durch Fluiddynamik und verhindert ihre nachfolgende Drehung, was eine genaue Messung des Fluoreszenzsignals ermöglicht, das von der gefärbten DNA ausgestrahlt wird. Andererseits vermindert die immobilisierende Wirkung die Bewegungen der Spermatozoen auch während einer Lagerung, was zu einer Verminderung des Energieverbrauchs und folglich zu einer konservierenden Wirkung führt.

Das Sortierverfahren der Erfindung verwendet den Apparat, der in US 5 135 759 beschrieben ist und vermindert den Verlust aufgrund von Fehlausrichtungen der Spermatozoen während der Sortierung. Diese Verminderung oder Minimierung der Fehlausrichtung von Spermatozoen wird durch das Immobilisieren intakter Spermatozoen erreicht, wenigstens für die Zeit, wenn sie aus einer tropfenformenden Spitze austreten und vor einem Detektor vorbei geleitet werden, der die Intensität des ausgestrahlten Lichts misst.

Die erfindungsgemäße Verwendung der Immobilisierungsmittel ermöglicht es, die Ausbeute der Sortierung von Spermatozoen zu verbessern, was im Vergleich zu dem Verfahren gemäß US 5 135 759 zu einer beträchtlich vergrößerten Ausbeute führt, d.h. Anteil von Spermatozoen, die in X- und Y- Chromosom tragende Fraktionen aufgetrennt sind.

Das neue Sortierverfahren ermöglicht vorteilhafterweise die Ausrichtung intakter Spermatozoen durch Fluiddynamik, z.B. durch die Geometrie und Anordnung der abgeschrägten Austrittsspitze, die Tropfen erzeugt, welche einzelne Spermatozoen enthalten. Aufgrund der immobilisierenden Wirkung können sich die Spermatozoen während oder nach der Ausrichtung nicht bewegen und behalten entsprechend ihre einheitliche Ausrichtung bei. Im Ergebnis wird eine im Vergleich zur US 5 135 759 signifikante Verminderung des Prozentsatzes an Spermatozoen erreicht, der für die FACS-Analyse ungeeignet ausgerichtet ist und daher wahlweise verworfen werden kann, bevor er in die sortierten Spermafraktionen eintritt.

Es ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass das Sortierverfahren bei höheren Strömungsgeschwindigkeiten der Spermatozoen enthaltenden Tropfen durchgeführt werden kann, was sich in eine verbesserte Leistung des Sortierverfahrens überträgt. Als ein anderer Gesichtspunkt des verbesserten Sortierverfahrens der Erfindung kann eine höhere Genauigkeit für das Sortieren erhalten werden, was eine höhere Rate der Homogenität der sortierten X- und Y- Chromosom tragenden Spermafraktionen ergibt.

Als ein weiterer Effekt des verbesserten Sortierverfahrens ist gefunden worden, dass die sortierten Spermatozoen im Vergleich zum Verfahren der US 5 135 759 bei ähnlichen Strömungsgeschwindigkeiten weniger Schädigungen erlitten haben. Im Einzelnen hat das Akrosom von Spermatozoen, die gemäß der vorliegenden Erfindung sortiert worden sind, weniger nachweisbare Schäden, was eine höhere Lebensfähigkeit und Befruchtungsfähigkeit anzeigt. Weiterhin führen die beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren höheren Strömungsgeschwindigkeiten während des Nachweises des Fluoreszenzsignals, das von dem die DNA färbenden Farbstoff unter Bestrahlung durch einen UV-Laser ausgestrahlt wird, auch zu einer Verminderung der UV-Schädigung der DNA.

Entsprechend sind die Spermafraktionen, die durch das Sortierverfahren gemäß der Erfindung unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels erhältlich sind, durch eine höhere Lebensfähigkeit und Befruchtungsfähigkeit aufgrund der verminderten Akrosomenschädigung und geringeren DNA-Schädigung, die durch die Verringerung der Bestrahlungszeit durch UV in geringerem Maß induziert werden, gekennzeichnet. Diese Eigenschaften spiegeln sich in einer längeren Lebensfähigkeit der Spermapräparate, die gemäß der Erfindung sortiert wurden, und in ihrer höheren Befruchtungsfähigkeit wieder.

Bei der Färbung von Säugerspermatozoen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst Bisbenzimid H 33342 ist überdies gefunden worden, dass die Effizienz des Färbens unterschiedlicher Proben von Spermatozoen, die von einem männlichen Säugetier eingesammelt wurden, abweicht. Beim Färben von Spermatozoen wurden weiterhin unterschiedliche Ergebnisse für die Spermatozoen beobachtet, die von unterschiedlichen männlichen Individuen derselben Spezies erhalten wurden, z.B. zwischen unterschiedlichen Bullen. Im Einzelnen ist gefunden worden, dass individuelle Bullen Samen erzeugen, die nicht adäquat mit Hoechst Bisbenzimid H 33342 gefärbt werden können, um für das Sortierverfahren auf Basis von FACS geeignet zu sein.

