WO2014026667A1

WO2014026667A1 - Anordnung für ein linsenloses, holografisches inline-auflichtmikroskop

Info

Publication number: WO2014026667A1
Application number: PCT/DE2013/000439
Authority: WO
Inventors: Alexej GRJASOW; Mario KANKA; Rainer Riesenberg; Jürgen Schreiber; Andreas Wuttig
Original assignee: Institut Für Photonische Technologien E.V.
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2013-08-01
Publication date: 2014-02-20
Also published as: DE102012016318A1; DE102012016318B4

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung für ein linsenloses, holografisches Inline-Auflichtmikroskop. Die Aufgabe, eine solche Anordnung anzugeben, die durch den Verzicht auf abbildende Optiken eine kompakte chipbasierte Bauweise ermöglicht, wobei auch große Proben, respektive Probenausschnitte abbildbar sein sollen, wird dadurch gelöst, dass in zueinander im Wesentlichen planparalleler Anordnung ein Probenträger (2) mit Probe (21), darüber in einem ersten Abstand (h1) zur Probe ein planparalleler teildurchlässiger Spiegel (3) und zu dessen teilreflektiver Fläche (31), in einem weiteren Abstand (h2) entfernt, ein digitales Detektor-Array (1) [CCD, CMOS] vorgesehen sind, wobei in der effektiven Fläche (12) des Detektor-Arrays (1) eine punktförmige Beleuchtungsquelle (11) zur Aussendung kohärenter Strahlung vorgesehen ist und das Verhältnis zwischen der Kantenlänge (b) der effektiven Fläche (12) des Detektor-Arrays (1) zum Abstand (h) dieser zum Probenträger (2), in einem Bereich von 3/2 bis 4/1 gewählt ist.

Description

Anordnung für ein linsenloses, holografisches Inline-Auflichtmikroskop Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine Anordnung für ein linsenloses,

holografisches Inline-Auflichtmikroskop, das bevorzugt zur Detektion von ausgedehnten und/oder beweglichen biologischen Proben mit hoher lateraler und Tiefenauflösung Verwendung findet. Die

vorgeschlagene Anordnung eignet sich insbesondere zur

dreidimensionalen Auflicht-Abbildung einer Probe aus nur einer

Messung (3D-Snapshot), womit sich die Anordnung insbesondere für die Rekonstruktion von relativ schnellen dreidimensionalen

Bewegungsabläufen mikroskopischer Objekte, z.B. in der Mikrofluidik, eignet. Weitere Anwendung findet die vorgeschlagene Anordnung z.B. in der Unterwassermikroskopie und der Mikroskopie biologischer Proben sowie der quantitativen Phasenmikroskopie. Der besonders hervorzuhebende Vorteil dieser Anordnung ergibt sich in deren Einsatz zur zerstörungsfreien online-Untersuchung von ausgedehnten

Oberflächen in der Werkstoffuntersuchung, Medizin etc.

Mit einem klassischen optischen Mikroskop für das sichtbare Licht erreicht man die bekannte laterale Auflösungsgrenze von etwa 550 nm (sogenannte Beugungsgrenze oder auch Abbelimit). Sie beträgt für eine Wellenlänge λ von 633 nm 0,61 λ/Ν₃ = 552nm, wenn man ein Objektiv mit einer Apertur N_a von 0,7 nutzt. Das Gesichtfeld beträgt dann typischerweise nur 480μιη · 480μηη. Will man größere Proben als Ganzes beobachten, also das Gesichtfeld vergrößern, so verwendet man Objektive mit einer geringeren Vergrößerung, die immer mit geringerer numerischer Apertur kombiniert sind. Mit der Vergrößerung des Gesichtfeldes vermindert sich aber auch die laterale Ortsauflösung. Um das typische, vorstehend genannte Gesichtfeld mit der maximalen, von den Objektiven begrenzten Auflösung, aufzuzeichnen, reicht bspw. eine CCD mit einer Pixelzahl von etwa 1 ,3 MPixel. Für eine solche Lösung wäre es eine denkbare Möglichkeit, zwecks Erzielung einer hohen Auflösung bei gleichzeitig stark erweitertem Gesichtfeld, sehr große Objektive zu bauen, wie sie von der Photolithographie her bekannt sind. Das wäre aber technisch und ökonomisch mit einem zu hohen Aufwand verbunden und würde im Ergebnis nicht zu einem Handheld-Gerät führen können.

