WO2006013069A2 - Verfahren und mittel zur gewinnung von thrombocytenreichem plasma - Google Patents

Verfahren und mittel zur gewinnung von thrombocytenreichem plasma Download PDF

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WO2006013069A2
WO2006013069A2 PCT/EP2005/008252 EP2005008252W WO2006013069A2 WO 2006013069 A2 WO2006013069 A2 WO 2006013069A2 EP 2005008252 W EP2005008252 W EP 2005008252W WO 2006013069 A2 WO2006013069 A2 WO 2006013069A2
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Julio Reinecke
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Definitions

  • the present invention relates to methods and compositions for the capture of thrombocyte-rich plasma ("platelet rich pJasma", PRP), which has a high content of platelets and which in particular is easily gellable, from whole blood.
  • thrombocyte-rich plasma platelet rich pJasma
  • PRP platelet rich pJasma
  • Platelet-rich plasma is used in medicine, among others, in the treatment of wounds, for the support of bone healing, for haemostasis, in particular in plastic surgery, etc.
  • the preparation and the use of autologous thrombocyte-rich plasma from whole blood is Foreground.
  • Thrombocytes in thrombocyte-rich plasma are characterized in particular by their high content of proteins, in particular growth factors and cytokines, which can be released from the thrombocytes with appropriate treatment.
  • the growth factors and cytokines are essentially platelet derived growth factor (PDGF), transforming growth factor (TGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and epithelial growth factor (EGF).
  • PDGF platelet derived growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • EGF epithelial growth factor
  • the medicinal benefit of autologous thrombocyte-rich plasma besides being a rich source of various healing promoting growth factors and cytokines, is the promotion of accelerated wound healing in all tissues, the promotion of higher collagen concentration in healing wounds leads in particular to higher scar strength, in the promotion of accelerated Gefäßneubil ⁇ tion, in promoting a reduced bone maturation period, in the promotion of an increased local bone density, in the promotion of partially reduced postoperative pain and in the promotion of lower wound infection rates.
  • the risk of transmission of the disease from foreign organisms is also eliminated when obtaining the thrombocyte-rich plasma from autologous whole blood.
  • a known technique for obtaining thrombocyte-rich plasma from whole blood is described in WO 00/61265 and in WO 01/83068 of Harvest Technologies Co., using a device with two communicating vessels and for the preparation of the platelet-rich plasma the first vessel is filled with withdrawn whole blood, an erythrocyte-rich pellet is automatically centrifuged, and a plasma supernatant containing the platelets is automatically separated therefrom by the arrangement of a swimmer within the vascular system during centrifugation. A fluctuating hematocrit can not be compensated.
  • a thrombocyte-rich fraction In a second centrifugation step, plasma and a thrombocyte-rich fraction are separated from one another, and then the plasma supernatant is partially removed and the thrombocyte pellet resuspended in a remaining plasma fraction in order to obtain a thrombocyte-rich plasma.
  • the known technologies and methods for obtaining autologous thrombocyte-rich plasma can not provide a constant and high yield and quality.
  • the fluctuations in yield and quality are due to the variability of the hematocrit of the removed whole blood.
  • the hematocrit that is to say the volume fraction of the cellular constituents of the total volume of the whole blood, can vary considerably between individuals, for example from 35 to 50%.
  • the existing systems for producing fresh platelet concentrates are unable to compensate for this variability of hematocrit. Consequently, the quality of the final product varies considerably with respect to the yield and the quality of the thrombocyte-rich plasma obtained.
  • thrombocyte-rich plasma autologously and, if possible, on-site and freshly, as well as under always sterile conditions, with the same constant yield. It is also desirable to obtain a high-quality platelet-rich plasma which forms a large amount of useful proteins such as growth factors and cytokines and has a high content of platelets.
  • thrombocyte-rich plasma is increasingly being used as a coagulated thrombocyte-rich gel for a number of applications.
  • the mechanical strength of the gel is crucial for its effectiveness and effectiveness in this application. It turns out, however, that the thrombocyte-rich plasma obtainable by known methods also has a low quality with respect to its coagulability. It is therefore also desirable to obtain thrombocyte-rich plasma which has a high coagulability and can be coagulated to form a platelet-rich gel which can be used more readily.
  • the technical problem underlying the present invention consists essentially in providing a method and means for obtaining thrombocyte-rich plasma from whole blood, which overcomes the disadvantages of the prior art, wherein the thrombocyte-rich plasma obtained is rich in, in particular activated, Thrombocytes and / or improved coagulability has.
  • the present invention is achieved according to the invention by providing a method for obtaining platelet-rich plasma from whole blood, wherein in a first step a) the whole blood is separated into at least one erythrocyte-containing fraction and a plasma fraction containing the thrombocytes ent and essentially erythrocyte-free, in a second step b) the thrombocyte-containing plasma is separated from the erythrocyte-containing fraction, in a further step c) the thrombocyte-containing plasma, preferably by centrifugation, into a thrombocyte-containing fraction which is preferably adjacent
  • the platelets also nucleated cells, ie, buffy coat and / or in particular is present as a pellet, wherein preferably immediately above the pellet formed further thrombocytes are suspended in the plasma, and in a supernatant from low platelet plasma separated w
  • the supernatant obtained from thrombocyte-poor plasma preferably by means of a syring
  • the inventors found, surprisingly, that a significantly increased thrombocyte activation takes place in particular by the reapplication of plasma supernatant previously removed and mixed after removal.
  • the inventors further found, surprisingly, that a thrombocyte-rich plasma which has a markedly improved coagulability is obtained, in particular by the re-application of previously removed plasma supernatant mixed after removal. Without being limited to theory, this effect may possibly be due to the fact that the platelets are resuspended in a plasma containing all plasma components, high molecular weight and low molecular weight, in physiologically correct composition.
  • the coagulation factors important for the subsequent coagulation are also contained in the thrombocyte-rich plasma obtained in accordance with the invention, as a result of which it can be more easily coagulated and a more improved platelet-rich gel can be obtained.
  • the known methods do not achieve this because only a part of the plasma is removed from the supernatant to obtain a thrombocyte-rich plasma, while a plasma residue containing especially high molecular weight fractions is mixed with the thrombocyte fraction.
  • the invention provides that, in particular autologous, and in particular venous, whole blood is taken from a patient and immediately afterwards from this blood at least one erythrocyten-rich fraction of the thrombocytes and preferably the "buffy coat" containing plasma, that is from at least one predominantly platelet and mononuclear cells are contained. separated fraction.
  • the in a vessel, in particular elastic vessel, preferably an elastic bag introduced whole blood by centrifugation, preferably at from 1500 to 3500 revolutions per minute, preferably from 2000 to 2800 revolutions per minute, over a preferred period of 1, 5 separated up to 4 minutes and in the vessel an erythrocyte-rich, especially erythrocyte-containing fraction as a pellet at the bottom of the vessel and at least one thrombocytes and preferably mononuclear cells containing "buffy coaf fraction obtained as a supernatant.
  • erythrocyte-rich especially erythrocyte-containing fraction as a pellet at the bottom of the vessel and at least one thrombocytes and preferably mononuclear cells containing "buffy coaf fraction obtained as a supernatant.
  • At least three fractions are formed: an erythrocyte-containing fraction which appears red, a thrombocyte-containing buffy coaf fraction which appears as a white, viscous and thin layer, and a supernatant of plasma appearing from yellow to orange.
  • the whole blood fractionated in the vessel, in particular the elastic bag, by centrifugation is mechanically applied by rolling up and / or wiping the vessel such that the plasma supernatant together with the thrombocyte-containing buffy coat fraction , which are in the upper portion of the vessel, is pressed out of the first vessel and in particular via a transfer line, which is connected to a second vessel, in particular an elastic vessel, in particular an elastic bag, is transferred to this, wherein the erythrocyte-containing fraction is separated as a function of the hematocrit of the removed whole blood.
  • the adaptation preferably takes place in that the extrusion of the supernatant from the first vessel, in particular by rolling up and or Streaking is continued until one of the plasma supernatant is largely transferred and the erythrocyte-containing fraction, ie the erythrocyte-containing pellet, is located at the upper end of the vessel.
  • the beginning of an erythrocyte-containing fraction, and thus the end of the transfer process can be determined by the appearance of erythrocytes at the upper end of the first vessel and / or detect in the transfer line.
  • the invention makes use of the properties of erythrocytes, in particular to absorb light energy in the visible range of the light, in particular by reddening to blushing.
  • the presence of erythrocytes at the upper end of the first vessel and / or in the transfer line is inventively preferably detected by suitable detectors or counters in a conventional manner and / or by simple visual inspection and then the transfer process ge stops. In this way, according to the invention, it is advantageously achieved that, in any case and independently of the individual hematocrit present, the largest possible amount of thrombocytes is obtained from the whole blood.
  • controlled transfer therefore means the process of transferring the supernatant from thrombocyte-containing plasma from centrifuged, fractionated whole blood which, depending on the individual hematocrit of the whole blood used, is the process of transferring the plasma supernatant
  • tion of an erythrocyte-containing fraction is preferably characterized in that a detectable fraction of erythrocytes is present at the upper end of the first vessel and / or in the transfer line. It is preferred to transfer all thrombocytes to the second vessel as a particularly pure, that is to say free from erythrocyte, platelet fraction.
  • the invention further provides that in further process steps the transferred and separated from the erythrocyte-containing fraction th thrombocyte-containing plasma preferably by centrifugation at from 2900 to 5000 revolutions per minute, preferably from 3200 revolutions per minute, over a period of 10 to 20 minutes, preferably 15 minutes, into a platelet fraction which, preferably together with monocular cells, is present in particular as a pellet and is fractionated into a thrombocyte-poor plasma supernatant.
  • thrombocyte-poor plasma in particular via an opening in the upper section of the second vessel, in particular the elastic bag, in which the separation of the thrombocyte-containing plasma has taken place, entnom ⁇ men, so that, preferably present as a pellet, thrombocyte tenfr forcing in the second vessel remains.
  • the thrombocyte-poor plasma is completely and / or substantially completely removed.
  • up to 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 20%, 10% of the thrombocyte ⁇ narmen plasma are removed.
  • the thrombocyte-poor plasma is removed in an amount that is selected as a function of the individual hematocrit of the whole blood used.
  • the plasma is stratified, ie in particular in the upper part of the plasma are small components and in the lower part of the plasma are larger components, is now, as in known methods, after centrifugation only When the upper part of the plasma is removed, the plasma remaining with the platelet fraction is unnaturally enriched in high-molecular constituents.
  • the withdrawn thrombocyte-poor plasma preferably in the means used for the removal, in particular a syringe, is mechanically mixed.
  • the plasma constituents separated by the preceding centrifugation mix again, so that a largely physiological composition of the plasma is established, that is, a plasma is obtained which is a homogeneous composition of naturally occurring plasma having.
  • the withdrawn and mixed thrombocyte-term plasma is returned to the thrombocyte fraction, ie in particular into the second vessel containing the thrombocyte fraction, that is to say reapplied, and subsequently the thrombocyte fraction is mixed with the returned plasma and thereby resuspended.
  • the resuspension preferably takes place by mechanical mixing of the thrombocyte fraction from the reapplied plasma.
  • the resuspension is carried out in the second vessel, which is preferably designed as an elastic bag, wherein the contents of the second vessel are mixed by preferably manual, mechanical loading of the elastic vessel walls, in particular by massaging.
  • the mechanical stress of the mechanically sensitive thrombocytes is reduced to a minimum, which promotes the recovery of a particular rich in activated platelet plasma.
  • the plasma which is particularly rich in activated thrombocytes, is then recovered by transferring or resuspending the platelet fraction resuspended in the reapplied thrombocyte poor plasma.
  • a coagulant that is to say a coagulant
  • the formation of this gel is strongly promoted by the fact that the appropriate concentration and the appropriate ratio of all relevant coagulation factors, which are naturally present in the plasma, are present in the thrombocyte-rich plasma obtained according to the invention.
