DE102004028179A1 - Biotechnological preparation of functionalized di- and tri-carboxylic acid e.g. citric acid comprises culturing microorganism (capable of cleaving monocarbonic acid under aerobic condition) in monocarbonic acid culture medium - Google Patents
Biotechnological preparation of functionalized di- and tri-carboxylic acid e.g. citric acid comprises culturing microorganism (capable of cleaving monocarbonic acid under aerobic condition) in monocarbonic acid culture medium Download PDFInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von funktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren, vorzugsweise zur Herstellung der im Tricarbonsäurecyclus vorkommenden Citronensäure, Isocitronensäure, 2-Oxoglutarsäure, Aconitsäure und/oder Itaconsäure unter Verwendung von Alkylestern gesättigter und/oder ungesättigter Monocarbonsäuren (Fettsäuren) mit einer Kettenlänge von 8 bis 22 C-Atomen als Hauptkohlenstoffquelle bei der Kultivierung von Mikroorganismen unter aeroben, submersen Bedingungen. Bevorzugte Mikroorganismen sind säureakkumulierende Hefen, wie z.B. die säurebildenden Hefenstämme der Gattungen Candida, Pichia und Yarrowia. Besonders bevorzugt werden zur Kultivierung der Mikroorganismen die Alkylester in Form preiswerter handelsüblicher Biodiesel-Kraftstoffgemische dem Kultivierungsmedium zugesetzt.The The invention relates to a method for biotechnological production of functionalized di- and tricarboxylic acids, preferably for the preparation in the tricarboxylic acid cycle occurring citric acid, isocitric acid, 2-oxoglutaric acid, aconitic acid and / or itaconic using alkyl esters of saturated and / or unsaturated Monocarboxylic acids (Fatty acids) with a chain length from 8 to 22 C atoms as the main carbon source in the cultivation of microorganisms under aerobic, submerged conditions. preferred Microorganisms are acid-accumulating Yeasts, e.g. the acid-forming yeast strains genera Candida, Pichia and Yarrowia. Especially preferred For the cultivation of the microorganisms, the alkyl esters are in the form cheaper commercial Biodiesel fuel mixtures added to the culture medium.
An funktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren, insbesondere an Citronensäure (2-Hydroxypropan-1,2,3-tricarbonsäure) besteht aufgrund ihrer komplexbildenden, geschmacklichen, antioxidativen und farbstabilisierenden Eigenschaften ein hoher Bedarf. Sie werden seit Jahrzehnten biotechnologisch im großtechnischen Maßstab gewonnen. Als Produktionsverfahren für Citronensäure sind Submersverfahren mit Hochleistungsstämmen des Pilzes Aspergillus niger etabliert, wobei Zuckermelassen und andere kohlenhydrathaltige Abprodukte aber auch Saccharose, Glucose und Stärkehydrolysate als Substrate dienen. Im diskontinuierlichen Aspergillus-Prozess werden Citronensäurekonzentrationen von 100–130 g/l bei Ausbeuten von 0,8–0,9 g/g Kohlenhydrat bei einer Kultivierungszeit von 5 bis 6 Tagen erzielt. Trotz jahrzehntelanger Verwendung dieser Kohlenstoffquellen sind eine Reihe von Nachteilen bekannt, die ihre Verwendung einschränken oder teilweise verbieten: z.B. schlechte Substratbevorratung bei batch-Verfahren durch physiologische Rückkopplungen bei hohen Zuckerkonzentrationen (z.B. Crabtree-Effekt), herabgesetzte Sauerstofflöslichkeit, Schaumbildung bei Belüftung, hohe Infektionsanfälligkeit und Substrathemmungen durch Schwermetallgehalt bei Melassen.At functionalized di- and tricarboxylic acids, in particular to citric acid (2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid) consists because of their complexing, flavor, antioxidant and color-stabilizing properties of high demand. you will be For decades, obtained biotechnologically on an industrial scale. As a production process for citric acid are submersed with high performance strains of the fungus Aspergillus niger, with sugar molasses and other carbohydrate-containing Abprodukte but also sucrose, glucose and starch hydrolysates as substrates serve. The discontinuous Aspergillus process produces citric acid concentrations from 100-130 g / l at yields of 0.8-0.9 g / g carbohydrate at a cultivation time of 5 to 6 days. Despite decades of use of these carbon sources a number of disadvantages that limit their use or partially forbid: e.g. poor substrate storage in batch processes through physiological feedback at high sugar levels (e.g., Crabtree effect), degraded Oxygen solubility, foaming with ventilation, high susceptibility to infection and substrate inhibition by heavy metal content in molasses.