Weiterhin ist die sogenannte Gaborsche Inlineholografie bekannt, die ein einziges kohärent beleuchtetes Pinhole nutzt, in dessen

Beleuchtungskegel eine Probe angeordnet ist. Aus den

aufgezeichneten Interferenzen können Phase und Amplitude des Objektes rekonstruiert werden [vgl. z.B. Kreuzer, H.J. et al.; "Digital inline holography with photons and electrons"; J. Phys. Condens. Matter 13, S. 10729-10741 (2001 )]. Dieses„Mikroskop" arbeitet ohne Objektiv. Die Apertur bestimmt sich aus der Pinholegröße. Allerdings ist bei dieser Anordnung die Probengröße sehr begrenzt, nämlich auf ca.

5 μΐΉ, und darf nur einen Teil des Lichtkegelquerschnitts beeinflussen, in der Regel etwa 25 %. Weiterhin gelten auch die diskutierten Grenzen und der Zusammenhang für Auflösung und Gesichtsfeld eines optischen Mikroskops.

Zur Lösung vorstehenden Problems wurde in DE 10 2005 023 137 A1 bereits eine Anordnung zur hochauflösenden digitalen Inline-Holografie vorgeschlagen, die allerdings im Durchlicht arbeitet, wobei dort die abzubildende Probe einer Beleuchtung aus mehreren Pinholes ausgesetzt wird, ehe ein Interferenzmuster auf einem Detektorarray auswertbar ist. Um dort überhaupt ein auswertbares und auf die Probe rückschließbares Interferenzmuster zu erhalten, muss gewährleistet sein, dass der wesentliche Teil der kohärenten Beleuchtungsstrahlung von der Probe unbeeinflusst ist. Dazu wird in dieser Schrift

vorgeschlagen, wenn mit vorgegebenen CCDs gearbeitet werden soll, in Abhängigkeit von variabel zu untersuchenden Probengrößen einen Satz austauschbarer und unterschiedlich strukturierter Pinholearrays vorzuhalten, was unter Routineeinsatzbedingungen allerdings nicht sonderlich praktikabel ist.

Bei der vorstehend umrissenen digitalen / ne-holografischen

Mikroskopie (DIHM) wird das hinter der Probe erzeugte Interferenzbild (Hologramm) mit einem digitalen Bildsensor (CCD, CMOS)

aufgezeichnet und für die Bildgebung in einen Computer übertragen. Mit zum Stand der Technik gehöriger Computerprogramme erfolgt nun die Bildgebung, ausgehend vom gemessenen Hologramm und mit Hilfe der Referenzwelle, dem von der Probe unbeeinflussten Teil der

Beleuchtung. Ein wesentlicher Vorteil gegenüber der klassischen Licht- Mikroskopie besteht in der Bildgebung der Probe in Intensität und Phase, was ein von der Messung unabhängiges nachträgliches

Fokussieren ermöglicht.

Mit einem Pinhole mit einem Durchmesser von 0,6 μιη wurde bereits eine linsenlose Durchlicht-Abbildung mikroskopischer Proben mit Objektdetails von 0,4 μηι erreicht, wobei die Pixel-Periode des

Bildsensors 3,5 μηι betrug. Hierzu war es nötig, die Probe bis auf wenige hundert Mikrometer zum Pinhole zu positionieren und einen über Größe und Abstand des Bildsensors definierten halben

Öffnungswinkel von 53° zu realisieren [Kanka, M. et al. OPTICS

LETTERS, Vol. 36, No. 18, September 15, 2011 , S. 3651-3653]. Dieser Winkel entspricht einer numerischen Apertur von 0,8, welche nach Abbe das optische Auflösungsvermögen eines abbildenden Systems bestimmt.

Die numerische Rekonstruktion erfolgt, wie vorstehend angedeutet, mit Hilfe eines sogenannten Kontrast-Hologramms (Contrast-Image), der Differenz zwischen dem Hologramm und der Beleuchtung (einer Messung ohne Probe). Dabei ergibt sich ein weiterer Nachteil der Inline-Holografie, der darin besteht, dass bei der Rekonstruktion zusätzlich zum eigentlichen Bild zwei Sekundärbilder (Twin-Image und Zero-Order-Image) entstehen, welche das gewünschte Bild der Probe störend überlageren [Latychevskaia, T. et al. PHYSICAL REVIEW LETTERS 98, S. 233901-01 bis -04 (2007)]. Aus diesem Grund besteht für die inline-holografische Mikroskopie eine prinzipielle Einschränkung auf Proben mit geringfügiger Störung der Beleuchtung, d.h.