  • Both the thrombocyte-rich plasma obtained according to the invention and the thrombocyte-rich gel preferably obtained according to the invention have a markedly increased formation or concentration of proteins such as growth factors and / or cytokines in the contained thrombocytes compared with the thrombocyte-rich plasma obtained by known methods.
  • proteins such as growth factors and / or cytokines in the contained thrombocytes
  • thrombocyte-rich plasma obtained by known methods In particular, depending on the quality of the thrombocytes obtained and / or the coagulum, there is a burst of thrombocytes, whereby the growth factors or cytokines are released during gel formation.
  • the following growth factors or cytokines are formed in the thrombocyte-rich plasma obtained according to the invention and in particular in the thrombocyte-rich gel obtained therefrom:
  • TNF-.alpha. and IL-1 ⁇ are inflammatory markers, whereas they are hardly elevated.
  • the present invention therefore also relates to the plasma produced in particular by the method according to the invention, in particular to activated thrombocytes, and the gel formed therefrom, in particular by coagulation with a coagulant.
  • the thrombocyte-rich plasma or gel obtained according to the invention is used for the prophylaxis and / or therapy or cure of a large number of diseases.
  • the thrombocyte-rich plasma or gel according to the invention particularly advantageously has a high leucocyte concentration, this is preferably used in order to reduce the risk of infection in the treatment. Furthermore, the thrombocyte-rich plasma or gel according to the invention particularly advantageously has a high concentration of dendritic cells.
  • the inventors further found, surprisingly, that the thrombocyte-rich plasma or gel obtained according to the invention, when mixed with, for example, autologous bone chips and / or bone substitutes, for example hydroxyapatite, gives a particularly advantageous "putty" for filling and / or restoring bone defects.
  • a further subject of the present invention is therefore also the use of the invention according to obtained thrombocyte-rich plasma or gel for filling or restoration of bone defects in conjunction with bone chips and / or bone substitutes.
  • the thrombocyte-rich plasma or gel obtained according to the invention accelerates the formation of intercellular matrix, which, for example, leads, particularly advantageously, to earlier wound closure.
  • a further subject of the present invention is therefore also the use of the thrombocyte-rich plasma or gel according to the invention for accelerating the wound closure.
  • the clinical fields of application of the method according to the invention and of the thrombocyte-rich plasma or gel obtainable according to the invention are manifold. They include oral and maxillofacial surgery, orthopedics, plastic and reconstructive surgery and dermatology.
  • An object of the present invention is also the use of the thrombocyte-rich plasma or gel according to the invention for accelerating and / or promoting the healing of diabetic ulcerations, in particular on the lower extremities.
  • the present invention therefore also relates to the use of the thrombocyte-rich plasma and / or gel according to the invention for accelerating the regeneration of bones, cartilage defects, endothelium, epithelium and / or epidermis; for stimulation of neovascularization; to enhance collagen synthesis; for accelerating the healing of soft tissues; to reduce scar formation; to facilitate hemostasis; to alleviate and / or reverse the negative effects of corticosteroids on wound healing; when filling cartilage defects in auto ⁇ logen cartilage transplantation (ACT), where a matrix with cartilage cells is glued to the defect, or the use of said plasma or gel for the preparation of corresponding pharmaceutical preparations.
  • ACT auto ⁇ logen cartilage transplantation
  • Vorrich ⁇ device in particular a bag system, which can be preferably used to carry out the method according to the invention.
  • This comprises at least one primary vessel (10) and at least one secondary vessel (30), which form a communicating vascular system.
  • Primary vessel (10) and secondary vessel (30) are connected via at least one, in particular closable, transfer line (20).
  • a "primary vessel” is understood to mean a vessel, that is to say a vessel, in which the liquid or suspension to be separated into its individual components is introduced or is present and subjected to a first fractionation Vessel, that is to say containers, in which the liquid or suspension completely or partially separated into its individual components in the primary vessel is introduced completely or partially, that is to say individual fractions thereof, and this is subjected to a second fractionation in the secondary vessel.
  • each of these vessels is provided with at least one, in particular closable, supply and / or supply line (11, 31), in particular for the supply, that is to say introduction or reapplication, of blood components and / or removal, that is to say, removal, provided by blood components.
  • primary vessel (10), secondary vessel (30) and transfer line (20) are fixed to a support plate (60).
  • the transfer line (20) can be closed by at least one interruption (21), which can be designed as a valve, tap and / or plug.
  • the transfer line (20) is designed as an elastic hose and in particular by at least one interruption (21) as a clamp, in particular a hose clamp, or as a slide clamping the hose, which preferably on the support plate (60 ) is arranged, lockable.
  • the transition (20) is optically transmissive, that is to say transparent, preferably optically clear, in order to permit the optical control of the transfer of erythrocytes by means of technical means and / or visual control.
  • the transition (20) is equipped with an optical detector or counter for detecting the presence of erythrocytes in the Kochlei ⁇ device.
  • Both primary vessel (10) and secondary vessel (30) are preferably designed according to the invention as elastic bags.
  • These bags are each preferably formed in a "pear shape" which is formed from a substantially semicircular lower portion (14, 34) and upwardly tapered substantially funnel-shaped upper portion (15, 35)
  • these elastic pouches are designed as pouches produced by welding and / or gluing elastic foils, normally initially flat, in which the bonded foils are preferably in abutment with one another, and the pouches with a purposeful filling of the between the joined foils lumens usually assume characteristic bag shape.
  • the secondary vessel (30) is further characterized in that at least one riser pipe (40) projecting into the lumen of the secondary vessel and having at least one lower opening (42) is provided to the at least one supply and / or supply line of the secondary vessel.
  • which is formed at the preferably in the middle of the Sekundärge ⁇ vessel, preferably at the boundary between a sch Vietnameseförmi ⁇ gene lower portion (34) and a funnel-shaped upper portion (35) of the secondary vessel, and at least one upper opening (41) which is formed in the upper section of the secondary vessel, preferably at the upper tip of the funnel-shaped upper part of the secondary vessel, in particular at the attachment of the supply and / or supply line (31) to the inside of the vessel wall of the secondary vessel.
  • the inventive design of the primary and Sekundärgefä ⁇ ßes in a pimple-like shape, that is, with an upwardly tapering funnel-shaped upper portion and a rud ⁇ circular lower portion is inventively advantageously an improved control of the separation of erythrocytes of thrombocyte-containing "buffy coat"
  • the pear shape according to the invention has the result that the border between erythrocytes, buffy coat and supernatant plasma can be reproduced sharply and clearly.
  • preferred transfer of the plasma supernatant from the primary vessel (10) via the transfer line (20) into the secondary vessel (30) is preferably centrifuged a further time to obtain a thrombocyte fraction and a platelet-poor plasma supernatant.
  • the inventively preferred pear shape of the secondary vessel (30) allows a particularly favorable because even distribution of Einwir ⁇ effect of centrifugal forces on the platelets per volume fraction, whereby the need for effective fractionation of the blood components not ⁇ speed and centrifugation time can be minimized, resulting in a lower mechanical stress on the platelets leads.
  • the device according to the invention for centrifugation is inserted into a centrifuge cup, which is designed in such a way that the primary vessel and / or secondary vessel, which is preferably designed as an elastic bag, is stretched during centrifugation so that the vessel walls become partially and / or completely come to rest on the inner wall of the centrifuge cup.
  • a centrifuge cup Preference is given to the use of a sterile cup. Be particularly advantageous so the strain load of the vascular walls and the cells contained during centrifugation redu ⁇ ed.
  • the preferred use of a centrifuge cup also allows the use of mechanically lighter, thinner and less stable material for the present invention preferred elastic see-bag.
  • the advantage of the lighter and thinner material is also that the mixing, that is, resuspension, of the platelets with the added plasma is easier.
  • primary vessel and secondary vessel of the device according to the invention are made of a material which, because of its surface condition and its chemical composition, is particularly advantageous for the coagulability of the thrombocyte-rich plasma obtained by means of the device.
  • the focus here is on maximum activation of the platelets without prematurely triggering coagulation.
  • the riser pipe (40) with an upper opening (41) and a lower opening (42), which is assigned to the secondary vessel (30) and its at least one inlet / outlet (31) according to the invention, makes it possible to carry out the practically complete removal or removal.
  • se complete emptying of the secondary vessel by a majority of the Matterstan ⁇ obtained after centrifugation in the secondary vessel of the first projecting through the lower opening of the secondary vessel into the lumen of Se ⁇ secondary vessel riser is removed and then the last remainder after turning the Secondary vessel, so that the upwardly tapering tip of the secondary vessel is facing down, through the upper opening (41), which is located at the top of the tapered portion of the secondary vessel, can be removed.
  • the device according to the invention also permits the recovery of other blood components, such as serum, erythrocyte concentrate, buffy coat or mononuclear cell concentrate, as well as thrombocyte-poor plasma Moreover, the device is also suitable for separating other tissue or body fluids containing, in particular, cellular components
  • the device according to the invention can also be used to fractionate all types of cell suspensions, for example cultured mammalian cells, into their constituents and to separate the fractions, for example cell constituents, high molecular weight proteins, etc.
  • the device according to the invention permits this Preferably, the optical control in the separation of cellular from non-cellular or other cellular components.Also provided, various Zellbe ⁇ constituents of a cell suspension or a cellular components to mark containing liquid with suitable dyes.
  • the invention also relates to a kit, in particular sterile packaged, comprising the device according to the invention.
  • the kit preferably contains at least one consumable, preferably all consumables, which are required for the production of thrombocyte-rich plasma from whole blood by means of the device according to the invention.
  • the system is easy to handle and directly at the place of intervention.
  • commercially available disposable articles such as syringes, cannulas, clamps, etc. are preferably used for this purpose.
  • An object of the present invention is therefore also a device, in particular a kit, for obtaining plasma from whole blood which is rich in activated thrombocytes, comprising at least one agent for separating the whole blood into an erythrocyte-containing fraction and thrombocyte-containing and essentially erythrocyte-free plasma, at least one Composition for isolating the thrombocyte-containing plasma, at least one means for separating the thrombocyte-containing plasma into a thrombocyte fraction and into a supernatant from thrombocyte-poor plasma by centrifugation, at least one means for removing supernatant from thrombocyte-poor plasma, at least one means for mixing the removed thrombocyte-poor plasma, at least one means for reapplication of mixed thrombocyte-poor plasma into the thrombocyte fraction, at least one means for resuspending the platelet fraction in the reappli formulate thrombocytenarmen plasma un d / or at
  • a further subject of the invention is a kit, in particular for obtaining plasma from whole blood rich in particular in activated thrombocytes, comprising the aforementioned device according to the invention and a centrifuge, in particular with centrifuge inserts adapted to the device according to the invention, in particular special centrifuge cups including equalizing vessels.
  • the kit according to the invention preferably comprises a centrifuge modified for the use of the device according to the invention.
  • the modification consists in particular of a special rotor and in particular four special hangers, with at least two metal cups plus metal screw caps which can each be sterilized, and at least one non-sterile metal cup including metal screw-on lid for weight compensation.
  • Figure 1 shows a schematic representation of a preferred embodiment of the device according to the invention, be ⁇ standing from a formed as an elastic bag primary vessel (10) with a semicircular lower Ab ⁇ section (14) and a tapered funnel-shaped upper portion (15) with at least one to and / or discharge (11), which opens into the funnel-shaped upper section (15) of the primary vessel and at its lower end, which opens into the lumen of the primary vessel 10, a lip valve (13), that is flutter valve, carries at its upper end, outside the primary vessel, a port (12) designed as a luerlock, is provided.
  • the primary vessel (10) has a Koch ⁇ line (20), which opens at the top of the funnel-shaped upper portion of the primary vessel (10).
