DE102005022125A1

DE102005022125A1 - Light pattern microscope with auto focus mechanism, uses excitation or detection beam path with auto focus for detecting position of focal plane

Info

Publication number: DE102005022125A1
Application number: DE200510022125
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. Westphal; Daniel Dr. Bublitz
Original assignee: Carl Zeiss MicroImaging GmbH; Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2005-05-12
Filing date: 2005-05-12
Publication date: 2006-11-16
Also published as: WO2007019895A1

Abstract

A light pattern microscope has an excitation and detection beam path, a device (9) for patterned scanning of an object (2) by shifting an imaged spot-, line-, or multi-spot zone over the object (2). An auto focus device (22) is coupled into the excitation or detection beam path (3,4) for detecting a position of the focus plane (F) of the objective (6), which images different depth zones at the image spot-, line-, or multi-spot zone in different locations of the location-resolving detector (20).

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Lichtrastermikroskop mit einem Anregungs- und einem Detektionsstrahlengang, Mitteln zur rasternden Abtastung eines Objektes durch Verschieben eines abgebildeten Spot- oder Multispotbereiches über das Objekt und einem den Spot- oder Multispotbereich abbildenden Objektiv, wobei für das Objektiv ein Fokusverstellmechanismus vorgesehen ist.The The invention relates to a light scanning microscope with an excitation and a detection beam path, means for raster scanning an object by moving a mapped spot or multispot area over the Object and a spot or multi-spot imaging lens, being for the lens is provided with a focus adjustment mechanism.

Lichtrastermikroskope sind im Stand der Technik bekannt, hierzu wird beispielsweise auf die DE 197 02 753 A1 oder die DE 102 57 237 A1 verwiesen, die ein als Laserscanningmikroskop ausgebildetes Lichtrastermikroskop beschreibt. In diesem Zusammenhang sei angemerkt, daß hier unter dem Begriff "Licht" der gesamte den optischen Gesetzen gehorchende Bereich der Strahlung verstanden wird.Light scanning microscopes are known in the art, this is for example on the DE 197 02 753 A1 or the DE 102 57 237 A1 which describes a trained as a laser scanning microscope light scanning microscope. In this context, it should be noted that the term "light" here means the entire region of the radiation which obeys the laws of optics.

Lichtrastermikroskope erreichen ein Objektbild üblicherweise durch Abbildung des genannten Spot- oder Multispotbereiches mit einer Detektion, die keine Struktur des Spots oder der Multispots auflöst (z.B. konfokale Detektion). Verschieben des Spot- oder Multispotbereiches über das Objekt liefert das Bild. Am Detektor liegt immer nur Strahlungsinformation zum jeweiligen Spot- bzw. Multispotbereich vor, und ein elektronisches Zusammenfügen dieser Bildinformation unter Berücksichtigung der Verschiebung des Spot- oder Multispotbereiches führt zum gewünschten Bild. Konfokale Detektion ist dabei eine Möglichkeit, eine sehr hohe Tiefenauflösung zu erreichen. Die Signalauswertung ist dann im wesentlichen auf die Fokalebene eingeschränkt, da außerhalb der Fokalebene liegende Bereiche keine wesentliche Signalinformation bei der konfokalen Detektion liefern; sie werden vor oder hinter die Konfokalblende abgebildet.Light scanning microscopes usually reach an object image by mapping the said spot or multispot area with a detection that has no structure of the spot or the multi-spots dissolves (e.g., confocal detection). Move the spot or multispot area over the Object delivers the picture. At the detector is always only radiation information to the respective spot or multi-spot area, and an electronic one Put together considering this image information the shift of the spot or multispot area leads to the desired Image. Confocal detection is one way to achieve a very high depth resolution to reach. The signal evaluation is then essentially on the Focal plane restricted, there outside the focal plane lying areas no significant signal information in confocal detection; they will be in front or behind the confocal aperture shown.

Die Einstellung der Fokalebenenlage ist damit für ein Lichtrastermikroskop, insbesondere wenn es mit konfokaler Detektion arbeitet, äußerst wichtig. Dies gilt insbesondere, wenn man eine Probe verwendet, die dicker ist als der Schärfentiefebereich des Objektivs. Man muß dann vor der Messung in der Probe diejenige Ebene anfahren, die vermessen werden soll. Zwar sind bei üblichen Lichtrastermikroskopen die Fokusverstellmechanismen hochpräzise, was es erlauben würde, zuerst eine bekannte Referenzfläche anzufahren, und dann die Fokusebene auf den gewünschten Abstand zur Referenzfläche zu stellen, jedoch kann sich der Abstand der aktuellen Fokusebene gegenüber der Referenzfläche aufgrund thermischer Effekte, durch Erschütterungen oder durch andere Störeinflüsse zeitlich verändern. Man müßte dann intermittierend immer wieder den Abstand zur Referenzfläche überprüfen, was sehr aufwendig wäre.The Adjustment of the focal plane position is thus for a light scanning microscope, especially when it works with confocal detection, extremely important. This This is especially true when using a sample that is thicker as the depth of field of the Lens. One must then Before measuring in the sample, approach the plane that is measuring shall be. Although are at usual Light microscope microscopes, the focus adjustment mechanisms highly precise, which it would allow first a known reference surface to approach, and then to set the focal plane to the desired distance to the reference surface, however, the distance between the current focal plane and the reference surface due to thermal effects, shocks or others Disruptions temporally change. You would have to intermittently checking the distance to the reference surface again and again would be very expensive.