Ansammlungen mikroskopischer Einzelobjekte (Partikel) oder nicht zu große vereinzelte Objekte (mit einer Lösung verdünnte Proben).

Mit einem klassischen Licht-Mikroskop und kohärenter Beleuchtung können mehrere Hologramme mit variierendem Abstand zur Probe (unterschiedliche Fokusebenen, z-Stack) verwendet werden, um die störenden Sekundärbilder iterativ zu entfernen. Hierfür werden jedoch mindestens eine Messung mit möglichst großem Abstand zur Probe (Fourier-Bild) und eine Messung möglichst nahe der Probenebene (Objekt-Bild) benötigt [Fienup, J. R. APPLIED OPTICS, Vol. 21 , No. 15, S. 2758-2769 (1982)] bzw. zusätzliche Bedingungen für die Probe, z.B. betreffend ihrer Ausdehnung, gestellt [Fienup, J. R. OPTICS LETTERS, Vol. 3, No. 1 , (1978) S. 27-29, oder Zhang, F. PHYSICAL REVIEW A 75, 043805-1 bis -4 (2007)]. Mit dem Objektiv eines klassischen Licht- Mikroskops ist dies aufgrund des gegebenen Arbeitsabstands von einigen Millimetern durchführbar. In der linsenlosen Inline-Holografie jedoch kann ein Bild der Probenebene nur mit der durch den Pixel- Abstand des Bildsensors definierten Auflösung von mehreren

Mikrometern oder mit dementsprechend erhöhtem Aufwand einer Mehrfachmessung für ein Sub-Pixel-Scanning aufgenommen

werden [Bishara, W. et al. OPTICS EXPRESS Vol. 18, No. 11 , S.

11181-11191 (2010), und Greenbaum A. et al. OPTICS EXPRESS Vol. 20, No. 3, S. 3129-3143 (2012)]. Hierbei kommt es jedoch zu

Problemen bei der Rekonstruktion sich schnell bewegender Proben, wie dies zum Beispiel in der Mikrofluidik häufig der Fall ist. Für die Inline-Holografie mit Pinhole, statt Objektiv, mussten daher andere Methoden zur Beseitigung der Sekundärbilder gefunden werden. Auch das in der Interferometrie häufig eingesetzte Verändern der

Phasenbeziehung [Zhang, T. et al. OPTICS LETTERS Vol. 23, No. 15 S. 1221-1223 (1998) / Colomb, T. et al. J. Opt. Soc. Am. A Vol. 23, No. 12, S. 3177-3190, (2006) / Stenner, M.D. et al. OPTICS EXPRESS Vol. 14, No. 10, S. 4286-4299 (2006) / Mico, V. et al. OPTICS LETTERS Vol. 34, No. 10 , S. 1492-1494 (2009)] zwischen der zu bestimmenden Wellenfront (Objektwelle) und einer Referenzwellenfront (Pinholewelle) kann hier nicht angewendet werden, da die Referenzwellenfront selbst die Probe beleuchtet und damit eine unveränderbare Phasenbeziehung zwischen beiden Wellenfronten besteht. Für die linsenlose Inline- Holografie haben sich Verfahren zur Verbesserung der

Abbildungseigenschaften für spezielle Proben etabliert. Zum Beispiel ist dies die Einschränkung auf„flache" Proben (zweidimensional), so dass ausgehend von einer Anfangsschätzung mit Hilfe des

Energieerhaltungssatzes [Latychevskaia, T. et al. PHYSICAL REVIEW LETTERS 98, S. 233901-01 bis -04 (2007)] oder mit einem

sogenannten Object-Supporting [Koren, G. et al. OPTICS LETTERS Vol. 16, No. 24, S.1979-1982 (1991 )] (d.h. das Unterdrücken aller Sekundärbildanteile, welche sich nicht mit dem Objektbild räumlich überlagern) die Sekundärbilder iterativ abgeschwächt bzw. entfernt werden können. Die digitale inline-holografische Durchlicht-Mikroskopie mit Pinhole, statt Objektiv, eignet sich, aufgrund der gleichzeitig als Referenz genutzten Beleuchtung, nur für die Abbildung von

vereinzelten, kleinen (Partikeln) bzw. flachen Proben (2D).

