Hintergrund der Erfindung
Bei
der Entstehung von Autoimmunerkrankungen stellen Antigen-Antikörperreaktionen
ein viel diskutiertes pathogenetisches Prinzip dar. Einer Familie
von Autoantikörpern
wird in der letzten Zeit besondere Aufmerksamkeit geschenkt, den
so genannten antineutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern (ANCA)
(Wiik, A., APMIS 97(suppl.6):12-13 (1989); Savige, J. et al., Am.
J. Clin. Pathol. 111:507-513 (1999)). Hierbei wurde in den letzten
Jahren beobachtet, dass diese Autoantikörper nicht nur eine wichtige
diagnostische und klinische Rolle bei den systemischen Vaskulitiden
wie z.B. Wegenerscher Granulomatose und mikroskopischer Polyangiitis
spielen, wo sie bereits etablierte Seromarker sind (Woude van der,
F.J. et al., Lancet 1:425-429 (1985), Falk, R.J. und Jennette, J.C.,
N. Engl. J. Med., 318:1651-1657 (1988)), sondern auch in hoher Prävalenz (70-96%)
im Serum von Patienten mit autoimmunen Lebererkrankungen, wie z.B.
autoimmuner Hepatitis (AIH) oder primär sklerosierender Cholangitis
(PSC), oder bei den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen,
z.B. der Colitis ulcerosa (CU), nachweisbar sind (Falk, R.J. und
Jennette, J.C., N Engl J Med, 318:1651-1657 (1988); Duerr, R.H.
et al., Gastroenterology 100:1385-1391 (1991); Hardarson, S. et
al., Am. J. Clin. Pathol. 99:277-281 (1993); Mulder, A.H.L. et al.,
Hepatology 17:411-417 (1993); Mulder, A.H.L. et al., Clin. Exp.
Immunol. 95:490-497 (1994); Targan, S. et al., Gastroenterology
108:1159-1166 (1995);
Bansi, D. et al., J. Hepatol. 24:581-586 (1996); Zauli, D. et al.,
Hepatology 25:1105-1107 (1997); Roozendaal, C. et al., J. Hepatol. 32:734-741
(2000)). Im Gegensatz zu den systemischen Vaskulitiden sind das
oder die Antigene der ANCA bei den autoimmunen Lebererkrankungen
und den chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen trotz intensiver weltweiter Bemühungen noch nicht identifiziert
worden.
Die
indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie auf äthanol-fixierten neutrophilen
Granulozyten stellt die Standardnachweismethode für ANCA dar
(Wiik, A., APMIS 97(suppl.6):12-13 (1989)). Dabei können drei
verschiedene Färbemuster
unterschieden werden: c-ANCA mit einer diffusen zytoplasmatischen
Fluoreszenz sowie zwei unterschiedliche „perinukleäre" Färbemuster
(p-ANCA) (Savige, J. et al., Am. J. Clin. Pathol. 111:507-513 (1999)).
Mit Hilfe der Doppelimmunfluoreszenz gelang der Nachweis, dass die
ursprüngliche
Definition von ANCA als antineutrophile zytoplasmatische Antikörper nicht
für p-ANCA
bei autoimmunen Lebererkrankungen oder CU gilt (Billing, P. et al.,
Am. J. Pathol. 147:979-987 (1995); Terjung, B. et al., Hepatology 28:332-340
(1998); Mallolas, J. et al., Gut 47:74-78 (2000)). Im Gegensatz zum „klassischen" p-ANCA, der durch
eine homogene, ringförmige
Anfärbung
des perinukleären
Zytoplasmas charakterisiert ist, weist der „atypische" p-ANCA, der fast ausschließlich bei
Patienten mit autoimmunen Lebererkrankungen oder chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen gefunden wird, eine inhomogene ringförmige Anfärbung der
Kernperipherie verbunden mit einer charakteristischen intranukleären Tüpfelung
auf (Terjung, B. et al., Hepatology 28:332-340 (1998); Terjung,
B. et al., Clin. Exp. Immunol. 126:37-46 (2001)). Elektronenmikroskopische
Untersuchungen deuteten darauf hin, dass diese intranukleäre Tüpfelung
am ehesten Anschnitten der angefärbten
Kernperipherie im Bereich von Kerneinstülpungen der mehrsegmentkernigen
neutrophilen Granulozyten entspricht, und somit ein nukleäres Antigen
der „atypischen" p-ANCA anzunehmen ist.
Zur Abgrenzung zu "klassischen" p-ANCA wurden solche
p-ANCA daher "atypische" p-ANCA genannt;
auch p-ANNA (antineutrophil nuclear antibodies) wurde als Bezeichnung
vorgeschlagen (Terjung, B. et al., Gastroenterology 119:310-322
(2000); Terjung, B. et al., Clin. Exp. Immunol. 126:37-46 (2001)).
In
unmittelbarem Einklang mit dieser Beobachtung steht die Tatsache,
dass „atypische" p-ANCA höchstens
bei 25-35% der Seren mit den bislang in der Literatur vorgeschlagenen
neutrophil-spezifischen Granula- oder Zytosolproteinen (wie z.B.
Bactericidal/permeability increasing protein, Cathepsin G, Elastase,
Lactoferrin, Catalase, Enolase) reagierten (Zhao, M.H. et al., Clin.
Exp. Immunol. 99:49-56 (1995); Halbwachs-Mecarelli, L. et al., Clin.
Exp. Immunol. 90:79-84 (1992); Peen, E. et al., Gut 34:56-62 (1993);
Stoffel, M.P. et al., Clin. Exp. Immunol. 104:54-59 (1996); Walmsley,
R.5: et al., Gut 40:105-109 (1997); Orth, T. et al., Clin. Exp. Immunol.
112:507-515 (1998); Roozendaal, C. et al., Clin. Exp. Immunol. 112:10-16
(1998)).
Bislang
wurden nur wenige putative nukleäre
Antigene atypischer p-ANCA vorgeschlagen. Histon H1, speziell seine
Isoform H1-3, wurde bereits als Kandidaten-Antigen bei CU diskutiert (Eggena, M.
et al., J. Autoimmun. 14:83-97 (2000)). Bei 89% von Patienten mit
AIH und atypischen p-ANCA wurde außerdem eine Reaktivität gegenüber HMG
1 und 2 (high mobility non-histone chromosomal protein 1 und 2)
nachgewiesen (Sobajima, J. et al., Gut 44:867-873 (1999)). Keines
dieser nukleären
Proteine ist spezifisch für
myeloische Zellen. Ein für
Assays geeignetes Antigen von atypischen p-ANCA muss jedoch von
der überwiegenden
Mehrheit von Seren, welche atypische p-ANCA enthalten, erkannt werden
und myeloidzell-spezifisch sein.
Atypische
p-ANCA sind z.B. im Blutserum von Patienten mit chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen (u.a. CU, seltener Morbus Crohn) sowie Autoimmunerkrankungen
wie z.B. AIH oder PSC nachweisbar und werden bereits in der klinischen
Diagnostik eingesetzt. Als Nachweisverfahren dient hierbei zumeist
die relativ aufwändige
indirekte Fluoreszenzmikroskopie. Der Einsatz von hochspezifischen
Festphasenassays wird erst nach Identifikation des verantwortlichen
Antigens atypischer p-ANCA möglich
sein.
Die
subzelluläre
Lokalisation des Ziel-Antigens von atypischen p-ANCA in der Kernhülle myeloischer Zellen
(Terjung, B. et al., Hepatology 28:332-340 (1998)) und weitere im
Vorfeld der vorliegenden Anmeldung durchgeführten Arbeiten führten zu
dem Patent
US 6,627,458 .
Es beschreibt ein Kernhüllprotein
von Neutrophilen und myeloischen Zellen als Antigen atypischer p-ANCA,
das von der überwiegenden
Mehrheit (>92%, n
= 34/37) der getesteten Seren mit atypischen p-ANCA erkannt wird
(Terjung, B. et al., Gastroenterology 119:310-322 (2000)). Hingegen
fand sich keine Reaktivität
mit atypische-p-ANCA-negativen Seren von gesunden Probanden. Seren,
die klassische p-ANCA enthielten, zeigten gleichfalls keine Reaktivität mit diesem
Protein. Darüber
hinaus fand sich die beobachtete Reaktivität nur bei myeloisch-differenzierten
Zellen (neutrophile Granulozyten, promyelomonozytäre humane
HL-60 Zellen, myelomonozytäre
murine 32D-Zellen). Das Antigen wurde in
US 6,627,458 aus Kernextrakten von humanen
Neutrophilen, HL-60-Zellen und Maus-32D-myeloischen Zellen isoliert
und im Wesentlichen anhand seiner biochemischen Eigenschaften über SDS-Gelelektrophorese
und isoelektrische Fokussierung charakterisiert. Das beschriebene
Antigen hatte hiernach ein offenbares Molekulargewicht (MW) von
50 kD und einen isoelektrischen Punkt (IEP; pI) von pH 6,0. Nachfolgende
Versuche der Erfinder der vorliegenden Anmeldung, das reaktive Protein
mittels massenspektrometrischer Methoden zu identifizieren, nachdem
es durch Gelelektrophorese gereinigt worden war, waren nicht erfolgreich.
Es zeigte sich, daß die
in der eindimensionalen Gelelektrophorese nachweisbare „reaktive
Bande" ein komplexes
Gemisch verschiedener Proteine mit dem gleichen Molekulargewicht,
aber vermutlich unterschiedlichen isoelektrischen Punkten darstellte.
Die massenspektrometrischen Analysen ergaben u.a. mehrfach den Hinweis
auf die „Beta-Kette
einer mitochondrialen ATP-Synthase" (52 kD, pI 5,0). Desweiteren wurde
in den massenspektrometrischen Analysen in der Regel lediglich ein
Peptid gefunden, das eine Übereinstimmung
mit einer „Diphosphooligosaccharid
Glykosyltransferase" (48
kD, pI 5,42), in einer weiteren Analyse mit dem „Hepatocyten Nuclear Factor
gamma" (47 kD, pI
8,29), dem „Heatshock
Protein 60" (58
kD, pI 5,23) oder „Apolipoprotein
A1" (23 kD, pI 5,4)
zeigte (jeweils niedriger Probability based Mowse score 60-80; minimal
erforderlicher Score, damit ein gefundenes Protein als mögliches
Kandidatenprotein angesehen werden kann: ≥ 46). Insgesamt waren vier massenspektrometrische
Analysen des reaktiven Proteins aus eindimensionalen Gelen versucht
worden (Protein Chemistry Core Facility, Columbia University, New
York; Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU, New York).
Die wiederholte Identifikation von zytoplasmatischen Proteinen als
mögliche
Kandidatenantigene der atypischen p-ANCA ist am ehesten auf eine
nicht vermeidbare Kontamination der Kernhüllenextrakte mit anhängenden
Zytoplasmabestandteilen zurückzuführen. Trotz
aufwendiger Reinigungsverfahren konnte keine reinere Fraktion der
Kernhüllenproteine
hergestellt werden.
Bislang
konnten keine hochspezifischen, zuverlässigen Festphasenassays zur
Detektion atypischer p-ANCA entwickelt werden. Es stand lediglich
die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie als Nachweismethode zur
Verfügung.