Seit den 60er Jahren des vorigen Jahrhunderts wurden alternativ zahlreiche Verfahren zur Citronensäuregewinnung mit Hefestämmen entwickelt, insbesondere Verfahren mit Hefen der Gattungen Candida und Yarrowia unter Verwendung von Paraffinen (Alkanen), insbesondere der C9-C23-Fraktion, bzw. Verfahren mit Nichtkohlehydratsubstraten (Reviews: Röhr, M. (1998), A century of citric acid fermentation and research. Food Technol. Biotechnol. 36, 163–171; Stottmeister, U., Behrens, U., Weissbrodt, E., Barth, G., Franke-Rinker, D. und Schulze, E. (1982) Nutzung von Paraffinen und anderen Nicht-Kohlenstoffquellen zur mikrobiellen Citronensäuresynthese. Z. Allg Mikrobiol 22: 399–424). Im Vergleich mit A. niger konnten mit den Hefen auf Paraffinen nach 5–7 Tagen Kultivierungsdauer höhere Produktkonzentrationen an Citronensäure (170–180 g/l) und Ausbeuten von 1,6–1,8 g/g erzielt werden. Extrem steigende Erdölpreise in den 70er Jahren und Vorbehalte wegen etwaiger carcinogener Rückstände im Endprodukt standen einer Etablierung von verfahren zur Citronensäurebildung aus Paraffinen jedoch im Wege.Since the 1960s, numerous methods for obtaining citric acid with yeast strains have been developed, in particular methods with yeasts of the genera Candida and Yarrowia using paraffins (alkanes), in particular the C 9 -C 23 fraction, or processes with non-carbohydrate substrates ( Reviews: Röhr, M. (1998), A century of citric acid fermentation and research, Food Technol.Biotechnol 36, 163-171, Stottmeister, U., Behrens, U., Weissbrodt, E., Barth, G., Franke-Rinker, D. and Schulze, E. (1982) Use of paraffins and other non-carbon sources for microbial citric acid synthesis Z. Allg Mikrobiol 22: 399-424). In comparison with A. niger, it was possible to achieve higher product concentrations of citric acid (170-180 g / l) and yields of 1.6-1.8 g / g with the yeasts on paraffins after 5-7 days of culture. However, extremely high oil prices in the 1970s and reservations about possible carcinogenic residues in the end product hampered the establishment of processes for citric acid formation from paraffins.
Deshalb
wurden auch Fermentationsverfahren zur Citronensäuregewinnung mittels Hefen,
insbesondere mit Candida lipolytica, unter Nutzung von physiologisch
unbedenklichen lipophilen Substraten aus erneuerbaren biogenen Ressourcen
entwickelt. So sind z.B. Verfahren unter Verwendung von unbehandelten
tierischen Fetten oder in Form von Talg als Substrate beschrieben
(
Auch die Verwendung von freien Fettsäuren für Kultivierungen ist als nachteilig anzusehen, weil sie einerseits eine starke Ansäuerung des Mediums bewirken, verbunden mit einem erhöhten Laugebedarf für die Neutralisierung, und andererseits bei Nutzung von Salzen der Fettsäuren erhebliche Mengen zusätzlicher Ca- oder Na-Kationen in das Medium eingebracht werden. Aufgrund der Seifenbildung ist in beiden Fällen bei Belüftung mit Schaumbildung zu rechnen.The use of free fatty acids for cultivations is also to be regarded as disadvantageous, because on the one hand they cause a strong acidification of the medium, combined with an increased need for neutralization, and on the other hand when using salts of the fatty acids considerable amounts of additional Ca or Na cations are introduced into the medium. Due to the formation of soap, foaming is to be expected in both cases in ventilation.