Zur Vermeidung vorstehend aufgeführter Probleme wurden bereits Methoden einer holografi sehen Auflichtmikroskopie mit Hilfe von

Michelson-Interferometern oder auch mit Mach-Zehnder- Interferometern bekannt [Kim, M.K. SPIE Reviews Vol. 1 , S. 018005-1- 50 (2010)]. In beiden Fällen sind Beleuchtungs- und

Referenzwellenfelder getrennt, so dass Phasenschiebeverfahren durchgeführt und damit ein Probenbild in Intensität und Phase ohne störende Sekundärbilder (Twin-Image, Zero-Order-Image) rekonstruiert werden können. Vergleichend mit der klassischen Licht-Mikroskopie besteht bei der digitalen holografischen Bildgebung stets der Vorteil, dass die Rekonstruktion von Probenbildern ausgehend vom

gemessenen Hologramm wiederholt für verschiedene Fokuspositionen mit Hilfe geeigneter, bekannter Computerprogramme möglich ist (3D- Snapshot) [Xu, W. et al. OPTICS LETTERS, Vol. 28, No. 3, S. 164-166 (2003)]. Darüber hinaus kann mit dem quantitativen Phasenbild ein Höhenprofil mit Nanometer-Aufösung erstellt werden [Charriere, F. et al. OPTICS EXPRESS Vol. 15, No. 14, S. 8818-8831 (2007) / Kemper, B. et al. SPIE-OSA Vol. 6633 66330D-1-9 (2007)]. Diese vorstehend beschriebene Art der holografischen Auflicht-Mikroskopie ermöglicht eine Abbildung einer Probe ohne störende Sekundärbilder, ist jedoch, durch den dazu notwendigen Interferometeraufbau, der durch die dazu erforderlichen optischen Komponenten (wie Strahlteilerwürfel,

Umlenkspiegel und/oder Mikroskop-Objektive), nicht miniaturisierbar und somit für ein kompaktes Handheld-Gerät ungeeignet. Darüber hinaus existieren bei diesen vorgeschlagenen Lösungen auch

funktionelle Probleme, die darin bestehen, dass bei der Abbildung mit solchen Interferometern der Strahlengang des Lichts mit Hilfe der um 45° gekippten halbdurchlässigen Spiegel in den Strahlteiler-Würfeln um 90° umgelenkt wird. Damit ist der halbe Öffnungswinkel für das von der Probe kommenden Lichts auf deutlich weniger als 45° begrenzt. Im Falle eines Aufbaus ohne abbildende Optik (Objektiv, Linse) kommt es zu einer Begrenzung der optischen Auflösung [Lee, M. et al.,

BIOMEDICAL OPTICS EXPRESS Vol. 2, No. 9, S.2721-2730 (201 1 )]. Aus diesem Grund wird für die mikroskopische Bildgebung ein auf Mehrfachmessung basierendes Sub-Pixel-Scanning (d.h. erhöhter Aufwand) [Bishara, W. et al., OPTICS EXPRESS Vol. 18, No. 1 1 , S. 1 1 181-1 191 (2010)] oder gar ein vergrößerndes Objektiv eingesetzt [Zhang, T. et al., OPTICS LETTERS Vol. 23, No. 15 S. 1221-1223 (1998) / Colomb, T. et al. J. Opt. Soc. Am. A Vol. 23, No. 12, S. 3177- 3190, (2006) / Kim, M.K. SPIE Reviews Vol. 1 , S. 018005-1-50 (2010)].

Weiterhin ist aus US 2009/009181 1 A1 ein holographisches Mikroskop nach einem anderen Prinzip, dem offline Ansatz, bekannt. Der

Strahlengang der Objektwelle und der Referenzstrahlengang sind dort optisch getrennt. Ein kompaktes Mikroskop, aufgebaut nur mit Chips, ist mit diesem Ansatz nicht realisierbar. Speziell ist bei dieser

Anordnung die Auflösung durch die Pixelgröße auf ca. zwei Pixel der CCD, d.h. auf 3 ... 7 μιτι begrenzt.

In DE 10 2007 058 558 A1 ist auch ein anderes Prinzip, nämlich das eines klassischen optischen Mikroskopes beschrieben. In dem dortigen Strahlengang werden durch geeignete Mittel Phasenunterschiede kontrastiert. Es wird ein Objektiv benötigt. Die Anordnung ist nicht so miniaturisierbar, wie durch vorliegende Erfindung angestrebt.