Überraschenderweise ist vorliegend von den Erfindern noch herausgefunden worden, dass das Färben von Spermatozoen mit Hoechst Bisbenzimid H 33342 durch das Vorliegen einer fluoridenthaltenen Verbindung verstärkt wird, vorzugsweise Natriumfluorid oder Kaliumfluorid, in dem Medium, das zum Färben der Spermatozoen mit dem Bisbenzimid verwendet wird. Wenn Spermatozoen mit Hoechst Bisbenzimid H 33342 in Gegenwart einer fluoridenthaltenden Verbindung gefärbt werden, werden die Färbeeigenschaften von Sperma, die zu verschiedenen Zeiten von einem männlichen Individuum gesammelt wurden, ausgeglichen. Als ein weiterer Vorteil kann das Sperma, das von bestimmten männlichen Individuen erhalten wurde, das bisher nicht mit Hoechst Bisbenzimid H 33342 gefärbt werden konnte, oder nur in einem für das Sortieren durch FACS unzureichenden Ausmaß gefärbt werden konnte, z.B. von bestimmten Bullen, nun ausreichend gefärbt werden, wenn fluoridenthaltende Verbindungen während des Färbens mit Hoechst Bisbenzimid H 33342 verwendet werden. Entsprechend ist das FACS-gestützte Sortieren in X- oder Y-Chromosomen enthaltende Fraktionen von Sperma, das z.B. von Bullen erhalten wurde, deren Sperma bisher nicht mit Hoechst Bisbenzimid H 33342 gefärbt werden konnte, nun realisierbar.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird nun mit Bezugnahme auf die begleitenden Figuren beschrieben, in denen

• 1 ein Graph ist, der die Motilität von Säugerspermatozoen nach dem Tiefkühlen und Auftauen zeigt, die dem Sortieren ohne Immobilisierungsmittel und ohne Antioxidationsmittel (⦁) unterworfen wurden, im Vergleich zu einer nicht sortierten Kontrolle

über eine anschließende Inkubation bei 37 °C,

• 2 ein Graph ist, der die Akrosomenschädigung und morphologischen Anomalitäten von Säugerspermatozoen zeigt, die dem Sortieren ohne Immobilisierungsmittel und ohne Antioxidanz im Vergleich zu einer unsortierten Vergleichsprobe zeigt,

• 3 ein Graph ist, der die Motilität von Säugerspermatozoen zeigt, die dem Sortieren ohne Immobilisierungsmittel oder Antioxidationsmittel

in der Gegenwart von Immobilisierungsmittel in Kombination mit Antioxidationsmittel

unterzogen wurden, sowie eine unsortierte Kontrolle (⦁), jeweils gefolgt von anschließendem Tiefkühlen und Auftauen, über eine anschließende Inkubation bei 37 °C

• 4 ein Graph ist, der die Akrosomenschädigung und morphologischen Anomalitäten von Säugerspermatozoen zeigt, die dem Sortieren gemäß der Erfindung unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels in Kombination mit einem Antioxidationsmittel (n) im Vergleich zu Proben ohne Immobilisierungsmittel und ohne Antioxidationsmittel (o), sowie eine unsortierte Probe (cont), jeweils mit anschließendem Tiefkühlen und Auftauen,

• 5 ein Graph ist, der den Anteil von membranintakten, nicht kapazitierten Säugerspermatozoen zeigt, die gemäß der Erfindung unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels in Kombination mit einem Antioxidationsmittel (n) sortiert wurden, im Vergleich mit Proben ohne Immobilisierungsmittel und ohne Antioxidationsmittel (o), sowie eine unsortierte Kontrolle (cont), mit anschließendem Tiefkühlen und Auftauen nach einer anschließenden Inkubation über eine Dauer von 24 Stunden bei 37 °C,

• 6 ein Graph ist, der die Motilität von Säugerspermatozoen zeigt, die dem Sortierverfahren gemäß der Erfindung unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels in Kombination mit Antioxidationsmittel

unterworfen wurden, im Vergleich zu einer Probe ohne Immobilisierungsmittel, jedoch mit Antioxidationsmittel (⦁), und einer unsortierten Kontrolle

mit anschließendem Tiefkühlen und Auftauen nach einer anschließenden Inkubation über eine Dauer von 24 Stunden bei 37 °C,

• 7 ein Graph ist, der die Akrosomenschädigung und morphologischen Anomalitäten von Säugerspermatozoen nach dem Sortierverfahren gemäß der Erfindung unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels (NF) oder eines Antioxidationsmittels (AO) im Vergleich mit Proben ohne Immobilisierungsmittel oder Antioxidationsmittel (C 1) zeigt und

• 8 ein Graph ist, der den Anteil von membranintaktem, nicht kapazitierten Säugerspermatozoen zeigt, die gemäß der Erfindung unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels (s-NF) oder eines Antioxidationsmittels (s-AO) im Vergleich zu Proben, die ohne Immobilisierungsmittel und ohne Antioxidationsmittel (C) sortiert wurden, nach Tiefkühlen und Auftauen und nach einer anschließenden Inkubation über eine Dauer von 24 Stunden bei 37 °C.

