DE102005023137A1

DE102005023137A1 - Anordnung zur hochauflösenden digitalen Inline-Holographie

Info

Publication number: DE102005023137A1
Application number: DE200510023137
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr. Dipl.-Phys. Riesenberg; Andreas Dr. Dipl.-Phys. Wuttig
Original assignee: Institut fuer Physikalische Hochtechnologie eV
Current assignee: Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2005-05-17
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2025-05-18
Also published as: DE102005023137B4

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur hochauflösenden digitalen Inline-Holographie, insbesondere Mikroskopie, die bevorzugt zur Detektion von ausgedehnten biologischen Proben mit hoher lateraler und Tiefenauflösung Verwendung findet. Die Aufgabe, eine solche Anordnung anzugeben, die bei höchst möglicher lateraler Auflösung im Bereich von 500 nm von ausgedehnten Objekten in der Größenordnung von bis zu 3 mm gleichzeitig eine hohe Tiefenauflösung ermöglicht, die eines vergleichweise geringen technischen Aufwands bedarf, wird dadurch gelöst, dass bei Einsatz eines Detektor-Arrays (1) und einer kohärenten Beleuchtungsquelle (4) Proben (21) in einer Probenebene (2) über einem Pinholearray (3) eingebracht sind, wobei im Pinholearray DOLLAR A - mindestens zwei Pinholes (31) und in Relation zur Anzahl der Detektor-Pixel (DELTAc) des Detektor-Arrays (1) in einer Dimension eine Anzahl von bis zu einem 150tel Pinholes (31) in der Pinholeebene (3) in der gleichen Dimensionsrichtung vorgesehen sind, wobei DOLLAR A - die Proben (21) eine Größenausdehnung aufweisen können, die gewährleistet, dass von den Pinholes (31) ausgehende Lichtkegel zu mindestens 50% von den Proben (21) ungestört zum Detektor-Array (1) gelangen, wobei DOLLAR A - der Pinholedurchmesser (d) und der maximale Rasterabstand (x) der Pinholes (31) zueinander, einer Beziehung DOLLAR F1 folgend, festgelegt sind, wobei lambda für die eingesetzte Wellenlänge; a für den Teil der Probenlänge der Probe (21), die durch nur einen Lichtkegel eines Pinholes ...

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur hochauflösenden digitalen Inline-Holographie, insbesondere Mikroskopie, die bevorzugt zur Detektion von ausgedehnten biologischen Proben mit hoher lateraler und Tiefenauflösung Verwendung findet.
Mit einem klassischen optischen Mikroskop für das sichtbare Licht erreicht man die bekannte laterale Auflösungsgrenze von etwa 550 nm (sogenannte Beugungsgrenze oder auch Abbelimit). Sie beträgt für eine Wellenlänge λ von 633 nm 0,61λ/N_a = 552nm, wenn man ein Objektiv mit einer Apertur N_a von 0,7 nutzt. Das Gesichtfeld beträgt dann typischerweise nur 480μm∙480μm. Will man größere Proben als Ganzes beobachten, also das Gesichtfeld vergrößern, so verwendet man Objektive mit einer geringeren Vergrößerung, die immer mit geringerer numerischer Apertur kombiniert sind. Mit der Vergrößerung des Gesichtfeldes vermindert sich aber auch die laterale Ortsauflösung. Um das typische, vorstehend genannte Gesichtfeld mit der maximalen, von den Objektiven begrenzten Auflösung, aufzuzeichnen, reicht bspw. eine CCD mit einer Pixelzahl von etwa 1,3 MPixel. Für eine solche Lösung wäre es eine denkbare Möglichkeit, zwecks Erzielung einer hohen Auflösung bei gleichzeitig stark erweitertem Gesichtfeld, sehr große Objektive zu bauen, wie sie von der Photolithographie her bekannt sind. Das wäre aber technisch und ökonomisch mit einem zu hohen Aufwand verbunden.

Weiterhin ist die sogenannte Gaborsche Inlineholographie bekannt, die ein einziges kohärent beleuchtetes Pinhole nutzt, in dessen Beleuchtungskegel eine Probe angeordnet ist. Aus den aufgezeichneten Interferenzen können Phase und Amplitude des Objektes rekonstruiert werden [vgl. z.B. Kreuzer, H.J. et al.; "Digital inline holography with photons and electrons"; J. Phys. Condens. Matter 13 (2001) 10729–10741]. Dieses „Mikroskop" arbeitet ohne Objektiv.