Schließlich offenbart DE 102 06 020 A1 ein optisches

Nahfeldmikroskop, dem ein anderes Prinzip zugrunde liegt: eine Sonde wird in einem Abstand von kleiner gleich der Wellenlänge über die Probe bewegt. Für ein optisches Nahfeldmikroskop ist eine aufwendige Mechanik zum Scannen erforderlich mit vielen Scanschritten und langen Messzeiten für ein Bild. Eine vorliegender Erfindung ähnliche Einfachheit, Miniaturisierbarkeit und Robustheit ist nicht gegeben. Den letzten zwei Veröffentlichungen haftet der wesentliche Nachteil an, dass prinzipbedingt ein 3D-Volumen nicht mit nur einer Aufnahme dargestellt werden kann.

Vorliegender Erfindung am nächsten kommt ein Aufbau, der eine neuartige holografische Auflicht-Mikroskopie realisiert [Schumann, I. Diplomarbeit, Friedrich-Schiller-Universität, S. 43, 2010]. Hierbei befindet sich eine seitlich schräg angeordnete Pinhole-Blende über einem als Probenhalter dienenden Spiegel. Der Sensor-Chip befindet sich ebenfalls über dem Spiegel, neben der Pinhole-Blende und ist derart gekippt, dass das Spiegelbild des Pinholes die aktive

Sensorfläche mittig trifft. Dieser Aufbau ermöglicht eine holografische Auflicht-Mikroskopie ohne abbildende Optik (Objektiv, Linse), hat jedoch, wie vergleichbare Anordnungen des Standes der Technik, ebenso den Nachteil, dass es, aufgrund der hier erforderlichen

Stahlumlenkung, auch hier zu einer Auflösungsbeschränkung kommt. Weiter erschwert die zur Detektionsebene (Sensorfläche) gekippte Probenebene die Bildrekonstruktion. Weiterhin ist auch bei diesem Vorschlag eine partielle Beeinflussung der Referenzwellenanteile durch die Probe selbst gegeben. Auch dieser Aufbau ermöglicht

konstruktionsbedingt allerdings keine kompakte Anordnung.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung für ein linsenloses, holografisches Inline-Auflichtmikroskop anzugeben, das durch den Verzicht auf abbildende Optiken (wie Linsen, Objektive etc.) eine kompakte chipbasierte Bauweise ermöglicht, wobei auch große Proben, respektive Probenausschnitte abbildbar sein sollen.

Die Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des

Patentanspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind

Gegenstand der nachgeordneten Ansprüche.

Das Wesen vorliegender Erfindung besteht darin, dass, aufgrund der eineindeutigen Trennung von Referenz- und

Beleuchtungswellenfeldern, keine zusätzlichen Bedingungen an die Probe gestellt werden müssen und durch die in vorgeschlagener Anordnung zum Einsatz gelangenden, parallel hintereinander angeordneten, flachen Komponenten (Beleuchtung, Sensor-Chip, teildurchlässiger Spiegel etc.) ein äußerst kompakter Aufbau der Gesamtanordnung ermöglicht wird, wobei auf jede Art von abbildenden Optiken (Objektiv, Linse) verzichtet werden kann. Durch den

erfindungsgemäß vorgeschlagenen Aufbau ist es besonders vorteilhaft möglich, in der Interferometrie an sich übliche

Phasenschiebeverfahren, die ansonsten in der Inline-Holografie typischen Sekundärbilder (Twin-Image) zu vermeiden.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels und schematischer, nicht maßstäblicher Zeichnung näher erläutert werden. Es zeigt:

Fig. 1 eine Ausführungsmöglichkeit des grundsätzlichen Aufbaus vorgeschlagener Anordnung mit ihren wesentlichen

Einzelkomponenten im seitlichen Schnitt

In Figur 1 sind zunächst die Hauptkomponenten der vorgeschlagenen Anordnung im seitlichen Schnitt dargestellt, welche bestehen aus:

- einem elektronischen digitalen Detektor-Array 1 , gebildet bspw. durch ein an sich handelsübliches CCD- oder CMOS-Array als bildempfindliches Sensorelement zur Registrierung entstehender Interferenzbilder mit einer mittig angeordneten punktförmigen Beleuchtungsquelle 11 zur Aussendung kohärenter Strahlung

- einer Probenebene 2, in der die Proben 21 angeordnet werden und

- einem planparallelen teildurchlässigen Spiegel 3.