Die mit dieser Technik erhobenen Resultate sind jedoch stets durch
die subjektive Einschätzung
desjenigen beeinflusst, der die Immunfluoreszenzmuster beurteilt.
Es wur den zwar bereits Versuche unternommen, ELISAs zum Nachweis
atypischer p-ANCA
zu entwickeln, die zytoplasmatische Proteine wie das Bactericidal/permeability
increasing protein, Cathepsin G, Elastase oder Lactoferrin berücksichtigten, selten
auch Myeloperoxidase (Zhao, M.H. et al., Clin. Exp. Immunol. 99:49-56
(1995); Halbwachs-Mecarelli, L. et al., Clin. Exp. Immunol. 90:79-84
(1992); Peen, E. et al., Gut 34:56-62 (1993); Stoffel, M.P. et al.,
Clin. Exp. Immunol. 104:54-59 (1996); Walmsley, R.S. et al., Gut
40:105-109 (1997)). Diese ELISAs reagierten jedoch nur mit einer
Minderheit aller für
atypische p-ANCA positiven Seren (<35%).
Sie sind daher nicht zum Einsatz in der klinischen Diagnostik geeignet.
Im
Lichte der vorstehend erläuterten
Forschungsergebnisse bestand ein zwingender Bedarf an einem verlässlichen
Verfahren zum Nachweis von p-ANCA.
Mikrotubuli
und ihre Hauptbestandteile, Tubulin-alpha und -beta, sind an einer
Vielzahl zellulärer
Prozesse in höheren
Eukaryoten beteiligt, u.a. der Zellteilung, der Zellbeweglichkeit
und der Erhaltung der Zellform (Wang, D. et al., J. Cell. Biol.
1034:1903-1910 (1986); Lewis, S.A. et al., J. Cell. Biol. 101:852-861
(1985); Lewis , S.A. et al., Cell 49:529-548 (1987); Panda, D. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11358-11362 (1994); Dumontet,
C. et al., Cell Motil. Cytoskeleton 35:49-58 (1996)). Zur Ausübung dieser
funktionalen Spezifität spielen
posttranslationale Modifikationen der einzelnen Tubulin-Isotypen,
wie z.B. Phosphorylierung, Acetylierung, Glycylierung, Palmitylierung,
oft eine wichtige Rolle. Tubulin-beta und -alpha werden generell
als zytosolische Proteine betrachtet, deren Hauptaufgabe die Bildung
von Mikrotubuli ist. Tubulin-beta ist ein ubiquitäres Protein,
das in fast allen Zellen vorhanden ist. Es sind mindestens 7 verschiedene
Isotypen bekannt (Roach, M.C. et al., Cell Motil Cytoskeleton 39:273-285
(1998); Wang, D. et al., J. Cell. Biol. 1034:1903-1910 (1986); Lewis,
S.A. et al., J. Cell. Biol. 101:852-861 (1985)); myeloidzell-spezifische
Isotypen befinden sich nicht darunter. Obwohl mehr als 800 Tubulin-(z.
T. Pseudo)Gene bekannt sind (Lee, M.G. et al., Cell 33:477-487 (1983); Cleveland,
D.W. und Sullivan, K.F., Ann. Rev. Biochem. 54:331-365 (1986)),
findet sich auch keine Sequenzinformation über myeloidzell-spezifische
Tubulin-beta Gene in den einschlägigen
Datenbanken. Eine Kreuzreaktivität
atypischer p-ANCA gegenüber
allen bislang identifizierten Tubulin-Isoformen ist bislang unbekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Überraschenderweise
wurde nun gefunden, dass die Mehrheit der Seren (>94%) von Patienten
mit chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen (wie z.B. CU, Morbus Crohn) und autoimmunen Lebererkrankungen
(wie z.B. AIH, PSC), die atypische p-ANCA enthalten, mit einem hier
zum ersten Mal beschriebenen, ungefähr 50 kD schweren, aziden (pH
4,7-5,1) Kernhüllenprotein
reagieren, das spezifisch für
myeloisch differenzierte Zellen ist und anhand von Sequenzdaten
als Tubulin-beta Isotyp 5 (TBB-5) oder als ein nahe verwandter,
noch nicht in den Datenbanken erfasster Isotyp von Tubulin-beta
identifiziert wurde.
Außerdem wurde überraschend
gefunden, dass auch TBB-5 selbst (aus myeloisch differenzierten
Zellen isoliert oder rekombinant hergestellt) sowie trunkierte und
elongierte Formen von TBB-5 durch atypische p-ANCA erkannt werden.
Des
weiteren wurde überraschend
gefunden, dass rekombinantes bakterielles Zellteilungsprotein FtsZ eine
Kreuzreaktivität
mit Seren aufweist, welche atypische p-ANCA enthalten. Tubulin-beta
Isotyp 5 zeigt eine hohe strukturelle Homologie zu FtsZ, vor allem
im Bereich der funktionell wichtigen GTP-Bindungsregion (8). Die Aminosäuresequenzen
der beiden Proteine (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:17) sind jedoch nur
zu 20% homolog. Diese Kreuzreaktivität ist auch deshalb von besonderem
Interesse, weil immer wieder bei den autoimmunen Lebererkrankungen
und den chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen ein molekulares Mimikry zwischen bakteriellen Proteinen
der Darmbakterien und der Autoantigene von Autoantikörpern vermutet wird
(Burns, R., Nature 391:121-122
(1998); Selmi, C. et al., Hepatology 38:1250-1257 (2003); Cohavy,
0. et al., Infect. Immun. 68: 1542-1548 (2000)).
Da
atypische p-ANCA eine hohe diagnostische Präzision für die oben genannten Erkrankungen
haben, vor allem bei den autoimmunen Lebererkrankungen, stellt die
Antigenidentifikation einen entscheidenden Schritt zur Ergänzung des
diagnostischen Armentariums dieser Erkrankungen dar. Insbesondere
wurde überraschend
gefunden, dass atypische p-ANCA die einzigen relevanten Seromarker
für primär sklerosierende Cholangitis
(PSC) sind sowie bei der AIH die Seromarker mit der höchsten diagnostischen
Präzision
darstellen.
Das
erfindungsgemäße Antigen
atypischer p-ANCA kann, rekombinant hergestellt werden, wodurch eine
aufwändige
Präparation
der Kernhülle
zur Gewinnung des Antigens unnötig
wird.
Das
erfindungsgemäße Antigen
atypischer p-ANCA kann, da es sich um ein isoliertes Protein handelt, zur
Herstellung von hochspezifischen Assays, besonders Festphasenassays,
zum Nachweis atypischer p-ANCA verwendet werden. Die Identifizierung
dieses Antigens ermöglicht
erstmals die Entwicklung solcher p-ANCA-spezifischen Festphasenassays,
was eine deutliche Verbesserung und vor allem Vereinfachung gegenüber den
bislang gebräuchlichen
Diagnosemethoden darstellt.
Die
Erfindung betrifft somit
- (1) ein Verfahren
zur Identifizierung und/oder Quantifizierung von atypischen antineutrophilen
zytoplasmatischen Antikörpern
(nachfolgend kurz „atypische
p-ANCA") in einer Probe
mittels eines isolierten Antigens, das zur Bindung mit atypischen
p-ANCA befähigt
ist (nachfolgend kurz „atypische-p-ANCA-Antigen");
- (2) eine bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens (1), wobei das Antigen ein Protein ist, das ein Molekulargewicht
von ca. 50 kD, bestimmt durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese (unter Verwendung
von kommerziell erhältlichen
Molekulargewichtsmarkern), und einen isoelektrischen Punkt (IEP)
von pH 4,7-5,1, bestimmt durch isoelektrische Fokussierung (unter
Verwendung von kommerziell erhältlichen
IEP-Standards), hat;
- (3) eine bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens (1) oder (2), wobei das Protein
(i) aus Tubulinpräparationen
aus Zellen von Menschen oder Vertebraten, bevorzugt aus Blutzellen,
Zellen des Immunsystems, Hepatozyten, Zellen des Gallensystems oder
Zellen der Darmschleimhaut, besonders bevorzugt aus myeloisch-differenzierten
Zellen, ganz besonders bevorzugt aus neutrophilen Granulozyten isolierbar
ist; und/oder
(ii) aus Kernhüllpräparationen myeloisch-differenzierter
Zellen isolierbar ist;
- (4) eine bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens (1), (2) oder (3), wobei das Antigen
(i) ein
Tubulin-beta, insbesondere ein TBB-5 mit der Aminosäuresequenz
SEQ ID NO:2 oder eine Substitutions-, Deletions- und/oder Additionsmutante
derselben ist, und/oder
(ii) ein bakterielles Zellteilungsprotein,
insbesondere das bakterielle Zellteilungsprotein FtsZ mit der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO:17, oder eine Substitutions-, Deletions- und/oder
Additionsmutante desselben ist;
- (5) eine bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens (1) bis (4), das die quantitative Bestimmung der
Konzentration von atypischen p-ANCA in einer Probe mit Hilfe eines
Immunoassays und/oder einen Abgleich mit einer Standardkonzentration
an atypischen p-ANCA umfasst;
- (6) ein Protein, wie in (1) bis (4) definiert, jedoch nicht
TBB-5 mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:2 oder FtsZ mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:17;
- (7) eine DNA, die für
ein Protein nach (6) kodiert;
- (8) einen Vektor, der eine DNA nach (7) umfasst;
- (9) einen Wirtsorganismus, der mit einem Vektor nach (8) transformiert
oder transfiziert ist und/oder eine DNA nach (7) aufweist;
- (10) ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach (6),
umfassend das Kultivieren des Wirtsorganismus nach (9);
- (11) einen Kit zur Identifizierung und/oder Quantifizierung
von atypischen p-ANCA
gemäß (1) bis
(5), vorzugsweise enthaltend ein wie in (1) bis (4) definiertes
Antigen und/oder eine Stammkultur einer Zelllinie, die dazu geeignet
ist, dieses Antigen vorzugsweise rekombinant zu exprimieren; und
- (12) die Verwendung des in (6) definierten Proteins in immunologischen,
neurobiologischen und zellphysiologischen Untersuchungen, in der
klinischen Forschung, und für
diagnostische Verfahren in vivo und in vitro.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
(1) führt
aufgrund der hohen Reinheit des Antigens zu geringen bis keinen
unspezifischen Kreuzreaktionen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1: Reaktivität von atypischen p-ANCA mit
einem 50 kD schweren Kernhüllenprotein
und „Fingerprinting" der p-ANCA-Antigene.
Auftrennung von Kernhüllenextrakten
von HL-60 Zellen mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese, anschließend Western
Blotting, Immunodetektion mit Seren, die „atypi sche" p-ANCA enthielten, und Nachweis reaktiver
Spots mittels Chemilumineszenz. Für die isoelektrische Fokussierung
wurden Gelstreifen mit immobilisierten pH-Gradienten (pH-Bereich
4,7-5,9) verwendet.
- (A) Nachweis von 2-3 perlschnurartig
angeordneten reaktiven Spots mit einem Molekulargewicht von 50 kD und
einem pH-Wert von 4,9-5,1 im mit Silbernitrat gefärbten Gel
(Ellipse).