Zur
Gewinnung von aliphatischen Dicarbonsäure (> C9), ist aus
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, die biotechnologischen Verfahren zur Gewinnung von funktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren des Tricarbonsäurecyclus zu verbessern, und Kohlenstoff- und Energiequellen (Substrate) für die Kultivierung zu erschließen, welche hohe Produktkonzentrationen und substratbezogene Produktausbeuten ermöglichen, ernährungsphysiologisch unbedenklich sind und die verfahrenstechnischen Nachteile bisher genutzter lipophiler Substrate, wie Triglyceride und freier Fettsäuren, vermeiden, wobei eine vollständige Metabolisierung (inklusive β-Oxidation) der Substrate wünschenswert ist.The The object of the invention is the biotechnological process to obtain functionalized di- and tricarboxylic acids of the tricarboxylic acid cycle and carbon and energy sources (substrates) for cultivation to open up which high product concentrations and substrate-related product yields enable, nutritionally are harmless and the procedural disadvantages so far used lipophilic substrates, such as triglycerides and free fatty acids, avoid being a complete one Metabolism (including β-oxidation) the substrates desirable is.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass funktionalisierte Di- und Tricarbonsäuren des Tricarbonsäurecyclus in hoher Ausbeute durch Kultivierung von Mikroorganismen, die zur Spaltung von Monocarbonsäurealkylestern und gleichzeitig zur β-Oxidation der bei der Spaltung gebildeten Monocarbonsäuren (Fettsäuren) befähigt sind, unter aeroben submersen Bedingungen in einem Nährmedium, das mindestens einen Alkylester gesättigter und/oder ungesättigter unverzweigter Monocarbonsäuren mit einer Kettenlänge von 8 bis 22 C-Atomen als assimilierbare Hauptkohlenstoffquelle umfasst, hergestellt werden können. Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 38°C und bei einem pH-Wert im Bereich von 3,0 bis 6,5. Die Gelöstsauerstoffkonzentration wird bevorzugt im Bereich von 10% bis 90% der Luftsättigung gehalten. Vorzugsweise werden Belüftungsraten eingestellt, welche eine Luftsättigung von über 40% gewährleisten.It was surprisingly found that functionalized di- and tricarboxylic acids of tricarboxylic acid cycle in high yield by culturing microorganisms used for Cleavage of monocarboxylic acid alkyl esters and simultaneously to β-oxidation the monocarboxylic acids (fatty acids) formed in the cleavage are capable of submerging under aerobic Conditions in a nutrient medium, the at least one alkyl ester of saturated and / or unsaturated unbranched monocarboxylic acids with a chain length from 8 to 22 carbon atoms as assimilable main carbon source includes, can be produced. Preferably, the cultivation is carried out at temperatures in the range from 20 to 38 ° C and at a pH in the range of 3.0 to 6.5. The dissolved oxygen concentration is preferred in the range of 10% to 90% of the air saturation held. Preferably, aeration rates are set, which an air saturation from above 40% guarantee.