Gemäß vorliegender Erfindung sind alle vorgenannten wesentlichen Baugruppen (1 , 2, 3) zueinander im Wesentlichen planparallel und im Beispiel axialsymmetrisch (zur Achse X-X) angeordnet, wobei der Abstand zwischen der aktiven Fläche 12 des digitalen Detektor-Arrays 1 und der dieser zugewandten Oberfläche 31 des teildurchlässigen, bevorzugt halbdurchlässigen, Spiegels 3 dem Abstand zwischen dieser Oberfläche 31 und der Probenebene 2 mit der abzubildenden Probe 21 im Wesentlichen entspricht. Wenn vorstehend und im weiteren von im Wesentlichen planparallel gesprochen wird, sollen damit von der absoluten Planparallelität abweichende, fertigungsbedingte Toleranzen mit erfasst sein. Das Verhältnis von Sensor-Proben-Abstand h und der Kantenlänge b der aktiven Fläche 12 des Detektor-Arrays 1 definiert die numerische Apertur (NA), das optische Auflösungsvermögen, des Systems. Um eine hohe Auflösung entsprechend einer NA von 0,8 (an Luft) zu erreichen, muss ein Verhältnis in der Größenordnung von 8:3 gewählt werden. Für ein Detektor-Array mit einer Kantenlänge b von 10 mm ergibt sich ein Sensor-Proben-Abstand von höchstens 3,75 mm. Der Abstand zwischen dem Detektor-Array und der Oberfläche 31 des teildurchlässigen Spiegels 3 beträgt dann etwa 1 ,9 mm. Bevorzugt ist ein geringerer Abstand der Probenebene 2 zur reflektiven Fläche 31 zu wählen. Aus vorstehenden beispielhaften Maßangaben ist, trotz eingedenk zusätzlicher geringfügiger Bauhöhenvergrößerungen durch nicht dargestellte Detektor-Array-Einfassungen und dessen

Elektronikeinheiten als auch integrierter Beleuchtungseinheiten, leicht ersichtlich, dass die Gesamtbauhöhe des Systems um

Größenordnungen unter denen vergleichbarer

Interferometeranordnungen gemäß des Standes der Technik liegt.

Womit ein erster Teil der Aufgabe der Erfindung erfüllt ist.

Reicht dem Anwender der erfindungsgemäßen Anordnung, bspw. zur Bildgebung von biologischen Zellen, hingegen eine Auflösung, die einer numerischen Apertur von 0,6 entspricht, kann besagtes Verhältnis in der Größenordnung von 3/2 gewählt werden. Damit ist immer noch eine kompakte Anordnung im Sinne vorliegender Erfindung gewährleistet, die die Tolleranzanforderungen an die Gesamtanordnung verringern. Wählt man bspw. für Proben, die eine höhere Auflösung erfordern, wie z.B. zur Bildgebung von Zellbestandteilen, kann bei Erhöhung der Toleranzanforderungen ein Verhältnis von 4/1 gewählt werden, womit man in den Bereich der Bildgebung klassischer Mikroskopie gelangt.

Bezüglich der mittig im Detektor-Array 1 erfindungsgemäß

vorgesehenen punktförmigen Beleuchtungsquelle 11 zur Aussendung kohärenter Strahlung sind unterschiedliche Ausführungen möglich. So kann in einer ersten Realisierungsform in einer nicht beschalteten Zelle des Detektor-Arrays 1 eine durchgehende Bohrung vorgesehen sein, die ggf. konisch ausgeführt ist, so dass sich der Probe zugewandt ein Öffnungsdurchmesser des Pinholes von ca. 500 nm ergibt. Ebenso kann, bei größerem Bohrungsdurchmesser, an besagter Stelle eine separat gefertigte Pinhole-Blende mit besagtem Durchmesser angebracht sein. Eine separat, hier nicht näher dargestellte kohärente Lichtquelle (bspw. ein Halbleiterlaser) durchstrahlt dann entsprechend eines in Figur 1 dargestellten dicken Pfeils L genannte Pinholeöffnung. In gleicher Weise ist aber auch der Einsatz einer kommerziell verfügbaren GRIN-Stab-Linse, ggf. versehen mit einer Lochblende mit einem Öffnungsdurchmesser von ca. 500 nm, direkt in die Bohrung des Detektor-Arrays 1 möglich. In gleicher Wiese kann bspw. eine mit einer nichttransparenten Ummantelung und mit einer Lochblende versehe Lichtleitfaser zum Einsatz gelangen. Der Einsatz anderer

Beleuchtungsquellen direkt an besagter Stelle liegt ausdrücklich im Rahmen der Erfindung, solange von diesen punktförmig eine kohärente Strahlung ausgeht.