Für übliche Mikroskope bekannte Autofokusansätze sind bei Lichtrastermikroskopen oftmals nicht verwendbar. Dies gilt für alle Ansätze, die eine strukturierte Beleuchtung der Probe vornehmen und anhand der Struktur die Fokussierung erreichen. Da bei einem Lichtrastermikroskop zu jedem Zeitpunkt aber nur ein Spot- oder Multispotbereich ohne Auflösung der Struktur des einzelnen Spots abgebildet wird, ist eine strukturierte Beleuchtung nicht möglich, da die Struktur nicht aufgelöst werden könnte. Ansätze wie aus der US 6.545.765 oder US 5.604.344 , die für Autofokuszwecke eine strukturierte Probenbeleuchtung bewirken, sind deshalb für Lichtrastermikroskope generell untauglich.Autofocus approaches known for conventional microscopes are often unusable in light scanning microscopes. This applies to all approaches that make structured illumination of the sample and achieve the focus by means of the structure. However, since a light-scanning microscope displays only one spot or multi-spot area without dissolving the structure of the individual spot at any time, structured illumination is not possible since the structure could not be resolved. Approaches like from the US 6,545,765 or US 5,604,344 , which cause a structured sample illumination for autofocus purposes, are therefore generally unsuitable for light scanning microscopes.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Lichtrastermikroskop der genannten Art so auszugestalten, daß eine genaue Bestimmung der Lage der Fokusebene aufwandsgering möglich ist.Of the The invention is therefore based on the object, a light scanning microscope the type mentioned so that an accurate determination of the Location of the focal plane is possible low.

Diese Aufgabe wird durch ein Lichtrastermikroskop der eingangs genannten Art gelöst, das eine Autofokuseinrichtung zum Erfassen einer Lage der Fokusebene des Objektives aufweist, die unterschiedliche Tiefenbereiche am abgebildeten Spot- oder Multispotbereich auf unterschiedliche Orte eines ortsauflösenden Detektors abbildet. Das erfindungsgemäße Lichtrastermikroskop bildet somit an jedem Spot einen Tiefenausschnitt auf den ortsauflösenden Detektor ab, so daß die Lage nicht nur der Fokusebene sondern auch einer Referenzebene, beispielsweise eines Übergangsglas/Probenmaterial ermittelt werden kann. Das Lichtrastermikroskop ermittelt damit die Lage der Fokusebene bezogen zur Referenzebene. Der Fokusverstellmechanismus wird dann so angesteuert, daß der Abstand der Fokusebene, die die Meßebene darstellt, von der Referenzebene auf ein bestimmtes Maß konstant gehalten wird, bzw. sich anwendungsspezifischen Vorgaben gemäß verändert.These Task is by a light scanning microscope of the aforementioned Sort of solved, the one autofocus device for detecting a position of the focal plane of the lens having different depth ranges at mapped spot or multispot area to different locations a spatially resolving Detector maps. The light scanning microscope according to the invention forms thus at each spot a detail of the spatial resolution detector off, so that the Location not only the focal plane but also a reference plane, for example of a transitional glass / sample material can be. The light scanning microscope thus determines the position of the Focus plane related to the reference plane. The focus adjustment mechanism is then controlled so that the Distance of the focal plane representing the measurement plane from the reference plane constant to a certain extent is maintained, or changed according to application-specific specifications.

Die Erfindung setzt also erstmals eine tiefenaufgelöste Abbildung des Spot- oder Multispotbereiches zur Autofokussierung ein. Um die Tiefenauflösung wiederzugeben, genügt ein eindimensionales Detektorelement. Die Koordinate des Detektorelementes skaliert die Tiefeninformation. Die Intensität der abgebildeten Strahlung aus dem Spot- oder Multispotbereich hängt von der einen Ortskoordinate des Detektorelementes ab, welche wiederum unter Berücksichtigung der Abbildungsgegebenheiten der Tiefenkoordinate zugeordnet ist.The Thus, for the first time, the invention uses a depth-resolved image of the spot or Multispot area for autofocusing on. To render the depth resolution, enough a one-dimensional detector element. The coordinate of the detector element scales the depth information. The intensity of the imaged radiation from the spot or multi-spot area depends on the one location coordinate of the detector element, which in turn taking into account the mapping conditions of the depth coordinate is assigned.

