-
Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Polymerisation von biologischen
Proben bei der Gefriersubstitution. Im besonderen betrifft die Erfindung eine
Vorrichtung zur Polymerisation von biologischen Proben bei der Gefriersubstitution.
Die Vorrichtung umfasst eine gekühlte
Kammer, einen Behälter,
der in der gekühlten
Kammer ausgebildet ist, und zur Aufnahme mindestens eines Probenträgers mit
einer biologischen Probe dient.
-
Ferner
betrifft die Erfindung die Verwendung von Dioden mit UV-Anteilen
zur Gefriersubstitution von biologischen Proben.
-
Das
Leica EM AFS offenbart ein Gerät
gemäß dem Stand
der Technik. Ein Dewargefäß ist mit flüssigem Stickstoff
gefüllt,
wobei der Dewarhals eine Kammer aufweist, die auf eine bestimmte
Temperatur gekühlt
wird. Die gewünschte
Temperatureinstellung erfolgt über
einen Regelkreis und eingebaute Heizelemente. Der Substitutionsprozess
beginnt bei etwa –90°C. Die gefrorene
Probe wird in die Kammer transferiert, wozu mehrere verschiedene
Behälter vorgesehen
sein können,
mit denen die Proben in ein Substitutionsmittel, üblicherweise
Aceton oder Methanol, getaucht werden. Bei dieser tiefen Temperatur
beginnt der langsame Prozess der Substitution, in dem das gefrorene
Wasser der Probe durch das Lösungsmittel
ersetzt wird, ohne dass es zu Rekristallisationen kommt. Während dieses
Prozesses wird nun die Temperatur langsam erhöht, das Medium ausgetauscht
und schließlich
durch ein Tieftemperatureinbettmedium ersetzt. Zur Polymerisation
des Tieftemperatureinbettmediums wird eine UV-Lampe auf die Kammer
aufgesetzt. Die verschiedenen Behälter für die Gefriersubstitution und
Einbettung sind in dem Katalog zur Leica EM AFS offenbart.
-
Die
Polymerisation, nach dem Stand der Technik, wird mit Hilfe von UV-Strahlung durchgeführt, die
von Gasentladungslampen emittiert wird. Ursprünglich wurden die Strahlungsquellen
in Gehäuse
eingebaut, die auch die Proben enthielten und mit diesen bestückt in eine
Kühlvorrichtung
(z.B. Kühltruhe)
gestellt wurden. Heute werden die Lampen eher in Form eines Aufsatzes
zu einer gekühlten Kammer,
in der der gesamte Substitutionsprozess durchgeführt wird, eingesetzt.
-
Es
werden im Wesentlichen zwei Lampentypen verwendet: Beide Typen haben
das Emissionsmaximum bei einer Wellenlänge von ca. 365nm. Der Lampentyp „Schwarzlichtlampe" hat ein sehr enges Emissionsspektrum,
das nahezu vollständig
im UV liegt. Der Lampentyp „Actinic" (z.B. Philips TLAD 15W/05)
hat ein breiteres Spektrum, das sowohl in das tiefere UV als auch
in den sichtbaren Bereich fortgesetzt ist. Die Entwickler der in
den Substitutionsprozessen meist verwendeten Kunststoffe (Firma Lowi,
Deutschland) geben eine Wellenlänge
von 360nm als ausschlaggebend für
die Polymerisation an.
-
Die
am Markt verfügbaren
Lampen weisen eine für
den Polymerisationsprozess zu hohe Intensität auf. Da die Intensität der Leuchtstofflampen
elektronisch sehr schlecht regelbar ist, erfolgt die Intensitätsanpassung
bisher auf geometrischem Weg durch Abschatten und mehrmalige Reflexion
der Strahlung und durch Erhöhen
der Distanz zwischen Lampe und Präparat.