  • This transition (20) represents a closable connection between the volume of the primary vessel (10) and the volume of the secondary vessel (30).
  • the elastic trans ⁇ parent transition (20) is defined by the interruption (21) Slider is formed, closed.
  • the designed as an elastic bag secondary vessel (30) consists of a semicircular lower formed
  • the riser (40) has an upper opening (41) and a lower opening (42).
  • FIG. 2 shows a further preferred embodiment of the primary vessel (10) or secondary vessel (30) of the device according to the invention, which is designed as an elastic, flat bag.
  • the bags are made of two superimposed plastic films which are cut over one another on the line (100) and are welded over the surface (101).
  • Primschen ⁇ vessel (10) and secondary vessel (30) and the inlet and / or outlet lines (11, 31) with the terminals (12, 32) and the transition (20) are fixed on a support plate (60).
  • Transition (20) is designed as an elastic hose and is closed by the trained as a clamping slide Unterbre ⁇ chung (21) which is slidably mounted on the support plate (60), closed by jamming.
  • Figure 3 shows a preferred embodiment of the erfindungsge ⁇ MAESSEN device.
  • FIG. 4 shows the embodiment according to FIG. 3, inserted into a centrifuge cup (50) made of metal.
  • FIG. 5 shows the results (numbers on the ordinate in pg proteins / ml) of ELISA tests on various growth factors or cytokines in serum obtained from whole blood immediately after removal of whole blood (legend: t ⁇ ), thrombocyte-poor plasma isolated from whole blood according to the invention ( Legend: PPP) and in coagulated gel obtained according to the invention, in particular on activated platelets (legend: PRP).
  • Example 1 Kit for obtaining thrombocyte-rich plasma from whole blood
  • a sterilizable single-use kit is put together, which contains the following:
  • the bag system according to the invention for the production of platelet concentrate (FIGS. 1 to 3, Table 1),
  • All components are single-use items, packaged and gamma-sterilized and provided with sterling outer packaging as a whole.
  • Tables 1 and 2 list the materials of the components used.
  • Table 1 Inventive device according to FIGS. 1 to 3
  • Component material, supplier
  • Support plate (60) (cover) ABS Terlux 2802, green translucent
  • Component Material, supplier device according to the invention (see Table 1) Butterfly cannula 1, 1 x 19 mm Closure cap: PE LL adapter: ABS transparent Wing connection head: PVC Tube: PVC 60 Sh A Cannula: ISO 638/13
  • Protective hose PE Cannula 1, 1 x 40 mm connection head: PP protective cap: PP cannula: stainless steel acc. DIN EN ISO 9626
  • Piston rod PP
  • Piston plugs PP
  • Perfusor line 1 5 m, LL male: ABS KR 2802 1, 0 x 2.7 mm Cap: PE 1 opaque
  • Tube inner Layer: ND PE middle layer: EVA outer layer: PVC
  • the required blood sample is taken with a 60 ml Luerlock syringe, which is charged with anticoagulation of the blood with 6 ml citrate / dextrose solution as anticoagulant (ACD-A) prior to collection.
  • ACD-A anticoagulant
  • the syringe is slowly filled to the 60 ml mark with whole blood. Attention is paid to bubble-free filling, so that in fact exactly 60 ml are in the syringe.
  • the blood-filled syringe is slowly rocked 5 to 6 times to ensure that ACD-A is evenly distributed.
  • the interruption (21) on the upper side of the support surface designed as a sliding clamp is pressed towards the center in order to close the hose. Remove the cap and connect the syringe to the red connector (12). In order to avoid confusion between the two connections on the carrier plate, the Luerlock connection for filling the whole blood is colored red.
  • the contents of the syringe are filled slowly and completely via the supply / discharge line (11) into the primary container (10) designed as an elastic bag. The syringe is screwed Susing and the port (12) of the bag is closed with a new cap again.
  • the bag system with the filled primary container (10) is inserted into the empty sterile centrifuge suspension, into the centrifuge cup (50). Attention is paid to the correct orientation of the carrier plate (60) of the bag system in the cup (FIG. 4).
  • the centrifuge bowl (50) is closed with the associated screw cap.
  • the sealed centrifuge cup is inserted into the centrifuge. The cup is held slightly inclined. After checking the correct weight balance by means of an enclosed water bottle (filled with about 30 ml of water), the centrifugation is carried out at 2500 rpm for 3 minutes. After expiration of the centrifugation, in which a separation of the cellular blood components of the liquid takes place, the centrifuge cup is carefully removed together with the bag system.
  • the erythrocytes (EC) have accumulated in the lower portion of the primary vessel (10).
  • the supernatant plasma and the intervening "buffy coat” (mononuclear cells, MZ) and thrombocytes are now by slowly rolling and / or spreading of the primary vessel (10) by means of a conventional detectable clamp from below via the transition (20) under
  • the slide on the upper side is again pulled away from the center of the lid so that the transparent tube of the transfer line (20) is released Tube is filled at the top of the carrier plate completely filled with red blood components and possibly erythrocytes spill into the secondary vessel, the slide designed as a breaker (21) on the support plate is moved towards the center to close the transfer hose and the passage in to stop the secondary vessel.
  • the secondary vessel now essentially contains the plasma component of the blood with thrombocytes and leucocytes as well as erythrocytes in a small amount. However, the platelets are still evenly distributed in the plasma and therefore not sufficiently concentrated.
  • the thrombocytes (and the other cellular constituents contained in the blood) are now fractionated in the lower section of the bag as a pellet and the plasma fraction in the supernatant.
  • the bag system is again inserted into the centrifuge using a second, sterile centrifuge beaker (50) and centrifuged at 3200 rpm for 15 minutes.
  • the centrifuge beaker with the bag system is taken out of the centrifuge again, and via the removal connection (32) of the inlet / outlet (31) of the secondary vessel (30), the supernatant plasma ("platelet poor plasma", PPP) except for a small amount (less than about 2 ml)
  • PPP platelet poor plasma
  • the withdrawn low-platelet plasma is thoroughly mixed in the syringe.
  • the syringe is vented and reconnected to the withdrawal port (32).
  • About 4 ml of the plasma are returned to the bag.
  • the plasma is mixed by gently "massaging" the elastic bag with the platelet fraction to form a uniform suspension of thrombocytes, which is then removed from the bag with a 10 ml syringe via inlet / outlet (31)
  • This is rotated upon removal of the plasma upside down, so that the remaining amount collects in the tip of the in the tapered portion of the secondary vessel (30) and through the opening arranged there (41) of the manifold (40) of the inlet / outlet (31) can be taken.
  • the plasma thus obtained (amount about 5 to 6 ml) is thrombocyte-rich plasma ("platelet rieh plasma", PRP).
  • the thrombocyte-rich plasma contained in the sampling syringe (amount approx. 5-6 ml) will be coagulated by adding 1 mMO% calcium gluconate solution.
  • the end product obtained is about 6 to 7 ml of thrombocyte-rich gel, which is characterized by a high content of various growth factors (FIG. 5) and can be supplied to various applications.
  • thrombin bovine thrombin
  • thrombin causes a rapid crosslinking of the fibrin, which among other things leads to a better An ⁇ adhesion of the gel to injured tissue and thus to a verbes ⁇ serten applicability of the thrombocyte-rich gel.
  • Figure 5 shows the results of the ELISA tests.
  • FIG. 5 shows that in particular the growth factors PDGF 1 TGF- ⁇ , HGF, FGF-II and IL-1ra in platelet-rich plasma are greatly increased in their concentration (pg proteins / ml) (logarithmic representation on FIG Ordinate). IGF-1 is also significantly increased in its concentration (logarithmic representation). In contrast, TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ are scarcely elevated in their concentration.

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Abstract

Verfahren und Mittel zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma (“platelet rich plasma“, PRP), welches insbesondere einen hohen Gehalt an insbesondere aktivierten Thrombocyten aufweist und welches insbesondere leicht coagulierbar ist, aus Vollblut.

Description

Verfahren und Mittel zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Gewin¬ nung von thrombocytenreichem Plasma („platelet rieh pJasma", PRP), das einen hohen Gehalt an Thrombocyten aufweist und wel- ches insbesondere leicht gelierbar ist, aus Vollblut.
Thrombocytenreiches Plasma (PRP) wird in der Medizin unter ande¬ rem genutzt in der Behandlung von Wunden, zur Unterstützung der Knochenheilung, zur Blutstillung, insbesondere in der plastischen Chirurgie, etc. Dabei steht die Aufbereitung und der Einsatz von autologem thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut im Vorder¬ grund.
Thrombocyten in thrombocytenreichem Plasma zeichnen sich insbe¬ sondere durch ihren hohen Gehalt an Proteinen, insbesondere Wachstumsfaktoren und Cytokinen aus, die bei entsprechender Behandlung aus den Thrombocyten freigesetzt werden können. Bei den Wachstumsfaktoren und Cytokinen handelt es sich im Wesentli¬ chen um PDGF („platelet derived growth factor"), TGF („transforming growth factor"), VEGF („vascular endothelial growth factor") und EGF („epithelial growth factor"). Diese Substanzen besitzen eine Vielzahl von positiven Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit, insbe¬ sondere die Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen des tieri¬ schen und menschlichen Körpers. Das Interesse der Medizin an Verfahren zur konzentrierten Gewinnung von Thrombocyten oder thrombocytenreichem Plasma ist daher groß.
In präklinischen Versuchen an humanen fetalen osteoblastenähnli- chen Zellen in Zellkultur zeigten Slater et al. (J. Orthopaedic Res. 13:655-663), dass der Zusatz eines humanen thrombocytenreichen Plasmas zum Zellkulturmedium die Thymidinaufnahme der Zellen als ein Indikator für die Synthese von Knochenmatrix ungefähr um das 4-fache steigerte. Über einen Zeitraum von 30 Tagen stieg die Dicke der dabei gebildeten Mehrzellschicht um cirka das 36-fache gegen¬ über unbehandelten Vergleichskulturen.
Die ersten klinischen Anwender waren Marx et al. (Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. (1998) 85:638-646), die zeig¬ ten, dass die Zugabe von Thrombocytenkonzentrat zu autologen Knochenspänen, welche vornehmlich zur Wiederherstellung des Kieferknochens eingesetzt wurden, zu einer deutlich quantifizierba¬ ren Beschleunigung der Knochenneubildung und einer erhöhten Knochendichte in diesem Bereich gegenüber unbehandelten Kno¬ chenspänen führte. Unerwünschte Nebenwirkungen wurden dabei nicht beobachtet. Daraufhin führten Lowery et al. (Bone (August 1999) Suppl. 25(2):47S-50S) erfolgreiche Tests zur Wirkung von autologem Thrombocytenkonzentrat bei der Fusion von Wirbelkör¬ pern durch. Sie fanden, dass die Reifung des Knochens im Initi¬ alstadium deutlich beschleunigt wird. Auch hier wurden keine Ne- benwirkungen beobachtet.
Im Wesentlichen besteht der medizinische Nutzen von autologem thrombocytenreichem Plasma neben seiner Eigenschaft, eine reiche Quelle für verschiedene heilungsfördernde Wachstumsfaktoren und Cytokine darzustellen, in der Förderung einer beschleunigten Wund- heilung in allen Geweben, in der Förderung einer höheren Kollagen¬ konzentration in heilenden Wunden, was insbesondere zu höherer Narbenfestigkeit führt, in der Förderung beschleunigter Gefäßneubil¬ dung, in der Förderung einer reduzierten Knochenreifungsdauer, in der Förderung einer erhöhten lokalen Knochendichte, in der Förde¬ rung teilweise reduzierter postoperativer Schmerzen und in der För¬ derung geringerer Wundinfektionsraten. Dabei ist bei der Gewinnung des thrombocytenreichen Plasmas aus autologem Vollblut insbeson- dere auch die Gefahr der Krankheitsübertragung von fremden Orga¬ nismen gebannt.
