DE102004036840B4

DE102004036840B4 - Verfahren und Mittel zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma

Info

Publication number: DE102004036840B4
Application number: DE102004036840A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Wehling Peter; Dr. Reinecke Julio
Original assignee: Orthogen AG
Current assignee: Orthogen AG
Priority date: 2004-07-29
Filing date: 2004-07-29
Publication date: 2012-04-19
Anticipated expiration: 2024-07-30
Also published as: WO2006013069A2; US20080286379A1; DE102004036840A1; AU2005268914A1; WO2006013069A3; EP1773426A2

Abstract

Verfahren und Mittel zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma („platelet rich plasma”, PRP), welches insbesondere einen hohen Gehalt an insbesondere aktivierten Thrombocyten aufweist und welches insbesondere leicht coagulierbar ist, aus Vollblut.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma („platelet rich plasma”, PRP), das einen hohen Gehalt an Thrombocyten aufweist und welches insbesondere leicht gelierbar ist, aus Vollblut.
Thrombocytenreiches Plasma (PRP) wird in der Medizin unter anderem genutzt in der Behandlung von Wunden, zur Unterstützung der Knochenheilung, zur Blutstillung, insbesondere in der plastischen Chirurgie, etc. Dabei steht die Aufbereitung und der Einsatz von autologem thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut im Vordergrund.
Thrombocyten in thrombocytenreichem Plasma zeichnen sich insbesondere durch ihren hohen Gehalt an Proteinen, insbesondere Wachstumsfaktoren und Cytokinen aus, die bei entsprechender Behandlung aus den Thrombocyten freigesetzt werden können. Bei den Wachstumsfaktoren und Cytokinen handelt es sich im Wesentlichen um PDGF („platelet derived growth factor”), TGF („transforming growth factor”), VEGF („vascular endothelial growth factor”) und EGF („epithelial growth factor”). Diese Substanzen besitzen eine Vielzahl von positiven Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit, insbesondere die Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen des tierischen und menschlichen Körpers. Das Interesse der Medizin an Verfahren zur konzentrierten Gewinnung von Thrombocyten oder thrombocytenreichem Plasma ist daher groß.
Im Wesentlichen besteht der medizinische Nutzen von autologem thrombocytenreichem Plasma neben seiner Eigenschaft, eine reiche Quelle für verschiedene heilungsfördernde Wachstumsfaktoren und Cytokine darzustellen, in der Förderung einer beschleunigten Wundheilung in allen Geweben, in der Förderung einer höheren Kollagenkonzentration in heilenden Wunden, was insbesondere zu höherer Narbenfestigkeit führt, in der Förderung beschleunigter Gefäßneubildung, in der Förderung einer reduzierten Knochenreifungsdauer, in der Förderung einer erhöhten lokalen Knochendichte, in der Förderung teilweise reduzierter postoperativer Schmerzen und in der Förderung geringerer Wundinfektionsraten. Dabei ist bei der Gewinnung des thrombocytenreichen Plasmas aus autologem Vollblut insbesondere auch die Gefahr der Krankheitsübertragung von fremden Organismen gebannt.
Eine bekannte Technik für die Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut ist in der WO 00/61256 und in der WO 01/83068 der Firma Harvest Technologies Co. beschrieben, wobei eine Vorrichtung mit zwei kommunizierenden Gefäße eingesetzt wird und zur Präparation des thrombocytenreichen Plasmas das erste Gefäß mit entnommenem Vollblut gefüllt wird, durch Zentrifugation ein erythrocytenreiches Pellet und ein die Thrombocyten enthaltender Plasmaüberstand davon automatisch durch die Anordnung eines Schwimmers innerhalb des Gefäßsystems während der Zentrifugation abgetrennt wird. Ein schwankender Hämatokrit kann dabei nicht kompensiert werden. In einem zweiten Zentrifugationsschritt werden Plasma und eine thrombocytenreiche Fraktion voneinander getrennt und anschließend der Plasmaüberstand teilweise entnommen und das Thrombocytenpellet in einem verbleibenden Plasmaanteil resuspendiert, um ein thrombocytenreiches Plasma zu erhalten.
Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut wird in der WO 00/54825 beziehungsweise der US 6,325,750 B1 der Firma Implant Innovations Inc. beschrieben, worin ein System mit zwei über eine Überleitung kommunizierenden elastischen Beuteln in einem Becher eingesetzt wird. Das in den einen Beutel applizierte Vollblut wird zentrifugiert und anschließend mittels Injizieren einer festen Luftmenge in das Volumen zwischen elastischer Gefäßwand und fester Becherwand der thrombocytenhaltige Plasmaüberstand vom erythrocytenreichen Pellet abgetrennt und in den zweiten elastischen Beutel überführt. Auch hier werden in einem zweiten Zentrifugationsschritt Plasma und eine thrombocytenreiche Fraktion voneinander getrennt, der Plasmaüberstand teilweise entnommen und das Thrombocytenpellet in einem verbleibenden Plasmaanteil resuspendiert, um ein thrombocytenreiches Plasma zu erhalten.
Die bekannten Technologien und Verfahren zur Gewinnung von autologem thrombocytenreichem Plasma können eine konstante und hohe Ausbeute und Qualität nicht bieten. Die Schwankungen in Ausbeute und Qualität sind zurückzuführen auf die Variabilität des Hämatokrits des entnommenen Vollbluts. Der Hämatokrit, das heißt der Volumenanteil der zellulären Bestandteile des Gesamtvolumens des Vollbluts, kann interindividuell erheblich schwanken, beispielsweise von 35 bis 50%. Die bestehenden Systeme zur Herstellung von frischen Thrombocytenkonzentraten sind nicht in der Lage, diese Variabilität des Hämatokrit zu kompensieren. Folglich schwankt die Qualität des Endproduktes im Hinblick auf die Ausbeute und die Qualität des erhaltenen thrombocytenreichen Plasmas beträchtlich.
Eine weitere Ursache für die Schwankungen in der Ausbeute und Qualität ist das teilweise erhebliche Zeitintervall zwischen Blutabnahme und Präparation des thrombocytenreichen Plasmas. Bei der üblichen Herstellung in Blutbanken ist die Zeitspanne zwischen Herstellung und Verwendung zu groß, um eine akzeptable Ausbeute an aktiven Wachstumsfaktoren zu ermöglichen. Üblicherweise werden für die Präparation mindestens 500 ml Vollblut benötigt. Dies bedeutet, dass für eine autologes Präparat der Patient mindestens 5 Tage vorher Blut spenden muss, um seine körperliche Belastung gering zu halten. Die dann notwendige Lagerung führt unweigerlich zu einer Verringerung der Qualität.
Es Ist daher wünschenswert, thrombocytenreiches Plasma autolog und möglichst vor Ort und frisch, sowie unter stets sterilen Bedingungen, bei gleicher konstanter Ausbeute herstellen zu können. Es ist außerdem wünschenswert, ein thrombocytenreiches Plasma hoher Qualität zu erhalten, welches eine große Menge an nützlichen Proteinen wie Wachstumsfaktoren und Cytokinen bildet und einen hohen Anteil an Thrombocyten aufweist.
