DE102005007756A1 - Scanmikroskop - Google Patents
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Abstract
Ein Scanmikroskop, insbesondere konfokales Scanmikroskop oder Stereomikroskop, mit einer Scaneinrichtung für einen Beleuchtungs- und/oder Detektionslichtstrahl und einem eine optische Achse aufweisenden Objektiv ist im Hinblick auf die Realisierung einer hohen Auflösung mit konstruktiv einfachen Mitteln durch eine Beleuchtungseinrichtung zur Erzeugung eines auf die Probe fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahls mit einer zur optischen Achse geneigten Beleuchtungsrichtung gekennzeichnet.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Scanmikroskop, insbesondere konfokales Scanmikroskop oder Stereomikroskop, mit einer Scaneinrichtung für einen Beleuchtungs- und/oder Detektionslichtstrahl und einem eine optische Achse aufweisenden Objektiv.
- Scanmikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt und existieren in unterschiedlichen Ausführungsformen. Dabei sind beispielsweise Laser-Scanmikroskope bekannt, bei denen ein Beleuchtungslichtstrahl über eine Scaneinrichtung und ein Objektiv auf eine zu untersuchende Probe geführt wird. Von der Probe wird reflektiertes oder aufgrund einer Anregung erzeugtes Licht zurück über das Objektiv und die Scaneinrichtung zu einem Detektor geleitet.
- Bei den bekannten Mikroskopen muss aus bautechnischen und Kostengründen meist ein Objektiv mit kleiner numerischer Apertur eingesetzt werden. Dies hat zur Folge, dass ein Beleuchtungsfokus oder Detektionsfokus eine relativ lange Erstreckung entlang der optischen Achse des Objektivs oder eine relativ lange PSF (Point Spread Function) aufweist. Mit anderen Worten ist der Fokus entlang der optischen Achse des Objektivs durch ein längliches Volumen gebildet. Aufgrund dieser Längserstreckung ist die Auflösung der üblicherweise verwendeten Objektive begrenzt und in vielen Anwendungsfällen nicht ausreichend.
- Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Scanmikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, bei dem eine hohe Auflösung mit konstruktiv einfachen Mitteln realisiert ist.
- Erfindungsgemäß ist die voranstehende Aufgabe durch ein Scanmikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Danach weist das Scanmikroskop eine Beleuchtungseinrichtung zur Erzeugung eines auf die Probe fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahls mit einer zur optischen Achse geneigten Beleuchtungsrichtung auf.
- In erfindungsgemäßer Weise ist erkannt worden, dass durch eine Beleuchtung der Probe mit einem zur optischen Achse geneigten Beleuchtungslichtstrahl die obige Aufgabe auf überraschend einfache Weise gelöst ist. Im Konkreten ist das Scanmikroskop der eingangs genannten Art mit einer Beleuchtungseinrichtung ausge rüstet, die einen auf die Probe fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahl mit einer zur optischen Achse geneigten Beleuchtungsrichtung erzeugt. Beim Mikroskopierbetrieb schneiden sich hierdurch das Detektionsfokusvolumen und das Beleuchtungsfokusvolumen, wobei im Ergebnis ein Schnittvolumen verbleibt, das die Ortsauflösung des Mikroskops bestimmt. Mit anderen Worten stehen das längliche Detektionsfokusvolumen und das längliche Beleuchtungsfokusvolumen in einem Winkel zueinander, so dass sich ein Schnittvolumen hinsichtlich des Fokus ergibt. Die Auflösung des Mikroskops lässt sich hierdurch in Richtung der optischen Achse mindestens um den Faktor 3 verbessern.
- Folglich ist mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop ein Scanmikroskop angegeben, bei dem eine hohe Auflösung mit konstruktiv einfachen Mitteln realisiert ist.
- Im Hinblick auf eine besonders hohe Auflösung könnte der Beleuchtungslichtstrahl mittels des Objektivs auf die Probe fokussierbar sein. Dabei wird der Beleuchtungslichtstrahl mit demselben Objektiv auf die Probe fokussiert, mit dem ein Detektionslichtstrahl zu einem Detektor geführt wird. Hierdurch ist ein besonders kleines Volumen des Beleuchtungslichtstrahlfokus und damit ein besonders kleines Schnittvolumen mit dem Volumen des Detektionsfokus erreichbar.
- Im Hinblick auf eine einfache Realisierung eines zur optischen Achse des Objektivs geneigten Beleuchtungslichtstrahls könnte der Beleuchtungslichtstrahl schräg in das Objektiv eingekoppelt sein.