In den folgenden Beispielen werden Säugerspermatozoen von Samen repräsentiert, der von Bullen erhalten wurde, unter Verwendung von Aliquots einer Probe (n > 6) für Vergleichstests. Sofern nicht anders angegeben, wurden polyfunktionale Spermatozoen verwendet. Ähnliche Effekte wurden für Säugerspermatozoen verschiedener Spezies gefunden. Zur Verdünnung wurde TRIS-Medium als Verdünner verwendet, sofern nicht anders angegeben. Es ist allgemein bekannt, dass speziesspezifische Verdünnerflüssigkeiten verwendet werden, um besondere Anforderungen zu erfüllen, jedoch hängt die vorliegende Erfindung nicht von einer spezifischen Verdünnerflüssigkeit oder Hüllflüssigkeit ab, solange diese den Wirkungen des Immobilisierungsmittels und/oder des Antioxidationsmittels nicht entgegenwirkt.

Es werden Beispiele für frische und tiefgekühlte, sortierte und unsortierte Spermapräparationen angegeben. Für Präparate, die sortiert und anschließend tiefgekühlt wurden, werden detailliertere Ergebniswerte angegeben, da diese durch den Verlust an Vitalität und Befruchtungsfähigkeit empfindlicher reagieren als Frischsamenpräparate. Die vorgestellten Werte beweisen, dass sogar mit den empfindlicheren sortierten und tiefgekühlten Präparaten gemäß der Erfindung bedeutende Verbesserungen der Samenqualität und -befruchtungsfähigkeit erhalten werden.

Für die Sortierexperimente wurde eine Strömungsrate von wenigstens 25.000 Ereignissen /sec auf einem FACS Sortierapparat (Modell MOFLO DakoCytomation, Fort Collins, Colorado, USA, ausgerüstet mit einer Düse Modell sx, gemäß US 2002/0129669 A1) in TRIS-Medium verwendet.