Die Apertur bestimmt sich aus der Pinholegröße. Allerdings ist bei dieser Anordnung die Probengröße sehr begrenzt, nämlich auf ca. 5 μm, und darf nur einen Teil des Lichtkegelquerschnitts beeinflussen, in der Regel etwa 25 %. Weiterhin gelten auch die diskutierten Grenzen und der Zusammenhang für Auflösung und Gesichtsfeld eines optischen Mikroskops.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung zur Inline-Holographie, insbesondere Mikroskopie anzugeben, die bei höchst möglicher lateraler Auflösung im Bereich von 500 nm von ausgedehnten Objekten in der Größenordnung von bis zu 3 mm gleichzeitig eine hohe Tiefenauflösung ermöglicht, die eines vergleichsweise geringen technischen Aufwands bedarf und in weitestgehend miniaturisierter Form herstellbar ist.

Die Aufgabe wird durch die Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte weitere Ausbildungen sind durch die nachgeordneten Ansprüche erfasst.

Die vorgeschlagene Anordnung zur hochauflösenden digitalen Inline-Holographie, insbesondere Mikroskopie, besteht aus einem Detektor-Array (im Falle der Einsatzes von Licht im sichtbaren Spektralbereich einem CCD-Array), einer Ebene, in der die Probe definiert anordenbar ist, einer weiteren Ebene, in der gemäß vorliegender Erfindung mindestens zwei Pinholes vorgesehen sind und einer kohärenten Beleuchtungsquelle, für die vorteilhaft ein Laser eingesetzt wird. Um die gestellte Aufgabe zu lösen, sind einige erfindungsgemäße Relationen einzuhalten, nämlich, dass

– mindestens zwei Pinholes und in Relation zur Anzahl der Detektor-Pixel in einer Dimension bis zu einer Anzahl von einem 150tel Pinholes in einem Pinholearray in der Pinholeebene in der gleichen Dimensionsrichtung vorgesehen sind, wobei
– die Proben eine solche Größenausdehnung in einer Dimension aufweisen können, die gewährleisten, dass von den Pinholes ausgehende Lichtkegel in Summe zu mindestens 50% von den Proben ungestört zum Detektor-Array gelangen, wobei einzuhalten ist,
– dass der Pinholedurchmesser d und der maximale Rasterabstand x der Pinholes (31) zueinander einer Beziehung:
folgend festgelegt sind, wobei λ für die eingesetzte Wellenlänge; a für den Teil der Probenlänge der Probe, die durch nur einen Lichtkegel eines Pinholes erfaß- und darstellbar wäre und b für den Abstand der Probenebene zur Pinholebene steht.

Zur Erreichung einer maximalen Auflösung Δa von Probendetails ist der Abstand b der Probenebene 2 im Rahmen der technischen Realisierbarkeit möglichst klein festgelegt und folgt einer Beziehung Δa ≈ 1,5∙b/c∙Δc, mit c als dem Abstand der Probenebene zur Detektorebene und Δc als der Pixelgröße des Detektors.

Weiterhin besteht eine enge Beziehung zwischen dem Rasterabstand x der Pinholes zueinander in Relation zum Abstand b der Probenebene zur Pinholebene, welcher in einem typischen Bereich von x = 0,5b bis 5b festlegbar ist.