In der einfachsten Bauweise genügt folglich eine Detektorzeile, auf die die tiefenabhängige ortsaufgelöste Abbildung so erfolgt, daß unterschiedliche Tiefenbereiche auf unterschiedliche Bereiche der Detektorzeile zur Abbildung gebracht sind. Die Mitte der Detektorzeile befindet sich in einer zur Fokalebene konjugierten Ebene, anstatt der sonst üblichen konfokalen Blende.In the simplest construction, therefore, a detector line is sufficient, to which the depth-dependent locations resolved image is done so that different depth ranges are brought to different areas of the detector line for imaging. The center of the detector line is in a plane conjugate to the focal plane rather than the otherwise confocal aperture.

Die tiefenauflösende Abbildung kann mittels einer der Detektorzeile vorgeschalteten anamorphotischen Optik realisiert werden, die auf die Detektorzeile einen Linienfokus bündelt, der mit der Detektorzeile in einer Ebene liegt und die Detektorzeile schneidet. Eine Verkippung der anamorphotischen Optik oder der Detektorzeile realisiert diese geometrische Anordnung besonders einfach. Die anamorphotische Optik kann beispielsweise als Zylinderlinse, als torische Linse oder als Kombination eines eindimensionalen holographischen Diffusors mit einer sphärischen Linse realisiert werden.The low resolution The image can be anamorphic by means of a detector line upstream Optics are realized, which on the detector line a line focus bundles, which is in one plane with the detector line and intersects the detector line. A tilt of the anamorphic optics or the detector line Realizes this geometric arrangement very easy. The anamorphic Optics can, for example, as a cylindrical lens, as a toric lens or as a combination of a one-dimensional holographic diffuser with a spherical Lens can be realized.

Beim Lichtrastermikroskop kommen prinzipiell der Anregungs- oder der Detektionsstrahlengang in Frage, um die Strahlung für die Autofokuseinrichtung auszukoppeln. Vorteilhafterweise erfolgt die Einbindung in den Anregungsstrahlengang. Dann wird Anregungslicht, das aus der Fokusebene des Objektes bzw, von der Referenzebene zurückreflektiert wird, in der Autofokuseinrichtung verwendet. Eine Erhöhung der Strahlungsleistung, mit der Anregungslicht auf das Objekt gerichtet ist, ist nicht nötig, da die Autofokuseinrichtung sich auf die Strahlungsintensität im Detektionsstrahlengang in keiner Weise auswirkt. Aus baulichen Gründen kann es natürlich auch angezeigt sein, die Autofokuseinrichtung in den Detektionsstrahlengang einzubinden. Da das Autofokusverfahren auf reflektiertes Licht von einer Referenzebene angewiesen ist, sollte dafür Sorge getroffen werden, daß der Spektralbereich des Anregungslichtes zur Autofokuseinrichtung im Detektionsstrahlengang gelangen kann. Bei einem Laserscanningmikroskop, dessen Detektoren entsprechende Anregungsfilter vorgeschaltet sind, die Anregungslicht abblocken, ist im Strahlengang bis zu diesen Anregungsfiltern diese Bedingung üblicherweise erfüllt. Durch das konfokale Prinzip wird zurückgestreutes Licht aus anderen als der Probenebene unterdrückt. Durch reflektierende Grenzflächen Glas/Luft, Glas/Wasser oder auch Glas/Probe werden aber Geisterbilder erzeugt, die nicht konfokal unterdrückt werden, wenn sie auf die schräge Zeile abgedrückt werden. Diese dienen nun zur Autofokussierung. Die Referenzebene ist stets eine reflektierende Grenzfläche.At the Scanning microscope come in principle the excitation or the Detection beam path in question, the radiation for the autofocus device decouple. Advantageously, the integration takes place in the excitation beam path. Then, excitation light is emitted from the focal plane of the object or, respectively, is reflected back from the reference plane, used in the autofocus device. An increase in radiant power, with the excitation light directed to the object is not necessary because the autofocus device is based on the radiation intensity in the detection beam path in no way affects. Of course, it can also be displayed for structural reasons be to integrate the autofocus device in the detection beam path. Because the autofocus method is based on reflected light from a reference plane should be instructed, should do so Care be taken that the Spectral range of the excitation light to the autofocus device in Detection beam path can get. In a laser scanning microscope, whose detectors are preceded by corresponding excitation filters, block the excitation light is in the beam path up to this Excitation filters usually meets this condition. By the confocal principle becomes backscattered light suppressed from other than the sample level. By reflecting interfaces glass / air, glass / water or even glass / sample but ghost images are generated that are not confocally suppressed, when she's on the weird Line are pressed. These are now used for autofocusing. The reference level is always a reflective interface.

Die Auskopplung der Strahlung für die Autofokuseinrichtung im Strahlengang zwischen Detektormodul bzw. Anregungsmodul und dem Scanner, also bei ruhendem Strahl, bewirkt vorteilhafterweise, daß die Tiefeninformation über die gesamte abgebildete Fläche des Objektes gemittelt wird. Einzelne Objektbereiche in der Fokusebene, die keine Strahlung rückstreuen, wirken sich dann nicht störend aus.The Decoupling the radiation for the autofocus device in the beam path between the detector module or excitation module and the scanner, so when the beam is stationary causes Advantageously, that the Depth information about the entire imaged area of the object is averaged. Individual object areas in the focal plane, that do not scatter radiation, then do not interfere out.