Eine bekannte Technik für die Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut ist in der WO 00/61265 und in der WO 01/83068 der Firma Harvest Technologies Co. beschrieben, wobei eine Vor- richtung mit zwei kommunizierenden Gefäße eingesetzt wird und zur Präparation des thrombocytenreichen Plasmas das erste Gefäß mit entnommenem Vollblut gefüllt wird, durch Zentrifugation ein erythro- cytenreiches Pellet und ein die Thrombocyten enthaltender Plasma¬ überstand davon automatisch durch die Anordnung eines Schwim- mers innerhalb des Gefäßsystems während der Zentrifugation abge¬ trennt wird. Ein schwankender Hämatokrit kann dabei nicht kompen¬ siert werden. In einem zweiten Zentrifugationsschritt werden Plasma und eine thrombocytenreiche Fraktion voneinander getrennt und anschließend der Plasmaüberstand teilweise entnommen und das Thrombocytenpellet in einem verbleibenden Plasmaanteil resuspen¬ diert, um ein thrombocytenreiches Plasma zu erhalten.
Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Gewinnung von thrombocyten¬ reichem Plasma aus Vollblut wird in der WO 00/54825 beziehungs¬ weise der US 6,325,750 B1 der Firma Implant Innovations Inc. be- schrieben, worin ein System mit zwei über eine Überleitung kommu¬ nizierenden elastischen Beuteln in einem Becher eingesetzt wird. Das in den einen Beutel applizierte Vollblut wird zentrifugiert und anschließend mittels Injizieren einer festen Luftmenge in das VoIu- men zwischen elastischer Gefäßwand und fester Becherwand der thrombocytenhaltige Plasmaüberstand vom erythrocytenreichen Pellet abgetrennt und in den zweiten elastischen Beutel überführt. Auch hier werden in einem zweiten Zentrifugationsschritt Plasma und eine thrombocytenreiche Fraktion voneinander getrennt, der Plasmaüberstand teilweise entnommen und das Thrombocytenpellet in einem verbleibenden Plasmaanteil resuspendiert, um ein throm- bocytenreiches Plasma zu erhalten.
Die bekannten Technologien und Verfahren zur Gewinnung von autologem thrombocytenreichem Plasma können eine konstante und hohe Ausbeute und Qualität nicht bieten. Die Schwankungen in Ausbeute und Qualität sind zurückzuführen auf die Variabilität des Hämatokrits des entnommenen Vollbluts. Der Hämatokrit, das heißt der Volumenanteil der zellulären Bestandteile des Gesamtvolumens des Vollbluts, kann interindividuell erheblich schwanken, beispiels¬ weise von 35 bis 50 %. Die bestehenden Systeme zur Herstellung von frischen Thrombocytenkonzentraten sind nicht in der Lage, diese Variabilität des Hämatokrit zu kompensieren. Folglich schwankt die Qualität des Endproduktes im Hinblick auf die Ausbeute und die Qualität des erhaltenen thrombocytenreichen Plasmas beträchtlich.
Eine weitere Ursache für die Schwankungen in der Ausbeute und Qualität ist das teilweise erhebliche Zeitintervall zwischen Blutab¬ nahme und Präparation des thrombocytenreichen Plasmas. Bei der üblichen Herstellung in Blutbanken ist die Zeitspanne zwischen Her- Stellung und Verwendung zu groß, um eine akzeptable Ausbeute an aktiven Wachstumsfaktoren zu ermöglichen. Üblicherweise werden für die Präparation mindestens 500 ml Vollblut benötigt. Dies bedeu¬ tet, dass für eine autologes Präparat der Patient mindestens 5 Tage vorher Blut spenden muss, um seine körperliche Belastung gering zu halten. Die dann notwendige Lagerung führt unweigerlich zu einer Verringerung der Qualität.
Es ist daher wünschenswert, thrombocytenreiches Plasma autolog und möglichst vor Ort und frisch, sowie unter stets sterilen Bedin¬ gungen, bei gleicher konstanter Ausbeute herstellen zu können. Es ist außerdem wünschenswert, ein thrombocytenreiches Plasma hoher Qualität zu erhalten, welches eine große Menge an nützlichen Proteinen wie Wachstumsfaktoren und Cytokinen bildet und einen hohen Anteil an Thrombocyten aufweist.
Darüber hinaus wird thrombocytenreiches Plasma für eine Reihe von Anwendungen vermehrt als koaguliertes thrombocytenreiches Gel eingesetzt. Die mechanische Festigkeit des Gels ist dabei entschei¬ dend für dessen Effektivität und Wirksamkeit bei diesem Einsatz. Es zeigt sich aber, dass das mit bekannten Verfahren erhältliche throm- bocytenreiche Plasma auch eine geringe Qualität bezüglich seiner Koagulierbarkeit aufweist. Es ist daher auch wünschenswert, throm¬ bocytenreiches Plasma zu erhalten, welches eine hohe Koagulier¬ barkeit aufweist und zu einem besser einsetzbaren thrombocytenrei- chen Gel koaguliert werden kann.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Prob¬ lem besteht im Wesentlichen darin, ein Verfahren und Mittel zur Gewinnung von thrombocytenreichen Plasma aus Vollblut bereitzu¬ stellen, das die Nachteile im Stand der Technik überwindet, wobei das gewonnene thrombocytenreiche Plasma reich an, insbesondere aktivierten, Thrombocyten ist und/oder eine verbesserte Koagulier¬ barkeit aufweist. Die vorliegende Erfindung wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung von an Thrombocy- ten reichem Plasma aus Vollblut, wobei in einem ersten Schritt a) das Vollblut aufgetrennt wird in mindestens eine erythrocytenhaltige Fraktion und in eine Plasmafraktion, welche die Thrombocyten ent¬ hält und im Wesentlichen erythrocytenfrei ist, in einem zweiten Schritt b) das thrombocytenhaltige Plasma von der erythrocytenhalti- gen Fraktion getrennt wird, in einem weiteren Schritt c) das thrombo¬ cytenhaltige Plasma, bevorzugt mittels Zentrifugation, in eine throm- bocytenhaltige Fraktion, die vorzugsweise neben den Thrombocyten außerdem kernhaltige Zellen, das heißt mononucleäre Zellen („buffy coat") aufweist und/oder insbesondere als Pellet vorliegt, wobei vorzugsweise unmittelbar über dem gebildeten Pellet teilweise noch weitere Thrombocyten suspendiert im Plasma vorliegen, und in ei- nen Überstand aus thrombocytenarmem Plasma aufgetrennt wird, in einem weiteren Schritt d) der gewonnene Überstand aus thrombocy- tenarmen Plasma, bevorzugt mittels einer Spritze, entnommen wird, in einem weiteren Schritt e) das entnommene thrombocytenarme Plasma durchmischt wird, in einem weiteren Schritt f) durchmischtes thrombocytenarmes Plasma in die Thrombocyten-Fraktion zurückge¬ geben, das heißt reappliziert, wird, in einem weiteren Schritt g) die Thrombocyten-Fraktion in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma suspendiert wird, insbesondere durch Durchmischen, bevor¬ zugt durch mechanisches Durchmischen, und in einem weiteren Schritt h) die in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma re¬ suspendierte Thrombocyten-Fraktion als an Thrombocyten reiches Plasma, insbesondere als an aktivierten Thrombocyten reiches Plasma, gewonnen wird. Die Erfinder fanden überraschend, dass insbesondere durch die Reapplikation von zuvor entnommenen und nach der Entnahme durchmischten Plasmaüberstand eine deutlich gesteigerte Thrombo- cytenaktivierung erfolgt. Die Erfinder fanden weiter überraschend, dass insbesondere durch die Reapplikation von zuvor entnommenen und nach der Entnahme durchmischten Plasmaüberstand ein throm- bocytenreiches Plasma gewonnen wird, das eine deutlich verbesser¬ te Koagulierbarkeit aufweist. Ohne auf die Theorie beschränkt zu sein, ist dieser Effekt eventuell darauf zurückzuführen, dass durch diesen erfindungsgemäßen Verfahrensschritt die Thrombocyten in einem Plasma resuspendiert werden, welches alle Plasmabestand¬ teile, hochmolekulare und niedermolekulare, in physiologisch richti¬ ger Zusammensetzung enthält. Dadurch sind auch die für die an¬ schließende Koagulierung wichtigen Gerinnungsfaktoren in dem erfindungsgemäß erhaltenen thrombocytenreichen Plasma enthal¬ ten, wodurch dieses leichter koaguliert werden kann und ein verbes¬ sertes thrombocytenreiches Gel gewonnen werden kann.
Die bekannten Verfahren leisten dies nicht, da hier zur Gewinnung eines thrombocytenreichen Plasmas lediglich ein Teil des Plasmas aus dem Überstand abgezogen wird, während ein Plasmarest, ent¬ haltend insbesondere hochmolekulare Anteile, mit der Thrombocy- ten-Fraktion vermischt wird.
Die Erfindung sieht vor, dass, insbesondere autologes, und insbe¬ sondere venöses, Vollblut einem Patienten entnommen wird und unmittelbar anschließend aus diesem Blut mindestens eine erythro- cytenreiche Fraktion von dem die Thrombocyten und vorzugsweise den „buffy coat" enthaltenden Plasma, das heißt von mindestens einer überwiegend Thrombocyten und mononucleäre Zellen enthal- tenden Fraktion abgetrennt wird. Dazu wird das in ein Gefäß, insbe¬ sondere elastisches Gefäß, bevorzugt einen elastischen Beutel, eingebrachte Vollblut mittels Zentrifugation, bevorzugt bei von 1500 bis 3500 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise von 2000 bis 2800 Umdrehungen pro Minute, über einen bevorzugten Zeitraum von 1 ,5 bis 4 Minuten aufgetrennt und in dem Gefäß eine erythrocytenreiche, insbesondere erythrocytenhaltige Fraktion als Pellet am Boden des Gefäßes und mindestens eine die Thrombocyten und bevorzugt mononuleäre Zellen enthaltende „buffy coaf-Fraktion als Überstand erhalten. Es entstehen also mindestens drei Fraktionen: Eine erythrocytenhaltige Fraktion, welche rot erscheint, eine thrombocy- tenhaltige „buffy coaf-Fraktion , welche als weiße, viskose und dünne Schicht erscheint, und ein gelb bis orange erscheinender Überstand aus Plasma.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das in dem Gefäß, insbesondere dem elastischen Beutel, durch die Zentrifugati¬ on fraktionierte Vollblut durch Aufrollen und/oder Ausstreichen des Gefäßes derart mechanisch beaufschlagt, dass der Überstand aus Plasma zusammen mit der thrombocytenhaltigen „buffy coat"- Fraktion, welche sich im oberen Abschnitt des Gefäßes befinden, aus dem ersten Gefäß herausgepresst wird und insbesondere über eine Überführungsleitung, welche mit einem zweiten Gefäß, insbe¬ sondere einem elastischen Gefäß, insbesondere einem elastischen Beutel, verbunden ist, in dieses überführt wird, wobei das erythrocy- tenhaltige Pellet in dem ersten Gefäß verbleibt. Erfindungsgemäß ist dabei vorgesehen, die erythrocytenhaltige Fraktion in Abhängigkeit vom Hämatokrit des entnommenen Vollbluts abzutrennen. Bevorzugt erfolgt die Anpassung dadurch, dass das Auspressen des Überstan¬ des aus dem ersten Gefäß, insbesondere durch Aufrollen und/oder Ausstreichen, solange fortgesetzt wird, bis zum einem der Plasmaü¬ berstand weitgehend überführt ist und die erythrocytenhaltige Frakti¬ on, das heißt das erythrocytenhaltige Pellet, am oberen Ende des Gefäßes lokalisiert ist. Durch die erfindungsgemäß besonders be- vorzugte Ausführung des ersten Gefäßes und/oder der Überfüh¬ rungsleitung aus optisch durchlässigem Material lässt sich der be¬ ginnende Übertritt einer erythrocytenhaltigen Fraktion, und damit das Ende des Überführungsvorgangs, am Erscheinen von Erythrocyten am oberen Ende des ersten Gefäßes und/oder in der Überführungs- leitung detektieren. Die Erfindung macht sich die Eigenschaften von Erythrocyten zunutze, insbesondere im sichtbaren Bereich des Lichts Lichtenergie zu absorbieren, insbesondere durch eine Rot- bis Blau¬ färbung in Erscheinung zu treten. Die Gegenwart von Erythrocyten am oberen Ende des ersten Gefäßes und/oder in der Überführungs- leitung wird erfindungsgemäß bevorzugt durch geeignete Detektoren oder Zähler in an sich bekannter Weise und/oder durch einfache Sichtkontrolle festgestellt und dann der Überführungsvorgang ge¬ stoppt. Auf diese Weise wird erfindungsgemäß vorteilhaft erreicht, dass in jedem Fall und unabhängig vom vorliegenden individuellen Hämatokrit die größtmögliche Menge an Thrombocyten aus dem Vollblut gewonnen wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird daher unter der Formulierung „kontrolliertes Überführen" derjenige Vorgang des Überführens des Überstands aus thrombocytenhaltigem Plasma aus zentrifugiertem, fraktioniertem Vollblut verstanden, welcher in Ab¬ hängigkeit vom individuell vorliegenden Hämatokrit des eingesetzten Vollbluts der Vorgang des Überführens des Plasmaüberstands im Augenblick der detektierbaren beginnenden Überführung einer ery¬ throcytenhaltigen Fraktion gestoppt wird. Die beginnende Überfüh- rung einer erythrocytenhaltigen Fraktion ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass ein detektierbarer Anteil von Erythrocyten am oberen Ende des ersten Gefäßes und/oder in der Überführungslei¬ tung vorliegt. Es wird bevorzugt, alle Thrombocyten in das zweite Gefäß zu überführen, als eine besonders reine, das heißt von Erythrocyten freie, Thrombocytenfraktion zu erhalten.