- (B) Bei der Immunodetektion mit Seren, die „atypische" p-ANCA enthielten (Serum eines Patienten
mit autoimmuner Hepatitis und atypischen p-ANCA, Serum-Endpunkttiter 1:2.560),
waren im gleichen pH-Bereich reaktive Spots (Ellipse) erkennbar.
Die im Gel gefundenen Spots konnten eindeutig den im Immunoblot
reagierenden Spots zugeordnet werden.
Die Molekülmasse in
kD ist auf der linken Seite des Gels und des Immunoblots angegeben.
Für die
Immunodetektion wurden die Seren 1:500 verdünnt.
- (C) MALDI-TOF-MS-Analyse der reaktiven Spots ergab Fragmente,
die zu Sequenzabschnitten von Tubulin-beta Isotyp 5 (TBB-5; Swiss-Prot
P05218) homolog waren. Da die beiden reaktiven Spots unabhängig voneinander
als TBB-5-homolog
identifiziert wurden, jedoch leicht unterschiedliche Molekularmassen
aufwiesen, sind posttranslationale Modifikationen, die zu den leicht
unterschiedlichen pI-Werten führen,
sehr wahrscheinlich.
2: Reaktivität von atypischen
p-ANCA mit Proteinen aus Tubulinpräparationen von HL-60 Zellen. Die
Tubulinpräparationen
aus HL-60-Zellen wurden durch 1D- bzw. 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt.
Für die isoelektrische
Fokussierung wurden Gelstreifen mit immobilisierten pH-Gradienten
(pH-Bereich 4,7-5,9) verwendet. Zur Visualisierung von Tubulinen,
die mit atypischen p-ANCA reagieren, wurde die Immunodetektion eingesetzt.
- (A) Die überwiegende
Mehrheit der Seren mit atypischen p-ANCA (94%; 32/34) reagierte
nach eindimensionaler (1D-)Gelektrophorese mit einem Tubulin, das
ein Molekulargewicht von 50 kD aufwies (Bahn 1: Serum von einem
Patienten mit autoimmuner Hepatitis [AIH], Titer der atypischen
p-ANCA 1:5.120; Bahn 2: Serum von einem Patienten mit primär sklerosierender
Cholangitis [PSC], Titer der atypischen p-ANCA 1:320; Bahn 3: Serum
von einem Patienten mit AIH und Colitis ulcerosa [UC], Titer der
atypischen p-ANCA 1:1.280). Mit Serum von gesunden Normalpersonen
(Bahn 4) war keine Reaktivität
mit einem der elektrophoretisch aufgetrennten Proteine nachweisbar.
- (B) Immunoblotting mit Tubulinextrakten zeigte zwei Proteinspots
mit einem Molekulargewicht von 50 kD und pI-Werten zwischen 4,9-5,1,
die mit Serum von Patienten mit atypischen p-ANCA reagierten. Die
Inkubation erfolgte mit einem Serum, das atypische p-ANCA enthielt
(siehe unter (A) Bahn 1). Das Molekulargewicht in kD ist auf der
linken Seite des Gels und des Immunoblots angegeben. Für die Immunodetektion wurden
die Seren 1:500 verdünnt.
- (C) MALDI-TOF Massenspektrometrieanalyse der beiden reaktiven
Punkte aus 2B mit anschließender Proteindatenbanksuche
(Swiss-Prot; MASCOT) bestätigte
Tubulin-beta Isotyp 5 (TBB-5) als Zielantigen atypischer p-ANCA.
Angegeben ist die Aminosäuresequenz
von TBB-5 (444 Aminosäuren;
SEQ ID NO:2) sowie die massenspektrometrisch ermittelten Peptide
(44% der Gesamtaminosäuresequenz;
blaue Fettschrift). Die identifizierten Peptide haben die Positionen
1-19, 47-58, 63-78, 104-122, 155-162, 163-174, 217-241, 242-252,
253-262, 263-276, 283-297, 310-318, 363-377, 381-391. Es konnte
ein „Signalpeptid" (grau unterlegt)
an der Position 283-297 identifiziert werden, dass die eindeutige
Zuordnung zu TBB-5 ermöglichte.
3: Atypische p-ANCA erkennen
TBB-5, nicht jedoch TBB-1. Tubulinextrakte aus HL-60-Zellen wurden über zweidimensionale
(2D-)Gelelektrophorese aufgetrennt.
- (a) Mit
Antikörpern
gegen Tubulin-beta Isotyp 1 (verdünnt 1:20.000) wurde ein reaktiver
Spot mit Molekularmasse von ca. 50 kD und einem pI-Wert von ca.
4,95 nachgewiesen.
- (b) Inkubation desselben Immunoblots mit einem Serum, welches
atypische p-ANCA
enthielt, führte
zur Beobachtung zweier reaktiver Spots mit einem Molekulargewicht
von ca. 50 kD, die einen leicht höheren pI-Wert (ca. 5,0) als
TBB-1 aufwiesen.
- (c) Die Computersimulation (Adobe photoshop, version 6.0 (San
Jose, CA)) zeigt eine virtuelle Überlagerung
beider Bilder (a) und (b) und belegt, dass anti-TBB-1 und atypische
p-ANCA unterschiedliche Proteine mit demselben Molekulargewicht,
jedoch leicht unterschiedlichen pI-Werten erkennen.
Das
Molekulargewicht in kD ist auf der linken Seite des Immunoblots
angegeben. Für
die Immunodetektion wurden die Seren 1:500 verdünnt.
4: Myeloid-zellspezifische
Reaktivität
von atypischen p-ANCA. Elektrophoretische Auftrennung von Tubulinpräparationen
aus humanen promyelomonozytären
HL-60-, humanen Hela- und humanen HepG2-Zellen und anschließende Immunodetektion
mit Seren, die atypische p-ANCA enthielten. Hierbei zeigte sich
nur eine Reaktion mit einem 50 kD schweren Protein aus elektrophoretisch
aufgetrennten Tubulinpräparationen
von HL-60 Zellen (Bahn 1,2), nicht aber bei Hela(Bahn 3,4) oder
HepG2-(Bahn 5,6) Zellen. Bahnen 1, 3, 5: Inkubation mit einem Serum
von einem Patienten mit autoimmuner Hepatitis und atypischen p-ANCA (1:1.280).
Bahnen 2, 4, 6: Serum von einem Patienten mit primär sklerosierender
Cholangitis und atypischen p-ANCA (1:320).
5: Mikroskopische Immunfluoreszenzmuster
atypischer p-ANCA vor und nach Affnitätsreinigung und Präabsorption.
Darstellung der Färbemuster
mit konventioneller indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie an äthanol-fixierten
neutrophilen Granulozyten. Atypische p-ANCA wurden durch Fluorescein-Isothiocyanat-markierte
Sekundärantikörper detektiert.
- (A) Äthanolfixierte
neutrophile Granulozyten wurden mit dem Serum eines Patienten mit
autoimmuner Hepatitis, das atypische p-ANCA (Serumtiter 1:640) enthält, inkubiert.
Zu erkennen ist das charakteristische Fluoreszenzmuster atypischer
p-ANCA mit einer ringförmigen
Anfärbung
der Kernperipherie und einer intranukleären Tüpfelung.
- (B) Um affinitätsgereinigte
atypische p-ANCA zu erhalten, wurde Tubulin mittels eindimensionaler
SDS-PAGE aufgetrennt, die Proteine anschließend auf eine Nitrocellulosemembran
transferiert und eine reaktive Bande mit einem Molekulargewicht
von ca. 50 kD durch Inkubation mit Serum, das atypische p-ANCA enthält, immunodetektiert.
Diese reaktive Bande wurde aus der Nitrocellulosemembran ausgeschnitten.
Gebundene atypische p-ANCA wurden mit einer sauren Lösung aus
200 mM Glycin (pH 2,8) und 1 mM EDTA eluiert und für die Immunfluoreszenzmikroskopie
eingesetzt. Das erhaltene Färbemuster
zeigt dieselben typischen Charakteristika von atypischen p-ANCA,
wie sie vor der Affinitätsreinigung
zu erkennen waren (vgl. (A)).
- (C) Fluoreszenzmuster von atypischen p-ANCA aus dem Serum eines
Patienten mit Colitis ulcerosa (1:640).
- (D) Serum aus (C) wurde mit einer Tubulinpräparation im Verhältnis 1:10
präabsorbiert.
Anschließend
waren fluoreszenzmikroskopisch keine atypischen p-ANCA mehr detektierbar.
Balkenlänge: 10 μm. Nicht-affinitätsgereinigte
und nicht präabsorbierte
Seren wurden 1:10 verdünnt, während affinitätsgereinigte
und präabsorbierte
Seren unverdünnt
verwendet wurden.
6:
- (A) Transiente
Transfektion von Cos-7 Zellen mit cDNA-Plasmiden, die für TBB-5
kodieren, und anschließende
elektrophoretische Auftrennung der Zelllysate. Zum spezifischen
Nachweis war ein zusätzliches Xpress-Epitop
am N-terminalen Ende der jeweiligen cDNA integriert. Die exprimierten
Fusionsproteine wurden mit anti-Xpress Antikörpern (1:1.000 verdünnt) nach
Immunodetektion mittels Chemilumineszenzreaktion nachgewiesen.
Es
konnte eine deutlich reaktive Bande sowohl für exprimiertes Volllängen TBB-5
(BC007605, Bahn 3) und ein mit GFP elongiertes TBB-5 (GFP-B0007605,
Bahn 5) als auch für
zwei trunkierte Proteine, welche das N-terminale bzw. das C-terminale Ende von
TBB-5 umfassen (Bahn 1: BB, Bahn 2: BP) gezeigt werden. Hingegen
fand sich nur eine schwach reaktive Bande für das trunkierte Fusionsprotein
BE, welches einen gegenüber
BB verkürzten
Bereich des Nterminalen Endes von TBB-5 umfasst (Bahn 4). Die Doppelbande bei
BP lässt
auf proteolytische Abbauprodukte schließen. Zum Aufbau der Vektorkonstrukte
vgl. 6B.
- (B) Vektorkonstrukte zur Herstellung von trunkiertem TBB-5 oder
GFP-TBB-5 Fusionsprotein. BC007605, Volllängen-TBB-5 (theoretisches Molekulargewicht
55 kD). BE, 32 kD. BB, 45 kD. BP, 30 kD. BC007605-GFP, 81 kD.
7: Reaktivität von rekombinant
hergestelltem Volllängen-TBB-5,
GFP-TBB-5 sowie trunkierten Fragmenten von TBB-5 mit verschiedenen
Seren.
Rekombinant
hergestelltes Volllängen-TBB-5,
GFP-TBB-5 und trunkierte Fragmente von TBB-5 (BB, BP) wurden mittels
eindimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt (vgl. auch 6) und wie in Bsp. 5 beschrieben mit atypische
p-ANCA enthaltenden Seren oder atypische-p-ANCA-negativen Seren
von gesunden Normalpersonen getestet. Reaktive Proteinbanden wurden
mit Hilfe der Immunodetektion und anschließender Chemilumineszenzreaktion nachgewiesen
(vgl. Bsp. 5). Hochspezifische und hochsensitive Antikörper, die
gegen das integrierte Xpress-Epitop der exprimierten Fusionsproteine
gerichtet sind (1:1.000 verdünnt),
wurden zur Kontrolle der jeweiligen qualitativen und quantitativen
Proteinexpression und Reaktivität
in der Immunodetektion eingesetzt.