Die Autofokuseinrichtung erlaubt es dem Lichtrastermikroskop nun, den Fokusverstellmechanismus wunschgemäß anzusteuern. Es ist deshalb eine Weiterbildung bevorzugt, bei der eine Steuereinheit vorgesehen ist, die Signale der Autofokuseinrichtung ausliest und den Fokusverstellmechanismus ansteuert.The Autofocus device allows the light scanning microscope now, the Focus adjustment mechanism to drive as desired. It is therefore one Preferred development, in which a control unit is provided, reads out the signals of the autofocus device and the focus adjustment mechanism controls.

Zweckmäßigerweise wird die Steuereinheit aus den Signalen die Lage der Fokusebene im Bezug auf eine Referenzebene ermitteln. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Steuereinheit aus den Signalen ein Maß für einen Abstand zwischen der Fokusebene des Objektives und einer Referenzebene am Objekt feststellt und gegebenenfalls bei der Ansteuerung des Fokusverstellmechanismus berücksichtigt.Conveniently, the control unit uses the signals to determine the position of the focal plane in relation to a reference level. It is therefore preferable that the Control unit from the signals a measure of a distance between the Focus plane of the lens and a reference plane on the object detects and optionally in the control of the Fokusverstellmechanismus considered.

Die Signale der Autofokuseinrichtung können in den genannten Ausführungsformen das Signal der Detektorzeile sein. Das Signal wird üblicherweise mindestens zwei Intensitätsmaxima aufweisen: das erste Maximum entspricht der Lage der aktuellen Meßposition, d.h. der Lage der Fokusebene, das zweite Maximum ist der Lage der Referenzebene, beispielsweise einer Glas-/Prbbenmaterialgrenzfläche zuzuordnen.The Signals of the autofocus device can in the embodiments mentioned be the signal of the detector line. The signal is usually at least two intensity maxima have: the first maximum corresponds to the position of the current measuring position, i.e. the location of the focal plane, the second maximum is the location of the Reference plane, for example, a glass / Prbenbenmaterialgrenzfläche assign.

Der Abstand der beiden Maxima liefert den Abstand zwischen Fokusebene und Referenzebene, wobei die Funktion, mit der die Tiefenauflösung auf die Ortsauflösung des Detektors übertragen wird, zu berücksichtigen ist. Je nach Ausführungsform kann hierbei der Winkel zwischen Linienfokus und Längsachse der Detektorzeile, die Schärfentiefe des Objektives und der Abbildungsmaßstab eingehen, um den Abstand zwischen den Maxima in den Abstand zwischen Fokusebene und Referenzebene umzurechen. Die Breite der Maxima wird dabei in der Regel von der Schärfentiefe des Objektivs bestimmt.Of the Distance between the two maxima provides the distance between focal plane and reference plane, where the function with which the depth resolution on the spatial resolution transmitted to the detector will take into account is. Depending on the embodiment Here, the angle between line focus and longitudinal axis the detector line, the depth of field of the objective and the magnification come in to the distance between the maxima in the distance between focal plane and reference plane turn rake. The width of the maxima is usually of the depth of field of the lens.

Die anamorphotische Optik erzeugt den erwähnten Linienfokus. Die Intensitätsverteilung längs des Linienfokus ist dabei nur selten konstant, bzw. nur wenn erheblicher Aufwand getrieben wird. Einfacher ist es, bei der Bestimmung der Maxima die Intensitätsverteilung längs des Linienfokuses zu berücksichtigen. Im Falle einer Zylinderoptik entspricht die Intensitätsverteilung längs der Linie dabei der Intensitätsverteilung der Spotbeleuchtung mit Anregungslicht.The anamorphic optics produces the mentioned line focus. The intensity distribution along the Line focus is rarely constant, or only if significant Effort is driven. It is easier in determining the Maxima the intensity distribution along the To consider line focuses. In the case of a cylinder optic corresponds to the intensity distribution along the Line thereby the intensity distribution the spot lighting with excitation light.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber noch näher erläutert. Es zeigen:The Invention will now be described by way of example with reference to the drawings explained in more detail. It demonstrate:

1 eine schematische Darstellung eines Lichtrastermikroskops mit einer Autofokuseinrichtung; 1 a schematic representation of a light scanning microscope with an autofocus device;

2a–c unterschiedliche Bauweisen für die Autofokuseinrichtung der 1, 2a -C different constructions for the autofocus device of 1 .

3 eine vereinfachte Schnittdarstellung eines mit dem Lichtrastermikroskop der 1 erfaßten Objektes und 3 a simplified sectional view of one with the light scanning microscope of 1 captured object and

4 eine vereinfachte Darstellung eines Signalverlaufes, wie er mit der Autofokuseinrichtung des Lichtrastermikroskops der 1 anfällt. 4 a simplified representation of a waveform, as with the autofocus device of the optical microscope of the 1 accrues.