Die Erfindung sieht weiter vor, dass in weiteren Verfahrensschritten das überführte und von der erythrocytenhaltigen Fraktion abgetrenn¬ te thrombocytenhaltige Plasma vorzugsweise durch Zentrifugation bei von 2900 bis 5000 Umdrehungen pro Minute, bevorzugt von 3200 Umdrehungen pro Minute, über einen Zeitraum von 10 bis 20 Minuten, bevorzugt von 15 Minuten, in eine Thrombocytenfraktion, die, vorzugsweise zusammen mit monoculeären Zellen, insbesonde¬ re als Pellet vorliegt, und in einen thrombocytenarmen Plasmaü- berstand fraktioniert wird. Erfindungsgemäß wird thrombocytenarmes Plasma, insbesondere über eine Öffnung am oberen Abschnitt des zweiten Gefäßes, insbesondere des elastischen Beutels, worin die Auftrennung des thrombocytenhaltigen Plasmas erfolgt ist, entnom¬ men, so dass die, vorzugsweise als Pellet vorliegende, Thrombocy- tenfraktion in dem zweiten Gefäß verbleibt. In einer Variante wird das thrombocytenarme Plasma vollständig und/oder im Wesentli¬ chen vollständig entnommen. In einer alternativen Variante werden bis zu 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 20 %, 10 % des thrombocyte¬ narmen Plasmas entnommen. In einer besonders bevorzugten Vari- ante wird das thrombocytenarme Plasma in einer Menge entnom¬ men, die in Abhängigkeit von dem individuellen Hämatokrit des ein¬ gesetzten Vollbluts gewählt wird. Nach der Trennung von Thrombocyten und Plasma ist das Plasma stratifiziert, das heißt insbesondere in dem oberen Teil des Plasmas befinden sich kleine Bestandteile und im unteren Teil des Plasmas befinden sich größere Bestandteile, wird nun, wie in bekannten Ver- fahren, nach der Zentrifugation nur der obere Teil des Plasmas ab¬ genommen, ist das mit der Thrombocyten-Fraktion verbleibende Plasma unnatürlicherweise an hochmolekularen Bestandteilen ange¬ reichert. Erfindungsgemäß wird das entnommene thrombocytenarme Plasma, vorzugsweise in dem zur Entnahme verwendeten Mittel, insbesondere einer Spritze, mechanisch durchmischt. Dadurch wird erfindungsgemäß vorteilhaft erreicht, dass sich die durch die voraus¬ gehende Zentrifugation aufgetrennten Plasmabestandteile wieder vermischen, so dass sich eine weitgehend physiologische Zusam¬ mensetzung des Plasmas einstellt, das heißt ein Plasma gewonnen wird, welches eine homogene Zusammensetzung von natürlich vor¬ kommenden Plasma aufweist. In einem weiteren erfindungsgemä¬ ßen Schritt wird das entnommene und durchmischte thrombocyte¬ narme Plasma zu der Thrombocyten-Fraktion, also insbesondere in das die Thrombocyten-Fraktion enthaltende zweite Gefäß, zurück- gegeben, das heißt reappliziert, und anschließend die Thrombocy¬ ten-Fraktion mit dem zurückgegebenen Plasma vermischt und da¬ durch resuspendiert wird. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die Resuspension durch mechanische Durchmischung der Thrombocy¬ ten-Fraktion aus dem reapplizierten Plasma. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, die Resuspension in dem zweiten Gefäß, welches be¬ vorzugt als elastischer Beutel ausgeführt ist, durchzuführen, wobei der Inhalt des zweiten Gefäßes durch bevorzugt manuelle, mechani¬ sche Beaufschlagung der elastischen Gefäßwände, insbesondere durch Massieren, vermischt wird. Dadurch wird erfindungsgemäß vorteilhaft erreicht, dass die mechanische Belastung der mechanisch empfindlichen Thrombocyten auf ein Mindestmaß reduziert wird, was die Gewinnung eines insbesondere an aktivierten Thrombocyten reichen Plasmas fördert. Das insbesondere an aktivierten Thrombo- cyten reiche Plasmas wird dann durch Überführen beziehungsweise Aufnehmen der in dem reapplizierten thrombocyten armen Plasma resuspendierten Thrombocytenfraktion gewonnen.
Erfindungsgemäß ist bevorzugt vorgesehen, das gewonnene throm- bocytenreiche Plasma in einem weiteren Schritt i) mit mindestens einem Koagulanz, das heißt einem Gerinnungsmittel, zu versehen, so dass es zu einer Koagulation des Plasmas kommt und ein insbe¬ sondere an aktivierten Thrombocyten und/oder Wachstumsfaktoren reiches Gel gewonnen wird. Die Bildung dieses Gels wird dadurch stark gefördert, dass die angemessene Konzentration und das an- gemessene Verhältnis aller relevanten Gerinnungsfaktoren, welche naturgemäß im Plasma vorhanden sind, in dem erfindungsgemäß gewonnenen thrombocytenreichen Plasma vorliegen.
Sowohl das erfindungsgemäß erhaltene thrombocytenreiche Plasma als auch das erfindungsgemäß bevorzugt erhaltene thrombocyten- reiche Gel weisen gegenüber dem mittels bekannter Verfahren ge¬ wonnenen thrombocytenreichen Plasma eine deutlich verstärkte Bildung beziehungsweise Konzentration an Proteinen wie Wachs¬ tumsfaktoren und/oder Cytokinen in den enthaltenen Thrombocyten auf. Insbesondere in Abhängigkeit von der Qualität der gewonnenen Thrombocyten und/oder des Koagulanz kommt es zu einem Platzen von Thrombocyten, wodurch bei der Gelbildung die Wachstumsfak¬ toren beziehungsweise Cytokine freigesetzt werden. Nachgewiese¬ nermaßen werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfin- dung folgende Wachstumsfaktoren beziehungsweise Cytokine in dem erfindungsgemäß erhaltenen thrombocytenreichen Plasma und insbesondere im daraus gewonnenen thrombocytenreichen Gel verstärkt gebildet: Die Wachstumsfaktoren PDGF, TGF-ß, HGF, FGF-II und IGF-I sowie das entzündungshemmende IL-1 ra. TNF-α und IL-1 ß sind Inflammationsmarker, die hingegen kaum erhöht sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch das mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte insbesondere an aktivierten Thrombocyten reiche Plasma und das daraus, insbeson- dere durch Koagulation mit einem Koagulans, gebildete Gel. Auf¬ grund ihrer vorteilhaften Eigenschaften dienen das erfindungsgemäß erhaltene thrombocytenreiche Plasma beziehungsweise Gel der Prophylaxe und/oder Therapie beziehungsweise Heilung einer Viel¬ zahl von Erkrankungen.
Da das erfindungsgemäße thrombocytenreiche Plasma beziehungs¬ weise Gel besonders vorteilhaft eine hohe Leukocytenkonzentration aufweist, wird dieses bevorzugt eingesetzt, um die Infektionsgefahr bei der Behandlung zu reduzieren. Weiter weist das erfindungsge¬ mäße thrombocytenreiche Plasma beziehungsweise Gel besonders vorteilhaft eine hohe Konzentration an dendritischen Zellen auf.
Die Erfinder fanden weiter überraschend, dass das erfindungsgemäß erhaltene thrombocytenreiche Plasma beziehungsweise Gel, wenn es mit beispielsweise autologen Knochenspänen und/oder Knochen¬ ersatzstoff, beispielsweise Hydroxylapatit, vermischt wird, einen besonders vorteilhaften „Kitt" zur Füllung und/oder Wiederherstellung von Knochendefekten ergibt. Ein weiterer Gegenstand der vorlie¬ genden Erfindung ist daher auch die Verwendung des erfindungs- gemäß erhaltenen thrombocytenreichen Plasmas beziehungsweise Gels zur Füllung oder Wiederherstellung von Knochendefekten in Verbindung mit Knochenspänen und/oder Knochenersatzstoffen.
Weiter zeigte sich überraschend, dass das erfindungsgemäß erhal- tene thrombocytenreiche Plasma beziehungsweise Gel die Bildung von Zwischenzellmatrix beschleunigt, was beispielsweise, besonders vorteilhaft, zu einem früheren Wundverschluss führt. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwen¬ dung des erfindungsgemäßen thrombocytenreichen Plasmas bezie- hungsweise Gels zur Beschleunigung des Wundverschlusses.