- (A) Es fand
sich eine deutliche Reaktivität
des exprimierten Volllängen
TBB-5 (ungefähres
Molekulargewicht 55 kD) mit dem anti-Xpress Antikörper (Bahnen
1 und 8) sowie mit Seren von Patienten, die an autoimmuner Hepatitis
erkrankt waren und deren Seren atypische p-ANCA enthielten (Bahnen
2-5). Hingegen zeigten atypische-p-ANCA-negative Kontrollseren keine
Reaktivität
mit dem exprimierten Volllängen
TBB-5 (Bahnen 6, 7, 9).
- (B) Das exprimierte trunkierte Fragment BB wurde sowohl von
dem anti-Xpress Antikörper
(Bahn 11) als auch von Seren mit atypischen p-ANCA (Bahn 10) als
reaktive Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 45 kD
nachgewiesen. Es wurde das gleiche Patientenserum wie in Bahn 5
eingesetzt.
- (C) und (D) Zusätzlich
fanden sich spezifische Reaktivitäten mit dem trunkierten Fragment
BP (ungefähres Molekulargewicht
30 kD; Doppelbande möglicherweise
auf proteolytischen Abbau des Fragments BP zurückzuführen) und bei Einsatz des exprimierten
GFP-TBB-5 sowohl mit anti-Xpress Antikörpern (Bahnen 13 und 15) als
auch bei Verwendung von Seren, die atypische p-ANCA enthielten (Bahnen
12 und 14). Es wurde das gleiche Serum verwendet wie für die Immunodetektion
in Bahn 2. Da das trunkierte Fragment BE bislang nur in geringen
Mengen exprimiert werden konnte, stehen Untersuchungen mit Seren
auf spezifische Reaktivitäten
noch aus.
8: Vergleich von FtsZ aus
E.coli mit humanen Tubulinen. 3D-Rekonstruktion von FtsZ aus E.coli, humanem
Tubulin-beta und -alpha. Alle drei Moleküle zeigen eine hohe strukturelle
Homologie, vor allem im Bereich der GTP-Bindungsregion (grün markiert),
bei höchstens
20%iger Übereinstimmung
der Aminosäuresequenz. Übereinstimmungen
der α-Helices
sind in orange und Übereinstimmungen
der β-Stränge in lila
dargestellt. Bereiche, die sich unterscheiden (vor allem im Bereich
des C-terminalen Endes der drei Moleküle), sind in grau dargestellt.
Modifiziert nach Burns, R., Nature 391:121-122 (1998).
9: Reaktivität von FtsZ
mit atypischen p-ANCA. Rekombinant in E.coli hergestelltes FtsZ
wurde mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und zeigte im Coomassie-gefärbten Gel
(A) einen charakteristischen Spot mit einem ungefähren Molekulargewicht
von 42 kD und einem isoelektrischen Punkt von 4,8. Im Immunoblot
(B) war eine deutliche Reaktivität
des Proteins mit atypischen p-ANCA
nachweisbar (vgl. Bsp. 15). Massenspektrometrische Analysen des
reaktiven Spots bestätigten
diesen als FtsZ.
Sequenzprotokoll – freier
Text
Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
Die
vorliegende Erfindung betrifft die molekulare Charakterisierung
und Identifizierung mehrerer Antigene, welche durch atypische p-ANCA
erkannt werden. Es konnte gezeigt werden, dass ein Grossteil der
Seren von Patienten mit autoimmunen Lebererkrankungen oder CU mit
einem aziden myeloidzell-spezifischen 50 kD Protein aus Kernhüllpräparationen
reagierte, das homolog zu TBB-5 ist. Bei Verwendung von Tubulinpräparationen
aus myeloisch differenzierten Zellen reagierten 94% der Seren mit
eine Protein der Masse 50 kD und einem pI von 4,9-5,1. Massenspektrometrische
Daten bestätigten,
dass es sich dabei um TBB-5 handelte. Die vorliegende Erfindung
erlaubt somit die verbesserte Diagnose von Patienten mit chronisch
entzündlichen
Darmerkrankungen (wie z.B. CU, Morbus Crohn) und autoimmunen Lebererkrankungen
(wie z.B. AIH, PSC).
„Atypische-p-ANCA-Antigen" bedeutet im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung ein natives Antigen, welches in vivo
und in vitro durch atypische p-ANCA
erkannt und gebunden wird, sowie des weiteren diejenigen nicht-nativen
Antigene atypischer p-ANCA, die ebenfalls mit hoher Sensitivität und Spezifität in vivo und
in vitro durch atypische p-ANCA gebunden werden, insbesondere Proteine,
die hohe Sequenzhomologien zu Tubulin-beta-Isoform 5 aufweisen,
ganz besonders Tubulin-beta Isoform 5 selbst und dessen trunkierte
und elongierte Versionen, sowie bakterielles FtsZ und dessen trunkierte
und elongierte Versionen. Insbesondere kann ein erfindungsgemäßes Antigen
atypischer p-ANCA auch rekombinant hergestellt sein.
Ein "Fusionsprotein" im Kontext der vorliegenden
Erfindung umfasst mindestens ein definiertes Protein oder Peptid,
das mit einem zweiten Protein oder Peptid („Markerprotein") verknüpft ist.
Die Nukleotidsequenzen, die für
die einzelnen Teile des Fusionsproteins codieren, sind in einer
Weise miteinander verknüpft,
die die Expression unter der Kontrolle eines einzigen Promoters
erlaubt.
Ein „Markerprotein" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist bevorzugt ein nichttoxisches, direkt oder indirekt
detektierbares Protein oder Peptid, bevorzugt entweder ein funktionales
Protein (z.B. ein Fluoreszenzmarker wie GFP oder ein Enzym) oder
ein Peptid, das die Detektion und/oder Isolierung des Fusionsproteins erleichtert
(z.B. ein Xpress-Tag, His-Tag). Im Falle eines funktionalen Proteins
als Markerprotein ist dieses vorzugsweise colorimetrisch nachweisbar,
z.B. über
die Lowry-Methode, durch Coomassie-Blau nach Bradford, Sulforhodamin
B, β-Galaktosidase
(lacZ), plazentale alkalische Phosphatase (PAP), Fluoreszenz, Biolumineszenz
wie z.B. Glühwürmchen-Luziferase,
Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder ähnliche Detektionsmethoden
(Haughland, R.P., Molecular Probes. Handbook of fluorescent probes
and research chemicals, 172-180, 221-229 (1992-1994); Freshney,
R.I., Culture of animal cells, 3rd ed.,
Wiley & Sons,
Inc. (1994)). Bevorzugt ist die Verwendung eines fluoreszierenden
Proteins oder Peptids, besonders bevorzugt die Verwendung von GFP
und dessen Varianten sowie „Reef
Coral Fluorescent Proteins" (RCFPs)
wie z.B. AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, DsRed, AsRed und HcRed (Clontech,
Palo Alto, CA). Besonders bevorzugt sind GFP und GFP-Varianten (Übersicht
s. Labas, Y.A. et al., PNAS 99(7):4256-4261 (2002)), ganz besonders
bevorzugt GFP.
„Isoliert" bedeutet im Falle
eines Proteins, dass es von anderen Proteinen, mit denen es normalerweise
in demjenigen Organismus assoziiert ist, in welchem es natürlicherweise
vorkommt, getrennt oder gereinigt wurde. Dies umfasst biochemisch
gereinigte Proteine, rekombinant hergestellte Proteine und auf chemischem Wege
synthetisierte Proteine. Die Definition gilt übertragen auch für Nukleinsäuren, insbesondere
DNA, und Peptide.
„Nativ" wird gleichbedeutend
mit „natürlich (vorkommend)" verwendet.
Nukleinsäuresequenzen,
insbesondere DNA-Sequenzen, die für erfindungsgemäße Proteine
oder Peptide codieren, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung
entweder identisch oder substantiell identisch zur nativen oder
zu der ihnen zugrundeliegenden künstlichen
erfindungsgemäßen Sequenz.
Wenn im Rahmen dieser Erfindung eine spezielle Nukleotidsequenz
genannt wird, so sind damit diese Sequenz selbst und die zu ihr
substantiell identischen Sequenzen erfasst. „Substantiell identisch" bedeutet hierbei,
dass nur ein Austausch von Basen in der Sequenz im Rahmen des degenerierten
Nukleinsäure-Codes
erfolgt ist, dass also dadurch die Codons innerhalb codierender
Sequenzen der substantiell identischen Nukleinsäure lediglich gegenüber dem
ursprünglichen
Molekül
in einer Weise verändert
sind, welche nicht zu einer Veränderung
der Aminosäuresequenz
des Translationsprodukts führt
(in der Regel Austausch des Codons durch ein anderes Codon seiner
Codon-Familie). Bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung
die Sequenzen, welche im Sequenzprotokoll benannt werden.
Proteinsequenzen
und Peptidsequenzen können
im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch Substitution von Aminosäuren modifiziert
werden. Bevorzugt sind solche Substitutionen, bei denen die Funktion und/oder
Konformation des Proteins oder Peptids erhalten bleibt, besonders
bevorzugt jene Substitutionen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren durch
Aminosäuren
ersetzt werden, die ähnliche
chemische Eigenschaften besitzen, z.B. Valin durch Alanin („konservative
Aminosäuresubstitution"). Der Anteil der
substituierten Aminosäuren
im Vergleich zum nativen Protein oder – falls es sich nicht um ein
natives Protein handelt – zur
Ausgangssequenz beträgt
bevorzugt 0-30% (bezogen auf die Zahl der Aminosäuren in der Sequenz), besonders
bevorzugt 0-15%,
ganz besonders bevorzugt 0-5%.
Nukleinsäuresequenzen
und Aminosäuresequenzen
können
als Volllänge-Sequenzen oder als
Additions- oder Deletionsprodukte dieser Volllängesequenzen zur Durchführung der
Erfindung eingesetzt werden. Bei den Aminosäuresequenzen umfassen die Additionsprodukte
auch Fusionsproteine, außerdem
Aminsäuresequenzen,
die durch Addition von 1-200, bevorzugt 1-50, ganz besonders bevorzugt
1-20 Aminosäuren
entstehen. Die addierten Aminosäuren
können
dabei einzeln oder in zusammenhängenden
Abschnitten von 2 oder mehr miteinander verknüpften Aminosäuren ein-
oder angefügt
werden. Die Addition kann am N- oder C-Terminus oder innerhalb der
ursprünglichen
Sequenz stattfinden. Es sind mehrere Additionen in einer Sequenz
zulässig,
wobei eine einzelne Addition bevorzugt ist, besonders bevorzugt
eine Addition am C- oder N-Terminus.
Die
Deletionsprodukte der Volllängen-Aminosäuresequenzen
entstehen – falls
nicht für
spezielle Sequenzen anders angegeben – durch Deletion von 1-220,
bevorzugt 1-100, ganz besonders bevorzugt 1-50 Aminosäuren. Die
deletierten Aminosäuren
können
dabei einzeln oder in zusammenhängenden
Abschnitten von 2 oder mehr miteinander verknüpften Aminosäuren entfernt
werden. Die Deletion kann am N- oder C-Terminus oder innerhalb der
ursprünglichen
Sequenz stattfinden. Es sind mehrere Deletionen in einer Sequenz zulässig, wobei
eine einzelne Deletion bevorzugt ist, besonders bevorzugt eine Deletion
am C- oder N-Terminus.