In den folgenden Beispielen wurde die Kapazitierung als FITC-PNA positive Spermatozoen bestimmt. Morphologische Anomalitäten und Akrosomenschädigungen wurden mikroskopisch bestimmt und die Motilität wurde mikroskopisch bewertet.
Beispiel 1: Konservieren von Säugetier-Frischsamen unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels
Das Immobilisierungsmittel (Natriumfluorid) wurde auf eine Endkonzentration von 7,5 mM zu frisch erhaltenem Bullensamen, der in TRIS-Medium verdünnt war, zugegeben. Es wurde jedoch gefunden, dass die optimale Konzentration des bevorzugten Immobilisierungsmittels, nämlich eines Fluorids, zwischen Individuen unterschiedlich war.
Frischsamen wurde in Verdünnerflüssigkeit, die 7,5 mM Natriumfluorid enthielt, für 24 h bei 5 °C bzw. 15 °C gelagert, dann wurde das Immobilisierungsmittel durch sanfte Zentrifugation entfernt und wahlweise wurde mit frischer Verdünnerflüssigkeit gewaschen und dann in frischer Verdünnerflüssigkeit resuspendiert. Zum Vergleich wurde ein paralleles Aliquot ohne Immobilisierungsmittel unter ansonsten identischen Bedingungen gelagert. Die Motilität wurde mikroskopisch bei 0 h und nach 3 bis 12 h bei 37 °C beobachtet.
Es wurde gefunden, dass die Lebensfähigkeit der Spermatozoen durch Entfernen des Immobilisierungsmittels wiederhergestellt werden konnte und dass die Spermatozoen noch fruchtbar waren, was selbst nach 7 Tagen Lagerung in Gegenwart von Immobilisierungsmittel bei 5 °C zu Trächtigkeiten führte.
Verbesserte Ergebnisse wurden erhalten, wenn zusätzlich zu dem Immobilisierungsmittel Antioxidationsmittel zu der Verdünnerflüssigkeit gegeben wurde.
Beispiel 2: Konservieren von frisch sortierten Säugerspermatozoen unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels
Der Test von Beispiel 1 wurde auch unter Verwendung von Spermafraktionen durchgeführt, die für X- oder Y-Chromosomen enthaltende Fraktionen angereichert waren, die aus Frischsamen entsprechend Vergleichsbeispiel 1, dass unten beschrieben ist, hergestellt wurden, wobei während des Sortierverfahrens kein Immobilisierungsmittel verwendet wurde.
Die Lagerung erfolgte unter Kühlung auf 5 °C oder 15 °C in Gegenwart von 7,5 mM Natriumfluorid. Eine Kontrolle wurde parallel, jedoch ohne zugesetztes Immobilisierungsmittel behandelt. Spermatozoen wurden durch sanfte Zentrifugation gesammelt, in frisches TRIS-Medium überführt und bei 37 °C inkubiert. Zu Beginn (0 h) und nach 3 h bzw. 6 h wurden Aliquots entnommen und der Prozentgehalt motiler und morphologisch intakter Spermatozoen wurde mikroskopisch bestimmt.
Es wurde festgestellt, dass die Motilität nach Entfernen des Immobilisierungsmittels annähernd auf das Maß wiederhergestellt wurde, das vor Zugabe des Immobilisierungsmittels bestimmt werden konnte. Weiterhin wurde beobachtet, dass bei der anschließenden Inkubation bei 37 °C die Motilität der Probe, die in Gegenwart von Immobilisierungsmittel gelagert worden war, im Vergleich zur Kontrollprobe bei signifikant höheren Werten und über eine längere Zeitdauer beibehalten wurde. In den Vergleichstests von Beispiel 1 und 2 konnte die positive Wirkung des Immobilisierungsmittels bei der ausgedehnten Lagerungsdauer für Frischsamen, ob sortiert oder unsortiert, bewiesen werden.
Verbesserte Ergebnisse wurde festgestellt, wenn der Verdünnerflüssigkeit zusätzlich zu dem Immobilisierungsmittel Antioxidationsmittel zugegeben wurde.
Beispiel 3: Konservieren von tiefgekühltem Säugersamen unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels
Um die Eignung von Immobilisierungsmitteln für die Konservierung von tiefgekühltem Säugetiersamen zu prüfen wurde Beispiel 1 identisch wiederholt, außer in Bezug auf die Lagerungsbedingungen, die nun aus dem langsamen Tiefkühlen der Samenpräparate in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels (Natriumfluorid) auf -196 °C in Flüssigstickstoff bestanden.
Im Anschluss an eine Lagerdauer von wenigstens 10 Tagen wurden die Samenproben in einem Wasserbad bei 37 °C für 30 s aufgetaut. Die Motilität wurde wie im Beispiel 1 beschrieben beobachtet und es wurde festgestellt, dass während der Inkubationsdauer bei 37 °C die Motilität der Spermatozoen, die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels tiefgekühlt waren, allmählich über eine Dauer von wenigstens 20 min anstieg, jedoch signifikant niedriger, als bei Kontrollen ohne Immobilisierungsmittel. Diese Beobachtungen können als Anzeichen für den Energiespareffekt des Immobilisierungsmittels ausgelegt werden. Die Morphologie war hingegen gegenüber den Proben, die ohne Immobilisierungsmittel oder Antioxidationsmittel tiefgekühlt waren, überlegen, d.h. durch Immobilisierungsmittel oder Antioxidationsmittel signifikant verbessert.
Die Ergebnisse der Fruchtbarkeitstests zeigten keine Abweichung von der normalen künstlichen Besamung (Standard tiefgekühlt, d.h. unsortiert und ohne Immobilisierungsmittel, unter Verwendung von 20 Millionen Spermatozoen), wenn nur ein Zehntel der Spermatozoen für die künstliche Besamung verwendet wurde, die gemäß der Erfindung eingefroren wurden (2 Millionen tiefgekühlte Spermatozoen in Gegenwart von Immobilisierungsmittel). Dies ist ein Beleg, dass sogar ohne Entfernen des Immobilisierungsmittels vor der künstlichen Besamung die Fruchtbarkeit von Samenpräparaten, die unter den Bedingungen des Einfrierens gemäß der Erfindung gelagert waren, d.h. in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels, mit normalem Frischsamen gemäß dem Stand der Technik vergleichbar ist. Es wird angenommen, dass das Immobilisierungsmittel nach der künstlichen Besamung innerhalb des weiblichen Genitaltrakts von den Spermatozoen wegdiffundiert.