Darüber hinaus wird thrombocytenreiches Plasma für eine Reihe von Anwendungen vermehrt als koaguliertes thrombocytenreiches Gel eingesetzt. Die mechanische Festigkeit des Gels ist dabei entscheidend für dessen Effektivität und Wirksamkeit bei diesem Einsatz. Es zeigt sich aber, dass das mit bekannten Verfahren erhältliche thrombocytenreiche Plasma auch eine geringe Qualität bezüglich seiner Koagulierbarkeit aufweist. Es ist daher auch wünschenswert, thrombocytenreiches Plasma zu erhalten, welches eine hohe Koagulierbarkeit aufweist und zu einem besser einsetzbaren thrombocytenreichen Gel koaguliert werden kann.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht im Wesentlichen darin, ein Verfahren und Mittel zur Gewinnung von thrombocytenreichen Plasma aus Vollblut bereitzustellen, das die Nachteile im Stand der Technik überwindet, wobei das gewonnene thrombocytenreiche Plasma reich an, insbesondere aktivierten, Thrombocyten ist und/oder eine verbesserte Koagulierbarkeit aufweist.
Die vorliegende Erfindung wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung von an Thrombocyten reichem Plasma aus Vollblut, wobei in einem ersten Schritt a) das Vollblut aufgetrennt wird in mindestens eine erythrocytenhaltige Fraktion und in eine Plasmafraktion, welche die Thrombocyten enthält und im Wesentlichen erythrocytenfrei ist, in einem zweiten Schritt b) das thrombocytenhaltige Plasma von der erythrocytenhaltigen Fraktion getrennt wird, in einem weiteren Schritt c) das thrombocytenhaltige Plasma, bevorzugt mittels Zentrifugation, in eine thrombocytenhaltige Fraktion, die vorzugsweise neben den Thrombocyten außerdem kernhaltige Zellen, das heißt mononucleäre Zellen („buffy coat”) aufweist und/oder insbesondere als Pellet vorliegt, wobei vorzugsweise unmittelbar über dem gebildeten Pellet teilweise noch weitere Thrombocyten suspendiert im Plasma vorliegen, und in einen Überstand aus thrombocytenarmem Plasma aufgetrennt wird, in einem weiteren Schritt d) der gewonnene Überstand aus thrombocytenarmen Plasma, bevorzugt mittels einer Spritze, entnommen wird, in einem weiteren Schritt e) das entnommene thrombocytenarme Plasma durchmischt wird, in einem weiteren Schritt f) durchmischtes thrombocytenarmes Plasma in die Thrombocyten-Fraktion zurückgegeben, das heißt reappliziert, wird, in einem weiteren Schritt g) die Thrombocyten-Fraktion in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma suspendiert wird, insbesondere durch Durchmischen, bevorzugt durch mechanisches Durchmischen, und in einem weiteren Schritt h) die in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma resuspendierte Thrombocyten-Fraktion als an Thrombocyten reiches Plasma, insbesondere als an aktivierten Thrombocyten reiches Plasma, gewonnen wird.
Die Erfinder fanden überraschend, dass insbesondere durch die Reapplikation von zuvor entnommenen und nach der Entnahme durchmischten Plasmaüberstand eine deutlich gesteigerte Thrombocytenaktivierung erfolgt. Die Erfinder fanden weiter überraschend, dass insbesondere durch die Reapplikation von zuvor entnommenen und nach der Entnahme durchmischten Plasmaüberstand ein thrombocytenreiches Plasma gewonnen wird, das eine deutlich verbesserte Koagulierbarkeit aufweist. Ohne auf die Theorie beschränkt zu sein, ist dieser Effekt eventuell darauf zurückzuführen, dass durch diesen erfindungsgemäßen Verfahrensschritt die Thrombocyten in einem Plasma resuspendiert werden, welches alle Plasmabestandteile, hochmolekulare und niedermolekulare, in physiologisch richtiger Zusammensetzung enthält. Dadurch sind auch die für die anschließende Koagulierung wichtigen Gerinnungsfaktoren in dem erfindungsgemäß erhaltenen thrombocytenreichen Plasma enthalten, wodurch dieses leichter koaguliert werden kann und ein verbessertes thrombocytenreiches Gel gewonnen werden kann.
Die bekannten Verfahren leisten dies nicht, da hier zur Gewinnung eines thrombocytenreichen Plasmas lediglich ein Teil des Plasmas aus dem Überstand abgezogen wird, während ein Plasmarest, enthaltend insbesondere hochmolekulare Anteile, mit der Thrombocyten-Fraktion vermischt wird.
Die Erfindung sieht vor, dass, insbesondere autologes, und insbesondere venöses, Vollblut einem Patienten entnommen wird und unmittelbar anschließend aus diesem Blut mindestens eine erythrocytenreiche Fraktion von dem die Thrombocyten und vorzugsweise den „buffy coat” enthaltenden Plasma, das heißt von mindestens einer überwiegend Thrombocyten und mononucleäre Zellen enthaltenden Fraktion abgetrennt wird. Dazu wird das in ein Gefäß, insbesondere elastisches Gefäß, bevorzugt einen elastischen Beutel, eingebrachte Vollblut mittels Zentrifugation, bevorzugt bei von 1500 bis 3500 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise von 2000 bis 2800 Umdrehungen pro Minute, über einen bevorzugten Zeitraum von 1,5 bis 4 Minuten aufgetrennt und in dem Gefäß eine erythrocytenreiche, insbesondere erythrocytenhaltige Fraktion als Pellet am Boden des Gefäßes und mindestens eine die Thrombocyten und bevorzugt mononuleäre Zellen enthaltende „buffy coat”-Fraktion als Überstand erhalten. Es entstehen also mindestens drei Fraktionen: Eine erythrocytenhaltige Fraktion, welche rot erscheint, eine thrombocytenhaltige „buffy coat”-Fraktion, welche als weiße, visköse und dünne Schicht erscheint, und ein gelb bis orange erscheinender Überstand aus Plasma.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das in dem Gefäß, insbesondere dem elastischen Beutel, durch die Zentrifugation fraktionierte Vollblut durch Aufrollen und/oder Ausstreichen des Gefäßes derart mechanisch beaufschlagt, dass der Überstand aus Plasma zusammen mit der thrombocytenhaltigen „buffy coat”-Fraktion, welche sich im oberen Abschnitt des Gefäßes befinden, aus dem ersten Gefäß herausgepresst wird und insbesondere über eine Überführungsleitung, welche mit einem zweiten Gefäß, insbesondere einem elastischen Gefäß, insbesondere einem elastischen Beutel, verbunden ist, in dieses überführt wird, wobei das erythrocytenhaltige Pellet in dem ersten Gefäß verbleibt. Erfindungsgemäß ist dabei vorgesehen, die erythrocytenhaltige Fraktion in Abhängigkeit vom Hämatokrit des entnommenen Vollbluts abzutrennen. Bevorzugt erfolgt die Anpassung dadurch, dass das Auspressen des Überstandes aus dem ersten Gefäß, insbesondere durch Aufrollen und/oder Ausstreichen, solange fortgesetzt wird, bis zum einem der Plasmaüberstand weitgehend überführt ist und die erythrocytenhaltige Fraktion, das heißt das erythrocytenhaltige Pellet, am oberen Ende des Gefäßes lokalisiert ist. Durch die erfindungsgemäß besonders bevorzugte Ausführung des ersten Gefäßes und/oder der Überführungsleitung aus optisch durchlässigem Material lässt sich der