Die
zulässigen
Deletionen und Additionen in den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
haben den Umfang und die Ausprägung,
welche der zulässigen
Aminosäuredeletionen
bzw.- additionen entsprechen. Über
die Deletion und Addition ganzer Codons hinaus ist auch die Addition
oder Deletion von einzelnen oder paarweisen Basen möglich.
Ein
Fragment einer Nukleinsäure
oder eines Proteins ist ein Teil von dessen Sequenz, das kürzer als Volllänge ist,
jedoch noch einen minimal zur Hybridisierung bzw. spezifischen Bindung
erforderlichen Sequenzabschnitt enthält. Im Falle einer Nukleinsäure ist
dieser Sequenzabschnitt noch in der Lage, mit der nativen Nukleinsäure unter
stringenten Bedingungen zu hybridisieren und umfasst vorzugsweise
mindestens 15 Nukleotide, besonders bevorzugt mindestens 25 Nukleotide.
Im Falle eines Peptids ist dieser Sequenzabschnitt ausreichend,
um eine Bindung eines für
das native Protein spezifischen Antikörpers zu ermöglichen.
„Trunkiert" bezeichnet eine
verkürzte, „elongiert" eine verlängerte Aminosäureoder
Nukleinsäuresequenz.
Eine
bevorzugte erfindungsgemäße Charakterisierung
des natürlichen
atypischep-ANCA-Antigens gemäß Ausführungsform
(1)-(3) umfasst die Herstellung nukleärer Extrakte aus myeloisch
differenzierten Zellen, bevorzugt humanen neutrophilen Granulozyten,
humanen HL-60-Zellen und murinen 32D Myeloid-Zellen. Die isolierten Proteine werden
durch 1- und 2-dimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt. Reaktive
Proteine werden durch Immunoblotting mit atypische-p-ANCA-enthaltenden
Seren und entsprechenden Negativkontrollen ohne atypische p-ANCA
identifiziert. Das Antigen, welches durch atypische p-ANCA erkannt
wird, wird gereinigt und biochemisch sowie hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz
charakterisiert.
Aufbauend
auf den in
US 6,627,458 dargestellten
Untersuchungsergebnissen wurde hierzu für die vorliegende Erfindung
die zweidimensionale Gelelektrophorese optimiert. Hierbei wurden
Kernhüllenextrakte
im Unterschied zum vorangegangenen Verfahren mittels immobilisierter
pH-Gradienten weiter aufgetrennt (vgl. Bsp. 6). Mit diesem Verfahren
konnten gut reproduzierbare Ergebnisse erreicht werden. Es wurden
durch Immunoblotting regelmäßig zwei „Spots" mit einem ungefähren Molekulargewicht
von 50 kD und einem isoelektrischen Punkt zwischen 4,9 und 5,1 identifiziert
(
1), die von der Mehrzahl (>94%) der getesteten
Seren von Patienten mit PSC oder AIH mit atypischen p-ANCA detektiert
wurden (32 von 34 getesteten atypische-p-ANCApositiven Seren, davon
AIH: 26/27 und PSC 6/7; s. Bsp. 6). Keines der Seren von ANCA-negativen
gesunden Kontrollpersonen (n = 5) reagierte mit diesen 50 kD-Proteinen. Auch Seren
von Patienten mit AIH oder PSC und klassischen p-ANCA (n=3) erkannten
das 50 kD-Protein nicht.
Massenspektrometrische
Analysen (z.B. MALDI-TOF) dieser reaktiven Spots im Immunoblot (1C) erlaubten nach Zugriff
auf Proteindatenbanken (z.B. Swiss-Prot; MASCOT), die nachgewiesenen Peptidmassen
mit hoher Wahrscheinlichkeit (Mowse based Probability score 318-780;
erforderlicher Mindest-Score zu Protein-Identifizierung: ≥46) Tubulin-beta
Isotyp 5 (TBB-5) (Swiss-Prot: P05218) zuzuordnen. Dieser Befund war
reproduzierbar, insbesondere auch in unterschiedlichen Massenspektrometrielaboren
(ZMMK, Universität Köln; Swiss-Prot, Genf, Schweiz).
Interessanterweise wurden beide reaktiven Spots unabhängig voneinander als
TBB-5 identifiziert, was posttranslationale Modifikationen des Proteins,
die zu leicht unterschiedlichen pI-Werten führen, wahrscheinlich macht.
Zur
weiteren Bestätigung
des Ergebnisses, dass TBB-5 das Ziel-Antigen von atypischen p-ANCA
ist, wurden Präparationen
von Tubulin aus HL-60 Zellen hergestellt (vgl. Bsp. 4). Diese Präparationen
enthielten Gemische von verschiedenen Tubulinen und Tubulin-bindenden
Proteinen. Nach proteinchemischer Auftrennung der Tubulinfraktionen
mittels ein- und zwei-dimensionaler Gelelektrophorese zeigte sich
erneut bei 94% (32/34; AIH: 26/27, PSC: 6/7) der Seren, die atypische
p-ANCA enthielten, eine Reaktivität mit einem 50 kD schweren,
aziden (pI 4,9-5,1) Protein (2A und 2B). Atypische-p-ANCA-negative Seren oder
Seren mit klassischen p-ANCA erkannten keines der elektrophoretisch
aufgetrennten Tubuline. Massenspektrometrische Analysen in zwei
unabhängigen
Labors bestätigten
eindeutig Tubulin-beta Isotyp 5 als das mit atypische-p-ANCA-positiven Seren
reagierende Protein (2C). Allerdings
umfassten, wie auch schon bei den vorangegangenen massenspektrometrischen
Analysen, die identifizierten Peptide nur 44-50% der Aminosäuresequenz
von TBB-5. Im Bereich des gesamten C-terminalen Endes der Aminosäuresequenz
(Aminosäuren 391-444;
Gesamtaminosäurenzahl:
444) konnten wiederholt keine Peptide sequenziert werden. Dies ist
von Bedeutung, da überwiegend
in diesem Bereich signifikante Unterschiede der Aminosäuresequenz
zwischen den bekannten humanen hochhomologen Tubulin-beta Isotypen
1-5 (>95%) bestehen.
Die exakte Identifizierung der Aminosäuresequenz des Peptids an der
Position Aminosäure
283-297 („Signalpeptid" mit SEQ ID NO:3,
entsprechend der Sequenz ALTVPELTQQVFDAK) erlaubte jedoch die eindeutige
Abgrenzung des mit atypische-p-ANCA-positiven Seren reagierenden
Proteins TBB-5 von den anderen, stark homologen Isotypen von Tubulin-beta
und machte erneut eine Zuordnung zu TBB-5 sehr wahrscheinlich (2C). Allerdings lässt sich nicht mit letzter
Sicherheit ausschließen,
dass es sich bei dem gesuchten Protein um einen spezifischen Isotyp
von Tubulin-beta handelt, der eine hohe Homologie zu TBB-5 aufweist,
sich jedoch in der Aminosäurensequenz
in den bislang nicht identifizierten Bereichen von den Datenbankeinträgen (P05218
Swiss-Prot, NCBI) unterscheidet. Ferner könnte von Bedeutung sein, dass
die beiden in der 2D-Gelelektrophorese
eng nebeneinander liegenden reaktiven Spots einzeln massenspektrometrisch
analysiert wurden und beide gefundenen Peptidsequenzen unabhängig voneinander
TBB-5 entsprachen. Vermutlich sind posttranslationale Modifikationen
des TBB-5 Proteins, die zu gering unterschiedlichen isoelektrischen
Werten von TBB-5 führen,
als Erklärung
für die
zwei gefundenen atypische-p-ANCA-reaktiven Spots anzunehmen. Erste
Hinweise für
eine relevante Phosphorylierung des Proteins liegen vor.
Zusätzlich wurde
die Reaktivität
von atypischen p-ANCA mit TBB-5, jedoch nicht Tubulin-beta Isotyp 1
(TBB-1) gezeigt: die 2D-Gelelektrophorese ergab nahe beieinanderliegende,
aber klar voneinander unterscheidbare reaktive Spots bei Inkubation
der Immunoblots entweder mit Antikörpern gegen TBB-1 oder mit
atypischen p-ANCA (3).
Obwohl die Aminosäuresequenzen
von TBB-1 und TBB-5 fast identisch sind und beide TBB-Isotypen von
HL-60-Zellen in großen
Mengen exprimiert werden, reagierten atypische p-ANCA nur mit TBB-5.
Da der verwendete Antikörper
gegen TBB-1 gegen das carboxyterminale Ende von TBB-1 erzeugt wurde,
das auf Aminosäuren-Sequenzbasis
identisch bei TBB-1 und TBB-5 ist, scheinen posttranslationale Modifikationen
für diese
Unterscheidung verantwortlich zu sein.
Des
weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung die myeloidzell-spezifische
Reaktivität von
Tubulin-beta Isotyp 5 mit atypischen p-ANCA bestätigt, eine wichtige Voraussetzung
dafür,
dass ein Protein als potentiell diagnostisch nutzbares Zielantigen
atypischer p-ANCA fungieren kann. Wie bereits in dem Terminus „antineutrophile
zytoplasmatische Antikörper" zum Ausdruck kommt,
reagieren atypische p-ANCA mit einem Antigen, das spezifisch für neutrophile
Granulozyten bzw. myeloisch-differenzierte Zellen ist. Dabei ist
unklar, ob das gesuchte Protein ausschließlich in diesen Zellen exprimiert
wird und/oder ob die Expression in den übrigen Zellen des jeweiligen
Organismus herunterreguliert ist. Zum Nachweis der myeloidzell-spezifischen
Reaktivität
von TBB-5 mit atypischen p-ANCA wurden Tubulinfraktionen aus verschiedenen
nicht-myeloischen Zellen hergestellt und eine entsprechende Reaktivität mit dem
Immunoblot-Verfahren untersucht. Hierbei zeigte sich keine signifikante
Reaktivität
mit Tubulin-Präparationen
aus nicht-myeloisch differenzierten Zellen, z.B. HeLa-, HepG2-,
Cos7-, NIH3T3-Zellen (4).
Mit Tubulin-Präparationen
aus myeloisch differenzierten Zellen (hier: HL-60) war dagegen eine
deutliche Reaktion atypischer p-ANCA erkennbar. Obgleich die Reaktivität der atypischen
p-ANCA sich hauptsächlich
gegen das 50 kD-Protein in Tubulinextrakten aus HL-60-Zellen richtete,
reagierten 15% (n = 5/34) bzw. 6%(n = 2/34) der Seren mit atypischen
p-ANCA auch mit Proteinen der Tubulinpräparationen aus HeLa-Zellen
bzw. Hep G2-Zellen. Bis auf ein Serum war das Antigen hier ein Protein
mit einer offenbaren Molekülmasse
von 48 kD und wurde durch MS-Fingerprinting als ein komplexes Gemisch
verschiedener Proteine identifiziert, die nicht mit TBB-5 oder anderen
Tubulin-Isotypen verwandt sind. Seren gesunder Kontrollpersonen
zeigten keine spezifische Reaktivität mit den verschiedenen Tubulinpräparationen.