Um ein in der Interferometrie ansonsten übliches

Phasenschiebeverfahren auch bei vorliegender Erfindung realisieren zu können, ohne die Kompaktheit der bisher geschaffenen Bauform zu beeinträchtigen, wird in einer Ausführung nach Fig. 1 weiterhin vorgeschlagen, das Detektor-Arrays 1 und den teildurchlässigen Spiegel 3 miteinander in eine starre Verbindung vermittels einer piezoelektrischen Baugruppe 4 zu bringen. Solche Aktoren sind, für andere Verwendungszwecke konzipiert, ebenfalls am Markt verfügbar. Die im Beispiel eingesetzten PICMA Chip Aktoren, der Fa. Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, weisen in Auslenkungsrichtung (vgl. Doppelpfeil in der Baugruppe 4 in Fig. 1 ) eine Höhe von 2 mm auf und ermöglichen einen Auslenkungshub von 2,2 μητι bei einer

Resonanzfrequenz von 300 kHz (angepasst an die zeitliche

Begrenzung des digitalen Detektor-Arrays) auf. Bei entsprechender Ansteuerung der piezoelektrischen Baugruppe 4 können durch die damit erreichbare Veränderung des Abstands zwischen dem teildurchlässigen Spiegel und dem Detektor-Arrays 1 die für die Inline- Holografie typischen Sekundärbilder (Twin-Images) vermieden werden. Zum besseren Verständnis dieser Maßnahme soll nur Nachstehendes vorsorglich ausgeführt werden:

Die komplexwertige Referenzwellet? ist die von der Beleuchtungsquelle 1 1 ausgehende Wellenfront. Die komplexwertige Objektwelle u ist die von der beleuchteten Probe ausgehende Wellenfront. Das in der Detektorebene gemessene Hologramm entspricht dem Betragsquadrat (Intensität) der Summe beider Wellenfronten

\u + v\² = uv* + vu* + uu* + w*. Der erste Term ist die gesuchte

komplexwertige Objektwelle multipliziert mit der komplex konjugierten Referenzwelle. Der zweite Term heißt Twin-Image, der dritte Zero- Order-Image und der vierte Summand ist die Intensität der

Referenzwelle. Die Intensität der Referenzwelle | * wird durch eine zweite Messung ohne Probe bestimmt und vom Hologramm subtrahiert. Mit dem sogenannten Kontrasthologramm

|u + i;|²- |v|² = uv* + vu* + uu* wird ein Bild der Probe numerisch rekonstruiert. Damit dieses Kontrasthologramm die Objektwelle gut approximiert, muss die Referenzwelle dem Betrag nach die

Objektwelle dominieren (im* « w*). In diesem Fall gilt

|u + v|²-M² « v* + vu*, d.h. das Bild der Probe wird in guter Näherung allein durch das Twin-Image überlagert. Eine Variation der

Phasenbeziehung zwischen Referenz- und Objektwelle (bei Durchlicht- Inline-Holografie nicht möglich) führt zu einer Kosinus-Modulation der Intensität \u + v e-^i£ f

- Θ) in Abhängigkeit vom Phasenhub Θ. Mit bekannter mittlerer Intensität

+ |² genügen bereits zwei Messungen (z.B. θ e {θ,ττ/2}) zur Bestimmung der komplexwertigen Objektwelle. Im

Allgemeinen jedoch wird die Objektwelle nicht vernachlässigbar klein gegenüber der Referenzwelle sein, so dass ein

Phasenschiebeverfahren, ohne Kenntnis der mittleren Intensität, vorteilhaft mindestens drei Messung benötigt (z.B. θ e {ο,πβ,π}).

Durch die derzeit verfügbaren schnellen piezoelektrischen

Bauelemente und schnellen CCDs ist es möglich, innerhalb von bspw. 100 με, oder darunter, eine Verstellung des Abstandes h2 in die jeweils gewünschten Lagen vorzunehmen und die zugehörigen Bilder aufzunehmen. Dazu werden piezoelektrische Bauelemente eingesetzt, die Hubänderungen bis zur Wellenlänge der eingesetzten

Beleuchtungsquelle, bspw. eines gepulsten Lasers, ermöglichen. Damit sind auch relativ bewegliche Objekte abbildbar, wenn sie innerhalb vorstehend genannten Zeitfensters einen geringen lokalen Versatz aufweisen.

Alle in der Beschreibung, dem Ausführungsbeispiel und der

nachfolgenden Zeichnung erkennbaren Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander

erfindungswesentlich sein.