1 zeigt schematisch ein als Laserscanningmikroskop 1 ausgebildetes Lichtrastermikroskop. Mit dem Laserscanningmikroskop 1 wird ein Objekt 2 auf noch zu erläuternde Art vermessen. Das Laserscanningmikroskop 1 ist im wesentlichen in ein Anregungsmodul 3, ein Detektionsmodul 4 sowie ein Mikroskopmodul 5 unterteilbar. Das Anregungsmodul 3 stellt Anregungsstrahlung bereit und speist diese in das Mikroskopmodul 5 ein, so daß sie als spotförmige Beleuchtung auf das Objekt 2 gerichtet wird. Die spotförmige Beleuchtung wird vom Mikroskopmodul 5 rasternd über das Objekt 2 geführt. Der am Objekt 2 dabei mit Anregungsstrahlung aus dem Anregungsmodul 3 beleuchtete Spotbereich wird über das Mikroskopmodul 5 vom Detektionsmodul 4 konfokal detektiert, z.B. in Form einer Fluoreszenzanalyse. 1 schematically shows a laser scanning microscope 1 trained light scanning microscope. With the laser scanning microscope 1 becomes an object 2 to measure in a way to be explained. The laser scanning microscope 1 is essentially in an excitation module 3 , a detection module 4 as well as a microscope module 5 divisible. The excitation module 3 provides excitation radiation and feeds it into the microscope module 5 a, so that they as a spot-shaped illumination on the object 2 is directed. The spot-shaped illumination is from the microscope module 5 rastering over the object 2 guided. The on the object 2 with excitation radiation from the excitation module 3 illuminated spot area is via the microscope module 5 from the detection module 4 confocal detected, eg in the form of a fluorescence analysis.

Das Mikroskopmodul 5 weist ein Objektiv 6 auf, das mittels eines Antriebes A in einer Fokusverstellung FV hinsichtlich der Lage der Fokusebene im Objekt 2 verändert werden kann. Diese Fokusverstellung ist beispielsweise in der DE 197 02 753 A1 näher erläutert.The microscope module 5 has a lens 6 on, by means of a drive A in a focus adjustment FV with respect to the position of the focal plane in the object 2 can be changed. This focus adjustment is for example in the DE 197 02 753 A1 explained in more detail.

Dem Objektiv 6 ist eine Tubuslinse 7 vorgeschaltet. Die vom Anregungsmodul 3 kommende Strahlung wird mittels einer Scanoptik 8 sowie eines Scanners 9 durch die Tubuslinse 7 und das Objektiv 6 als rasternder Spot über das Objektiv 2 geführt. Gleichzeitig bewirkt der Scanner 9 in ungekehrter Strahlrichtung zum Detektionsmodul 4 hin ein sogenanntes de-scannen, so daß nach dem Scanner 9 im Detektionsmodul 4 wieder ein ruhender Strahl vorliegt.The lens 6 is a tube lens 7 upstream. The of the excitation module 3 incoming radiation is by means of a scanning optics 8th as well as a scanner 9 through the tube lens 7 and the lens 6 as a rippling spot on the lens 2 guided. At the same time the scanner causes 9 in ungekehrter beam direction to the detection module 4 down a so-called de-scanning, so that after the scanner 9 in the detection module 4 again a static beam is present.

Der Anregungsstrahlengang des Anregungsmoduls 3 und der Detektionsstrahlengang des Detektionsmoduls 4 sind über einen Hauptfarbteiler HFT vereinigt.The excitation beam path of the excitation module 3 and the detection beam path of the detection module 4 are united via a main color splitter HFT.

Die Wirkung des Hauptfarbteilers HFT ist ebenfalls der bereits genannten DE 197 02 753 A1 zu entnehmen. Anstelle eines dichroitischen Hauptfarbteilers kann auch ein farbneutraler Teiler verwendet werden, wie er beispielsweise in der DE 102 57 237 A1 geschildert ist.The effect of the main color splitter HFT is also the one already mentioned DE 197 02 753 A1 refer to. Instead of a dichroic main color divider, a color-neutral divider can be used, as it is for example in the DE 102 57 237 A1 is described.

Im Detektionsstrahlengang des Detektionsmoduls 4 wird die Strahlung über weitere, nicht näher bezeichnete Farbteiler in einzelne Detektionskanäle aufgeteilt, die jeweils aus einem Photomultiplier 14 mit vorgeschaltetem Pinhole 15 sowie Pinholeoptik 16 aufgebaut sind. Das Pinhole 15 engt den Detektionsbereich nahezu vollständig auf die theoretische Fokalebene ein; außerhalb dieser Fokalebene erzeugte Strahlung kann das Pinhole 15 nicht passieren.In the detection beam path of the detection module 4 the radiation is divided by further, unspecified color divider into individual detection channels, each consisting of a photomultiplier 14 with upstream pinhole 15 as well as Pinholeoptik 16 are constructed. The pinhole 15 narrows the detection area almost completely to the theoretical focal plane; Radiation generated outside of this focal plane can be the pinhole 15 not happen.