Die
Identifizierung von TBB-5 als Ziel-Antigen von atypischen p-ANCA
ist überraschend,
denn Tubulin-beta ist in fast allen Zellen vorhanden und ist kein
myeloidzell-spezifisches Protein (Dumontet, C. et al., Cell Motil
Cytoskeleton 35:49-58
(1996); Lewis, S.A. et al., J Cell Biol 101:852-861 (1985); Roach,
M. C. et al., Cell Motil Cytoskeleton 39:273-285 (1998); Wang, D.
et al., J. Cell Biol. 1034:1903-1910 (1986)).
Auch
die Fluoreszenzmuster von atypischen p-ANCA nach Affinitätsreinigung
bzw. nach Präabsorption
mit Tubulinextrakten bestätigen
die Reaktion von atypischen p-ANCA mit Tubulinen:
Repräsentative
Seren mit atypischen p-ANCA (PSC n=3, AIH n=5), die mittels Bindung
an das zu TBB-5 homologe Protein aus den Tubulinextrakten von HL-60-Zellen affinitätsgereinigt
worden waren, zeigten das gleiche für atypische p-ANCA charakteristische
Fluoreszenzmuster auf äthanol-fixierten
Granulozyten wie nicht affinitäts-gereinigte
atypische p-ANCA (5A und 5B). Wurden andererseits Seren, die atypische
p-ANCA enthielten, mit Tubulinextrakt aus HL-60-Zellen im Überschuss
präabsorbiert,
war das vor der Präabsorption
bestehende Fluoreszenzmuster atypischer p-ANCA nicht mehr nachweisbar
(5C und 5D).
Das
aus Kernhüllpräparationen
isolierte atypische-p-ANCA-Antigen gemäß Ausführungsform (2) der Erfindung
hat eine offenkundige Molekülmasse
von ca. 50 kD (geschätzt
nach SDS-Gelelektrophorese durch Vergleich mit Molekulargewichtsmarkern)
und einen isoelektrischen Punkt von ca. pH 4,7-5,1 (geschätzt nach isoelektrischer
Fokussierung über
2D-Gelelektrophorese durch Vergleich mit Markern für die isoelektrische
Fokussierung). Dieses Target-Antigen
wird von über
94% der getesteten Patientenseren erkannt, was den in
US 6,627,458 genannten Wert übertrifft.
Das
aus Kernhüllpräparationen
isolierte natürliche
Antigen atypischer p-ANCA gemäß Ausführungsform
(1), (2) oder (3) umfasst vorzugsweise die Teilsequenz SEQ ID NO:3,
und/oder eine oder mehrere der Teilsequenzen ausgewählt aus
SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ
ID NO:25, SEQ ID NO:26 und SEQ ID NO:27, besonders bevorzugt ausgewählt aus
SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 und SEQ ID NO:23. Diese
Teile der Proteinsequenz des atypische-p-ANCA-Antigens wurden durch
massenspektroskopische Methoden ermittelt. Gegenstand der Erfindung
sind auch die Nukleinsäuren,
die Nukleinsäurefragmente
umfassen, welche für
derartige Proteine kodieren, bevorzugt DNA-Sequenzen und cDNA.
Der
Sequenzvergleich mit bekannte Proteinsequenzen ergab, dass Tubulin-beta
Isoform 5 eine hohe Homologie auf Sequenzebene mit dem atypische-p-ANCA-Antigen aufweist
(2C).
Das
Antigen atypischer p-ANCA gemäß Ausführungsform
(1), (2) oder (3) umfasst somit in einer bevorzugten Ausführungsform
die Teilsequenz SEQ ID NO:3, und/oder eine oder mehrere der Teilsequenzen ausgewählt aus
SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24,
SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 und SEQ ID NO:27, besonders bevorzugt
ausgewählt
aus SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 und SEQ ID NO:23. Gegenstand
der Erfindung sind auch die Nukleinsäuren, die Nukleinsäurefragmente
umfassen, welche für
derartige Proteine kodieren, bevorzugt DNA-Sequenzen und cDNA.
In
einem Aspekt von Ausführungsform
(4) ist das Antigen TBB-5 (SEQ ID NO:2) und/oder wird durch eine
DNA mit SEQ ID NO:1 oder von deren substantiell identischen Varianten
codiert.
Bei
dem nativen atypische-p-ANCA-Antigen von Ausführungsform (1) oder (4) kann
es sich entweder um Tubulin-beta Isoform 5 oder ein noch unbekanntes
Tubulin handeln. Dies wurde durch heterologe Expression des Tubulin-beta
Isoform 5 und anschließende
Versuche zur Kreuzreaktivität
des p-ANCA mit diesem Tubulin-beta gezeigt.
In
einem bevorzugten Aspekt der Ausführungsform (1) ist das Antigen
atypischer p-ANCA durch Präparation
einer Tubulinfraktion aus Zellen von Menschen oder Vertebraten erhältlich.
Insbesondere ist es aus Blutzellen, Zellen des Immunsystems, aus
Hepatozyten, Zellen des Gallensystems oder der Darmschleimhaut, besonders
bevorzugt aus myeloisch differenzierten Zellen, ganz besonders bevorzugt
aus neutrophilen Granulozyten oder Granulozytenähnlichen Zellen erhältlich.
Diese Tubulinpräparation
wird insbesondere aus HL-60-Zellen
hergestellt, bevorzugt anschließend
weiter aufgetrennt durch Methoden zur Auftrennung von Proteingemischen,
insbesondere durch 1D- und 2D-Gelelektrophorese,
ganz besonders durch SDS-Gelelektrophorese und Isoelektrische Fokussierung,
oder andere geeignete Methoden zur Reinigung von Proteinen, so dass
ein Antigen atypischer p-ANCA (atypische-p-ANCA-Antigen) aufgereinigt
wird. Dieses atypische-p-ANCA-Antigen wird durch Immunoblotting
mit Antiseren, welche atypische p-ANCA enthalten, oder durch andere
geeignete Methoden, wie z.B. Proteinsequenzierung, identifizert.
Es kann dann zum Nachweis von atypischen p-ANCA, z.B. in Immunoassays
oder ELISA, verwendet werden. Diese Tubulinpräparation ist wesentlich einfacher
als die bislang zur Gewinnung des atypische-p-ANCA-Antigens durchgeführte Kernhüllenpräparation.
Ein
bevorzugter Aspekt der Ausführungsform
(4) ist die Verwendung von rekombinant hergestelltem TBB-5. Für die rekombinante
Herstellung des TBB-5 werden in der Fachwelt übliche Methoden zur rekombinanten
Herstellung eukaryotischer Proteine verwendet, insbesondere die
Expression als Fusionsprotein in eukaryotischen Zellen, ganz besonders
bevorzugt die Expression als Fusionsprotein mit Polyhistidinschwanz und/oder
Xpress-Tag. Des weiteren bevorzugt ist die Verwendung von DNA, die
für TBB-5
codiert, insbesondere von DNA mit SEQ ID NO:1.
Um
die myeloidzell-spezifische cDNA des TBB-5 oder des nativen atypische-p-ANCA-Antigens gemäß Ausführungsform
(7) zu klonieren und das Protein gemäß Ausführungsform (10) rekombinant
herstellen zu können,
können
verschiedene literaturbekannte Verfahren zur heterologen Expression
von eukaryotischer DNA angewandt werden. So wurde für die vorliegende
Erfindung aus HL-60 Zellen mRNA isoliert, durch Einsatz von poly-dT-Primern
revers transkribiert, mittels für
TBB-5 spezifischer Oligonukleotid-Primer (SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15)
für das
C- und N-terminale Ende die TBB-5 Nukleotidsequenz amplifiziert
(Primerdesign auf der Basis des Datenbankeintrages für TBB-5
aus humanem Gehirn, BC007605) und anschließend in einen Expressionsvektor
(z.B. PQE-TrisSystem [Qiagen, Hilden] oder pcDNA3.1/His+/lacZ [Invitrogen,
Karlsruhe]) mit integriertem 6xHistidin- und/oder Xpress-Tag [-Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys]) subkloniert
(vgl. Bsp. 9). Das Ergebnis der Sequenzierung der cDNA entsprach
dem Datenbankeintrag BC007605 für
humanes TBB-5 (Gewebe: Gehirn), SEQ ID NO:1. Somit war bei dieser
Vorgehensweise kein Unterschied zwischen der HL-60-zellspezifischen
cDNA für
TBB-5 und der Nukleotidsequenz von humanem Gehirn nachweisbar. Dies mag
zum einem dadurch begründet
sein, dass bei dem gegenwärtigen
Kenntnisstand nur Primer zur reversen Synthese von TBB-5 cDNA verwendet
werden konnten, die basierend auf einer bekannten Datenbanksequenz entworfen
worden waren. Eine genomische Analyse der Nucleotidsequenz von HL-60
spezifischen TBB-5 ist noch nicht erfolgt. Zum anderen könnte eine
zellspezies-unabhängige
Identität
in der Nukleotidsequenz von TBB-5 auch auf entscheidende posttranslationale
Veränderungen
hinweisen, die für
das jeweilige zell-spezifische TBB-5 charakteristisch sind.
In
Versuchen, TBB-5 in E.coli (Stamm: M15; Qiagen) zu exprimieren,
konnte weder ein exprimiertes Fusionsprotein in Coomassie gefärbten Gelen
noch ein reaktives Protein bei der Immunodetektion mit den für atypische
p-ANCA positiven Seren oder mit Antikörpern, die gegen das Polyhistidin-Tag
bzw. Xpress-Tag gerichtet sind, nachgewiesen werden. Im Unterschied
dazu konnten Kontrollproteine in E.coli (z.B. FtsZ) erfolgreich
exprimiert werden. Alternativ wurde deshalb eine transiente Transfektion
von eukaryotischen Zellen, z.B. Hela-Zellen, Cos7-Zellen, versucht.
Verschiedene Transfektionssysteme, wie z.B. Calciumpräzipitation
und Lipofektion, wurden vergleichend eingesetzt. Eine deutlich bessere
Transfektionseffizienz ergab sich bei Verwendung der Lipofektion.
Allerdings war auch in den eukaryotischen Zellen eine Expression
von Volllängen-TBB-5
anfänglich
quantitativ nur eingeschränkt
und inkonstant möglich,
während
sich TBB-5-Fragmente nachweislich exprimieren ließen. Von
verschiedenen Autoren (Cleveland, D.W., Curr. Opin. Cell Biol. 1:10-14 (1989);
Burke, D, et al., Mol. Cell Biol. 9:1049-1059 (1989)) wird ein toxischer
Effekt von überexprimiertem
Tubulin (z.B. TBB-2 und -3) in transfizierten Hefezellen und/oder
eine „enge" Regulation von Tubulin
berichtet, indem überexprimiertes
Tubulin durch raschen proteolytischen Wiederabbau degradiert wird.
Dies wird von den Autoren als physiologische Reaktion gewertet,
um ein quantitatives Ungleichgewicht von Tubulin-alpha und -beta
bei der Mikrotubulibildung und möglicherweise
daraus resultierende funktionelle Störungen der Zellen zu verhindern.