Als bevorzugte Mikroorganismen mit den gewünschten Eigenschaften haben sich säureakkumulierende Hefen gezeigt, vorzugsweise säurebildende Hefen der Gattungen Candida, Pichia oder Yarrowia, insbesondere Hefestämme von Yarrowia lipolytica. Ganz besonders bevorzugt werden die Stämme Yarrowia lipolytica H181 (ursprünglich als Saccaromycopsis lipolytica H181 bezeichnet) und Yarrowia lipolytica H222-27-11 eingesetzt, welche bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland unter DSM 7806 (H181) und DSM 8068 (H222-27-11) hinterlegt sind. Die Hinterlegung des Stammes DSM 7806 wurde am 25.10.1983 unter ZIMET 43720 registriert, für den Stamm DSM 8068 erfolgte die Registrierung unter ZIMET 43856 am 08.12.1987. Beide Stämme wurden am 04.06.2004 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren verlängert.When have preferred microorganisms with the desired properties acid-accumulating Yeasts shown, preferably acid-forming Yeasts of the genera Candida, Pichia or Yarrowia, in particular yeast strains from Yarrowia lipolytica. Very particularly preferred are the strains Yarrowia lipolytica H181 (originally as Saccaromycopsis lipolytica H181) and Yarrowia lipolytica H222-27-11 used, which in the German collection of microorganisms and cell cultures GmbH, Braunschweig, Germany under DSM 7806 (H181) and DSM 8068 (H222-27-11) are deposited. The deposit of the strain DSM 7806 was registered on 25.10.1983 under ZIMET 43720, for the tribe DSM 8068 was registered under ZIMET 43856 on 08.12.1987. Both tribes were on 04.06.2004 according to the conditions of the Budapest Treaty on the international recognition of microorganisms for the purposes of Patent proceedings extended.
Die Kultivierung erfolgt bei bevorzugten Temperaturen zwischen 26 und 33°C, vorzugsweise bei 30°C. Mikroorganismenstämme, die zur Spaltung von Monocarbonsäurealkylestern und zur β-Oxidation der bei der Spaltung gebildeten Fettsäuren befähigt sind, werden unter aeroben, submersen Bedingungen in üblichen, bekannten synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedien für das Zielprodukt, die Di- bzw. Tricarbonsäureausscheidung kultiviert, wobei die eigentliche Bildung und Akkumulation der Säuren in bekannter Weise durch Limitation der Stickstoffquelle (z.B. NH4) oder einer anderen anorganischen Medienkomponente wie Phosphor oder Schwefel und/oder Vitaminmangel (z.B. Thiamin) bei auxothrophen Stämmen ausgelöst wird.The cultivation is carried out at preferred temperatures between 26 and 33 ° C, preferably at 30 ° C. Microorganism strains which are capable of cleaving monocarboxylic acid alkyl esters and of β-oxidation of the fatty acids formed in the cleavage are cultured under aerobic, submerged conditions in customary, known synthetic or semisynthetic nutrient media for the target product, the di- or tricarboxylic acid excretion Formation and accumulation of acids in a known manner by limiting the nitrogen source (eg NH 4 ) or other inorganic media component such as phosphorus or sulfur and / or vitamin deficiency (eg thiamine) is triggered in auxotrophic strains.
Die Kohlenstoffquelle wird dem Medium nach bekannten Kultivierungsregimes entweder bereits zu Beginn der Kultivierung (batch-Betrieb) vollständig zugeführt oder es erfolgt zu bestimmten Zeitpunkten eine Nachdosierung des Substrates (fed-batch). Selbstverständlich sind auch semikontinuierliche und kontinuierliche Verfahren mit Fettsäurealkylestern durchführbar. Der Verlauf der Kultivierung lässt sich i.d.R. in eine Wachstums- und Produktbildungsphase unterteilen. Die mikrobielle Wachstumsphase bis zur Auszehrung der limitierenden Medienkomponente (z.B. Stickstoff) beträgt in Abhängigkeit von deren Konzentration gewöhnlich zwischen 10 und 24 Stunden. Die daran anschließende Produktbildungsphase für die gewünschte Säure erfolgt bis zur vollständigen Utilisation des Fettsäurealkylesters als Kohlenstoffquelle. Üblicherweise wird sie aber zu einem ökonomischen Zeitpunkt bezüglich der Raum-Zeit-Ausbeuten abgebrochen.The Carbon source becomes the medium after known cultivation regimes either completely added at the beginning of the cultivation (batch operation) or There is at certain times a subsequent dosing of the substrate (Fed-batch). Of course are also using semi-continuous and continuous processes fatty acid alkyl esters feasible. The course of cultivation leaves i.d.R. subdivide into a growth and product development phase. The microbial growth phase until the consumption of the limiting Media component (e.g., nitrogen) is dependent on their concentration usually between 10 and 24 hours. The subsequent product development phase for the desired Acid takes place until the complete Utilization of the fatty acid alkyl ester as a carbon source. Usually But it becomes an economic one Time regarding the space-time yields were aborted.