Das Anregungsmodul 3 bewirkt eine Beleuchtung des Spots mit Strahlung verschiedener Wellenlängen. Dazu sind verschiedene Beleuchtungskanäle vorgesehen, die im Ausführungsbeispiel jeweils aus einem Laseranschluß 10 bzw. 12 zum Einkoppeln der Strahlung eines Lasers sowie Einkoppeloptik 11 bzw. 13 aufgebaut sind und welche über eine nicht näher bezeichnete Spiegeltreppe vereinigt werden. Zur Einstellung des Spotdurchmessers ist ein Teleskop 17 vorgesehen, das für die Einkopplung entsprechend konditionierter Strahlung am Hauptfarbteiler HFT sorgt.The excitation module 3 causes illumination of the spot with radiation of different wavelengths. For this purpose, different illumination channels are provided, which in the exemplary embodiment in each case from a laser connection 10 respectively. 12 for coupling in the radiation of a laser and coupling optics 11 respectively. 13 are constructed and which are united via an unspecified mirror staircase. To adjust the spot diameter is a telescope 17 provided, which ensures the coupling according to conditioned radiation at the main color splitter HFT.

Das insoweit dem Stand der Technik entsprechende Laserscanningmikroskop 1 weist nun am Anregungsmodul 3 einen Auskoppler 18 auf, der vom Objekt 2 in den Anregungsstrahlengang des Anregungsmoduls 3 rückgestreute Strahlung auskoppelt und über hier als Anamorphot ausgebildete Optik 19 in einen Linienfokus LF bündelt. Im Falle eines Laserscanningmikroskops 1 mit Punktrasterung handelt es sich bei der Optik 19 um einen Anamorphot. Bei einem linienscannenden Mikroskop kann eine sphärische Optik 19 verwendet werden, da diese dann schon einen Liniefokus liefert. Der Linienfokus LF ist auf eine Detektorzeile 20 gerichtet, die mit der optischen Achse OA einen Winkel α einschließt und vom Linienfokus LF geschnitten wird. Der Linienfokus LF und die Detektorzeile 20 liegen also in einer Ebene. Der Anamorphot 19 und die Detektorzeile 20 bilden eine Autofokuseinrichtung 22, deren Funktionsweise anhand der 3 und 4 noch erläutert wird.The state-of-the-art laser scanning microscope 1 now points to the excitation module 3 a decoupler 18 on, the object 2 in the excitation beam path of the excitation module 3 backscattered radiation decouples and formed here as anamorphic optics 19 in a line focus LF bundles. In the case of a laser scanning microscope 1 with dot patterning is the optics 19 around an anamorphic photo. In a line-scanning microscope, a spherical optics 19 can be used, as this then already delivers a line focus. The line focus LF is on a detector line 20 directed, which forms an angle α with the optical axis OA and is cut by the line focus LF. The line focus LF and the detector line 20 So lie in one plane. The anamorphic 19 and the detector line 20 form an autofocus device 22 whose operation is based on the 3 and 4 will be explained.

Eine mögliche Ausgestaltung für die Optik 19 zeigen die 2a–c. Zusätzlich ist exemplarisch in 2b noch der Linienfokus LF bzw. in 2c die Längsachse L der Detektorzeile 20 dargestellt. Die Optik 19 kann als Kombination aus eindimensionalem holographischen Diffusor 26 mit vorgeschalteter sphärischer Optik 25 (2a), als torische Linse 24 (2b) oder als Zylinderlinse 23 (2c) ausgebildet sein, wenn das Laserscanningmikroskop einen Punktspot zum Scannen verwendet.A possible design for the optics 19 show the 2a c. In addition, is exemplary in 2 B nor the line focus LF or in 2c the longitudinal axis L of the detector line 20 shown. The optics 19 can be as a combination of one-dimensional holographic diffuser 26 with upstream spherical optics 25 ( 2a ), as a toric lens 24 ( 2 B ) or as a cylindrical lens 23 ( 2c ) may be formed when the laser scanning microscope uses a spot spot for scanning.

Die 1 und 2 zeigen durchgängig eine Schrägstellung der Detektorzeile 20, um zu erreichen, daß der Linienfokus LF schräg zur Längsachse L der Detektorzeile 20 liegt. Diese gegenseitige Schräglage kann natürlich auch ohne Verkippung der Detektorzeile 20 gegenüber der optischen Achse OA erreicht werden, beispielsweise durch ein geeignetes holographisches Element oder eine schräg gestellte Zylinderoptik.The 1 and 2 consistently show an inclination of the detector line 20 to make the line focus LF oblique to the longitudinal axis L of the detector line 20 lies. Of course, this mutual skew can also be done without tipping the detector line 20 be achieved with respect to the optical axis OA, for example by a suitable holographic element or an inclined cylinder optics.