Bei Einhaltung vorgegebener Maßgaben gelingt es, eine laterale Auflösung deutlich unter 1000nm zu realisieren und das Gesichtsfeld gegenüber dem eines einsetzbaren vergleichbaren Mikroskops zu vervielfachen und das bei einem erheblich eingeschränkten gerätetechnischen Aufwand.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels und schematischer Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen:
1 eine Ausführungsmöglichkeit des grundsätzlichen Aufbaus vorgeschlagener Anordnung mit ihren wesentlichen Einzelkomponenten im seitlichen Schnitt,
2 eine detailliertere Darstellung von 1 und
3 eine Ausführungsform nach 1 mit einem zusätzlichen Objektiv.
In 1 sind zunächst die Hauptkomponenten der vorgeschlagenen Anordnung im seitlichen Schnitt dargestellt, nämlich einen Detektor-Array 1, eine Ebene 2, in der die Proben angeordnet werden, eine Pinholeebene 3 und eine kohärente Beleuchtungsquelle 4. Im dargestellten Beispiel weist die Pinholeebene 3∙3 Pinholes 31 auf, auf deren Beabstandung und Dimensionierung weiter unten eingegangen wird.
Im Beispiel erfolgt die Präparation der Pinholebene 3 durch in der Photolithographie übliche Chrommasken als Basis, die verstärkt werden, wobei auf dieses Standardverfahren hier nicht näher eingegangen werden braucht.
Nähere einzuhaltende Maßgaben nach vorliegender Erfindung sind in 2 detaillierter dargestellt. Für das Detektor-Array 1 wird im Beispiel eine CCD Axiocam HRc in der Version 2600∙2060 Pixel eingesetzt mit einer Pixelgröße Δc von je 3,35 μm. Als Probe 21 wird ein Wassertropfen, der Escheri Coli enthält, verwendet. Einzelne Bakterien haben Abmaße von 2...6 μm, und es ist das Ziel, ausgedehnte Kolonien im Wassertropfen mit einem Gesichtsfeld deutlich größer als 400 μm in einer Dimension zu beobachten. Der Abstand b zur Pinholeebene 2 wird im Beispiel über eine 134 μm dicke transparente SU-Lackschicht als Spacerschicht realisiert. Der die Pinholes 31 tragende Chip trägt somit über die Spacerschicht die Proben 21. Andere Probenpositionierungen, bspw. durch externe und justierbare gesonderte Halterungen, die die Maßgaben vorliegender Erfindung realisieren lassen, liegen im Rahmen der Erfindung. Der Pinholechip mit Probe wurde vor dem Detektor-Array positioniert, wobei im Beispiel ein Abstand c von etwa 1250 μm zur Probenebene 3 eingestellt wurde. Die photolithographisch erzeugten Pinholes 31 sollen im Beispiel einen Durchmessers von je 0,8 μm aufweisen, wodurch sich bei der eingesetzten Beleuchtungswellenlänge ein halber Öffnungswinkel α von 71,7° ergibt, wobei im Hinblick auf die Figuren die Darstellung des Winkels nicht maßstäblich erfolgte. Abweichend von der gezeigten Darstellung wurden zum besseren Vergleich mit den nach dem Stand der Technik erreichbaren Ergebnissen für ein verfügbares Mikroskop 6∙6 Pinholes 31 in einem, in einer Dimension betrachtet maximalen Abstand x von je 600 μm, im Beispiel von 500 nm strukturiert. Das Pinholearray wurde mit einem 10 mW HeNe Laser (Wellenlänge 633 nm) als kohärenter Beleuchtungsquelle 4 beleuchtet. In der Detektorebene entsteht durch die Wechselwirkung von durch die Proben 21 beeinflussten und durch die Proben ungestörten Lichtwellen (Referenzwellen) ein Hologramm, was in der CCD-Ebene detektierbar ist. Die Entfaltung des Hologramm und somit die Erzeugung des Objektbildes erfolgt grundsätzlich nach den bekannten Methoden des Standes der Technik für eine normale Inline-Holographie für nur ein Pinhole, auf die hier deshalb nicht näher einzugehen ist. Bei Einhaltung vorstehender Maßgaben ergibt sich im Beispiel eine Auflösung Δa von 538 nm.
Infolge der wechselseitigen Abhängigkeiten der einzelnen variablen Parameter in vorliegender Erfindung, besteht eine enge Wechselwirkung konkret einzuhaltender Dimensionierungen zu den jeweiligen Untersuchungsaufgaben. Will man bspw. mit fest vorgegebenen CCDs arbeiten ist es zweckmäßig, in Abhängigkeit von variabel zu untersuchenden Probengrößen einen Satz austauschbarer und unterschiedlich strukturierter Pinholearrays vorzuhalten.
Typische Werte für die Anzahl der Detektorpixel in einer Dimension sind 1140 bis 6300 Pixel und für die Pixelgröße 3.35 μm bis 24 μm. Typische vorteilhafte Werte für Untersuchungen mit sichtbarem Licht sind Pinholedurchmesser d von 0,8 μm bis 1,5 μm. Der Pinholedurchmesser bestimmt den Lichtkegel, dessen nutzbarer Öffnungswinkel sich mit abnehmendem Durchmesser erhöht. Etwa 50% des Kegelschnittes in einer Dimension darf die Ausdehnung der Probe betragen. Der Lichtkegel des Nachbarpinholes muss dann auch die Probe mindestens berühren. So ergibt sich der maximale Pinholeabstand x in Abhängigkeit von der Probengröße und -lage. Je nach Probenausdehnung werden eine Mindestzahl von Detektorpixeln benötigt, um die beugungsbegrenzte Auflösung zu erreichen. Alle weiteren Pixels tragen erfindungsgemäß zu Gesichtsfelderweiterung bei, ohne Verminderung der Auflösung. Das Verhältnis zwischen Pixelgröße und Auflösung der Probe bestimmt im Wesentlichen das Abstandsverhältnis c/b.
In 3 ist beispielhaft dargestellt, dass an der Stelle, an der in 2 die CCD positioniert war, auch eine abbildende Optik, ein Objektiv 5, positioniert werden kann. Dieses Objektiv bildet das Hologramm der CCD-Ebene auf eine neue CCD-Ebene ab. Für experimentelle Aufbauten ergibt sich der Vorteil, dass durch Wahl der Objektivvergrößerung, der Abbildungsmaßstab variiert werden kann. Durch die Zwischenabbildung kann die wirksame Pixelgröße um Faktoren verkleinert werden. Das Gesichtfeld und die Auflösung sind bei Verwendung von einem festen CCD-Kameratyp in weiten Grenzen auf diese Weise schnell variierbar. Die weiter oben diskutierte Begrenzung durch das Objektiv bleibt aber wirksam. Der diskutierte Vorteil einer Gesichtsfelderweiterung bei gleichzeitig hoher Auflösung ist jedoch nur ohne vorstehendes Zwischenobjektiv 5 in vollem Umfang realisierbar.
Um den Vorteil der erfindungsgemäßen Anordnung zu dokumentieren, wurde die gleiche Escheri Coli-Probe mit einen Mikroskop zum Vergleich abgebildet. Es wurde dabei das Mikroskop Axiotron von ZEISS mit einem Objektiv 50/0,7 verwendet. Mit dem optischen Mikroskop beträgt die beugungsbegrenzte Auflösung für Licht mit einer Wellenlänge von 633 nm z.B. 0,61 λ/N_a = 552nm, wenn man das Objektiv mit einen Apertur N_a = 0,7 nutzt (N_a = sinα/2), wodurch ein unmittelbaren Vergleich zu den unter 2 beschriebenen Verhältnissen gewährleistet ist. Das Mikroskopgesichtsfeld beträgt 480μm∙480μm. Damit Auflösung und Gesichtsfeld nicht von der CCD begrenzt werden und wenn man annimmt, dass diese ein Stützstellenraster von λ/(2N_a) = 452 nm wiedergeben soll, muss die CCD mindestens 1,3 MPixel (in einer Dimension 1130 Pixel) aufweisen. Mit der erfindungsgemäßen Anordnung konnte eine laterale Auflösung an der Beugungsgrenze erreicht werden und gleichzeitig das Gesichtsfeld gegenüber dem des Mikroskops mehr als verdoppelt werden. Wenn 6∙6 Pinholes verwendet werden, erhält man ein Gesichtsfeld von etwa 3 mm∙3 mm.
Alle in der Beschreibung, dem Ausführungsbeispiel und den nachfolgenden Zeichnungen erkennbaren Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