beginnende Übertritt einer erythrocytenhaltigen Fraktion, und damit das Ende des Überführungsvorgangs, am Erscheinen von Erythrocyten am oberen Ende des ersten Gefäßes und/oder in der Überführungsleitung detektieren. Die Erfindung macht sich die Eigenschaften von Erythrocyten zunutze, insbesondere im sichtbaren Bereich des Lichts Lichtenergie zu absorbieren, insbesondere durch eine Rot- bis Blaufärbung in Erscheinung zu treten. Die Gegenwart von Erythrocyten am oberen Ende des ersten Gefäßes und/oder in der Überführungsleitung wird erfindungsgemäß bevorzugt durch geeignete Detektoren oder Zähler in an sich bekannter Weise und/oder durch einfache Sichtkontrolle festgestellt und dann der Überführungsvorgang gestoppt. Auf diese Weise wird erfindungsgemäß vorteilhaft erreicht, dass in jedem Fall und unabhängig vom vorliegenden individuellen Hämatokrit die größtmögliche Menge an Thrombocyten aus dem Vollblut gewonnen wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird daher unter der Formulierung „kontrolliertes Überführen” derjenige Vorgang des Überführens des Überstands aus thrombocytenhaltigem Plasma aus zentrifugiertem, fraktioniertem Vollblut verstanden, welcher in Abhängigkeit vom individuell vorliegenden Hämatokrit des eingesetzten Vollbluts der Vorgang des Überführens des Plasmaüberstands im Augenblick der detektierbaren beginnenden Überführung einer erythrocytenhaltigen Fraktion gestoppt wird. Die beginnende Überführung einer erythrocytenhaltigen Fraktion ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass ein detektierbarer Anteil von Erythrocyten am oberen Ende des ersten Gefäßes und/oder in der Überführungsleitung vorliegt. Es wird bevorzugt, alle Thrombocyten in das zweite Gefäß zu überführen, als eine besonders reine, das heißt von Erythrocyten freie, Thrombocytenfraktion zu erhalten.
Die Erfindung sieht weiter vor, dass in weiteren Verfahrensschritten das überführte und von der erythrocytenhaltigen Fraktion abgetrennte thrombocytenhaltige Plasma vorzugsweise durch Zentrifugation bei von 2900 bis 5000 Umdrehungen pro Minute, bevorzugt von 3200 Umdrehungen pro Minute, über einen Zeitraum von 10 bis 20 Minuten, bevorzugt von 15 Minuten, in eine Thrombocytenfraktion, die, vorzugsweise zusammen mit monoculeären Zellen, insbesondere als Pellet vorliegt, und in einen thrombocytenarmen Plasmaüberstand fraktioniert wird. Erfindungsgemäß wird thrombocytenarmes Plasma, insbesondere über eine Öffnung am oberen Abschnitt des zweiten Gefäßes, insbesondere des elastischen Beutels, worin die Auftrennung des thrombocytenhaltigen Plasmas erfolgt ist, entnommen, so dass die, vorzugsweise als Pellet vorliegende, Thrombocytenfraktion in dem zweiten Gefäß verbleibt. In einer Variante wird das thrombocytenarme Plasma vollständig und/oder im Wesentlichen vollständig entnommen. In einer alternativen Variante werden bis zu 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 20%, 10% des thrombocytenarmen Plasmas entnommen. In einer besonders bevorzugten Variante wird das thrombocytenarme Plasma in einer Menge entnommen, die in Abhängigkeit von dem individuellen Hämatokrit des eingesetzten Vollbluts gewählt wird.
Nach der Trennung von Thrombocyten und Plasma ist das Plasma stratifiziert, das heißt insbesondere in dem oberen Teil des Plasmas befinden sich kleine Bestandteile und im unteren Teil des Plasmas befinden sich größere Bestandteile, wird nun, wie in bekannten Verfahren, nach der Zentrifugation nur der obere Teil des Plasmas abgenommen, ist das mit der Thrombocyten-Fraktion verbleibende Plasma unnatürlicherweise an hochmolekularen Bestandteilen angereichert. Erfindungsgemäß wird das entnommene thrombocytenarme Plasma, vorzugsweise in dem zur Entnahme verwendeten Mittel, insbesondere einer Spritze, mechanisch durchmischt. Dadurch wird erfindungsgemäß vorteilhaft erreicht, dass sich die durch die vorausgehende Zentrifugation aufgetrennten Plasmabestandteile wieder vermischen, so dass sich eine weitgehend physiologische Zusammensetzung des Plasmas einstellt, das heißt ein Plasma gewonnen wird, welches eine homogene Zusammensetzung von natürlich vorkommenden Plasma aufweist. In einem weiteren erfindungsgemäßen Schritt wird das entnommene und durchmischte thrombocytenarme Plasma zu der Thrombocyten-Fraktion, also insbesondere in das die Thrombocyten-Fraktion enthaltende zweite Gefäß, zurückgegeben, das heißt reappliziert, und anschließend die Thrombocyten-Fraktion mit dem zurückgegebenen Plasma vermischt und dadurch resuspendiert wird. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die Resuspension durch mechanische Durchmischung der Thrombocyten-Fraktion aus dem reapplizierten Plasma. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, die Resuspension in dem zweiten Gefäß, welches bevorzugt als elastischer Beutel ausgeführt ist, durchzuführen, wobei der Inhalt des zweiten Gefäßes durch bevorzugt manuelle, mechanische Beaufschlagung der elastischen Gefäßwände, insbesondere durch Massieren, vermischt wird. Dadurch wird erfindungsgemäß vorteilhaft erreicht, dass die mechanische Belastung der mechanisch empfindlichen Thrombocyten auf ein Mindestmaß reduziert wird, was die Gewinnung eines insbesondere an aktivierten Thrombocyten reichen Plasmas fördert. Das insbesondere an aktivierten Thrombocyten reiche Plasmas wird dann durch Überführen beziehungsweise Aufnehmen der in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma resuspendierten Thrombocytenfraktion gewonnen.
Erfindungsgemäß ist bevorzugt vorgesehen, das gewonnene thrombocytenreiche Plasma in einem weiteren Schritt i) mit mindestens einem Koagulanz, das heißt einem Gerinnungsmittel, zu versehen, so dass es zu einer Koagulation des Plasmas kommt und ein insbesondere an aktivierten Thrombocyten und/oder Wachstumsfaktoren reiches Gel gewonnen wird. Die Bildung dieses Gels wird dadurch stark gefördert, dass die angemessene Konzentration und das angemessene Verhältnis aller relevanten Gerinnungsfaktoren, welche naturgemäß im Plasma vorhanden sind, in dem erfindungsgemäß gewonnenen thrombocytenreichen Plasma vorliegen.