-
Der
größte Nachteil
des Stands der Technik zu der vorliegenden Erfindung besteht in
dem relativ großen
Volumen, das die bisher verwendeten Lampen einnehmen. Die in der
gegenständlichen
Erfindung beschriebenen Leuchtdioden sind dagegen klein und können wesentlich
näher an
den Proben und selbst in der Substitutionskammer positioniert werden
ohne die Probenmanipulation zu behindern. Nur mit dieser Erfindung
kann die Integration in die Kammer derartig durchgeführt werden,
dass der Substitutionsprozess nicht zum Aufsetzen einer Lampe unterbrochen
werden muss.
-
Ein
weiterer Nachteil der bisher verwendeten Lampen besteht darin, dass
die bevorzugt verwendeten kleinen Gasentladungsröhren (im Unterschied zu großen) relativ
instabil sind und starke Emissionsschwankungen bzw. Alterung aufweisen
können.
Die Lebensdauer der Röhren
ist deutlich geringer als die von gängigen Leuchtdioden.
-
Die
Gasentladungslampen sind wesentlich empfindlicher auf Erschütterungen
als die Dioden und können
bei unsachgemäßer Handhabung
brechen, was sowohl zu Verletzungen als auch zum Austritt von Quecksilber
führen
kann.
-
Gasentladungslampen
sind einfach mit hohen Spannungen bzw. Netzspannung zu betreiben, während der
Betrieb mit Niederspannung einen relativ hohen elektronischen Aufwand
notwendig macht und meist auch mit Verlusten der Leistung und Reduktion
der Lebensdauer verknüpft
ist.
-
Obwohl
Gasentladungslampen im Vergleich zu Glühlampen eine sehr niedrige
Verlustleistung aufweisen, ist sie im Vergleich zu Leuchtdioden
hoch. Das ist besonders für
die Tieftemperaturanwendung ein entscheidender Nachteil, da höhere Verlustleistung
der Lampe durch höhere
Kühlleistung
kompensiert werden muss.
-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zur Gefriersubstitution
biologischer Proben zur Verfügung
zu stellen, die einfach zu benutzen ist, eine lange Lebensdauer
besitzt und für
einen Benutzer sicher zu handhaben ist.
-
Die
obige Aufgabe wird durch eine Vorrichtung zur Gefriersubsitution
und Einbettung gelöst,
die die Merkmale des Anspruchs 1 umfasst.
-
Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung von Dioden für die Polymerisation
von biologischen Proben bei der Gefriersubstitution.
-
Die
Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale des Anspruchs
16 umfasst.
-
Die
Verwendung von Dioden ist von Vorteil, da ein aufzusetzendes Lampenhaus
mit Niederspannung betrieben werden kann, was das An- und Abstecken
so einfach und gefahrlos wie möglich
macht. Im Vergleich zu Gasentladungslampen oder Glühlampen
weisen Leuchtdioden eine sehr niedrige Verlustleistung auf. Bei
einer Tieftemperaturanwendung muss somit eine Verlustleistung der
Lampe nicht durch eine höhere
Kühlleistung
kompensiert werden.
-
Darüber hinaus
resultiert aus der Verwendung der Dioden die Möglichkeit einer Regelung, was die
Anpassung der Intensität
an den verwendeten Kunststoff ermöglicht. Ein weiterer Vorteil
ist die direkte Integration der Dioden in eine Gefriersubstitutionskammer
oder in ein mit dieser verwendetes Zusatzgerät, so dass eine Unterbrechung
des Prozesses zum Aufsetzen der UV-Lampe entfallen kann.
-
Diejenigen
Dioden oder Leuchtdioden (LED) sind geeignet, die einen UV-Emissionsanteil aufweisen.