Aufgrund dieser Beobachtungen stand zu vermuten, dass TBB-5 in voller
Länge nicht
unter allen konventionellen Bedingungen überexprimiert werden kann,
und nur unter bestimmten Expressionsbedingungen zumindest eine eingeschränkte Überexpression
möglich
war. Dies bestätigte
sich im Experiment. Entsprechende proteinchemische Nachweisverfahren
wurden darüberhinaus
im Rahmen der vorliegenden Erfindung unmittelbar an die Proteinexpression
angeschlossen, um eine mögliche
Proteindegradation zu minimieren. Unter diesen Bedingungen war die
Expression und der Nachweis von Volllängen-TBB-5 erfolgreich (6).
Ausgehend
von der Annahme, dass eine Verlängerung
(z.B. durch Fusion mit GFP [grün
fluoreszierendes Protein]) oder Trunkierung der TBB-5 Nukleotidsequenz
die vermutete posttranskriptionelle Inaktivierung des Proteins verhindern
können,
wurden Transformationen sowohl mit trunkierter TBB-5 cDNA (vgl.
Bsp. 10) als auch mit GFP-TBB-5 Volllängen cDNA durchgeführt. Die
Expression von trunkierter TBB-5 cDNA und GFP-TBB-5-Volllängen cDNA
ist erfolgreich durchführbar,
wie 6 zeigt. Die Immunodetektion der
rekombinanten trunkierten TBB-5-Proteine durch atypische p-ANCA
ergab, dass zumindest einige (BB, BP) dieser trunkierten TBB-5 durch
atypische p-ANCA nachweisbar sind (7).
Die Immunreaktivität
von BE, welches in erster Linie das Nterminale Ende von TBB-5 umfasst,
ist gegenwärtig
Gegenstand weiterführender
Untersuchungen. Auch GFP-TBB-5 ist durch atypische p-ANCA nachweisbar
(7).
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind somit gemäß Ausführungsform (4) auch trunkierte TBB-5,
bevorzugt TBB-5, deren Aminosäuresequenz
um 1-220 Aminosäuren,
bevorzugt 1-100 Aminosäuren, besonders
bevorzugt 1-50 Aminosäuren,
auf der N-oder C-terminalen Seite verkürzt ist, besonders bevorzugt TBB-5,
deren Aminosäuresequenz
auf der C-terminalen Seite verkürzt
ist und/oder um ein Protein mit SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 oder SEQ
ID NO:9. Gegenstand der Erfindung sind auch die Nukleinsäuren, die
für derartige
Moleküle
kodieren, bevorzugt DNA, besonders bevorzugt die cDNA mit SEQ ID
NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ- ID NO:8 sowie deren substantiell identische
Varianten.
Gegenstand
der vorliegende Erfindung sind somit gemäß Ausführungsform (4) des weiteren
auch Fusionsproteine, die entweder Volllängen- oder trunkierte TBB-5
enthalten, bevorzugt Fusionsproteine mit wie oben definierten Markerproteinen,
besonders bevorzugt mit GFP und/oder Xpress-Tag oder His-Tag. Ganz besonders
bevorzugt sind von den GFP-Fusionsproteinen diejenigen, die das
GFP am C-Terminus des TBB-5 enthalten, insbesondere GFP-Vollängen-TBB-5 oder SEQ ID
NO:29. Gegenstand der Erfindung sind auch die Nukleinsäuren, die
für derartige
Moleküle
kodieren, bevorzugt DNA, besonders bevorzugt die cDNA für GFP-Vollängen-TBB-5
oder SEQ ID NO:28 sowie deren substantiell identische Varianten.
Ein
weiterer bevorzugter Aspekt der Ausführungsform (4) ist die rekombinante
Herstellung von trunkiertem TBB-5 als Fusionsprotein mit einem Markerprotein
oder einem Peptid, das zur Isolierung des Fusionsproteins genutzt
werden kann. Bevorzugt ist die Verwendung der oben definierten trunkierten
TBB-5. Für
die rekombinante Herstellung werden in der Fachwelt übliche Methoden
zur rekombinanten Herstellung eukaryotischer Proteine verwendet,
insbesondere die Expression als Fusionsprotein in eukaryotischen
Zellen, ganz besonders bevorzugt die Expression als Fusionsprotein
mit GFP, mit einem Polyhistidinschwanz und/oder Xpress-Tag. Des
weiteren bevorzugt ist die Verwendung von DNA, die für derartige
trunkierte TBB-5-Fusionsproteine codiert und deren TBB-5-Protein-Teil
durch die DNA von SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 codiert
wird.
Eine
bevorzugte Ausführungsform
von (1) bis (5) ist die Verwendung von rekombinant hergestelltem atypische-p-ANCA-Antigen
basierend auf der Nukleinsäuresequenz
SEQ ID NO:1, einschließlich
deren substantiell identischen Varianten oder trunkierter oder elonigerter
SEQ ID NO:1. Das erfindungsgemäße Antigen atypischer
p-ANCA kann daher rekombinant hergestellt werden, wodurch eine aufwändige Präparation
der Kernhülle
zur Gewinnung des Antigens unnötig
wird. Diese rekombinante Herstellung erfolgt durch in der Fachwelt übliche Methoden
zur rekombinanten Herstellung eukaryotischen Proteine, bevorzugt
durch die Expression als Fusionsprotein mit einem Peptid, das der
Isolierung des Fusionsproteins dient, ganz besonders bevorzugt die
Expression als Fusionsprotein mit Polyhistidinschwanz oder Xpress-Schwanz.
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
von (1) bis (5) ist die Verwendung von bakteriellem FtsZ (SEQ ID
NO:17) oder von Modifikationen des bakteriellen FtsZ, erhältlich durch
Substitution, Deletion oder Addition von Aminosäuren in der SEQ ID NO:17, als
Antigen. Bevorzugt ist die Verwendung von Modifikationen des bakteriellen
FtsZ, welche die strukturell zu TBB-5 hoch-homologen Bereiche umfassen,
also die Aminosäuresequenz
der Positionen 65-135 von SEQ ID NO:17 (entspricht bei Tubulin-beta
den Aminosäuren 95-175,
Homologie 85-87%), und/oder die Aminosäuresequenz der Positionen 255-300
(entspricht bei Tubulinbeta den Aminosäuren 305-330; Homologie 51-78%).
Besonders bevorzugt sind daneben trunkierte FtsZ, deren Aminosäuresequenz
um 1-180 Aminosäuren, bevorzugt
1-100 Aminosäuren,
besonders bevorzugt 1-70 Aminosäuren,
ganz besonders bevorzugt 1-40 Aminosäuren am N- oder C-Terminus
verkürzt
ist. Des weiteren bevorzugt sind FtsZ-Varianten, in denen der Mittelteil
der SEQ ID NO:17, also die Aminosäuresequenz der Positionen 136-254,
durch Substitution, Addition oder Deletion von Aminosäuren verändert wurde,
wobei 1-40, bevorzugt 1-20 Aminosäuren addiert oder deletiert
werden können.
Gegenstand der Erfindung sind auch die Nukleinsäuren, die für derartige Moleküle kodieren,
bevorzugt DNA, besonders bevorzugt DNA mit SEQ ID NO:16 sowie deren
substantiell identische Varianten.
Nach
rekombinanter Synthese von FtsZ in E.coli (Stamm M15), konnte in
Immunoblot-Bestätigungsexperimenten
eine Reaktivität
von FtsZ mit Seren von Patienten mit AIH, die atypische p-ANCA enthielten, nachgewiesen
werden (9; Bsp. 15).
Diese Reaktivität
wurde nicht mit Seren von gesunden Kontrollpersonen, Patienten mit
alkoholischer Leberzirrhose oder anderen intestinalen Erkrankungen
außer
chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen gefunden.
Zudem
wurden im Rahmen einer Kollaboration Seren von IL-10 „knock-out" Mäusen untersucht,
die ein Tiermodell für
die Colitis ulcerosa (CU) darstellen. Diese IL-10 „knock-out" Mäuse waren
entweder unter keimfreien Bedingungen oder Standardbedingungen gehalten
worden. Hierbei konnte mit den Seren der „keimfrei" gehaltenen IL-10-/- Mäuse bei
der Immunodetektion weder-eine Reaktivität gegen das FtsZ-Protein noch
mit den Proteinen aus den Tubulinpräparationen von HL-60 Zellen
beobachtet werden. Hingegen zeigte sich bei 90% der Seren von IL
10 -/- Tieren mit normaler Keimbesiedelung des Darmes sowohl eine
Reaktion mit dem FtsZ Protein als auch mit dem 50 kD Protein in
der humanen Tubulinpräparation.
Folglich
sind die Ausführungsformen
(1), (4), (5) und (11) der Erfindung auch mit FtsZ der SEQ ID NO:17
oder modifizertem FtsZ, wie oben beschrieben, als Antigen atypischer
p-ANCA durchführbar,
besonders mit rekombinantem FtsZ, ganz besonders bevorzugt mit FtsZ
hergestellt mit Hilfe von E. coli M15 (Quiagen) und/oder unter Verwendung
von DNA mit SEQ ID NO:16.
Ein
bevorzugter Aspekt der erfindungsgemäßen Verwendung von FtsZ ist
die rekombinante Herstellung von FtsZ. Für die rekombinante Herstellung
des FtsZ gemäß Ausführungsform
(10) werden in der Fachwelt übliche
Methoden zur rekombinanten Herstellung bakterieller Proteine verwendet,
insbesondere die Expression als Fusionsprotein nach Proteininduktion
durch Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranosid (IPTG), ganz besonders
bevorzugt die Expression als Fusionsprotein mit Polyhistidinschwanz
und Isolierung über
Bindung des Poly-His-Schwanzes
an Nickel-Austauscherharze. Des weiteren bevorzugt ist die Verwendung
von DNA, die für
FtsZ codiert, insbesondere von DNA mit SEQ ID NO:16.
Ein
weiterer Aspekt der Ausführungsformen
(1), (4), (5) und (11) der Erfindung ist die durch die Erfindung
erstmals belegte Möglichkeit,
nicht nur das native Antigen gegen atypische p-ANCA – das schwierig
und aufwändig
aus Kernhüllpräparationen
zu isolieren ist – sondern
auch Tubulin-beta Isoform 5 oder bakterielles FtsZ oder deren durch
Deletion, Substitution oder Addition von Aminosäure erhältlichen Homologe zum Nachweis
von atypischen p-ANCA zu verwenden. Bevorzugt wird hierfür TBB-5
oder FtsZ eingesetzt. Besonders bevorzugt wird das verwendete Tubulin-beta
5 rekombinant hergestellt oder aus einer Tubulinpräparation
gewonnen bzw. das verwendete FtsZ rekombinant hergestellt. Zur rekombinanten
Herstellung werden bevorzugt DNA-Moleküle mit den für TBB-5
und FtsZ codierenden Sequenzen, insbesondere mit SEQ ID NO:1 bzw.
SEQ ID NO:16, verwendet.