Die klinischen Einsatzgebiete des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäß erhältlichen thrombocytenreichen Plas¬ mas beziehungsweise Gels sind vielfältig. Sie umfassen die Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, die Orthopädie, die plastische und rekonstruktive Chirurgie sowie die Dermatologie. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des erfin¬ dungsgemäßen thrombocytenreichen Plasmas beziehungsweise Gels zur Beschleunigung und/oder Unterstützung der Heilung diabe¬ tischer Ulzerationen, insbesondere an den unteren Extremitäten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwen¬ dung des erfindungsgemäßen thrombocytenreichen Plasmas und/oder Gels zur Beschleunigung der Regeneration von Knochen, Knorpeldefekten, Endothel, Epithel und/oder Epidermis; zur Stimula¬ tion der Gefäßneubildung; zur Verstärkung der Collagen-Synthese; zur Beschleunigung der Heilung von Weichgeweben; zur Verringe- rung der Narbenbildung; zur Erleichterung der Blutstillung; zur Linde¬ rung und/oder Umkehrung der negativen Effekte von Cortikoiden auf die Wundheilung; beim Auffüllen von Knorpeldefekten bei der auto¬ logen Knorpeltransplantation (ACT), wo eine Matrix mit Knorpelzellen auf den Defekt geklebt wird, beziehungsweise die Verwendung des genannten Plasmas oder Gels zur Herstellung entsprechender pharmazeutischer Präparate.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrich¬ tung, insbesondere ein Beutelsystem, das bevorzugt zur Durchfüh- rung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden kann. Diese umfasst mindestens ein Primärgefäß (10) und mindestens ein Sekundärgefäß (30), welche ein kommunizierendes Gefäßsystem bilden. Primärgefäß (10) und Sekundärgefäß (30) stehen über min¬ destens eine, insbesondere verschließbare, Überleitung (20) in Ver- bindung. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Primärgefäß" ein Gefäß, das heißt Behälter, verstan¬ den, worin die in ihre Einzelkomponenten aufzutrennende Flüssigkeit oder Suspension eingebracht wird oder vorliegt und einer ersten Fraktionierung unterzogen wird. Unter einem „Sekundärgefäß" wird ein Gefäß, das heißt Behälter, verstanden, worin die vollständig oder teilweise im Primärgefäß in ihre Einzelkomponenten aufgetrennte Flüssigkeit oder Suspension vollständig oder teilweise, das heißt einzelne Fraktionen davon, eingebracht wird und diese im Sekun¬ därgefäß einer zweiten Fraktionierung unterzogen wird. Erfindungs- gemäß ist jedes dieser Gefäße mit jeweils mindestens einer, insbe¬ sondere verschließbaren, Ab- und/oder Zuleitung (11 , 31 ), insbeson¬ dere zur Zuführung, das heißt Einführen beziehungsweise Reappli- kation, von Blutkomponenten und/oder Abführen, das heißt Entneh¬ men, von Blutkomponenten vorgesehen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind Primärgefäß (10), Sekundärgefäß (30) und Überleitung (20) an einer Trägerplatte (60) fixiert. Besonders bevorzugt ist die Überleitung (20) durch min¬ destens eine Unterbrechung (21 ) welche als Ventil, Hahn und/oder Stopfen ausgebildet sein kann, verschließbar. In einer besonders bevorzugten Variante ist die Überleitung (20) als elastischer Schlauch ausgeführt und insbesondere durch mindestens eine Un¬ terbrechung (21 ) als eine Klemme, insbesondere Schlauchklemme, oder als einen den Schlauch klemmenden Schieber, welcher bevor- zugt an der Trägerplatte (60) angeordnet ist, verschließbar. Bevor¬ zugt ist die Überleitung (20) optisch durchlässig, das heißt transpa¬ rent, bevorzugt optisch klar, ausgeführt, um die optische Kontrolle des Übertritts von Erythrocyten mittels technischer Mittel und/oder Sichtkontrolle zu ermöglichen. In einer bevorzugten Variante ist die Überleitung (20) mit einem optischen Detektor beziehungsweise Zähler zur Detektion der Gegenwart von Erythrocyten in der Überlei¬ tung ausgestattet.
Sowohl Primärgefäß (10) als auch Sekundärgefäß (30) sind erfin¬ dungsgemäß bevorzugt als elastische Beutel ausgeführt. Diese Beutel sind jeweils bevorzugt in einer „Birnenform", welche sich aus einem im Wesentlichen halbkreisförmigen unteren Abschnitt (14, 34) und sich nach oben verjüngenden im Wesentlichen trichterförmigen oberen Abschnitt (15, 35) aufbaut, ausgebildet. In einer besonders bevorzugten Variante sind diese elastischen Beutel als durch Ver- schweißen und/oder Verkleben elastischer Folien hergestellte, nor¬ malerweise zunächst flache, Beutel ausgeführt, worin die verbunde¬ nen Folien bevorzugt aneinander anliegen, und die Beutel bei zweckbestimmter Befüllung des zwischen den verbundenen Folien gebildeten Lumens normalerweise charakteristische Beutelform annehmen.
Das Sekundärgefäß (30) ist erfindungsgemäß) weiter dadurch ge¬ kennzeichnet, dass der mindestens einen Ab- und/oder Zuleitung des Sekundärgefäßes mindestens ein in das Lumen des Sekundär¬ gefäßes ragendes Steigrohr (40) mit mindestens einer unteren Öff¬ nung (42), welche an der vorzugsweise in der Mitte des Sekundärge¬ fäßes, vorzugsweise an der Grenze zwischen einem halbkreisförmi¬ gen unteren Abschnitt (34) und einem trichterförmigen oberen Ab- schnitt (35) des Sekundärgefäßes ausgebildet ist, und mindestens einer oberen Öffnung (41), welche im oberen Abschnitt des Sekun¬ därgefäßes, bevorzugt an der oberen Spitze des trichterförmigen oberen Teils des Sekundärgefäßes, insbesondere am Ansatz der Ab- und/oder Zuleitung (31 ) an der Innenseite der Gefäßwand des Sekundärgefäßes, ausgebildet ist.
Die erfindungsgemäße Ausführung des Primär- und Sekundärgefä¬ ßes in einer bimenartigen Form, das heißt mit einem sich nach oben hin verjüngenden trichterförmigen oberen Abschnitt und einem halb¬ kreisförmigen unteren Abschnitt wird erfindungsgemäß vorteilhaft eine verbesserte Kontrolle der Abtrennung von Erythrocyten von thrombocytenhaltigem „buffy coat" und Plasma nach der Fraktionie¬ rung des Vollbluts im Primärgefäß erreicht. Die erfindungsgemäße Birnenform führt dazu, dass die Grenze zwischen Erythrocyten, „buffy coat" und überständigem Plasma scharf und klar reproduziert werden kann. Nach der ersten Zentrifugation ist eine breite Grenz¬ zone (Scheidungsgrenze) zwischen Erythrocyten und thrombocyten¬ haltigem „buffy coat" vorhanden. Durch die erfindungsgemäß ausge¬ bildete Verjüngung wird diese breite Grenze erst kurz vor der Über- leitung verschmälert. Die dadurch ermöglichte verbesserte Kontrolle, ermöglicht eine bessere Trennung und höhere Ausbeute. Bei den Vorrichtungen aus dem Stand der Technik, die die erfindungsbemä- ße Form nicht aufweisen, ist die Grenze zwischen Erythrocyten und thrombocytenhaltigem „buffy coat" nicht deutlich ausgebildet; da¬ durch kann es sehr leicht passieren, dass Erythrocyten schon über¬ führt werden, obwohl noch ein nicht unwesentlicher Teil an Plasma und „buffy coat" im Primärgefäß anwesend ist.
Nach der erfindungsgemäß bevorzugten Überführung des Plasmaü- berstandes aus dem Primärgefäß (10) über die Überleitung (20) in das Sekundärgefäß (30) wird erfindungsgemäß bevorzugt ein weite¬ res Mal zentrifugiert, um eine Thrombocyten-Fraktion und einen thrombocytenarmen Plasmaüberstand zu erhalten. Dabei erlaubt die erfindungsgemäß bevorzugte Birnenform des Sekundärgefäßes (30) eine besonders günstige weil gleichmäßige Verteilung der Einwir¬ kung der Zentrifugalkräfte auf die Thrombocyten pro Volumenanteil, wodurch die zur effektiven Fraktionierung der Blutbestandteile not¬ wendige Drehzahl und Zentrifugationszeit minimiert werden können, was zu einer geringeren mechanischen Belastung der Thrombocyten führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Vorrichtung für die Zentrifugation in einen Zentrifugenbecher einge¬ setzt, dieser ist so gestaltet, dass das bevorzugt als elastischer Beu¬ tel ausgeführte Primärgefäß und/oder Sekundärgefäß bei der Zentri- fugation so gedehnt wird, dass die Gefäßwände teilweise und/oder vollständig an der Innenwand des Zentrifugenbechers zu liegen kommen. Bevorzugt ist die Benutzung eines sterilen Bechers. Be¬ sonders vorteilhaft werden so die Dehnungsbelastung der Gefäß- wände und der enthaltenen Zellen während der Zentrifugation redu¬ ziert. Die bevorzugte Verwendung eines Zentrifugenbechers erlaubt auch den Einsatz von mechanisch leichterem, dünnerem und weni¬ ger stabilem Material für den erfindungsgemäß bevorzugten elasti- sehen Beutel. Der Vorteil des leichteren und dünneren Materials besteht auch darin, dass die Vermischung, das heißt Resuspension, der Thrombocyten mit dem hinzugefügten Plasma leichter ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Primärgefäß und Sekun¬ därgefäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus einem Material ausgeführt, welches aufgrund seiner Oberflächenbeschaffenheit und seiner chemischen Zusammensetzung für die Gerinnungsfähigkeit des mittels der Vorrichtung erhaltenen thrombocytenreichen Plas¬ mas besonders vorteilhaft ist. Im Vordergrund stehen dabei eine maximale Aktivierung der Thrombocyten, ohne vorzeitig eine Gerin- nung auszulösen.
Das erfindungsgemäß dem Sekundärgefäß (30) und dessen mindes¬ tens einen Zu-/Ableitung (31 ) zugeordnete Steigrohr (40) mit einer oberen Öffnung (41 ) und einer unteren Öffnung (42) erlaubt beson¬ ders vorteilhaft die praktisch vollständige Entnahme beziehungswei- se komplette Entleerung des Sekundärgefäßes, indem ein Großteil des nach der Zentrifugation im Sekundärgefäß erhaltenen Überstan¬ des zunächst durch die untere Öffnung des in das Lumen des Se¬ kundärgefäßes ragenden Steigrohrs zu einem großen Teil entnom¬ men wird und anschließend der letzte Rest nach Umdrehen des Sekundärgefäßes, so dass die sich nach oben verjüngende Spitze des Sekundärgefäßes nach unten zeigt, durch die obere Öffnung (41), welche sich an der Spitze des sich verjüngenden Teils des Sekundärgefäßes befindet, entnommen werden kann. Durch die erfindungsgemäße Kombination der vorgenannten zweckmäßigen Merkmale der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann erreicht werden, dass in einer kurzen Zeit, in einer sterilen Umge¬ bung und insbesondere unmittelbar nach der Blutentnahme, eine große Menge an qualitativ hochwertigem thrombocytenreichen Plasma effektiv und mit hoher Ausbeute gewonnen werden kann.
Selbstverständlich erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung auch die Gewinnung anderer Blutkomponenten wie Serum, Erythrocyten- konzentrat, „buffy coat" beziehungsweise mononucleäres Zellkon- zentrat, sowie thrombocytenarmes Plasma. Darüber hinaus ist die Vorrichtung auch zur Trennung anderer, insbesondere zelluläre Bestandteile enthaltender, Gewebs- beziehungsweise Körperflüssig¬ keiten geeignet. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch ein¬ gesetzt werden, um alle Arten von Zellsuspensionen, beispielsweise kultivierte Säugetierzellen, in ihre Bestandteile zu fraktionieren und die Fraktionen, beispielsweise Zellbestandteile, hochmolekulare Proteine etc. getrennt zu gewinnen. Die erfindungsgemäße Vorrich¬ tung erlaubt bevorzugt die optische Kontrolle bei der Abtrennung zellulärer von nichtzellulären beziehungsweise weiteren zellulären Bestandteilen. Dabei ist auch vorgesehen, verschiedene Zellbe¬ standteile einer Zellsuspension oder einer zelluläre Bestandteile enthaltenden Flüssigkeit mit geeigneten Farbstoffen zu markieren.