Die Beobachtung überraschte, dass nämlich die in X- bzw. Y-Chromosom tragende Fraktionen sortierter Spermatozoen, vorzugsweise mit dem erfindungsgemäßen Sortierverfahren hergestellt, nach Tiefkühlung in Anwesenheit des erfindungsgemäßen Immobilisierungsmittels auch in geringerer Menge, z.B. nur ein Zehntel der erforderlichen Menge unsortierten Frischsamens, in der künstlichen Besamung zu gleichen Trächtigkeitsraten führte. Daher bezieht sich die Erfindung in einer Ausführungsform auf die Verwendung von Fluoriden zur Konservierung sortierter Spermatozoen, insbesondere mit Tiefkühlung, bzw. auf Präparate sortierter Spermatozoen mit einem zur reversiblen Immobilisierung ausreichenden Gehalt an Fluoriden, insbesondere auf derartige tiefgekühlte Präparate. Vorzugsweise sind die für X- bzw. Y-Chromosomen angereicherten Fraktionen der Spermatozoen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt.
Beispiel 4: Konservieren von tiefgekühlten sortierten Säugerspermatozoen unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels
Um die Eignung von Immobilisierungsmitteln für die Konservierung tiefgekühlter Fraktionen von Säugersperma zu prüfen, die gemäß US 5 135 759 sortiert worden waren, wurde Beispiel 3 identisch wiederholt, außer dass Spermafraktionen eingesetzt wurden, die entsprechend Vergleichsbeispiel 1 aus Frischsamen für X- oder Y-Chromosomen enthaltende Spermatozoen angereichert worden waren, das unten beschrieben ist, wobei während des Sortierverfahrens kein Immobilisierungsmittel oder Antioxidationsmittel verwendet wurde. Für Kontrollzwecke wurden Aliquots der sortierten Fraktionen identisch behandelt, außer dass kein Immobilisierungsmittel in dem Lagermedium enthalten war.
Es wurde gefunden, dass die Gegenwart eines Immobilisierungsmittels während der Lagerung sortierter Spermatozoen unter Tiefkühlung deren Motilität und Lebensfähigkeit nach dem Auftauen verbesserte, sobald das Immobilisierungsmittel entfernt war.
Vergleichsbeispiel 1: Sortieren polyfunktionaler Bullenspermatozoen in X- und Y-chromosomenhaltige Fraktionen gemäß US 5 135 759
Als ein Beispiel für Säugersperma wurden Bullensamen unter Verwendung eines bekannten Verfahrens erhalten, verdünnt und mit Hoechst Bisbenzimid H 33342 gefärbt. Gefärbte Spermatozoen, die in Verdünnerflüssigkeit enthalten waren, wurden mit FACS sortiert und in TEST yolk Medium gesammelt, wie in US 5 135 759 beschrieben ist.
Als Kontrollprobe wurde ein Aliquot des Samens vor dem Sortieren entnommen und für Vergleichszwecke verwendet, ohne dass er dem Sortieren unterworfen wurde.
Nach dem Sortieren, im Fall der Kontrollprobe ohne Sortieren, wurden die Spermatozoen in frisches TRIS-Medium überführt und bei 37 °C inkubiert. Zu Beginn (0 h) und nach 3 h bzw. 6 h wurden Aliquots entnommen und der Prozentgehalt motiler Spermatozoen wurde mikroskopisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt, die belegen, dass gemäß US 5 135 759
sortierte Spermatozoen im Vergleich zur unsortierten Kontrolle (⦁) eine verminderte Motilität haben, was einen Verlust der Lebensfähigkeit und Befruchtungsfähigkeit aufgrund des Sortierens anzeigt.
Für die Praxis wird ein Prozentgehalt von 50% motiler Spermatozoen als das Minimum für Tiefkühlsamenpräparate angesehen. Dieser Prozentgehalt wird von der gemäß US 5 135 759 sortierten Probe bereits nach einer signifikant kürzeren Inkubationsdauer bei 37 °C erreicht, als von der unsortierten Probe.
Zusätzlich zur Bestimmung der Motilität wurden die Wirkungen des Sortierens auf die Integrität der Spermatozoen durch Prüfen ihrer Akrosomenschädigung und Morphologie überprüft. Anomalitäten in der Morphologie und der Akrosomenintegrität wurden mikroskopisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt und weisen auf einen Anstieg der Akrosomendefekte (ACR) und von morphologischen Anomalitäten (MAS) für herkömmlich sortierte Spermatozoen (sort) im Vergleich zu unsortierten Kontrollproben (cont) hin.
Beispiel 5: Sortieren von Säugerspermatozoen in Gegenwart eines Immobilisierungs mittels
Wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben wurde polyfunktionaler Bullensamen sortiert, außer dass die Verdünnerflüssigkeit (TRIS-Medium) mit einem Immobilisierungsmittel (7,5 mMol Natriumfluorid) und einem Antioxidationsmittel (1058 U/L Katalase) supplementiert war.
Die Reinheit der X- und Y-Chromosomtragenden Spermienfraktionen wurde durch erneutes Sortieren dieser Fraktionen nach Entfernen der Spermienschwänze durch Ultrabeschallung überprüft. Es wurde bestimmt, dass jede Fraktion wenigstens 92% der erwünschten Spezies enthielt und auf Grund von Fehlausrichtungen und Zusammentreffen oder Verwerfen von Zellen die gesamte Ausbeute von Spermatozoen, die in jeder Fraktion enthalten war, sich auf 20% der Anzahl von Spermatozoen belief, die für das Sortieren verwendet wurde, was einer Ausschussrate auf Grund von Fehlausrichtungen von 50 – 64% entspricht.
Beispiel 6: Sortieren und Tiefkühlen von Säugerspermatozoen in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels und Antioxidationsmittels
Zur Einschätzung des Einflusses eines Immobilisierungsmittels, das während des Sortierverfahrens gemäß Vergleichsbeispiel 1 vorliegt, wurde Natriumfluorid zu einer Endkonzentration von 7,5 mM dem TRIS-Medium zugegeben, das für das Färben einer Samenprobe vor dem Sortieren verwendet wurde. Eine Kontrollprobe ohne Immobilisierungsmittel wurde unter ansonsten identischen Bedingungen unter Verwendung des FACS-Sortierverfahrens sortiert, wie oben beschrieben. Nach dem Sortieren wurden die Spermafraktionen, die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels in X- oder Y-Chromosomen enthaltende Fraktionen sortiert wurden, ohne Immobilisierungsmittel und eine Kontrollprobe (Grundwert) in TRIS-Medium mit Antioxidationsmittel überführt und bei -196 °C tiefgekühlt, wobei im Stand der Technik bekannte Verfahren eingesetzt wurden, um die schädigenden Wirkungen des Tiefkühlens zu vermeiden, und anschließend durch Inkubieren in einem Wasserbad von 38 °C aufgetaut.