- Zur sicheren Positionierung des Beleuchtungslichtstrahls auf der Probe könnte die Pupille des Objektivs vom Beleuchtungslichtstrahl unterleuchtet sein. Hierdurch ist ein Versatz des Fokus des Beleuchtungslichtstrahls zum Detektionsfokus erreichbar.
- Bei einer alternativen Ausgestaltung des Scanmikroskops könnte der Beleuchtungslichtstrahl mittels eines zweiten Objektivs auf die Probe fokussierbar sein. Die Fokussierung des Beleuchtungslichtstrahls könnte dabei unabhängig vom ursprünglich vorhandenen Objektiv erfolgen, mit welchem das Detektionslicht zum Detektor geführt wird.
- Die Fokussierung des Beleuchtungslichtstrahls zu einem möglichst kleinen Volumen des Beleuchtungsfokus bietet den weiteren Vorteil, dass die Probe in einem nur sehr kleinen und eng definierten Bereich durch das Beleuchtungslicht belastet ist. Bei lichtempfindlichen Proben hat dies eine wesentlich geringere Schädigung oder Beeinflussung der Probe zur Folge, als dies bei einer flächigen Beleuchtung der Fall ist.
- Im Hinblick auf eine besonders hohe Auflösung könnte der Beleuchtungslichtstrahl mittels der Scaneinrichtung über die Probe führbar sein. Hierdurch ist eine besonders einfache Führung des Beleuchtungslichtstrahls mit der üblichen Scaneinrichtung des Scanmikroskops realisiert.
- Bei einer konstruktiv besonders einfachen Ausgestaltung könnte der Beleuchtungslichtstrahl schräg und/oder zu einem Detektionslichtstrahl versetzt in die Scaneinrichtung eingekoppelt sein. Mit anderen Worten muss der Beleuchtungslichtstrahl lediglich in geeigneter Weise zur Scaneinrichtung geführt und dann weiter zur Probe geleitet werden.
- Bei einer alternativen Ausgestaltung könnte der Beleuchtungslichtstrahl mittels eines zusätzlichen und vorzugsweise konfokalen Scanners über die Probe führbar sein. Hierdurch ist ein von der üblichen Scaneinrichtung unabhängiges Scannen des Beleuchtungslichtstrahls über die Probe ermöglicht.
- Hinsichtlich einer besonders hohen Auflösung könnte des Fokus des Beleuchtungslichtstrahls und ein Detektionsfokus synchronisiert sein. Hierdurch könnte gewährleistet werden, dass sich der Beleuchtungslichtstrahl und ein Detektionsfokus in geeigneter Weise schneiden.
- Je nach Anwendungsfall könnte der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls dem Detektionsfokus in vorgebbarem Umfang vorauseilen. Hierdurch wäre quasi ein Vorlaufscanner realisiert.
- Die vorliegende Erfindung könnte beispielsweise im Rahmen eines konfokalen Scanmikroskops realisiert werden. Des Weiteren könnte die vorliegende Erfindung bei einem Mikroskop realisiert werden, das als Objektiv eine Makrolinse aufweist.
- Derartige Mikroskope werden üblicherweise als Stereomikroskope bezeichnet. Bei einer konkreten Ausgestaltung könnte eine Makrolinse mit einem konfokalen Scanner kombiniert werden. Bei Einsatz der vorliegenden Erfindung bei einem Stereomikroskop könnte die Beleuchtung im Rahmen des linken oder rechten Strahlengangs realisiert sein.
- Die Beleuchtung der Probe könnte mittels des durch die Beleuchtungseinrichtung erzeugten Beleuchtungslichtstrahls und eines entlang der optischen Achse verlaufenden weiteren Beleuchtungslichtstrahls gleichzeitig oder zeitlich versetzt erfolgen. Mit anderen Worten könnten in diesem Fall nicht nur der mit der Beleuchtungseinrichtung erzeugte Beleuchtungslichtstrahl sondern auch ein weiterer entlang der optischen Achse verlaufender Beleuchtungslichtstrahl verwendet werden.
- In weiter vorteilhafter Weise könnten der durch die Beleuchtungseinrichtung erzeugte Beleuchtungslichtstrahl und ein entlang der optischen Achse verlaufender weiterer Beleuchtungslichtstrahl unterschiedliche Wellenlängen aufweisen. Mit anderen Worten könnte in diesem Fall mit unterschiedlichen Wellenlängen beleuchtet und manipuliert werden. Eine derartige Manipulation der Probe könnte durch das Anregen einer Fluoreszenz in der Probe realisiert sein.