Die verwendeten Dioden sind in großer Stückzahl, in verlässlicher
Qualität
und zu günstigen
Preisen zu erhalten. Dioden haben aber nicht das für die Polymerisation
optimale Maximum der Wellenlänge von
360nm. Es konnte gezeigt werden, dass auch langwelligere Strahlung
zur Polymerisation geeignet ist. So sind auch Dioden mit einem Emissionsmaximum
bei 400nm zur Polymerisation geeignet. Das derzeit beste Preis-/Leistungsverhältnis kann
mit Dioden mit Emissionsmaxima um 380–385nm erreicht werden.
-
Die
Vorrichtung zur Polymerisation von biologischen Proben bei der Gefriersubstitution
umfasst eine gekühlte
Kammer. Ein Behälter
ist in der gekühlten
Kammer ausgebildet und zur Aufnahme mindestens eines Probenträgers mit
einer biologischen Probe ausgebildet. An einem Bauteil der gekühlten Kammer
ist mindestens eine Diode angebracht, die Licht mit UV-Anteilen aussendet.
Die Dioden sind derart angeordnet, dass das Licht auf die biologischen
Proben gerichtet ist.
-
Das
Bauteil, in dem die Dioden angebracht sind, ist ein separates Bauteil,
das zum Polymerisieren auf die gekühlte Kammer aufsetzbar ist.
-
Eine
weitere vorteilhafte Ausgestaltung ist, dass das Bauteil, in dem
die Dioden angebracht sind, fest mit der gekühlten Kammer verbunden ist.
Eine weitere Möglichkeit
ist, dass die Dioden fest in einer Wandung der gekühlten Kammer
angebracht sind.
-
Ferner
kann das Bauteil, in dem die Dioden angebracht sind, ein Teilgerät oder Zusatzgerät zu der
gekühlten
Kammer sein.
-
Eine
vorteilhafte Anordnung der Dioden ist, dass die mehreren Dioden
ringförmig
angeordnet sind, wobei die Dioden einen großen Emissionswinkel besitzen,
so dass eine gleichmäßige Ausleuchtung
der gekühlten
Kammer bzw. des Behälters
erzielbar ist.
-
Ferner
ist ein Sensor vorgesehen, der den Zustand bestimmt, ob die gekühlte Kammer
geschlossen ist, oder das separate Bauteil mit den Dioden an der
gekühlten
Kammer angebracht ist, oder das Zusatzmodul zur gekühlten Kammer
angebracht ist. An Hand des Sensorsignals werden die Dioden angeschaltet
oder nicht.
-
Ferner
ist eine Steuereinheit vorgesehen, die die Dioden und die gekühlte Kammer
steuert. Die Steuereinheit regelt die Intensität der Dioden durch Variation
des Diodenstromes oder durch Pulsbetrieb.
-
Weitere
Vorteile und vorteilhafte Ausführungsformen
der Erfindung können
den Unteransprüchen
entnommen werden und sind Gegenstand der nachfolgenden Figuren sowie
deren Beschreibungen.
-
Es
zeigen im einzelnen:
-
1 eine
schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der Erfindung;
-
2 eine
schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Erfindung;
-
3 eine
schematische Darstellung einer dritten Ausführungsform der Erfindung;
-
4 eine
perspektivische Ansicht des Probenträgers für die Gefriersubstitution und
Einbettung, der bei der gegenwärtigen
Erfindung verwendet werden kann; und
-
5 eine
perspektivische Ansicht des Behälters
zur Gefriersubstitution und Einbettung, wobei mehrere Probenträger in den
Behälter
eingesetzt sind.