In 3 sind die Wirkungen des Immobilisierungsmittels auf die Motilität für das Sortieren in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels und Antioxidationsmittels
ohne Immobilisierungsmittel oder Antioxidationsmittel
und für eine unsortierte Kontrolle ohne Immobilisierungsmittel (⦁) gezeigt. Nach dem Auftauen wurden die Proben in einem Volumen TRIS-Medium bei 37 °C inkubiert, während Aliquots zu Beginn (0 h) und nach 6, 12 bzw. 24 h für die mikroskopische Bewertung ihrer Motilität entnommen wurden.
Dieser Vergleich beweist erstens, dass die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels sortierten Spermatozoen unmittelbar nach dem Auftauen einen höheren Prozentgehalt motiler Zellen aufweisen als diejenigen, die ohne Immobilisierungsmittel sortiert wurden, was die Wirkung des Immobilisierungsmittels anzeigt, die Reduktion der Lebensfähigkeit des Spermas während des Sortierverfahrens zu vermindern. Zweitens wird die Verminderung der Motilität des Spermas während der Inkubationsdauer bei 37 °C für Spermatozoen reduziert, die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels sortiert wurden. Diese Wirkung des Immobilisierungsmittels ist so ausgeprägt, dass die in Gegenwart des Immobilisierungsmittels sortierten Spermatozoen eine höhere Motilität als die unsortierte Kontrollprobe (Basiswert) beibehalten. Drittens beweisen diese Beobachtungen, dass die Motilität nach dem Sortieren durch Entfernen des Immobilisierungsmittels wiederhergestellt werden kann. Das Entfernen des Immobilisierungsmittels wird hier durch Austauschen des Mediums beispielhaft dargestellt, so dass es keine Immobilisierungsmittel mehr enthält.
Der Einfluss des Sortierens und Tiefkühlens in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels wurde weiterhin durch überprüfen der Akrosomendefekte (ACR) durch Reaktion mit PNA und morphologische Anomalitäten von Spermatozoen bewertet. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt, die gemäß US 5 135 759 sortierte und tiefgekühlte Spermatozoen (o) zeigt, in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels (7,5 mMol Natriumfluorid) in Kombination mit Antioxidationsmittel (n) (1058 U/L Katalase), sowie als eine Kontrolle (cont) unsortierte Spermatozoen, die ohne Immobilisierungsmittel oder Antioxidationsmittel tiefgekühlt wurden. Diese Beobachtungen beweisen, dass die Akrosomenschädigung bei den Samenproben, die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels in Kombination mit einem Antioxidationsmittel sortiert wurden, im Vergleich mit der Probe, die ohne Immobilisierungsmittel sortiert wurde und sogar im Vergleich zu einer Probe, die keinem Sortierverfahren unterworfen wurde, sondern nur tiefgekühlt und aufgetaut wurde, für die Spermatozoen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren sortiert wurden, vermindert sind. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen sind auch die morphologischen Anomalitäten für die Spermatozoen vermindert, die entsprechend der Erfindung sortiert wurden, d.h. in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels, vorzugsweise zusätzlich mit Antioxidationsmittel, im Vergleich zu herkömmlich sortierten Spermatozoen und sogar im Vergleich zu Spermatozoen, die dem Sortierverfahren nicht unterworfen worden waren.
5 zeigt die Ergebnisse der Überprüfung zeitlicher Veränderungen des Prozentgehalts von membranintakten nicht kapazitierten Spermatozoen, die durch die Afftinität zu dem Lektin PNA (Arachis hypogaea (Erdnuss)) Agglutinin bestimmt wurde, während der Inkubation bei 37 °C. Dieses beweist, dass das verminderte Auftreten von Membranschädigungen auf Grund des Sortierens, d.h. der gestiegene Prozentgehalt membranintakter Spermatozoen, die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels sortiert worden sind, sich nur gemäßigt über die Inkubationsdauer von 24 h verschlechtert. Im Gegensatz zu den Spermatozoen, die gemäß der Erfindung in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels (n) sortiert wurden, zeigen herkömmlich sortierte Spermatozoen, d.h. ohne Immobilisierungsmittel (o), sowie unsortierte Aliquots (cont) nach Tiefkühlen und Auftauen ein vermehrtes Auftreten von Membranschädigungen, d.h. eine Verminderung des Prozentgehaltes membranintakter Spermatozoen während des Verlaufs der Inkubation bei 37 °C.
Diese Werte belegen, dass das Sortierverfahren unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels Spermafraktionen erzeugt, die signifikant verminderte Membranschädigungen aufweisen, d.h. eine verbesserte Fruchtbarkeit selbst nach Tiefkühlen und Auftauen der sortierten Fraktionen. Diese zuträgliche Wirkung des Sortierverfahrens gemäß der Erfindung auf die erhaltenen Spermafraktionen sind im Anschluss an eine Inkubation bei 37 °C sogar noch ausgeprägter, was zusätzlich eine verbesserte Befruchtungsfähigkeit anzeigt.
Ähnliche Ergebnisse für eine verbesserte Motilität und Morphologie wurden erhalten, wenn die obige Kombination eines Immobilisierungsmittels und Antioxidationsmittels durch wenigstens ein Antioxidationsmittel (z.B. Katalase, Natriumpyruvat oder Mercaptoethanol) ausgetauscht wurde, oder alternativ gegen ein Immobilisierungsmittel während des Sortierverfahrens, wenn auch in geringerem Ausmaß.