- Bei der vorliegenden Erfindung könnten die Beleuchtungs- oder Anregungs-PSF (Point Spread Function) und die Detektions-PSF teilweise überlappen. Ein derartiges Überlappen ist insbesondere bei kleinen Vergrößerungen und bei Stereoobjektiven vorteilhaft.
- Des Weiteren könnte eine Erhöhung der Auflösung durch ein Überlagern der Sideloops der Beleuchtungs- oder Anregungs-PSF (Point Spread Function) und der Detektions-PSF realisiert werden. Sowohl die zuletzt genante Überlappung als auch die zuletzt genannte Überlagerung lassen sich in einfacher Weise durch einen erfindungsgemäß geneigten Beleuchtungslichtstrahl einfach erreichen.
- Bei der vorliegenden Erfindung könnten die Beleuchtung und die Detektion mittels desselben Objektivs erfolgen, wobei eine Neigung des Beleuchtungslichtstrahls zur optischen Achse zu erfolgen hat. Alternativ hierzu könnten die Beleuchtung und die Detektion mittels separater Objektive erfolgen. Der Neigungswinkel des Beleuch tungslichtstrahls zur optischen Achse könnte grundsätzlich etwa 10° bis 20° betragen.
- Der von der Beleuchtungseinrichtung erzeugte Beleuchtungslichtstrahl könnte zur alleinigen oder zur zusätzlichen Beleuchtung der Probe dienen. Hierbei ist auf den jeweiligen Anwendungsfall abzustellen.
- Mit der vorliegenden Erfindung wird quasi eine Verkippung der Beleuchtung zur optischen Achse oder z-Achse erreicht, wobei die Detektion über die reguläre PSF zu einem kleinen Schnittvolumen zwischen Beleuchtungsfokus und Detektionsfokus führt.
- Mit dem Neigungswinkel könnte die Auflösung eingestellt werden. Grundsätzlich können mit der vorliegenden Erfindung sehr dicke Präparate untersucht werden. Mit einer Multiphoton-Beleuchtung könnte ein dickes Präparat in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung noch tiefer als bisher untersucht werden.
- Die Anwendung der vorliegenden Erfindung kann bei großen Präparaten im Millimeter- bis Zentimeterbereich mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern erfolgen. Die vorliegende Erfindung könnte im Rahmen der Photoaktivierung, Photochemie (CALI), Release Caged Compound und bei anderen Techniken vorzugsweise an großen Objekten angewendet werden.
- Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Lehre anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Lehre anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
-
1 in einer schematischen Darstellung den Teilüberlapp der Volumina eines Beleuchtungsfokus und eines Detektionsfokus und das entspre chende Schnittvolumen bei einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops, -
2 in einer schematischen Darstellung die Überlagerung der Sideloops einer Beleuchtungs-PSF und einer Detektions-PSF bei einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops und -
3 in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops mit unterleuchteter Eintrittspupille. -
1 zeigt in einer schematischen Darstellung den teilweisen Überlapp der Volumina eines Beleuchtungsfokus1 und eines Detektionsfokus2 und im rechten Bereich der1 das entsprechende Schnittvolumen3 bei einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scan- oder Rastermikroskops. Das Ausführungsbeispiel weist eine hier nicht gezeigte Scaneinrichtung für einen Beleuchtungs- und/oder Detektionslichtstrahl und ein eine optische Achse aufweisendes und hier ebenfalls nicht gezeigtes Objektiv auf. Im Hinblick auf eine hohe Auflösung weist das Scanmikroskop eine Beleuchtungseinrichtung zur Erzeugung eines auf die Probe fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahls mit einer zur optischen Achse geneigten Beleuchtungsrichtung auf. - Der in
1 gezeigte Detektionsfokus2 verläuft entlang der optischen Achse des Objektivs, üblicherweise die z-Achse. Der Beleuchtungsfokus1 verläuft in einem Winkel zum Detektionsfokus2 , so dass ein Schnittvolumen3 gebildet ist, das eine verbesserte Auflösung des Scanmikroskops gegenüber herkömmlichen Scanmikroskopen ergibt. -
2 zeigt in einer schematischen Darstellung die Überlagerung der Sideloops4 der Anregungs-PSF und der Detektions-PSF bei einem weiteren Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops. Die Überlagerung ist durch eine gekreuzte Schraffur in der Mitte der2 erkennbar. Als Folge der Überlagerung der Sideloops4 ergibt sich eine deutlich verbesserte Ortsauflösung bei dem Scanmikroskop. -