Sowohl das erfindungsgemäß erhaltene thrombocytenreiche Plasma als auch das erfindungsgemäß bevorzugt erhaltene thrombocytenreiche Gel weisen gegenüber dem mittels bekannter Verfahren gewonnenen thrombocytenreichen Plasma eine deutlich verstärkte Bildung beziehungsweise Konzentration an Proteinen wie Wachstumsfaktoren und/oder Cytokinen in den enthaltenen Thrombocyten auf. Insbesondere in Abhängigkeit von der Qualität der gewonnenen Thrombocyten und/oder des Koagulanz kommt es zu einem Platzen von Thrombocyten, wodurch bei der Gelbildung die Wachstumsfaktoren beziehungsweise Cytokine freigesetzt werden. Nachgewiesenermaßen werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung folgende Wachstumsfaktoren beziehungsweise Cytokine in dem erfindungsgemäß erhaltenen thrombocytenreichen Plasma und insbesondere im daraus gewonnenen thrombocytenreichen Gel verstärkt gebildet: Die Wachstumsfaktoren PDGF, TGF-β, HGF, FGF-II und IGF-I sowie das entzündungshemmende IL-1ra. TNF-α und IL-1β sind Inflammationsmarker, die hingegen kaum erhöht sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch das mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte insbesondere an aktivierten Thrombocyten reiche Plasma und das daraus, insbesondere durch Koagulation mit einem Koagulans, gebildete Gel. Aufgrund ihrer vorteilhaften Eigenschaften dienen das erfindungsgemäß erhaltene thrombocytenreiche Plasma beziehungsweise Gel der Prophylaxe und/oder Therapie beziehungsweise Heilung einer Vielzahl von Erkrankungen.
Da das erfindungsgemäße thrombocytenreiche Plasma beziehungsweise Gel besonders vorteilhaft eine hohe Leukocytenkonzentration aufweist, wird dieses bevorzugt eingesetzt, um die Infektionsgefahr bei der Behandlung zu reduzieren. Weiter weist das erfindungsgemäße thrombocytenreiche Plasma beziehungsweise Gel besonders vorteilhaft eine hohe Konzentration an dendritischen Zellen auf.
Die Erfinder fanden weiter überraschend, dass das erfindungsgemäß erhaltene thrombocytenreiche Plasma beziehungsweise Gel, wenn es mit beispielsweise autologen Knochenspänen und/oder Knochenersatzstoff, beispielsweise Hydroxylapatit, vermischt wird, einen besonders vorteilhaften Kitt” zur Füllung und/oder Wiederherstellung von Knochendefekten ergibt. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung des erfindungsgemäß erhaltenen thrombocytenreichen Plasmas beziehungsweise Gels zur Füllung oder Wiederherstellung von Knochendefekten in Verbindung mit Knochenspänen und/oder Knochenersatzstoffen.
Weiter zeigte sich überraschend, dass das erfindungsgemäß erhaltene thrombocytenreiche Plasma beziehungsweise Gel die Bildung von Zwischenzellmatrix beschleunigt, was beispielsweise, besonders vorteilhaft, zu einem früheren Wundverschluss führt. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen thrombocytenreichen Plasmas beziehungsweise Gels zur Beschleunigung des Wundverschlusses.
Die klinischen Einsatzgebiete des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäß erhältlichen thrombocytenreichen Plasmas beziehungsweise Gels sind vielfältig. Sie umfassen die Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, die Orthopädie, die plastische und rekonstruktive Chirurgie sowie die Dermatologie. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen thrombocytenreichen Plasmas beziehungsweise Gels zur Beschleunigung und/oder Unterstützung der Heilung diabetischer Ulzerationen, insbesondere an den unteren Extremitäten beziehungsweise zur Herstellung entsprechender pharmazeutischer Präparate.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen thrombocytenreichen Plasmas und/oder Gels zur Beschleunigung der Regeneration von Knochen, Knorpeldefekten, Endothel, Epithel und/oder Epidermis; zur Stimulation der Gefäßneubildung; zur Verstärkung der Collagen-Synthese; zur Beschleunigung der Heilung von Weichgeweben; zur Verringerung der Narbenbildung; zur Erleichterung der Blutstillung; zur Linderung und/oder Umkehrung der negativen Effekte von Cortikoiden auf die Wundheilung; beim Auffüllen von Knorpeldefekten bei der autologen Knorpeltransplantation (ACT), wo eine Matrix mit Knorpelzellen auf den Defekt geklebt wird, beziehungsweise die Verwendung des genannten Plasmas oder Gels zur Herstellung entsprechender pharmazeutischer Präparate.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung, insbesondere ein Beutelsystem, das bevorzugt zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden kann. Diese umfasst mindestens ein Primärgefäß (10) und mindestens ein Sekundärgefäß (30), welche ein kommunizierendes Gefäßsystem bilden. Primärgefäß (10) und Sekundärgefäß (30) stehen über mindestens eine, insbesondere verschließbare, Überleitung (20) in Verbindung. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Primärgefäß” ein Gefäß, das heißt Behälter, verstanden, worin die in ihre Einzelkomponenten aufzutrennende Flüssigkeit oder Suspension eingebracht wird oder vorliegt und einer ersten Fraktionierung unterzogen wird. Unter einem „Sekundärgefäß” wird ein Gefäß, das heißt Behälter, verstanden, worin die vollständig oder teilweise im Primärgefäß in ihre Einzelkomponenten aufgetrennte Flüssigkeit oder Suspension vollständig oder teilweise, das heißt einzelne Fraktionen davon, eingebracht wird und diese im Sekundärgefäß einer zweiten Fraktionierung unterzogen wird. Erfindungsgemäß ist jedes dieser Gefäße mit jeweils mindestens einer, insbesondere verschließbaren, Ab- und/oder Zuleitung (11, 31), insbesondere zur Zuführung, das heißt Einführen beziehungsweise Reapplikation, von Blutkomponenten und/oder Abführen, das heißt Entnehmen, von Blutkomponenten vorgesehen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind Primärgefäß (10), Sekundärgefäß (30) und Überleitung (20) an einer Trägerplatte (60) fixiert. Besonders bevorzugt ist die Oberleitung (20) durch mindestens eine Unterbrechung (21) welche als Ventil, Hahn und/oder Stopfen ausgebildet sein kann, verschließbar. In einer besonders bevorzugten Variante ist die Überleitung (20) als elastischer Schlauch ausgeführt und insbesondere durch mindestens eine Unterbrechung (21) als eine Klemme, insbesondere Schlauchklemme, oder als einen den Schlauch klemmenden Schieber, welcher bevorzugt an der Trägerplatte (60) angeordnet ist, verschließbar. Bevorzugt ist die Überleitung (20) optisch durchlässig, das heißt transparent, bevorzugt optisch klar, ausgeführt, um die optische Kontrolle des Übertritts von Erythrocyten mittels technischer Mittel und/oder Sichtkontrolle zu ermöglichen. In einer bevorzugten Variante ist die Überleitung (20) mit einem optischen Detektor beziehungsweise Zähler zur Detektion der Gegenwart von Erythrocyten in der Oberleitung ausgestattet.
Sowohl Primärgefäß (10) als auch Sekundärgefäß (30) sind erfindungsgemäß bevorzugt als elastische Beutel ausgeführt. Diese Beutel sind jeweils bevorzugt in einer „Birnenform”, welche sich aus einem im Wesentlichen halbkreisförmigen unteren Abschnitt (14, 34) und sich nach oben verjüngenden im Wesentlichen trichterförmigen oberen Abschnitt (15, 35) aufbaut, ausgebildet. In einer besonders bevorzugten Variante sind diese elastischen Beutel als durch Verschweißen und/oder Verkleben elastischer Folien hergestellte, normalerweise zunächst flache, Beutel ausgeführt, worin die verbundenen Folien bevorzugt aneinander anliegen, und die Beutel bei zweckbestimmter Befüllung des zwischen den verbundenen Folien gebildeten Lumens normalerweise charakteristische Beutelform annehmen.