Auch kann anstelle der Auskopplung der reflektierten Strahlung aus dem Anregungsstrahlengang des Anregungsmoduls 3 auch eine Auskopplung am Detektionsmodul 4 erfolgen, wenn der Hauptfarbteiler HFT rückgestreute Anregungsstrahlung passieren läßt. Eine mögliche Anbaustelle für die Autofokuseinrichtung 22 ist in 1 mit 30 bezeichnet und durch eine gestrichelte Linie angedeutet.Also, instead of decoupling the reflected radiation from the excitation beam path of the excitation module 3 also a decoupling on the detection module 4 take place when the main color splitter HFT allows backscattered excitation radiation to pass. A possible attachment point for the autofocus device 22 is in 1 With 30 designated and indicated by a dashed line.

3 zeigt eine schematische Schnittdarstellung durch das Objekt 2, das mit dem Laserscanningmikroskop 1 der 1 erfaßt wird. Das Objekt 2 weist einen Objektträger 27 auf, auf dem abgedeckt durch ein Deckglas 28 eine zu mikroskopierende Zellschicht 29 angeordnet ist. Weiter ist exemplarisch die Lage der Fokusebene F dargestellt, die derjenigen Ebene entspricht, die durch die Konfokalitätsbedingung des Detektionsmoduls 4, d.h. durch die auswählende Wirkung des Pinholes 15 festgelegt ist. Oberhalb der Zellschicht 29 befindet sich ein Übergang zum Deckglas 28. Ein solcher Glas/Zellschicht-Übergang weist einen Brechzahlsprung auf. Bekanntermaßen wird an einem Brechzahlsprung Strahlung grundsätzlich reflektiert. Der Brechzahlsprung des Übergangs zwischen Deckglas 28 und Zellschicht 29 kann somit als Referenzebene R verwendet werden. 3 shows a schematic sectional view through the object 2 that with the laser scanning microscope 1 of the 1 is detected. The object 2 has a slide 27 on, covered by a coverslip 28 a cell layer to be microscoped 29 is arranged. Further, by way of example, the position of the focal plane F is shown, which corresponds to that plane which is defined by the confocal condition of the detection module 4 ie by the selective action of the pinhole 15 is fixed. Above the cell layer 29 there is a transition to the cover glass 28 , Such a glass / cell layer transition has a refractive index jump. As is known, radiation is fundamentally reflected at a refractive index jump. The refractive index jump of the transition between cover glass 28 and cell layer 29 can thus be used as a reference plane R.

Die Abbildung des Linienfokuses LF in der Autofokuseinrichtung 22 auf die Detektorzeile 20 bewirkt, daß Strahlung, die aus unterschiedlichen Bereichen entlang der optischen Achse OA, auf der der Spot beleuchtet bzw. abgetastet wird, entlang der Detektorzeile 20 aufgefächert wird. Das Ergebnis dieser Auffächerung im Signal der Detektorzeile 20 zeigt 4.The image of the line focus LF in the autofocus device 22 on the detector line 20 causes radiation coming from different areas along the optical axis OA on which the spot is illuminated or scanned along the detector line 20 is fanned out. The result of this fanning in the signal of the detector line 20 shows 4 ,

Der Reflex am Brechzahlsprung der Referenzebene R führt zu einer gesteigerten Strahlungsintensität an einer bestimmten Stelle der Detektorzeile 20. Im Signal S der Detektorzeile 20 findet sich ein entsprechender Peak, der in 4 als referenzebenen Peak PR bezeichnet ist. Die in der Meßebene, d.h. der Fokusebene gemessene Struktur der Zellschicht führt ebenfalls zu einem Reflex, der an anderer Stelle auf der Detektorzeile 20 auftritt, d.h. bei anderer x-Koordinate in 4 und ebenfalls zu einer Erhöhung der Intensität I führt (in 4 als Fokusebenenpeak PF bezeichnet).The reflection at the refractive index jump of the reference plane R leads to an increased radiation intensity at a certain point of the detector line 20 , In signal S of the detector line 20 there is a corresponding peak in 4 is referred to as reference level peak PR. The structure of the cell layer, which is measured in the measurement plane, ie the focal plane, likewise leads to a reflection which occurs elsewhere on the detector line 20 occurs, ie at another x-coordinate in 4 and also leads to an increase in the intensity I (in 4 referred to as focal plane peak PF).

Entlang der Detektorzeile 20, deren entsprechende x-Koordinate üblicherweise durch die Pixelnummer gegeben ist, finden sich also zwei Peaks, nämlich der Fokusebenenpeak PF und der Referenzebenenpeak PR, die um einen Pixelabstand d beabstandet sind. Der Pixelabstand d kann auf einfache Weise in den Abstand D zwischen der Fokusebene F und der Referenzebene R umgerechnet werden. Dazu ist zum einen der Abbildungsmaßstab der optischen Abbildung zu berücksichtigen. Zum anderen spielt die Schrägstellung der Detektorzeile 20, d.h. der Winkel α zwischen Linienfokus LF und Längsebene L der Detektorzeile 20, eine Rolle.Along the detector line 20 , whose corresponding x-coordinate is usually given by the pixel number, there are thus two peaks, namely the focal plane peak PF and the reference plane peak PR, which are spaced apart by a pixel pitch d. The pixel spacing d can be converted into the distance D between the focal plane F and the reference plane R in a simple manner. For this purpose, on the one hand, the magnification of the optical image has to be considered. On the other hand, the inclination of the detector line plays 20 ie the angle α between the line focus LF and the longitudinal plane L of the detector line 20 , a role.