-
1 zeigt
eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der Erfindung. Die
Vorrichtung 1 zur Polymerisation von biologischen Proben
bei der Gefriersubstitution umfasst eine Kühlvorrichtung 5. In
die Kühlvorrichtung 5 kann
mindesten eine Kammer 6 eingesetzt werden. Die Kammer 6 dient
zur Aufnahme mindestes eines Probenträgers 2, der die biologische
Probe 4 beinhaltet. An einem Bauteil der Kühlvorrichtung 5 oder
der gekühlten Kammer 6 ist
mindestens eine Diode 7 angebracht, die Licht mit UV-Anteilen
aussendet und derart angeordnet ist, dass das Licht auf die biologischen
Proben bzw. den Probenträger 2 gerichtet
ist. Das Bauteil, in dem die Dioden 7 angebracht sind,
ist ein separates Bauteil 9, das zum Polymerisieren auf
die Kühlvorrichtung 5 aufgesetzt
wird. Es sind mehrere Dioden 7 vorgesehen, die dabei derart
angeordnet sind, dass eine gleichmäßige Ausleuchtung der Kammer 6 erzielbar
ist. Ferner ist eine Steuereinheit 11 vorgesehen, die die
Dioden 7 und die gekühlte
Kammer 6 steuert. Es werden Leuchtdioden bzw. Dioden 7 verwendet,
die zumindest teilweise eine Emission im ultravioletten Spektralbereich
aufweisen und daher zur Polymerisation von mit Kunstharz oder Monomeren infiltrierten
elektronenmikroskopischen Präparaten bzw.
Poben bei tiefen Temperaturen (–60°C bis 0°C) geeignet
sind. Vorzugsweise haben die Dioden 7 ein Emissionsmaximum
bei einer Wellenlänge
zwischen 360nm und 400nm. Es können
aber auch andere Dioden 7 eingesetzt werden, deren Emissionsspektrum teilweise
in diesem Spektralbereich liegt. In dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel
sind die Dioden 7 in ein separates Bauteil 9 eingebaut,
das für
die Polymerisation auf die gekühlte
Kammer 5, in der die Präparate
gekühlt
werden, aufgesetzt wird. Hier werden vorzugsweise mehrere Dioden 7 verwendet,
um eine gleichmäßig Ausleuchtung
zu erhalten. Zur schnellen Polymerisation kleiner Proben können aber
auch einzelne Dioden 7 derart eingebaut werden, dass sie
genau auf das Präparat
gerichtet sind.
-
2 zeigt
eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Erfindung. Das Bauteil 9,
in dem die Dioden 7 angebracht sind, ist fest mit der Kühlvorrichtung 5 verbunden.
Die Dioden 7 sind somit in die gekühlte Kammer 6 integriert.
In der hier dargestellten Ausführungsform
sind die Dioden 7 in einer Kammerwand 5, der Kühlvorrichtung 5 integriert.
Es ist besonders vorteilhaft, wenn die Kühlvorrichtung 5 eine
zylinderförmige Kammerwand 5, besitzt.
Ferner können
die Dioden 7 in einen anderen mit der Kammer 6 fix
verbundenen Bauteil 9 oder in die Kammer 6 selbst
eingebaut werden. Aus Gründen
des Platzes ist es hier ebenfalls vorteilhaft mit einzelnen Dioden 7 vorgegebene
Positionen für
die Präparate
zu beleuchten. In der hier dargestellten Ausführungsform ist eine ringförmige Anordnung
von Dioden 7 mit großem
Emissionswinkel dargestellt. Durch diese Anordnung ist auch eine
gleichmäßige Ausleuchtung
der ganzen gekühlten
Kammer 6 erzielbar. Die Dioden 7 sind bei dieser
Ausführungsform
auf einem Trägerring 9,
angebracht, woraus sich die ringförmige Anordnung der Dioden 7 ergibt. Die
Dioden 7 werden nur für
die Polymerisation eingeschaltet, verbleiben aber permanent in ihrer
Position. Daher entfällt
zu Beginn der Polymerisation die Manipulation mit dem Lampenhaus
und die Polymerisation kann auch programmgesteuert – also ohne unmittelbaren
Eingriff des Benutzers – gestartet
werden. Für
die Programmsteuerung der gesamten Vorrichtung wird die Steuerung 11 herangezogen.