Das Sekundärgefäß (30) ist erfindungsgemäß weiter dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens einen Ab- und/oder Zuleitung des Sekundärgefäßes mindestens ein in das Lumen des Sekundärgefäßes ragendes Steigrohr (40) mit mindestens einer unteren Öffnung (42), welche an der vorzugsweise in der Mitte des Sekundärgefäßes, vorzugsweise an der Grenze zwischen einem halbkreisförmigen unteren Abschnitt (34) und einem trichterförmigen oberen Abschnitt (35) des Sekundärgefäßes ausgebildet ist, und mindestens einer oberen Öffnung (41), welche im oberen Abschnitt des Sekundärgefäßes, bevorzugt an der oberen Spitze des trichterförmigen oberen Teils des Sekundärgefäßes, insbesondere am Ansatz der Ab- und/oder Zuleitung (31) an der Innenseite der Gefäßwand des Sekundärgefäßes, ausgebildet ist.
Die erfindungsgemäße Ausführung des Primär- und Sekundärgefäßes in einer birnenartigen Form, das heißt mit einem sich nach oben hin verjüngenden trichterförmigen oberen Abschnitt und einem halbkreisförmigen unteren Abschnitt wird erfindungsgemäß vorteilhaft eine verbesserte Kontrolle der Abtrennung von Erythrocyten von thrombocytenhaltigem „buffy coat” und Plasma nach der Fraktionierung des Vollbluts im Primärgefäß erreicht. Die erfindungsgemäße Birnenform führt dazu, dass die Grenze zwischen Erythrocyten, „buffy coat” und überständigem Plasma scharf und klar reproduziert werden kann. Nach der ersten Zentrifugation ist eine breite Grenzzone (Scheidungsgrenze) zwischen Erythrocyten und thrombocytenhaltigem „buffy coat” vorhanden. Durch die erfindungsgemäß ausgebildete Verjüngung wird diese breite Grenze erst kurz vor der Überleitung verschmälert. Die dadurch ermöglichte verbesserte Kontrolle, ermöglicht eine bessere Trennung und höhere Ausbeute. Bei den Vorrichtungen aus dem Stand der Technik, die die erfindungsbemäße Form nicht aufweisen, ist die Grenze zwischen Erythrocyten und thrombocytenhaltigem „buffy coat” nicht deutlich ausgebildet; dadurch kann es sehr leicht passieren, dass Erythrocyten schon überführt werden, obwohl noch ein nicht unwesentlicher Teil an Plasma und „buffy coat” im Primärgefäß anwesend ist.
Nach der erfindungsgemäß bevorzugten Überführung des Plasmaüberstandes aus dem Primärgefäß (10) über die Überleitung (20) in das Sekundärgefäß (30) wird erfindungsgemäß bevorzugt ein weiteres Mal zentrifugiert, um eine Thrombocyten-Fraktion und einen thrombocytenarmen Plasmaüberstand zu erhalten. Dabei erlaubt die erfindungsgemäß bevorzugte Birnenform des Sekundärgefäßes (30) eine besonders günstige weil gleichmäßige Verteilung der Einwirkung der Zentrifugalkräfte auf die Thrombocyten pro Volumenanteil, wodurch die zur effektiven Fraktionierung der Blutbestandteile notwendige Drehzahl und Zentrifugationszeit minimiert werden können, was zu einer geringeren mechanischen Belastung der Thrombocyten führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Vorrichtung für die Zentrifugation in einen Zentrifugenbecher eingesetzt, dieser ist so gestaltet, dass das bevorzugt als elastischer Beutel ausgeführte Primärgefäß und/oder Sekundärgefäß bei der Zentrifugation so gedehnt wird, dass die Gefäßwände teilweise und/oder vollständig an der Innenwand des Zentrifugenbechers zu liegen kommen. Bevorzugt ist die Benutzung eines sterilen Bechers. Besonders vorteilhaft werden so die Dehnungsbelastung der Gefäßwände und der enthaltenen Zellen während der Zentrifugation reduziert. Die bevorzugte Verwendung eines Zentrifugenbechers erlaubt auch den Einsatz von mechanisch leichterem, dünnerem und weniger stabilem Material für den erfindungsgemäß bevorzugten elastischen Beutel. Der Vorteil des leichteren und dünneren Materials besteht auch darin, dass die Vermischung, das heißt Resuspension, der Thrombocyten mit dem hinzugefügten Plasma leichter ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Primärgefäß und Sekundärgefäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus einem Material ausgeführt, welches aufgrund seiner Oberflächenbeschaffenheit und seiner chemischen Zusammensetzung für die Gerinnungsfähigkeit des mittels der Vorrichtung erhaltenen thrombocytenreichen Plasmas besonders vorteilhaft ist. Im Vordergrund stehen dabei eine maximale Aktivierung der Thrombocyten, ohne vorzeitig eine Gerinnung auszulösen.
Das erfindungsgemäß dem Sekundärgefäß (30) und dessen mindestens einen Zu-/Ableitung (31) zugeordnete Steigrohr (40) mit einer oberen Öffnung (41) und einer unteren Öffnung (42) erlaubt besonders vorteilhaft die praktisch vollständige Entnahme beziehungsweise komplette Entleerung des Sekundärgefäßes, indem ein Großteil des nach der Zentrifugation im Sekundärgefäß erhaltenen Überstandes zunächst durch die untere Öffnung des in das Lumen des Sekundärgefäßes ragenden Steigrohrs zu einem großen Teil entnommen wird und anschließend der letzte Rest nach Umdrehen des Sekundärgefäßes, so dass die sich nach oben verjüngende Spitze des Sekundärgefäßes nach unten zeigt, durch die obere Öffnung (41), welche sich an der Spitze des sich verjüngenden Teils des Sekundärgefäßes befindet, entnommen werden kann.
Durch die erfindungsgemäße Kombination der vorgenannten zweckmäßigen Merkmale der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann erreicht werden, dass in einer kurzen Zeit, in einer sterilen Umgebung und insbesondere unmittelbar nach der Blutentnahme, eine große Menge an qualitativ hochwertigem thrombocytenreichen Plasma effektiv und mit hoher Ausbeute gewonnen werden kann.
Selbstverständlich erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung auch die Gewinnung anderer Blutkomponenten wie Serum, Erythrocytenkonzentrat, „buffy coat” beziehungsweise mononucleäres Zellkonzentrat, sowie thrombocytenarmes Plasma. Darüber hinaus ist die Vorrichtung auch zur Trennung anderer, insbesondere zelluläre Bestandteile enthaltender, Gewebs- beziehungsweise Körperflüssigkeiten geeignet. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch eingesetzt werden, um alle Arten von Zellsuspensionen, beispielsweise kultivierte Säugetierzellen, in ihre Bestandteile zu fraktionieren und die Fraktionen, beispielsweise Zellbestandteile, hochmolekulare Proteine etc. getrennt zu gewinnen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt bevorzugt die optische Kontrolle bei der Abtrennung zellulärer von nichtzellulären beziehungsweise weiteren zellulären Bestandteilen. Dabei ist auch vorgesehen, verschiedene Zellbestandteile einer Zellsuspension oder einer zelluläre Bestandteile enthaltenden Flüssigkeit mit geeigneten Farbstoffen zu markieren.