Die Breite jedes Peak wird durch den Schärfentiefebereich des Objektivs 6 bestimmt. Sie kann bei der Ermittlung des Schwerpunktes des Fokusebenenpeaks PF sowie des Referenzebenenpeaks PR eingehen. Weiter kann bei der Peak- bzw. Schwerpunktsbestimmung ein Grundverlauf des Signals S berücksichtigt werden, der von der Intensitätsverteilung herrührt, die im Linienfokus LF grundsätzlich gegeben ist. Bei einem Gaußförmig beleuchteten Spot wird man z.B. diese Gaußverteilung auch im Linienfokus LF wiederfinden. Analoges gilt natürlich für andere Intensitätsverteilungen im beleuchteten Spot.The width of each peak is determined by the depth of field of the lens 6 certainly. It can enter into the determination of the center of gravity of the focal plane peak PF and the reference plane peak PR. Furthermore, in the case of the determination of the peak or center of gravity, a basic course of the signal S resulting from the intensity distribution which is fundamentally given in the line focus LF can be taken into account. In a Gaussian illuminated spot, for example, this Gaussian distribution will also be found in the line focus LF. The same applies of course to other intensity distributions in the illuminated spot.

Die Ermittlung des Abstandes D wird im Ausführungsbeispiel der 1 von einem Steuergerät 21 vorgenommen, das sowohl das Signal der Detektorzeile 20 ausliest, als auch den Antrieb A zur Fokusverstellung des Objektivs 6 entsprechend ansteuert. Das Steuergerät ermittelt weiter die Peak-Schwerpunkte, den Peak-Abstand d und steuert die Einstellung des Abstandes D auf ein bestimmtes Maß.The determination of the distance D is in the embodiment of 1 from a controller 21 made that both the signal of the detector line 20 reads out, as well as the drive A for focus adjustment of the lens 6 controls accordingly. The controller further determines the peak centroids, the peak distance d and controls the setting of the distance D to a certain extent.

Die dargestellte Bauweise zeigt ein Laserscanningmikroskop 1 mit punktförmiger Rasterung. Das Autofokusverfahren ist jedoch auch bei linienförmiger Rasterung einsetzbar, wobei dann da die Linienform der Strahlung ohne anamorphotische Abbildung bereits gegeben ist.The illustrated construction shows a laser scanning microscope 1 with punctiform screening. However, the autofocus method can also be used with linear screening, in which case the line shape of the radiation without anamorphic imaging already exists.

Claims

Scanning microscope with an excitation and a detection beam path, means ( 9 ) for raster scanning of an object ( 2 ) by moving an imaged spot, line or multispot area over the object ( 2 ) and a spot, line or multi-spot imaging lens ( 6 ), where for the lens ( 6 ) a Fokusverstellmechanismus (A) is provided, characterized in that one in the excitation or detection beam path ( 3 . 4 ) coupled autofocus device ( 22 ) for detecting a position of the focal plane (F) of the objective ( 6 ) is provided, the different depth ranges at the imaged spot, line or multi-spot area on different locations of a spatially resolving detector ( 20 ) maps.

Scanning microscope according to Claim 1, characterized in that the autofocus device ( 22 ) a detector line extending along a longitudinal axis (L) ( 20 ) with upstream optics ( 19 ), wherein the detector row ( 20 ) is tilted with its longitudinal axis (L) to the optical axis (OA) and the optics ( 19 ) concentrates the coupled-out radiation into a line focus (LF) which lies essentially in the plane spanned by the longitudinal axis (L) and the optical axis (OA), so that the line focus (LF) along the detector line (FIG. 20 ) runs.

A scanning microscope according to claim 2, characterized in that the light scanning microscope images a spot and the optics ( 19 ) a cylindrical lens ( 23 ), a toric lens ( 24 ) or a combination of a one-dimensional holographic diffuser ( 26 ) with a spherical lens ( 25 ) having.

Light scanning microscope according to one of the above claims, characterized by a control unit ( 21 ), the signals (S) of the autofocus device ( 22 ) and drives the focus adjustment mechanism (A).

Light scanning microscope according to claim 4, characterized in that the control unit ( 21 ) from the signals (S) is a measure of a distance (D) between the focal plane (F) of the objective ( 6 ) and a reference plane (R) on the object ( 2 ).

A scanning microscope according to claim 4 or 5, in each case in combination with claim 2, characterized in that the control unit ( 21 ) from anamorphic optics ( 19 ) caused intensity distribution along the line focus (LF) considered.

Scanning microscope according to Claim 5, characterized in that the control unit ( 21 ) keeps the focal plane (F) in a constant or specifically set distance (D) to the reference plane (R).