3 zeigt in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops. Das Scanmikroskop weist eine Laserlichtquelle21 zur Erzeugung eines auf die Probe19 fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahls mit einer zur optischen Achse geneigten Beleuchtungsrichtung auf. Mit anderen Worten dient die Laserlichtquelle21 hier als Beleuchtungseinrichtung. Des Weiteren weist das Scanmikroskop einen Detektor22 zur Detektion eines Detektionsprofils23 auf. - Die Laserlichtquelle
21 erzeugt einen Laserstrahl24 , der über eine Linse6 auf ein Pinhole8 fokussiert und dann auf einen Strahlteiler9 geleitet wird. Als Strahlteiler kann ein normaler Dichroit oder ein AOBS verwendet werden. - Dem Detektor
22 sind ein Pinhole7 und eine Linse5 zugeordnet. - Im Strahlengang nach dem Strahlteiler
9 ist eine Kollimationslinse10 angeordnet, die den Strahl auf eine Scaneinrichtung11 führt. Nach der Scaneinrichtung11 sind eine Scan-Linse12 und eine Tubus-Linse13 im Strahlengang angeordnet. Mit der Bezugsziffer14 ist der Detektionsstrahlengang, mit der Bezugsziffer15 der Beleuchtungsstrahlengang und mit der Bezugsziffer16 die Eintrittspupille bezeichnet. Hierbei ist gut erkennbar, dass die Eintrittspupille16 mittels des Beleuchtungsstrahlengangs15 einseitig unterleuchtet wird. Hierdurch wird ein geneigter Beleuchtungslichtstrahl oder schräg gestellter Fokus erzeugt. - Das Objektiv
17 ist mit einem Immersionsmedium18 in Kontakt. Das Objekt oder die Probe19 ist auf einem Schlitten20 angeordnet. - Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Scanmikroskops wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
- Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf diese Ausführungsbeispiele einschränken.
Claims (15)
- Scanmikroskop, insbesondere konfokales Scanmikroskop oder Stereomikroskop, mit einer Scaneinrichtung (
11 ) für einen Beleuchtungs- und/oder Detektionslichtstrahl und einem eine optische Achse aufweisenden Objektiv (17 ), gekennzeichnet durch eine Beleuchtungseinrichtung (21 ) zur Erzeugung eines auf die Probe (19 ) fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahls mit einer zur optischen Achse geneigten Beleuchtungsrichtung. - Scanmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungslichtstrahl mittels des Objektivs (
17 ) auf die Probe (19 ) fokussierbar ist. - Scanmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungslichtstrahl schräg in das Objektiv eingekoppelt ist.
- Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Pupille (
16 ) des Objektivs (17 ) vom Beleuchtungslichtstrahl unterleuchtet ist. - Scanmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungslichtstrahl mittels eines zweiten Objektivs auf die Probe fokussierbar ist.
- Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungslichtstrahl mittels der Scaneinrichtung (
11 ) über die Probe führbar ist. - Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungslichtstrahl schräg und/oder zu einem Detektionslichtstrahl versetzt in die Scaneinrichtung eingekoppelt ist.
- Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungslichtstrahl mittels eines zusätzlichen und vorzugsweise konfokalen Scanners über die Probe führbar ist.
- Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Fokus (
1 ) des Beleuchtungslichtstrahls und ein Detektionsfokus (2 ) synchronisiert sind. - Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Fokus (
1 ) des Beleuchtungslichtstrahls dem Detektionsfokus (2 ) in vorgebbarem Umfang vorauseilt. - Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektiv eine Makrolinse ist.
- Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtung der Probe mittels des durch die Beleuchtungseinrichtung erzeugten Beleuchtungslichtstrahls und eines entlang der optischen Achse verlaufenden weiteren Beleuchtungslichtstrahls gleichzeitig oder zeitlich versetzt erfolgt.
- Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die Beleuchtungseinrichtung erzeugte Beleuchtungslichtstrahl und ein entlang der optischen Achse verlaufender weiterer Beleuchtungslichtstrahl unterschiedliche Wellenlängen aufweisen.
- Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungs- oder Anregungs-PSF (Point Spread Function) und die Detektions-PSF teilweise überlappen.
- Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Sideloops (
4 ) der Beleuchtungs- oder Anregungs-PSF (Point Spread Function) und der Detektions-PSF überlagern.
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