Die Erfindung betrifft auch einen, insbesondere steril verpackten, Kit, umfassend die erfindungsgemäße Vorrichtung. Der Kit enthält dabei bevorzugt mindestens ein Verbrauchsmaterial, vorzugsweise alle Verbrauchsmaterialien, die für die Produktion von thrombocytenreichen Plasma aus Vollblut mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung erforderlich sind. Das System ist einfach zu handhaben und direkt am Ort des Eingriffs einzusetzen. Bevorzugt werden dazu neben der vorgenannten erfindungsgemäßen Vorrichtung handelsübliche Einmalgebrauchsartikel wie Spritzen, Kanülen, Klemmen, etc. eingesetzt. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch eine Vorrichtung, insbesondere Kit, zur Gewinnung von insbesondere an aktivierten Thrombocyten reichem Plasma aus Vollblut enthaltend mindestens ein Mittel zum Auftrennen des Vollbluts in eine erythrocytenhaltige Fraktion und in thrombocytenhaltiges und im Wesentlichen erythrocytenfreies Plasma, mindestens ein Mittel zum Isolieren des thrombocytenhaltigen Plasmas, mindestens ein Mittel zum Auftrennen des thrombocytenhaltigen Plasmas in eine Thrombocyten-Fraktion und in einen Überstand aus thrombocytenarmem Plasma mittels Zentrifugation, mindestens ein Mittel zum Entnehmen von Überstand aus thrombocytenarmem Plasma, mindestens ein Mittel zum Durchmischen des entnommenen thrombocytenarmen Plasmas, mindestens ein Mittel zur Reapplikation von durchmischten thrombocytenarmen Plasmas in die Thrombocyten-Fraktion, mindestens ein Mittel zur Resuspension der Thrombocyten-Fraktion in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma und/oder mindestens ein Mittel zum Gewinnen des insbesondere an aktivierten Thrombocyten reichen Plasmas. In einer bevorzugten Variante enthält der Kit weiter mindestens ein Mittel zum Gerinnung des thrombocytenreichen Plasmas zu einem thrombocytenreichen Gel sowie Mittel zum Gewinnen des thrombocytenreichen Gels.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit, insbesondere zur Gewinnung von insbesondere an aktivierten Thrombocyten reichem Plasma aus Vollblut, enthaltend die vorgenannte erfindungsgemäße Vorrichtung und eine Zentrifuge, insbesondere mit an die erfindungsgemäße Vorrichtung adaptierten Zentrifugeneinsätzen, insbesondere Zentrifugenbechern inklusive Ausgleichsgefäßen. Vorzugsweise beinhaltet der erfindungsgemäße Kit eine Zentrifuge, die für die Benutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung modifiziert ist. Die Modifizierung besteht insbesondere aus einem Spezialrotor und insbesondere vier Spezialgehängen, mit mindestens zwei Metallbechern plus Metallschraubdeckel, die jeweils sterilisiert werden können, sowie mindestens ein nicht steriler Metallbecher inklusive Metallschraubdeckel für den Gewichtsausgleich. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden bevorzugt zwei steril eingeschweißte mit Ganzmetallgehänge, bestehend aus Metallbecher und Metallschraubdeckel, benötigt. Diese Metallgehänge sind so konstruiert, dass sie mittels Autoklavierung sterilisiert werden können.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren und anhand der Beispiele näher erläutert. Weitere Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
1 zeigt eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bestehend aus einem als elastischen Beutel ausgebildeten Primärgefäß (10) mit einem halbkreisförmigen unteren Abschnitt (14) und einen sich verjüngenden trichterförmigen oberen Abschnitt (15) mit mindestens einer Zu- und/oder Ableitung (11), welche in den trichterförmigen oberen Abschnitt (15) des Primärgefäßes mündet und an ihrem unteren Ende, welcher in das Lumen des Primärgefäßes 10 mündet, ein Lippenventil (13), das heißt Flatterventil, trägt und an ihrem oberen Ende, außerhalb des Primärgefäßes, mit einem Anschluss (12), der als Luerlock ausgeführt ist, versehen ist. Weiter weist das Primärgefäß (10) eine Überleitung (20) auf, welche an der Spitze des trichterförmigen oberen Abschnitts des Primärgefäßes (10) mündet. Diese Überleitung (20) stellt eine verschließbare Verbindung zwischen dem Volumen des Primärgefäßes (10) und dem Volumen des Sekundärgefäßes (30) dar. Die elastische transparente Überleitung (20) wird durch die Unterbrechung (21), welche als Schieber ausgebildet ist, verschlossen. Das als elastischer Beutel ausgeführte Sekundärgefäß (30) besteht aus einem halbkreisförmig ausgebildeten unteren Abschnitt (34) und einem sich verjüngenden trichterförmigen oberen Abschnitt (35) sowie einer Zu- und/oder Ableitung (31), welche an der Spitze des sich trichterförmig verjüngenden oberen Abschnitts (35) des Sekundärgefäßes (30) in das Lumen des Sekundärgefäßes mündet und an ihrem unteren Ende, welches als Steigrohradapter (43) ausgebildet ist, ein Steigrohr (40) aufweist und an ihrem oberen Ende einen Anschluss (32) aufweist, der als Luerlock ausgeführt ist. Das Steigrohr (40) weist eine obere Öffnung (41) und eine untere Öffnung (42) auf. Die obere Öffnung (41) ist unmittelbar an der Spitze des trichterförmig zulaufenden oberen Abschnitts des Sekundärgefäßes (30) bei dem Steigrohradapter (43) angeordnet. Die untere Öffnung (42) ist am unteren Ende, etwa in der Mitte des Lumens des Sekundärgefäßes (30), im Bereich des Übergangs zwischen dem halbkreisförmigen unteren Abschnitt (34) und dem trichterförmigen oberen Abschnitt (35) angeordnet.
2 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Primärgefäßes (10) beziehungsweise Sekundärgefäßes (30) der erfindungsgemäßen Vorrichtung, welche als elastischer, flacher Beutel ausgeführt ist. Die Beutel werden aus zwei übereinandergelegten Kunststofffolien hergestellt, welche übereinandergelegt an der Linie (100) ausgeschnitten und über die Fläche (101) verschweißt werden. Primärgefäß (10) und Sekundärgefäß (30) sowie die Zu- und/oder Ableitungen (11, 31) mit den Anschlüssen (12, 32) und die Überleitung (20) sind auf einer Trägerplatte (60) fixiert. Die Überleitung (20) ist als elastischer Schlauch ausgeführt und wird durch die als Klemmschieber ausgebildete Unterbrechung (21), welche an der Trägerplatte (60) verschiebbar angeordnet ist, durch Verklemmen verschlossen.
3 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßer Vorrichtung.
4 zeigt die Ausführungsform nach 3, eingesetzt in einen Zentrifugenbecher (50) aus Metall.
5 zeigt die Ergebnisse (Zahlenangaben auf der Ordinate in pg Proteine/ml) von ELISA-Tests auf verschiedene Wachstumsfaktoren beziehungsweise Cytokine in unmittelbar nach der Entnahme von Vollblut daraus erhaltenem Serum (Legende: t0), erfindungsgemäß aus Vollblut abgetrenntem thrombocytenarmen Plasma (Legende: PPP) und in koaguliertem, erfindungsgemäß erhaltenem, insbesondere an aktivierten Thrombocyten reichem Gel (Legende: PRP).
Beispiel 1: Kit zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut
Es wird ein sterilisierbarer Kit zum Einmalgebrauch zusammengestellt, das folgendes enthält:

– Das erfindungsgemäße Beutelsystem zur Herstellung von Thrombocytenkonzentrat (1 bis 3, Tabelle 1),
– eine 20-Gauge-Kanüle zum Aufziehen des ACD-A (Gerinnungshemmer) in die Blutabnahmespritze,
– eine 60-ml-Spritze zur Blutabnahme,
– eine Butterfly-Kanüle zur Blutabnahme,
– eine 60-ml-Spritze zur Aufnahme thrombocytenarmen Plasmas,
– eine 10-ml-Spritze zur Aufnahme thrombocytenreichen Plasmas,
– eine Citrat/Dextrose-Lösung als Gerinnungshemmer zu 6 ml je Ampulle (ACD-A),
– eine 10 ml Ampulle mit 10% Calciumgluconat,
– eine Ampulle mit 1000 I. E. bovinem Thrombin.

Alle Komponenten sind Einmalgebrauchsartikel, verpackt und gamma-sterilisiert und als Ganzes mit sterlier Umverpackung versehen.

Die Tabellen 1 und 2 listen die Materialien der verwendeten Komponenten auf. Tabelle 1: erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß Figuren 1 bis 3

Komponente:	Material, Lieferant
Trägerplatte (60) (Deckel)	ABS Terlux 2802, grün translucent
Primärgefäß als Beutel (10)	Beutelfolie: PVC compound 3222 von Solvay Draka
Sekundärgefäß als Beutel (30)	Beutelfolie: PVC compound 3222 von Solvay Draka
Steigrohr (40)	s-12/1 aus PVC Raumedic 7567 Abmessungen: 2,2 × 4,15 mm
Steigrohr-Adapter (43)	ABS Terlux 2802, natur
Schlauch für Überleitung (20)	PVC RB4 NDG 75 Shore A, 3,0 × 4,1 mm
Winkel für Überleitung (20)	PVC RB1S2
Unterbrechung (21) als Schieber	ABS Terlux 2802, weiß
Luerlock (LL), female, rot für Anschluss (12)	ABS Terlux 2802, rot translucent
Luerlock (LL), female für Anschluss (32)	ABS Terlux 2802, natur

Tabelle 2: Kit

Komponente:	Material, Lieferant
erfindungsgemäße Vorrichtung	(siehe Tabelle 1)
Butterfly-Kanüle 1,1 × 19 mm	Verschlusskappe: PE LL-Adapter: ABS transparent Flügel-Anschlusskopf: PVC Schlauch: PVC 60 Sh A Kanüle: ISO 638/13 Schutzschlauch: PE
Kanüle 1,1 × 40 mm	Anschlusskopf: PP Schutzkappe: PP Kanüle: Edelstahl gem. DIN EN ISO 9626
60 ml Spritze	Zylinder: PP Kolbenstange: PP Kolbenstopfen: Naturkautschuk
10 ml Spritze (12 cc)	Zylinder: PP Kolbenstange: PP Kolbenstopfen: PP
Perfusorleitung 1,5 m, 1,0 × 2,7 mm	LL male: ABS KR 2802 Kappe: PE, opak LL female: PVC Kappe: ABS, rot Schlauch: inner Layer: ND PE middle layer: EVA outer layer: PVC
Blisterverpackung 0,9 × 206 × 500 mm	PET-GAG
Tyvek-Siegelpapier	Tyvek 10MP/1073B

Beispiel 2: Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut
a) Blutabnahme
Die erforderliche Blutabnahme erfolgt mit einer 60 ml Luerlock-Spritze, die zur Antikoagulation des Blutes vor der Abnahme mit 6 ml Citrat/Dextrose-Lösung als Gerinnungshemmer (ACD-A) beschickt wird. Die Spritze wird langsam bis zur 60 ml-Markierung mit Vollblut gefüllt. Es wird auf blasenfreie Füllung geachtet, damit sich tatsächlich genau 60 ml in der Spritze befinden. Sofort nach der Blutentnahme wird die blutgefüllte Spritze 5 bis 6 mal langsam hin- und hergeschwenkt, um sicherzustellen, dass ACD-A gleichmäßig verteilt ist.
b) Befüllen des Beutelsystems und erste Zentrifugation
Die als Schiebeklemme ausgebildete Unterbrechung (21) auf der Oberseite der Trägerfläche wird zum Zentrum gedrückt, um den Schlauch zu verschließen. Die Verschlusskappe wird entfernt und die Spritze mit dem roten Anschluss (12) verbunden. Um eine Verwechslung der beiden Anschlüsse auf der Trägerplatte auszuschließen, ist der Luerlock-Anschluss zur Einfüllung des Vollblutes rot gefärbt. Der Inhalt der Spritze wird langsam und vollständig über die Zu-/Ableitung (11) in das als elastischer Beutel ausgebildete Primärgefäß (10) eingefüllt. Die Spritze wird nach der Befüllung abgeschraubt und der Anschluss (12) des Beutels wird mit einer neuen Verschlusskappe wieder verschlossen.
Das Beutelsystem mit dem befüllten Primärgefäß (10) wird in das leere sterile Zentrifugengehänge, in den Zentrifugenbecher (50) eingesetzt. Es wird dabei auf die richtige Orientierung der Trägerplatte (60) des Beutelsystems im Becher geachtet (4). Der Zentrifugenbecher (50) wird mit dem zugehörigen Schraubdeckel verschlossen. Der verschlossene Zentrifugenbecher wird in die Zentrifuge eingesetzt. Der Becher wird dabei leicht schräg gehalten. Nach Kontrolle des korrekten Gewichtsausgleiches mittels einer beigefügten Wasserflasche (befüllt mit ca. 30 ml Wasser) wird die Zentrifugation bei 2500 U/min für 3 min durchgeführt. Nach Ablauf der Zentrifugation, in der eine Separation der zellulären Blutbestandteile von den flüssigen stattfindet, wird der Zentrifugenbecher zusammen mit dem Beutelsystem vorsichtig entnommen.
c) Trennung von Erythrocyten und Plasma
Durch die Zentrifugation haben sich die Erythrocyten (EZ) im unteren Abschnitt des Primärgefäßes (10) angesammelt. Das überständige Plasma sowie die dazwischen befindlichen „buffy coat” (mononucleäre Zellen, MZ) und Thrombocyten werden nun durch langsames Aufrollen und/oder Ausstreichen des Primärgefäßes (10) mittels einer herkömmlichen feststellbaren Klemme von unten her über die Überleitung (20) unter Sichtkontrolle in das Sekundärgefäß (30), welches ebenfalls als elastischer Beutel ausgeführt ist, transferiert. Dazu wird vorher der Schieber auf der Oberseite wieder vom Zentrum des Deckels weggezogen, so dass der durchsichtige Schlauch der Überleitung (20) freigegeben ist. Sobald der Schlauch an der Oberseite der Trägerplatte komplett mit roten Blutbestandteilen gefüllt ist und sich eventuell wenige Erythrocyten in das Sekundärgefäß ergießen, wird der als Schieber ausgebildete Unterbrecher (21) auf der Trägerplatte zur Mitte hin bewegt, um den Überleitungsschlauch zu verschließen und den Übertritt in das Sekundärgefäß zu stoppen.
d) Trennung von Thrombocyten und Plasma
Im Sekundärgefäß befindet sich nun im Wesentlichen der Plasmabestandteil des Blutes mit Thrombocyten und Leukocyten sowie Erythrocyten in einer geringen Menge. Die Thrombocyten sind jedoch noch im Plasma gleichmäßig verteilt und daher nicht ausreichend konzentriert.
In einer zweiten Zentrifugation werden nun die Thrombocyten (sowie die weiteren enthaltenen zellulären Blutbestandteile) im unteren Abschnitt des Beutels als Pellet und die Plasmafraktion im Überstand fraktioniert. Dazu wird das Beutelsystem unter Benutzung eines zweiten, sterilen Zentrifugenbechers (50) erneut in die Zentrifuge eingesetzt und bei 3200 U/min für 15 min zentrifugiert.
e) Gewinnung thrombocytenarmen Plasmas
Nach Ende der zweiten Zentrifugation wird der Zentrifugenbecher mit dem Beutelsystem wieder aus der Zentrifuge genommen, und über den Entnahmeanschluss (32) der Zu-/Ableitung (31) des Sekundärgefäßes (30) wird das überständige Plasma („platelet poor plasma”, PPP) bis auf einen geringen Rest (weniger als ca. 2 ml) entnommen. Die mit Plasma gefüllte Spritze wird abgeschraubt.
f) Gewinnung thrombocytenreichen Plasmas
Das entnommene thrombocytenarme Plasma wird in der Spritze gründlich vermischt. Die Spritze wird entlüftet und wieder mit dem Entnahmeanschluss (32) verbunden. Es werden ca. 4 ml des Plasmas wieder in den Beutel gegeben. Das Plasma wird durch leichtes „Massieren” des elastischen Beutels mit der Thrombocyten-Fraktion vermischt, so dass sich eine gleichmäßige Thrombocyten-Suspension bildet. Diese wird dann mit einer 10 ml Spritze über Zu-/Ableitung (31) aus dem Beutel entnommen. Um eine restlose Entleerung des Sekundärgefäßes (30) zu gewährleisten, wird dieser bei der Entnahme des Plasmas auf den Kopf gedreht, so dass die restliche Menge sich in der Spitze des sich in dem verjüngenden Abschnitt des Sekundärgefäßes (30) sammelt und über die dort angeordnete Öffnung (41) des Sammelrohrs (40) der Zu-/Ableitung (31) entnommen werden kann. Das so erhaltene Plasma (Menge ca. 5 bis 6 ml) ist thrombocytenreiches Plasma („platelet rich plasma”, PRP).
p) Präparation eines thrombocytenreichen Gels
Das in der Entnahmespritze enthaltene thrombocytenreiche Plasma (Menge ca. 5–6 ml) wird durch Zugabe von 1 ml 10% Calciumgluconatlösung zur Gerinnung gebracht werden. Als Endprodukt erhält man ca. 6 bis 7 ml thrombocytenreiches Gel, welches sich durch einen hohen Gehalt an verschiedenen Wachstumsfaktoren auszeichnet (5) und verschiedenen Anwendungen zugeführt werden kann.
Bei alleiniger Zugabe von Calciumionen dauert der Gerinnungsprozess ca. 10–15 min. Bei zusätzlicher Zugabe von 1000 Einheiten Thrombin (bovines Thrombin) wird die Gerinnung deutlich beschleunigt. Außerdem bewirkt die Zugabe von Thrombin eine schnelle Vernetzung des Fibrins, was unter anderem zu einer besseren Anhaftung des Gels an verletztes Gewebe und damit zu einer verbesserten Anwendbarkeit des thrombocytenreichen Gels führt.
h) Ergebnisse