Beispiel 7: Sortieren und Tiefkühlen von Säugerspermatozoen in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels oder Antioxidationsmittels
Um die Wirkung von Immobilisierungsmitteln oder Antioxidationsmitteln auf die Qualität von Säugerspermatozoen zu überprüfen, die entsprechend ihres relativen DNA-Gehalts sortiert wurden, wurden Bullenspermatozoen, die in Gegenwart von entweder Immobilisierungsmittel in Kombination mit Antioxidationsmittel oder Antioxidationsmittel ohne Immobilisierungsmittel sortiert worden waren, auf Akrosomenschädigung (ACR) und morphologische Anomalitäten (MAS), sowie hinsichtlich der Kapazitierung überprüft.
Frische Bullenspermatozoen, die mit der Hoechst Bisbenzimid H 33342 markiert waren, wurden in Gegenwart eines Antioxidationsmittels oder in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels oder ohne Zusatz zum TRIS-Medium sortiert. Im Anschluss an die Sortierung wurden die Fraktionen für wenigstens 10 Tage bei -196 °C tiefgekühlt, gefolgt von Erwärmen über 30 s in einem 37 °C Wasserbad und in frisches TRIS-Medium ohne Immobilisierungsmittel überführt und anschließend für 24 h bei 37 °C inkubiert. Zur Überprüfung der Integrität des Akrosoms wurde mit dem Agglutinin PNA gefärbt.
Die Ergebnisse der Motilität sind in 6 gezeigt, die eine Steigerung des Anteils motiler Spermatozoen anzeigen, wenn sie in Gegenwart des Immobilisierungsmittels in Kombination mit dem Antioxidationsmittel
prozessiert wurden, im Vergleich zu der Gruppe, in der das Medium allein mit Antioxidationsmittel
supplementiert war, oder der Kontrollgruppe, die ohne Immobilisierungsmittel oder Antioxidationsmittel (⦁) sortiert wurde.
Die Ergebnisse der Untersuchung von Akrosomenschädigungen (ACR) und morphologischen Anomalitäten (MAS) sind in 7 dargestellt, wobei NF die Probe mit Immobilisierungsmittel (Natriumfluorid, Endkonzentration von 7,5 mM) anzeigt, AO die Probe mit Antioxidationsmittel anzeigt (Katalase, Endkonzentration von 1058 U/L) und C 1 ein Kontroll-Aliquot ohne jeden Zusatz.
Die Ergebnisse, die in 7 dargestellt sind, zeigen an, dass die in Gegenwart des Immobilisierungsmittels sortierten Spermatozoen signifikant weniger Akrosomenschädigungen im Vergleich mit Spermatozoen erleiden, die in Gegenwart von Antioxidationsmittel allein sortiert wurden, oder im Vergleich mit einem Aliquot, das ohne Immobilisierungsmittel bzw. Antioxidationsmittel sortiert wurde. In Übereinstimmung mit der Verminderung von Akrosomenschädigungen, die durch die Gegenwart eines Immobilisierungsmittels während des Sortierverfahrens bewirkt wird, wurden signifikant verminderte morphologische Anomalitäten bei Spermatozoen bestimmt, die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels und eines Antioxidationsmittels sortiert worden waren.
Als eine weitere Analyse wurde der Prozentgehalt kapazitierter Spermatozoen bestimmt, wofür die Ergebnisse in 8 dargestellt sind. Die Prozentwerte membranintakter, nicht kapazitierter Spermatozoen beweisen, dass ein höherer Prozentgehalt membranintakter, nicht kapazitäter Spermatozoen in den Fraktionen enthalten ist, die in Gegenwart des Immobilisierungsmittels (7,5 mM Natriumfluorid) sortiert wurden, als in den Fraktionen, die in Gegenwart von Antioxidationsmittel allein sortiert wurden (1058 U/L Katalase) und als in dem Kontroll-Aliquot (c, unsortierte Kontrolle).
Die Einzelwirkung des Immobilisierungsmittels auf die Qualität sortierter Spermatozoen befindet sich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Beispiel 6, was zeigt, dass die morphologischen Anomalitäten (MAS) und Akrosomenschädigung (ACR) bei den Spermatozoen auf Grund der Gegenwart eines Immobilisierungsmittels während des Sortierverfahrens vermindert sind, dies sogar im Vergleich zu Spermatozoen, die einem Sortierverfahren nicht unterworfen worden waren.
Beispiel 8: Befruchtungsfähigkeit von Spermatozoen die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels sortiert wurden
Zusätzlich zu der oben beschriebenen in vitro Überprüfung von Spermatozoen, die in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels sortiert worden waren, wurde ihre Befruchtungsfähigkeit bei der künstlichen Besamung von Färsen und Kühen überprüft, wobei 2 Millionen intakte polyfunktionale Spermatozoen pro Röhrchen verwendet wurden.
Die folgenden durchschnittlichen Ergebnisse wurden mit wenigstens 10 Tieren pro Spermapräparat erhalten: Tabelle 1: Ergebnisse der Trächtigkeit
Die in Tabelle 1 angegebenen Trächtigkeitsergebnisse zeigen, dass für tiefgekühlte Präparate gemäß der Erfindung in Gegenwart von Immobilisierungsmittel sortierter Samen zu einem annähernd dreifachen Anstieg der Trächtigkeitsrate gegenüber herkömmlich sortiertem Samen führen kann. Im Vergleich zu unsortiertem Samen, der herkömmlich tiefgekühlt war, ergibt das erfindungsgemäße Sortierverfahren Samen, der sogar zu höheren Trächtigkeitsraten führt.
Bei Frischsamenpräparaten ergeben Spermatozoen, die gemäß der Erfindung in Gegenwart von Immobilisierungsmittel sortiert und bei 15 °C gemäß der Erfindung in Gegenwart von Antioxidationsmittel gelagert wurden, Trächtigkeitsraten im gleichen Bereich wie herkömmlicher unsortierter Samen.
Diese Ergebnisse beweisen, dass Säugerspermatozoen, die gemäß der Erfindung in Gegenwart eines Immobilisierungsmittels sortiert wurden, eine hohe Befruchtungsfähigkeit im Vergleich mit Spermatozoen, die ohne Immobilisierungsmittel sortiert wurden, aufweisen, wenn eine FACS-Sortiervorrichtung gemäß US 5 135 759 für das Sortierverfahren verwendet wird.