Mit einem Kammerdeckel 13 ist die gekühlte Kammer 7 verschließbar bzw.
verschlossen. Die elektronische Steuerung 11 dient zur
Regelung der Intensität
der emittierten Strahlung der Dioden 7. Die Regelung der Dioden 7 kann
durch Kontrolle des Diodenstroms oder gepulste Ansteuerung der Dioden 7 erfolgen.
-
3 zeigt
eine schematische Darstellung einer dritten Ausführungsform der Erfindung. Hier sind
die Dioden 7 in ein Teilgerät 17 oder Zusatzgerät integriert,
das nicht fest mit der Kühlvorrichtung 5 verbunden
ist. Das Teilgerät 17 oder
Zusatzgerät
wird vor der Polymerisation auf die Kühlvorrichtung 5 aufgesetzt.
Das Teilgerät 17 oder
Zusatzgerät
kann auch für
andere Prozessschritte neben der Polymerisation verwendet werden.
Das Teilgerät 17 oder
Zusatzgerät
kann ebenfalls mit anderen Funktionen, wie z.B. mit einem integrierten
Manipulator 19, versehen sein. Das Teilgerät 17 oder
Zusatzgerät
findet in den letzten Prozessschritten, also vor der Polymerisation, Verwendung,
damit ist – wie
bereits bei der in 2 beschriebenen Ausführungsform – mit den
integrierten Dioden 7 ein programmgesteuerter Polymerisationsstart
ohne unmittelbaren Benutzereingriff möglich. Die Dioden 7 sind
in das Teilgerät 17 oder
Zusatzgerät
der gekühlten
Kammer 6 eingebaut. In der dargestellten Form umfasst das
Teilgerät 17 oder
Zusatzgerät
ein Gehäuse 21,
das mit einem Sichtfenster 23 versehen ist, über das
ein Benutzer mit dem Manipulator 19 Veränderungen an den Proben durchführen kann.
Das Teilgerät 17 oder
Zusatzgerät kann
aber auch anders ausgeführt
sein, es kann sich insbesondere auch um den Kammerdeckel 13 handeln.
-
Die
Dioden 7 haben eine dem Polymerisationsprozess besser angepasste
Strahlungsintensität als
die herkömmlichen
Leuchten. Daher können
Abschattungsmaßnahmen,
wie sie bei den Gasentladungslampen üblich sind, entfallen. Höhere Intensitäten können mit
den Dioden 7 sehr einfach durch Anordnung mehrerer Dioden 7 erreicht
werden. Außerdem
ist die Intensität
durch Regelung des Betriebsstroms oder durch Pulsweitenmodulation
sehr einfach.
-
Es
ist bekannt, dass elektromagnetische Strahlung umso schädlicher
für Gewebe
(und damit für
den Benutzer) ist, je kurzwelliger sie ist. Daher trägt die etwas
höhere
Emissionswellenlänge
der Dioden 7 dazu bei, dass das Gefährdungspotential für den Benutzer
minimiert ist. Die Anordnung der Dioden 7 in Bezug auf
die biologische Probe kann auf verschiedene Arten erfolgen. Es ist
dabei zu beachten, dass dabei die Polymerisation möglichst
gleichmäßig abläuft, das
eingebettete Gewebe der Probe möglichst
wenig durch die UV-Bestrahlung geschädigt wird, und dass ebenfalls
der Benutzer der Vorrichtung 1 vor der UV-Bestrahlung geschützt ist.