Die Erfindung betrifft auch einen, insbesondere steril verpackten, Kit, umfassend die erfindungsgemäße Vorrichtung. Der Kit enthält dabei bevorzugt mindestens ein Verbrauchsmaterial, vorzugsweise alle Verbrauchsmaterialien, die für die Produktion von thrombocytenrei¬ chen Plasma aus Vollblut mittels der erfindungsgemäßen Vorrich¬ tung erforderlich sind. Das System ist einfach zu handhaben und direkt am Ort des Eingriffs einzusetzen. Bevorzugt werden dazu neben der vorgenannten erfindungsgemäßen Vorrichtung handels¬ übliche Einmalgebrauchsartikel wie Spritzen, Kanülen, Klemmen, etc. eingesetzt. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch eine Vorrichtung, insbesondere Kit, zur Gewinnung von insbe¬ sondere an aktivierten Thrombocyten reichem Plasma aus Vollblut enthaltend mindestens ein Mittel zum Auftrennen des Vollbluts in eine erythrocytenhaltige Fraktion und in thrombocytenhaltiges und im Wesentlichen erythrocytenfreies Plasma, mindestens ein Mittel zum Isolieren des thrombocytenhaltigen Plasmas, mindestens ein Mittel zum Auftrennen des thrombocytenhaltigen Plasmas in eine Throm- bocyten-Fraktion und in einen Überstand aus thrombocytenarmem Plasma mittels Zentrifugation, mindestens ein Mittel zum Entnehmen von Überstand aus thrombocytenarmem Plasma, mindestens ein Mittel zum Durchmischen des entnommenen thrombocytenarmen Plasmas, mindestens ein Mittel zur Reapplikation von durchmischten thrombocytenarmen Plasmas in die Thrombocyten-Fraktion, mindes¬ tens ein Mittel zur Resuspension der Thrombocyten-Fraktion in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma und/oder mindestens ein Mittel zum Gewinnen des insbesondere an aktivierten Thrombocyten reichen Plasmas. In einer bevorzugten Variante enthält der Kit weiter mindestens ein Mittel zum Gerinnung des thrombocytenreichen Plasmas zu einem thrombocytenreichen Gel sowie Mittel zum Ge¬ winnen des thrombocytenreichen Gels.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit, insbesondere zur Gewinnung von insbesondere an aktivierten Thrombocyten reichem Plasma aus Vollblut, enthaltend die vorgenannte erfindungsgemäße Vorrichtung und eine Zentrifuge, insbesondere mit an die erfin¬ dungsgemäße Vorrichtung adaptierten Zentrifugeneinsätzen, insbe- sondere Zentrifugenbechern inklusive Ausgleichsgefäßen. Vorzugs¬ weise beinhaltet der erfindungsgemäße Kit eine Zentrifuge, die für die Benutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung modifiziert ist. Die Modifizierung besteht insbesondere aus einem Spezialrotor und insbesondere vier Spezialgehängen, mit mindestens zwei Metallbe¬ chern plus Metallschraubdeckel, die jeweils sterilisiert werden kön¬ nen, sowie mindestens ein nicht steriler Metallbecher inklusive Me¬ tallschraubdeckel für den Gewichtsausgleich. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden bevorzugt zwei steril eingeschweißte mit Ganzmetallgehänge, bestehend aus Metallbe¬ cher und Metallschraubdeckel, benötigt. Diese Metallgehänge sind so konstruiert, dass sie mittels Autoklavierung sterilisiert werden können.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren und anhand der Beispiele näher erläutert. Weitere Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, be¬ stehend aus einem als elastischen Beutel ausgebildeten Primärgefäß (10) mit einem halbkreisförmigen unteren Ab¬ schnitt (14) und einen sich verjüngenden trichterförmigen oberen Abschnitt (15) mit mindestens einer Zu- und/oder Ableitung (11 ), welche in den trichterförmigen oberen Ab¬ schnitt (15) des Primärgefäßes mündet und an ihrem unte- ren Ende, welcher in das Lumen des Primärgefäßes 10 mündet, ein Lippenventil (13), das heißt Flatterventil, trägt und an ihrem oberen Ende, außerhalb des Primärgefäßes, mit einem Anschluss (12), der als Luerlock ausgeführt ist, versehen ist. Weiter weist das Primärgefäß (10) eine Über¬ leitung (20) auf, welche an der Spitze des trichterförmigen oberen Abschnitts des Primärgefäßes (10) mündet. Diese Überleitung (20) stellt eine verschließbare Verbindung zwi- sehen dem Volumen des Primärgefäßes (10) und dem Vo¬ lumen des Sekundärgefäßes (30) dar. Die elastische trans¬ parente Überleitung (20) wird durch die Unterbrechung (21 ), welche als Schieber ausgebildet ist, verschlossen. Das als elastischer Beutel ausgeführte Sekundärgefäß (30) besteht aus einem halbkreisförmig ausgebildeten unteren
Abschnitt (34) und einem sich verjüngenden trichterförmi¬ gen oberen Abschnitt (35) sowie einer Zu- und/oder Ablei¬ tung (31 ), welche an der Spitze des sich trichterförmig ver¬ jüngenden oberen Abschnitts (35) des Sekundärgefäßes (30) in das Lumen des Sekundärgefäßes mündet und an ihrem unteren Ende, welches als Steigrohradapter (43) ausgebildet ist, ein Steigrohr (40) aufweist und an ihrem oberen Ende einen Anschluss (32) aufweist, der als Luer- lock ausgeführt ist. Das Steigrohr (40) weist eine obere Öffnung (41) und eine untere Öffnung (42) auf. Die obere
Öffnung (41 ) ist unmittelbar an der Spitze des trichterförmig zulaufenden oberen Abschnitts des Sekundärgefäßes (30) bei dem Steigrohradapter (43) angeordnet. Die untere Öff¬ nung (42) ist am unteren Ende, etwa in der Mitte des Lu- mens des Sekundärgefäßes (30), im Bereich des Über¬ gangs zwischen dem halbkreisförmigen unteren Abschnitt (34) und dem trichterförmigen oberen Abschnitt (35) ange¬ ordnet. Figur 2 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Pri¬ märgefäßes (10) beziehungsweise Sekundärgefäßes (30) der erfindungsgemäßen Vorrichtung, welche als elasti¬ scher, flacher Beutel ausgeführt ist. Die Beutel werden aus zwei übereinandergelegten Kunststofffolien hergestellt, welche übereinandergelegt an der Linie (100) ausgeschnit¬ ten und über die Fläche (101 ) verschweißt werden. Primär¬ gefäß (10) und Sekundärgefäß (30) sowie die Zu- und/oder Ableitungen (11 , 31) mit den Anschlüssen (12, 32) und die Überleitung (20) sind auf einer Trägerplatte (60) fixiert. Die
Überleitung (20) ist als elastischer Schlauch ausgeführt und wird durch die als Klemmschieber ausgebildete Unterbre¬ chung (21), welche an der Trägerplatte (60) verschiebbar angeordnet ist, durch Verklemmen verschlossen.
Figur 3 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsge¬ mäßen Vorrichtung.
Figur 4 zeigt die Ausführungsform nach Figur 3, eingesetzt in einen Zentrifugenbecher (50) aus Metall.
Figur 5 zeigt die Ergebnisse (Zahlenangaben auf der Ordinate in pg Proteine/ml) von ELISA-Tests auf verschiedene Wachs¬ tumsfaktoren beziehungsweise Cytokine in unmittelbar nach der Entnahme von Vollblut daraus erhaltenem Serum (Legende: tθ), erfindungsgemäß aus Vollblut abgetrenntem thrombocytenarmen Plasma (Legende: PPP) und in koagu- liertem, erfindungsgemäß erhaltenem, insbesondere an ak¬ tivierten Thrombocyten reichem Gel (Legende: PRP). Beispiel 1 : Kit zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut
Es wird ein sterilisierbarer Kit zum Einmalgebrauch zusammenge¬ stellt, das folgendes enthält: - Das erfindungsgemäße Beutelsystem zur Herstellung von Thrombocytenkonzentrat (Figuren 1 bis 3, Tabelle 1 ),
- eine 20-Gauge-Kanüle zum Aufziehen des ACD-A (Gerin¬ nungshemmer) in die Blutabnahmespritze,
- eine 60-ml-Spritze zur Blutabnahme, - eine Butterfly-Kanüle zur Blutabnahme,
- eine 60-ml-Spritze zur Aufnahme thrombocytenarmen Plasmas,
- eine 10-ml-Spritze zur Aufnahme thrombocytenreichen Plas¬ mas,
- eine Citrat/Dextrose-Lösung als Gerinnungshemmer zu 6 ml je Ampulle (ACD-A),
- eine 10 ml Ampulle mit 10%Calciumgluconat,
- eine Ampulle mit 1000 I.E. bovinem Thrombin.
Alle Komponenten sind Einmalgebrauchsartikel, verpackt und gam- ma-sterilisiert und als Ganzes mit sterlier Umverpackung versehen.
Die Tabellen 1 und 2 listen die Materialien der verwendeten Kompo¬ nenten auf. Tabelle 1 : erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß Figuren 1 bis 3
Komponente: Material, Lieferant
Trägerplatte (60) (Deckel) ABS Terlux 2802, grün translu- cent
Primärgefäß als Beutel (10) Beutelfolie:
PVC Compound 3222 von Solvay Draka
Sekundärgefäß als Beutel (30) Beutelfolie:
PVC Compound 3222 von Solvay Draka
Steigrohr (40) s-12/1 aus PVC Raumedic 7567
Abmessungen: 2,2 x 4,15 mm
Steigrohr-Adapter (43) ABS Terlux 2802, natur
Schlauch PVC RB4 NDG 75 Shore A, 3,0 für Überleitung (20) x 4,1 mm
Winkel für Überleitung (20) PVC RB1 S2 Unterbrechung (21) als Schieber ABS Terlux 2802, weiß
Luerlock (LL), female, rot ABS Terlux 2802, rot translucent für Anschluss (12)
Luerlock (LL), female ABS Terlux 2802, natur für Anschluss (32)
Tabelle 2: Kit
Komponente: Material, Lieferant erfindungsgemäße Vorrichtung (siehe Tabelle 1 ) Butterfly-Kanüle 1 ,1 x 19 mm Verschlusskappe: PE LL-Adapter: ABS transparent Flügel-Anschlusskopf: PVC Schlauch: PVC 60 Sh A Kanüle: ISO 638/13
Schutzschlauch: PE Kanüle 1 ,1 x 40 mm Anschlusskopf: PP Schutzkappe: PP Kanüle: Edelstahl gem. DIN EN ISO 9626
60 ml Spritze Zylinder: PP Kolbenstange: PP Kolbenstopfen: Natur¬ kautschuk
10 ml Spritze (12 cc) Zylinder: PP
Kolbenstange: PP
Kolbenstopfen: PP
Perfusorleitung 1 ,5 m, LL male: ABS KR 2802 1 ,0 x 2,7 mm Kappe: PE1 opak
LL female: PVC Kappe: ABS, rot
Schlauch: inner Layer: ND PE middle layer: EVA outer layer: PVC
Blisterverpackung PET-GAG 0,9 x 206 x 500 mm
Tyvek-Siegelpapier Tyvek 10MP/1073B
Beispiel 2: Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma aus Voll¬ blut
a) Blutabnahme
Die erforderliche Blutabnahme erfolgt mit einer 60 ml Luerlock- Spritze, die zur Antikoagulation des Blutes vor der Abnahme mit 6 ml Citrat/Dextrose-Lösung als Gerinnungshemmer (ACD-A) beschickt wird. Die Spritze wird langsam bis zur 60 ml-Markierung mit Vollblut gefüllt. Es wird auf blasenfreie Füllung geachtet, damit sich tatsäch¬ lich genau 60 ml in der Spritze befinden. Sofort nach der Blutent- nähme wird die blutgefüllte Spritze 5 bis 6 mal langsam hin- und hergeschwenkt, um sicherzustellen, dass ACD-A gleichmäßig verteilt ist.
b) Befüllen des Beutelsystems und erste Zentrifugation
Die als Schiebeklemme ausgebildete Unterbrechung (21 ) auf der Oberseite der Trägerfläche wird zum Zentrum gedrückt, um den Schlauch zu verschließen. Die Verschlusskappe wird entfernt und die Spritze mit dem roten Anschluss (12) verbunden. Um eine Ver¬ wechslung der beiden Anschlüsse auf der Trägerplatte auszuschlie- ßen, ist der Luerlock-Anschluss zur Einfüllung des Vollblutes rot gefärbt. Der Inhalt der Spritze wird langsam und vollständig über die Zu-/Ableitung (11 ) in das als elastischer Beutel ausgebildete Primär¬ gefäß (10) eingefüllt. Die Spritze wird nach der Befüllung abge¬ schraubt und der Anschluss (12) des Beutels wird mit einer neuen Verschlusskappe wieder verschlossen.