Claims

Konservierungsmittel für Säugerspermatozoen, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens ein Fluorid enthält.
Konservierungsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluorid ausgewählt ist unter Fluoriden mono- und divalenter Kationen, insbesondere Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Ammoniumfluorid, Calciumfluorid und Magnesiumfluorid.
Konservierungsmittel nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Konservierungsmittel weiterhin wenigstens ein Antioxidationsmittel enthält.
Konservierungsmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Antioxidationsmittel unter Katalase, Superoxiddismutase, Glutathionreduktase, Glutathionperoxidase, Pyruvat und Mercaptoethanol ausgewählt ist.
Spermapräparat, das für X- oder Y- Chromosomen enthaltende Spermatozoen angereichert ist, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Konservierungsmittel nach einem der vorangehenden Ansprüche.
Spermapräparat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es Flüssigsamen oder Tiefkühlsamen ist.
Kontaktieren der Spermatozoen mit einem Konservierungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Verfahren zum Sortieren von Säugerspermatozoen, dass die Schritte umfasst von a. Anfärben intakter, lebensfähiger Spermatozoen, die von einem männlichen Säugetier erhalten wurden, mit einem selektiv DNA in lebenden Zellen anfärbenden Fluoreszenzfarbstoff,
Ausrichten der Spermatozoen in einer elektrisch leitfähigen isotonischen Hüllflüssigkeit, c. Vereinzeln der Spermatozoen in Tropfen, die Hüllflüssigkeit aufweisen, d. Hindurchtretenlassen der Tropfen durch den Strahl einer Anregungslichtquelle, e. Messen der relativen Fluoreszenzintensität, die von dem das Spermatozoon enthaltenden Tropfen emittiert wird, f. Auftrennen der ein Spermatozoon enthaltenden Tropfen entsprechend der gemessenen Fluoreszenzintensität, dadurch gekennzeichnet, g. dass die Spermatozoen mit einem Fluorid und/oder Antioxidationsmittel kontaktiert werden.
Verfahren nach Anspruch 8, h. dadurch gekennzeichnet, dass das Fluorid nach dem Sortieren abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das im Fluorid unter mono- und divalenten Kationen ausgewählt wird, insbesondere unter Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Ammoniumfluorid, Calciumfluorid und Magnesiumfluorid.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Antioxidationsmittel unter Katalase, Superoxiddismutase, Glutathionreduktase, Glutathionperoxidase, Pyruvat und Mercaptoethanol ausgewählt ist.
Verwendung von Fluoriden mono- und divalenter Kationen in einem Konservierungsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, oder in einem Verfahren nach einem Ansprüche 8 bis 11.
Präparat mit einem Gehalt an sortierten Säugerspermatozoen, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11.
Präparat nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Konservierungsmittel nach einem Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Verfahren zum Färben von Säugerspermatozoen mit Höchst Bisbenzimid H 33342, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Fluorid enthaltenden Verbindung.