Ausbeute an Thrombocyten:

Durchschnittliche Thrombocytenzahl im Vollblut:	275 × 10³/ml
Durchschnittliche Thrombocytenzahl im thrombocytenarmen Plasma (PPP):	19 × 10³/ml
Durchschnittliche Thrombocytenzahl im thrombocytenreichen Plasma (PRP):	1,3 × 10⁶/ml

Ausbeute an Cytokinen und Wachstumsfaktoren:
Die 5 zeigt die Ergebnisse der ELISA-Tests.
Aus der 5 geht hervor, dass insbesondere die Wachstumsfaktoren PDGF, TGF-β, HGF, FGF-II und IL-1ra in thrombocytenreichem Plasma in ihrer Konzentration (pg Proteine/ml) stark erhöht sind (logarithmische Darstellung auf der Ordinate). Auch IGF-1 ist in seiner Konzentration deutlich erhöht (logarithmische Darstellung). TNF-α und IL-1β dagegen sind in ihrer Konzentration kaum erhöht.

Claims

Verfahren zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut, umfassend die Schritte: a) Auftrennen des Vollbluts in eine erythrocytenhaltige Fraktion und in thrombocytenhaltiges, im Wesentlichen erythrocytenfreies Plasma, b) Isolieren des thrombocytenhaltigen Plasmas, c) Auftrennen des thrombocytenhaltigen Plasmas in eine Thrombocytenfraktion und in einen Überstand aus thrombocytenarmem Plasma mittels Zentrifugation, d) Entnehmen von Überstand aus thrombocytenarmem Plasma, e) Durchmischen des entnommenen thrombocytenarmen Plasmas, f) Reapplikation durchmischten thrombocytenarmen Plasmas in die Thrombocytenfraktion, g) Resuspension der Thrombocytenfraktion in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma und h) Gewinnen des thrombocytenreichen Plasmas.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftrennen des Vollbluts in Schritt a) mittels Zentrifugation erfolgt und die erythrocytenhaltige Fraktion als Pellet und das im Wesentlichen erythrocytenfreie und thrombocytenhaltige Plasma als Überstand erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das thrombocytenhaltige Plasma aus einem ersten elastischen Gefäß durch kontrolliertes Überführen in ein damit verbundenes zweites Gefäß von der erythrocytenreichen Fraktion abgetrennt wird, wobei die Überführung des Plasmas bei Detektion der beginnenden Überführung von Erythrocyten gestoppt wird.
Thrombocytenreiches Plasma, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verfahren zur Herstellung von thrombocytenreichem Gel, worin ein in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 gewonnenes trombocytenreiches Plasma in Schritt i) durch ein Gerinnungsmittel, koaguliert wird und ein an Thrombocyten und/oder Wachstumsfaktoren reiches Gel gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerinnungsmittel Calciumgluconat-Lösung ist.
Thrombocytenreiches Gel, erhältlich nach einem Verfahren nach Anspruch 5 oder 6.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4, aufweisend mindestens ein Primärgefäß und Sekundärgefäß (30) mit jeweils verschließbarer Ab- und/oder Zuleitung (11, 31) und mindestens eine verschließbare Überleitung (20), über die Primärgefäß (10) und Sekundärgefäß (30) kommunizieren, wobei Primärgefäß (10) und Sekundärgefäß (30) in einem im Wesentlichen halbkreisförmigen unteren Teil (14, 34) und einem sich nach oben hin verjüngendem trichterförmigen oberen Teil (15, 35) ausgebildet sind dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Ab- und/oder Zuleitung (31) des Sekundärgefäßes mit einem in das Sekundärgefäß ragenden Steigrohr (40) in Verbindung steht, das mindestens eine untere Öffnung (42) und mindestens eine obere Öffnung (41) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die untere Öffnung (42) an der Grenze zwischen halbkreisförmigem unteren Teil und trichterförmigem oberen Teil des Gefälles ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die obere Öffnung (41) an einer oberen Spitze des trichterförmigen oberen Teils des Gefäßes ausgebildet ist.