Das Beutelsystem mit dem befüllten Primärgefäß (10) wird in das leere sterile Zentrifugengehänge, in den Zentrifugenbecher (50) eingesetzt. Es wird dabei auf die richtige Orientierung der Trägerplat¬ te (60) des Beutelsystems im Becher geachtet (Figur 4). Der Zentri- fugenbecher (50) wird mit dem zugehörigen Schraubdeckel ver¬ schlossen. Der verschlossene Zentrifugenbecher wird in die Zentri¬ fuge eingesetzt. Der Becher wird dabei leicht schräg gehalten. Nach Kontrolle des korrekten Gewichtsausgleiches mittels einer beigefüg¬ ten Wasserflasche (befüllt mit ca. 30 ml Wasser) wird die Zentrifuga- tion bei 2500 U/min für 3 min durchgeführt. Nach Ablauf der Zentri¬ fugation, in der eine Separation der zellulären Blutbestandteile von den flüssigen stattfindet, wird der Zentrifugenbecher zusammen mit dem Beutelsystem vorsichtig entnommen.
c) Trennung von Ervthrocvten und Plasma
Durch die Zentrifugation haben sich die Erythrocyten (EZ) im unteren Abschnitt des Primärgefäßes (10) angesammelt. Das überständige Plasma sowie die dazwischen befindlichen „buffy coat" (mononucleä- re Zellen, MZ) und Thrombocyten werden nun durch langsames Aufrollen und/oder Ausstreichen des Primärgefäßes (10) mittels einer herkömmlichen feststellbaren Klemme von unten her über die Überleitung (20) unter Sichtkontrolle in das Sekundärgefäß (30), welches ebenfalls als elastischer Beutel ausgeführt ist, transferiert. Dazu wird vorher der Schieber auf der Oberseite wieder vom Zent¬ rum des Deckels weggezogen, so dass der durchsichtige Schlauch der Überleitung (20) freigegeben ist. Sobald der Schlauch an der Oberseite der Trägerplatte komplett mit roten Blutbestandteilen ge¬ füllt ist und sich eventuell wenige Erythrocyten in das Sekundärgefäß ergießen, wird der als Schieber ausgebildete Unterbrecher (21) auf der Trägerplatte zur Mitte hin bewegt, um den Überleitungsschlauch zu verschließen und den Übertritt in das Sekundärgefäß zu stoppen.
d) Trennung von Thrombocvten und Plasma
Im Sekundärgefäß befindet sich nun im Wesentlichen der Plasma¬ bestandteil des Blutes mit Thrombocyten und Leukocyten sowie Erythrocyten in einer geringen Menge. Die Thrombocyten sind je¬ doch noch im Plasma gleichmäßig verteilt und daher nicht ausrei- chend konzentriert. In einer zweiten Zentrifugation werden nun die Thrombocyten (sowie die weiteren enthaltenen zellulären Blutbestandteile) im unteren Abschnitt des Beutels als Pellet und die Plasmafraktion im Über¬ stand fraktioniert. Dazu wird das Beutelsystem unter Benutzung eines zweiten, sterilen Zentrifugenbechers (50) erneut in die Zentri¬ fuge eingesetzt und bei 3200 U/min für 15 min zentrifugiert.
e) Gewinnung thrombocytenarmen Plasmas
Nach Ende der zweiten Zentrifugation wird der Zentrifugenbecher mit dem Beutelsystem wieder aus der Zentrifuge genommen, und über den Entnahmeanschluss (32) der Zu-/Ableitung (31 ) des Sekundär¬ gefäßes (30) wird das überständige Plasma („platelet poor plasma", PPP) bis auf einen geringen Rest (weniger als ca. 2 ml) entnommen. Die mit Plasma gefüllte Spritze wird abgeschraubt.
f) Gewinnung thrombocytenreichen Plasmas
Das entnommene thrombocytenarme Plasma wird in der Spritze gründlich vermischt. Die Spritze wird entlüftet und wieder mit dem Entnahmeanschluss (32) verbunden. Es werden ca. 4 ml des Plas¬ mas wieder in den Beutel gegeben. Das Plasma wird durch leichtes „Massieren" des elastischen Beutels mit der Thrombocyten-Fraktion vermischt, so dass sich eine gleichmäßige Thrombocyten- Suspension bildet. Diese wird dann mit einer 10 ml Spritze über Zu-/Ableitung (31 ) aus dem Beutel entnommen. Um eine restlose Entleerung des Sekundärgefäßes (30) zu gewährleisten, wird dieser bei der Entnahme des Plasmas auf den Kopf gedreht, so dass die restliche Menge sich in der Spitze des sich in dem verjüngenden Abschnitt des Sekundärgefäßes (30) sammelt und über die dort angeordnete Öffnung (41 ) des Sammelrohrs (40) der Zu-/Ableitung (31) entnommen werden kann. Das so erhaltene Plasma (Menge ca. 5 bis 6 ml) ist thrombocytenreiches Plasma („platelet rieh plasma", PRP).
p) Präparation eines thrombocytenreichen Gels
Das in der Entnahmespritze enthaltene thrombocytenreiche Plasma (Menge ca. 5-6 ml) wird durch Zugabe von 1 mMO % Calciumgluco- natlösung zur Gerinnung gebracht werden. Als Endprodukt erhält man ca. 6 bis 7 ml thrombocytenreiches Gel, welches sich durch einen hohen Gehalt an verschiedenen Wachstumsfaktoren aus- zeichnet (Figur 5) und verschiedenen Anwendungen zugeführt wer¬ den kann.
Bei alleiniger Zugabe von Calciumionen dauert der Gerinnungspro- zess ca. 10-15 min. Bei zusätzlicher Zugabe von 1000 Einheiten Thrombin (bovines Thrombin) wird die Gerinnung deutlich beschleu- nigt. Außerdem bewirkt die Zugabe von Thrombin eine schnelle Vernetzung des Fibrins, was unter anderem zu einer besseren An¬ haftung des Gels an verletztes Gewebe und damit zu einer verbes¬ serten Anwendbarkeit des thrombocytenreichen Gels führt.
h) Ergebnisse
Ausbeute an Thrombocvten:
Durchschnittliche Thrombocytenzahl im Vollblut: 275 x 103 /ml
Durchschnittliche Thrombocytenzahl im thrombocytenarmen Plasma (PPP): 19 x 103 /ml Durchschnittliche Thrombocytenzahl im thrombocytenreichen Plasma (PRP): 1 ,3 x 106 /ml
Ausbeute an Cytokinen und Wachstumsfaktoren:
Die Figur 5 zeigt die Ergebnisse der ELISA-Tests.
Aus der Figur 5 geht hervor, dass insbesondere die Wachstumsfak¬ toren PDGF1 TGF-ß, HGF, FGF-II und IL-1ra in thrombocytenrei- chem Plasma in ihrer Konzentration (pg Proteine/ml) stark erhöht sind (logarithmische Darstellung auf der Ordinate). Auch IGF-1 ist in seiner Konzentration deutlich erhöht (logarithmische Darstellung). TNF-α und IL-1ß dagegen sind in ihrer Konzentration kaum erhöht.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von thrombocyten reichem Plasma aus Vollblut, umfassend die Schritte:
a) Auftrennen des Vollbluts in eine erythrocytenhaltige Fraktion und in thrombocytenhaltiges, im Wesentlichen erythrocytenfreies Plasma,
b) Isolieren des thrombocytenhaltigen Plasmas,
c) Auftrennen des thrombocytenhaltigen Plasmas in eine Thrombocytenfraktion und in einen Überstand aus thrombocytenarmem Plasma mittels Zentrifugation,
d) Entnehmen von Überstand aus thrombocytenarmem Plasma,
e) Durchmischen des entnommenen thrombocytenarmen Plasmas,
f) Reapplikation durchmischten thrombocytenarmen Plasmas in die Thrombocytenfraktion,
g) Resuspension der Thrombocytenfraktion in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma und
h) Gewinnen des an thrombocytenreichen Plasmas.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Auftrennen des Vollbluts in Schritt a) mittels Zentrifugation erfolgt und die erythrocytenhaltige Fraktion als Pellet und das im Wesentlichen erythrocytenfreie und thrombocytenhaltige Plasma als Überstand erhalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das thrombocytenhaltige Plasma aus einem ersten elastischen Gefäß durch kontrolliertes Überführen in ein damit verbundenes ein zweites Gefäß von der erythrocytenreichen Fraktion abgetrennt wird, wobei die Überfuhrung des Plasmas bei Detektion der beginnenden Überführung von Erythrocyten gestoppt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt i) das gewonnene thrombocytenreiche Plasma durch ein Gerinnungsmittel, insbesondere Calciumgluconat-Lösung, koaguliert wird und ein an Thrombocyten und/oder Wachstumsfaktoren reiches Gel gewonnen wird.
5. Thrombocytenreiches Plasma, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Thrombocytenreiches Gel, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
7. Vorrichtung, insbesondere zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma und/oder Gel aus Vollblut, umfassend mindestens ein Primärgefäß (10) und mindestens ein Sekundärgefäß (30) mit jeweils mindestens einer verschließbaren Ab- und/oder Zuleitung (11 ,31), welche über mindestens eine verschließbare Überleitung (20) kommunizieren, dadurch gekennzeichnet, dass Primärgefäß (10) und Sekundärgefäß (30) in einer Birnenform aus einem im Wesentlichen halbkreisförmigen unteren Teil (14,34) und einem sich nach oben verjüngendem trichterförmigen oberen Teil (15,35) ausgebildet sind.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Ab- und/oder Zuleitung (31) des Sekundärgefäßes mindestens ein in das Sekundärgefäß ragendes Steigrohr (40) mit mindestens einer unteren Öffnung (42), vorzugsweise ausgebildet an der Grenze zwischen halbkreisförmigem unteren Teil und trichterförmigem oberen Teil des Gefäßes, und mindestens einer oberen Öffnung (41), vorzugsweise ausgebildet an einer oberen Spitze des trichterförmigen oberen Teils des Gefäßes, aufweist.
9. Kit insbesondere zur Gewinnung von thrombocytenreichem Plasma aus Vollblut, insbesondere nach einem Verfahren nach Anspruch 1 , enthaltend mindestens ein Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Mittel zum Auftrennen des Vollbluts in eine erythrocytenhaltige Fraktion und in thrombocytenhaltiges, im Wesentlichen erythrocytenfreies Plasma,
b) Mittel zum Isolieren des thrombocytenhaltigen Plasmas, c) Mittel zum Auftrennen des thrombocytenhaltigen Plasmas in eine Thrombocyten-Fraktion und in einen Überstand aus thrombocytenarmem Plasma mittels Zentrifugation,
d) Mittel zum Entnehmen von Überstand aus thrombocytenarmem Plasma,
e) Mittel zum Durchmischen des entnommenen thrombocytenarmen Plasmas,
f) Mittel zur Reapplikation durchmischten thrombocytenarmen Plasmas in die Thrombocyten-Fraktion,
g) Mittel zur Resuspension der Thrombocyten-Fraktion in dem reapplizierten thrombocytenarmen Plasma und
h) Mittel zum Gewinnen des thrombocytenreichen Plasmas.
10. Kit nach Anspruch 9, insbesondere zur Gewinnung von thrombocytenreichem Gel aus Vollblut, zusätzlich enthaltend:
i) Mittel zum Koagulieren thrombocytenreichen Plasmas und
j) Mittel zum Gewinnen des thrombocytenreichen Gels.
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