Ausführungsform
(6) umfasst alle in (1) bis (4) definierten Proteine und deren oben
dargestellten Varianten, insbesondere alle nicht-nativen Proteine
und Fusionsproteine, besonders bevorzugt die trunkierten Varianten
von FtsZ und TBB-5 und deren Fusionsproteine. Ganz besonders bevorzugt
sind Proteine mit Aminosäuresequenzen
der SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 und SEQ ID-NO:29. Ausführungsform
(6) umfasst ausdrücklich
nicht die bereits beschriebenen Proteine TBB-5 und FtsZ, insbesondere
nicht TBB-5 mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO:2 oder FtsZ mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:17.
Ausführungsform
(7) umfasst die für
Ausführungsform
(6) codierende DNA, insbesondere die nicht-nativen DNA-Sequenzen.
Zur
Durchführung
der Erfindung gemäß Ausführungsform
(8) sind alle literaturbekannten Vektoren geeignet, welche zur heterologen
Amplifikation oder Expression von DNA verwendet werden. Insbesondere
sind bei Verwendung von cDNA-Strängen,
welche für
TBB-5 oder das native Antigen atypischer p-ANCA codieren oder für deren
erfindungsgemäße Derivate,
Vektoren zur Expression von eukaryotischen Proteinen bevorzugt, ganz
besonders Vektoren, die das heterolog exprimierte Protein mit einem
Polyhistidin-Schwanz oder Xpress-Schwanz
versehen. Die Vektoren gemäß (8), welche
die DNA von FtsZ und dessen erfindungsgemäßen Derivaten tragen, sind
dagegen bevorzugt für
den Einsatz in literaturbekannten prokaryotischen Expressionssystemen
geeignet und ermöglichen
insbesondere die Induktion der Expression durch Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranosid
(IPTG) und/oder die Expression des FtsZ als Fusionsprotein mit Polyhistidinschwanz.
Die
Wirtsorganismen gemäß Ausführungsform
(9) sind im Falle von FtsZ und dessen erfindungsgemäßen Derivaten
bevorzugt Prokaryoten, im Falle von TBB-5 und dessen erfindungsgemäßen Derivaten
für die
Amplifikation der DNA oder der Vektoren bevorzugt Prokaryoten, für die Expression
bevorzugt Eukaryoten oder Hefen. Besonders bevorzugt sind von den
Prokaryoten E. coli-Stämme,
von den Eukaryoten Säugerzellen,
bei letzteren insbesondere HeLa-Zellen und Cos7-Zellen.
Die
Produktion gemäß Ausführungsform
(10) erfolgt nach für
die jeweiligen Expressionssysteme geeigneten Protokollen, bei den
eukaryotischen Zellen entweder durch permanente oder transiente
Transfektion, bevorzugt durch transiente Transfektion. Die Expressionsprodukte
werden anschließend
von den Wirtszellen getrennt und weiter gereinigt, bevorzugt durch
Gelelektrophorese und/oder Affinitätschromatographie
Als
ein Aspekt der Ausführungsformen
(1) bis (5) und (11) kann das erfindungsgemäße atypische-p-ANCA-Antigen
zur Herstellung von hochspezifischen, hochempfindlichen und reproduzierbaren
Assays, besonders Fest phasenassays, zum Nachweis atypischer p-ANCA
verwendet werden. Die Identifizierung und Charakterisierung dieses
Antigens, besonders seiner Sequenzhomologien zu Tubulin-beta Isoform
5, ermöglicht
erstmals die Entwicklung solcher für atypische p-ANCA spezifischen
Festphasenassays, was eine deutliche Verbesserung und vor allem
Vereinfachung gegenüber
den bislang gebräuchlichen
Diagnosemethoden darstellt. Bevorzugt basieren solche Assays auf
dem Prinzip der ELISA-Technik.
Die
Nachweismethode für
atypische p-ANCA gemäß Ausführungsform
(1)-(5) ist ein Verfahren, bei dem eine Probe mit dem Antigen gegen
atypische p-ANCA in Kontakt gebracht wird, so dass in der Probe
vorhandene atypische p-ANCA an das Antigen gegen atypische p-ANCA
gebunden werden, und die gebundenen atypischen p-ANCA oder das gebundene
atypische-p-ANCA-Antigen durch geeignete Methoden nachgewiesen werden.
Diese Verfahren wird bevorzugt in vitro durchgeführt.
Geeignete
Methoden zur Durchführung
des Nachweises von gebundenen atypischen p-ANCA oder gebundenen
atypische-p-ANCA-Antigenen sind gemäß Ausführungsform (5) bevorzugt immunologische
Methoden. Insbesondere kann die erfindungsgemäße quantitative Bestimmung
der Konzentration von atypischen p-ANCA in einer Probe mit Hilfe
eines Immunoassays, besonders bevorzugt eines ELISAs erfolgen, und/oder sie
umfasst den Abgleich mit einer Standardkonzentration an atypischen
p-ANCA.
Ein
solches Verfahren umfasst somit beispielsweise als ersten Schritt
die Herstellung der zu testenden Probe, zum Beispiel durch Entnahme
einer Körperflüssigkeit,
vor allem Blut, und deren Aufbereitung, besonders die Gewinnung
von Serum. Im zweiten Schritt wird die Probe mit dem atypische-p-ANCA-Antigen in Kontakt
gebracht, welches bevorzugt auf einer festen Phase gebunden vorliegt.
Nach Inkubation wird der Überstand
entfernt. Die Menge der über
das Antigen an das Trägermaterial
gebundenen atypischen p-ANCA kann dann durch reproduzierbare und
literaturbekannte Immunoassay-Methoden, wie zum Beispiel ELISA,
bestimmt werden.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
von (1) bis (5) wird ein spezifisches sekundäres Agenz verwendet, das ein
Epitop des atypischen p-ANCA erkennt und bindet, ohne dessen Fähigkeit
zur Bindung des atypische-p-ANCA-Antigens zu beeinträchtigen.
Sekundäre
Agenzien umfassen bevorzugt Antikörper (sekundäre Antikörper). Als
sekundäre
Antikörper
können
insbesondere monoklonale oder polyklonale Antikörper eingesetzt werden. Besonders
bevorzugt sind dabei polyklonale Antikörper. Sekundäre Antikörper sind
humane, murine, Ratten-, Kaninchen-, Schaf-, Ziegen- oder Schweineantikörper, bevorzugt
Ziegen- oder Schafantikörper.
Die sekundären
Agenzien können
an ein Detektorreagenz, welches die Detektion des Agenz sowie die quantitative
und qualitative Auswertung der Bindung des sekundären Agenz
ermöglicht,
insbesondere ausgewählt
aus Enzymen, Fluoreszenzfarbstoffen und Radioisotopen, besonders
bevorzugt Meerettich-Peroxidase oder Fluorescein, gekoppelt sein.
Als funktionale Verbindungen kommen auch Teile eines Immunbindungspaares
(z.B. von Biotin/Streptavidin u.s.w.), magnetic beads, und weitere
funktionale Verbindungen infrage, welche die Detektion der Bindung
eines sekundären
Agenz an atypische p-ANCA ermöglichen
und/oder der Isolierung des sekundären Agenz oder eines Konjugats
aus sekundärem
Agenz und atypischen p-ANCA dienen. Besonders bevorzugt ist als
sekundäres
Agenz ein polyklonaler Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierter Ziege-anti-Mensch-IgG
oder ein Meerettichperoxidase-gekoppelter Schaf-anti-Mensch-IgG,
insbesondere der entsprechende IgG(H+L).
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
von (1) bis (5) ist das atypischep-ANCA-Antigen durch geeignete
Methoden zur Immobilisierung an ein Trägermaterial gekoppelt. Derartige
geeignete Immobilisierungsmethoden umfassen adäquate Kupplungstechniken, welche
die Spezifität
des Antigens nicht verändern, wie
z.B. die kovalente Vernetzung des Antigens mit dem Trägermaterial.
Eine alternative bevorzugte Ausführungsform
ist die Immobilisierung des Antigens an ein Trägermaterial durch Wechselwirkung
mit dem erfindungsgemäßen sekundären Antikörper.
Die
Diagnoseverfahren gemäß der Ausführungsform
(12) können
in vivo und in vitro durchgeführt
werden, bevorzugt jedoch in vitro. Bevorzugt verwendet wird für die Verwendung
gemäß Ausführungsform
(12) ein atypische-p-ANCA-Antigen gemäß Ausführungsform (6), insbesondere
natives atypische-p-ANCA-Antigen, Tubulin-beta Isoform 5 oder FtsZ
sowie deren trunkierte Varianten. Das atypische-p-ANCA-Antigen kann
dabei aus Quellen gereinigt worden sein, in denen es natürlich vorkommt,
oder rekombinant hergestellt worden sein. Bevorzugt wird rekombinantes
Antigen verwendet.
Der
Kit gemäß Ausführungsform
(11) kann neben dem in Ausführungsform
(6) definierten Protein eine Stammkultur der Zelllinie zur Produktion
dieses Proteins enthalten. Des weiteren bevorzugt enthält dieser
Kit bakterielles FtsZ, TBB-5, elongiertes oder trunkiertes TBB-5
und/oder eine Stammkultur von Zellen, die zur rekombinanten Produktion
von FtsZ, TBB-5, elongiertem oder trunkiertem TBB-5 geeignet sind.
Neben diesen Komponenten kann der Kit weiterhin ein wie vorstehen
definiertes sekundäres
Agenz, bevorzugt einen wie vorstehend definierten sekundären Antikörper, Mittel
zur Detektion der Bindung von atypischen p-ANCA über das Antigen an das sekundäre Agenz,
Puffer und/oder Kulturmedien umfassen.
Eine
bevorzugte Verwendung des atypische-p-ANCA-Antigens gemäß Ausführungsform
(12) ist sein Einsatz zum Nachweis von chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen, besonders Colitis ulcerosa und/oder Morbus Crohn,
und/oder autoimmunen Lebererkrankungen, besonders autoimmuner Hepatitis
und/oder primär
sklerosierender Cholangitis, insbesondere von AIH und primär sklerosierender
Cholangitis (PSC). Es wurde nämlich überraschend
gefunden, dass atypische p-ANCA die einzigen relevanten Seromarker
im diagnostischen Armentarium für
PSC sind. Atypische p-ANCA traten mit hoher Prävalenz in PSC-Patientenseren auf (94%).
Bis auf ein getestetes Serum zeigten alle p-ANCApositiven Seren
der Patienten (97%) ein atypisches p-ANCA-Fluoreszenzmuster mit
Median-Serumtitern von 1:320. Lediglich atypische p-ANCA erwiesen
sich als diagnostisch relevante Seromarker für PSC im Vergleich mit anderen
Antikörpern
wie z.B. antinukleären
Antikörpern
(ANA) und Antikörpern
gegen glatte Muskeln (SMA) (Tab. 3 und 4; Bsp. 16).
Eine
weitere bevorzugte Verwendung des atypische-p-ANCA-Antigens gemäß Ausführungsform
(12) ist sein Einsatz zur Diagnose von autoimmuner Hepatitis (AIH).
Atypische p-ANCA wurden als Seromarker mit der höchsten diagnostischen Präzision für die Diagnose
von AIH identifiziert (Tab. 3 und 4, Bsp. 16).
Die
Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Diese
schränken
den Schutzbereich der Erfindung jedoch nicht ein.