1: Detektor-Array (CCD)
2: Probenebene
21: Probe
3: Pinholeebene
31: Pinhole
4: kohärente Beleuchtungsquelle
5: Objektiv
a: erfaß- und darstellbarer Probenteil
b: Abstand der Probenebene zur Pinholebene
c: Abstand der Probenebene zur Detektorebene
Δc: Detektorpixel
d: Pinholedurchmesser
x: Rasterabstand der Pinholes

Claims

Anordnung zur hochauflösenden digitalen Inline-Holographie, insbesondere Mikroskopie, bestehend aus einem Detektor-Array (1), einer Probenebene (2), einer Pinholeebene (3) und einer kohärenten Beleuchtungsquelle (4), dadurch gekennzeichnet, dass – mindestens zwei Pinholes (31) und in Relation zur Anzahl der Detektor-Pixel (Δc) des Detektor-Arrays (1) in einer Dimension eine Anzahl von bis zu einem 150tel Pinholes (31) in einem Pinholearray in der Pinholeebene (3) in der gleichen Dimensionsrichtung vorgesehen sind, wobei – die Proben (21) eine Größenausdehnung aufweisen können, die gewährleisten, dass von den Pinholes (31) ausgehende Lichtkegel zu mindestens 50% von den Proben (21) ungestört zum Detektor-Array (1) gelangen, wobei – der Pinholedurchmesser (d) und der maximale Rasterabstand (x) der Pinholes (31) zueinander einer Beziehung
folgend festgelegt sind, wobei λ für die eingesetzte Wellenlänge; a für den Teil der Probenlänge der Probe (21), die durch nur einen Lichtkegel eines Pinholes (31) erfaß- und darstellbar wäre und b für den Abstand der Probenebene (2) zur Pinholebene (3) steht.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erreichung einer maximalen Auflösung Δa von Probendetails der Abstand b der Probenebene (2) im Rahmen der technischen Realisierbarkeit möglichst klein festgelegt ist und einer Beziehung Δa ≈ 1,5∙b/c∙Δc folgt.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Rasterabstand x der Pinholes (31) zueinander in Relation zum Abstand b der Probenebene (2) zur Pinholebene (3) in einem Bereich von x = 0,5b bis 5b festgelegt ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass den Pinholes (31) ein Durchmesser in der Größenordnung von 0,5 μm bis 3 μm, bei Einsatz von Licht im sichtbaren Spektralbereich, gegeben ist.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektor-Array (9) durch ein CCD-Array gebildet ist
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass oberhalb der Probenebene (2) ein Objektiv (5), welches das CCD-Array auszuleuchten gestattet, dem CCD-Array (1) vorgeordnet ist.