Mehrere Dioden 7 sind dabei derart angeordnet, dass eine
gleichmäßige Ausleuchtung
des Behälters
erzielbar ist. Ebenso ist eine Anordnung denkbar, bei der mehrere
Dioden 7 vorgesehen sind, die dabei derart angeordnet sind,
dass auf jede biologische Probe eine einzelne Diode 7 gerichtet
ist. Eine weitere Möglichkeit
ist, dass die mehreren Dioden 7 ringförmig angeordnet sind, wobei
die Dioden 7 einen großen
Emissionswinkel besitzen, so dass eine gleichmäßige Ausleuchtung der gekühlten Kammer 6 bzw.
des Behälters 2 erzielbar
ist. Damit ein Benutzer vor einer möglichen Schädigung durch die UV-Strahlung
geschützt
ist, ist ein Sensor 25 (siehe 2) vorgesehen,
der den Zustand bestimmt, ob die Kühlvorrichtung 5 bzw.
die gekühlte
Kammer 6 geschlossen ist oder das Teilgerät mit den
Dioden 7 an der Kühlvorrichtung 5 angebracht
ist. Der Sensor 25 stellt sicher, dass die Dioden 7 nur
eingeschaltet werden können,
wenn die gekühlte
Kammer 6 geschlossen ist, bzw. das Teilgerät 17 auf
die Kühlvorrichtung 5 aufgesetzt
ist. Die Dioden 7 werden mit Niederspannung betrieben und
können
durch den Benutzer oder durch ein Programm ein- und ausgeschaltet
werden. Der Benutzer ist dadurch ebenfalls vor Stromschlägen geschützt.
-
Bei
den in 1 bis 3 dargestellten Ausführungsformen
sind die Proben in einen Probenträger 2 eingebracht,
der als PCR-Gefäß ausgebildet ist.
Dies soll jedoch nicht als eine Beschränkung der Erfindung aufgefasst
werden. Es ist für
jeden Fachmann selbstverständlich,
dass auch andere Probenträger
verwendet werden können,
die für
die Polymerisation durch Licht mit UV-Anteilen geeignet sind. Eine weitere
Ausführungsform
eines Probenträgers ist
in 4 gezeigt.
-
4 zeigt
eine perspektivische Ansicht eines Probenträgers 2, der eine Probe 4 trägt. Der
Probenträger 2 ist
ringförmig
ausgebildet und trägt
in einer Vertiefung 3 die Probe 4. Die Probe 4 besitzt
in etwa einen Durchmesser von 1,2 mm und eine Dicke von etwa 0,2
mm.
-
5 zeigt
eine perspektivische Ansicht einer Einbettform 26 für die Gefriersubstitution
und Einbettung, in die mehrere Probenträger 2 aufgenommen
werden können.
Die Einbettform 26 ist zylinderförmig ausgebildet und besitzt
eine Seitenwand 8 und einen Boden 16. Der Behälter ist
an der dem Boden 16 abgewandten Seite offen. Im Inneren
der Einbettform 26 sind mehrere Mulden 12 ausgebildet.
Es ist besonders vorteilhaft, wenn die Mulden 12 in einer aus
dem Innenbereich der Einbettform 6 entnehmbaren Muldenplatte 10 ausgebildet
sind. In der hier dargestellten Ausführungsform besitzt die Muldenplatte 10 eine
zentrale Einfüll-
und Absaugöffnung 14, durch
die die für
die Gefriersubstitution und Einbettung erforderlichen Chemikalien
bzw. Medien zugeführt
und abgesaugt werden können.
Die Mulden 12 sind in dieser Ausführungsform radial um die Einfüll-/Absaugöffnung 14 angeordnet.
Gegenüber
der Seitenwand 8 der Einbettform 6 besitzen die
Mulden 12 ein verjüngtes
Ende 18. Das verjüngte
Ende 18 hat eine Stufe 20 ausgeformt, durch die
die Probenträger
in der Mulde gehalten werden. Jeweils ein Probenträger 2 wird
in eine Mulde 12 eingelegt und auf das sich verjüngende Ende 18 hingeschoben,
bis er an der Stufe 20 anliegt. Die Probenträger 2 sind
dabei radial entlang der Seitenwand 8 der Einbettform 6 verteilt.
Bei der radialen Verteilung der Probenträger 2 in der Einbettform 6 empfiehlt
sich auch eine radiale Verteilung der Dioden.