Bezugszeichenliste

1 - Detektor-Array (CCD, CMOS)

1 1 - punktförmige Beleuchtungsquelle

12 - aktive Fläche des Detektor-Array

13 - Pinhole

2 - Probenebene

21 - Probe

3 - teildurchlässiger Spiegel

31 - teilreflektive Fläche des teildurchlässiger Spiegels

4 - piezoelektrischen Baugruppe

5 - Marker

h1 - Abstand Probenträger zur Fläche 31

h2 - Abstand Fläche 31 zur aktiven Detektor-Array- Fläche

h - Abstand Probenträger zur aktiven Detektor-Array- Fläche

L - kohärente Beleuchtungsquelle

X-X - Symmetrieachse

Claims

Patentansprüche

1. Anordnung für ein linsenloses, holografisches Inline Auflicht- Mikroskop, dadurch gekennzeichnet, dass in zueinander im Wesentlichen planparalleler Anordnung ein Probenträger (2) mit Probe (21 ), darüber in einem ersten Abstand (h1 ) zur Probe ein planparalleler teildurchlässiger Spiegel (3) und zu dessen teilreflektiver Fläche (31 ), in einem weiteren Abstand (h2) entfernt, ein digitales Detektor-Array (1 ) [wie z.B. CCD, CMOS] vorgesehen sind, wobei in der aktiven Fläche (12) des Detektor- Arrays (1 ) eine punktförmige Beleuchtungsquelle (1 1 ) zur

Aussendung kohärenter Strahlung vorgesehen ist und das Verhältnis zwischen der Kantenlänge (b) der aktiven Fläche (12) des Detektor-Arrays (1 ) zum Abstand (h) dieser zum

Probenträger (2), in einem Bereich von 3/2 bis 4/1 gewählt ist.

2. Anordnung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Leuchtspotdurchmesser der punktförmigen Beleuchtungsquelle (1 1 ) in der Größenordnung von 500 nm festgelegt ist.

3. Anordnung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsquelle (1 1 ) durch ein Pinhole (13) gebildet ist, welches durch das Detektor-Array (1 ) durchgehend geführt ist und rückseitig des Detektor-Arrays von einer kohärenten

Lichtquelle (L) bestrahlt wird.

4. Anordnung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsquelle (1 1 ) durch eine GRIN-Stab-Linse gebildet ist, welche durch das Detektor-Array (1 ) durchgehend geführt ist und mit der aktiven Detektor-Arrayfläche bündig abschließt und in die andererseits eine kohärente Lichtstrahlung eingekoppelt wird.

5. Anordnung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei größerer Querschnittsausdehnung der zum Einsatz gelangenden punktförmigen Beleuchtungsquelle dieser in der Ebene der aktiven Detektor-Arrayfläche (12) eine Lochblende mit einem Öffnungsdurchmesser in der

Größenordnung von 500 nm zugeordnet ist.

6. Anordnung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die punktförmige Beleuchtungsquelle (1 1 ) mittig auf der aktiven Fläche des Detektor-Arrays (1 ) angeordnet ist.

7. Anordnung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand (h1 ) der Probenebene zur teilreflektiven Fläche (31 ) des teildurchlässigen Spiegel (3) in etwa gleich groß, wie der Abstand (h2) der aktiven Fläche (12) des digitalen Detektor-Arrays (1 ) zu besagter teilreflektiver Fläche (31 ) gewählt ist.

8. Anordnung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand (h1 ) der Probenebene zur teilreflektiven Fläche (31 ) des teildurchlässigen Spiegel (3) kleiner, als der Abstand (h2) der aktiven Fläche (12) des digitalen Detektor-Arrays (1 ) zu besagter teilreflektiver Fläche (31 ) gewählt ist.

9. Anordnung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Detektor-Array (1 ) und der teildurchlässige Spiegel (3)

miteinander umfangsseitig oder zumindest an zwei

gegenüberliegenden Rändern, starr über ein Höhenverstellmittel (4) verbunden sind, wobei durch das Höhenverstellmittel definiert einstellbare Abstandsänderungen zwischen der effektiven Fläche (12) des Detektor-Arrays (1 ) und dieser zugewandter

teilreflektiver Ebene (31 ) des teildurchlässigen Spiegels (3) in der Größenordnung der eingesetzten Lichtwellenlänge realisierbar sind.

10. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Höhenverstellmittel durch ein elektrisch ansteuerbares

piezoelektrisches Bauelement (4) gebildet sind, welches

Hubänderungen bis zur Wellenlänge der eingesetzten

Beleuchtungsquelle ermöglicht.