Die Erfindung zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass dem Medium als assimilierbare Kohlenstoffquelle Fettsäurealkylester als Gemische oder Einzelkomponenten bevorzugt in einer Konzentration von 20 bis 175 g/l zugesetzt werden. In Abhängigkeit von der wachstumlimitierenden Medienkomponente (z.B. Stickstoff) können aber auch niedrigere oder höhere Esterzugaben verwertet werden. Die Fettsäurealkylester können separat autoklaviert oder pasteurisiert werden. Auch die gemeinsame Sterilisierung mit den anderen Medienbestandteilen ist möglich.The Invention is characterized in particular by the fact that the medium as assimilable carbon source fatty acid alkyl esters as mixtures or individual components preferably in a concentration of 20 to 175 g / l are added. Dependent on growth limiting media component (e.g., nitrogen) can but also lower or higher Ester additions are utilized. The fatty acid alkyl esters can be separated be autoclaved or pasteurized. Also, the common sterilization with the other media components is possible.
Hinsichtlich ihrer Struktur werden erfindungsgemäß folgende Fettsäurealkylester-Gruppen bevorzugt für eine Kultivierung eingesetzt:
- Methylester und Ethylester gesättigter und ungesättigter unverzweigter Monocarbonsäuren (Alkansäuren) mit der Kettenlänge C8 bis C22; davon sind alle bei den bevorzugten Kultivierungstemperaturen von 26 bis 33°C im flüssigen Aggregatzustand vorliegenden Ester der natürlichen Fettsäuren, wie z.B. die Ester der Laurin-, Myristin-, Palmitin-, Öl-, Linol- und/oder Linolensäure besonders geeignet.
- Gemische zweier oder mehrerer, der unter 1. benannten Methyl- oder Ethylester von Alkansäuren z.B. die Gemische der Alkansäureester von Pflanzenölen, tierischen Fetten und Ölen, gereinigten Altfetten mit besonderer Eignung als Biokraftstoffe, welche unter dem Begriff Biodiesel erfasst werden.
- Gemische der unter 1. genannten Methyl- und Ethylester von Monocarbonsäuren mit Glycerin, bevorzugt die Gemische welche insbesondere bei der Gewinnung der als Biodiesel bezeichneten Biokraftstoffen nach der Veresterungsstufe mit Methanol oder Ethanol anfallen und der verbleibende Alkoholgehalt keine toxische Wirkung auf die eingesetzten Hefekulturen hat oder Gemische aus Biodiesel und Triglyceriden.
- Gemische der unter 1. genannten Methyl- umd Ethylester von Monocarbonsäuren mit anderen utilsierbaren Kohlenstoffquellen, bevorzugt die Gemische welche aus der Anwendung von Biodiesel als Lösungsmittel für Fette und Farben anfallen und deren anderen Betandteile keine toxische Wirkung auf die eingesetzten Hefekulturen hat.
- Methyl esters and ethyl esters of saturated and unsaturated unbranched monocarboxylic acids (alkanoic acids) with the chain length C 8 to C 22 ; of these, all esters of natural fatty acids, such as the esters of lauric, myristic, palmitic, oleic, linoleic and / or linolenic acid present in the liquid state at the preferred cultivation temperatures of from 26 to 33 ° C., are particularly suitable.
- Mixtures of two or more of the mentioned under 1. methyl or ethyl esters of alkanoic acids, for example, the mixtures of alkanoic acid esters of vegetable oils, animal fats and oils, purified waste fats with particular suitability as biofuels, which are covered by the term biodiesel.
- Mixtures of the mentioned under 1. methyl and ethyl esters of monocarboxylic acids with glycerol, preferably the mixtures which are obtained in particular in the production of biofuels referred to as biodiesel after the esterification with methanol or ethanol and the remaining alcohol content has no toxic effect on the yeast cultures used or mixtures from biodiesel and triglycerides.
- Mixtures of the mentioned under 1. Methyl- ethyl ester of monocarboxylic acids with other utilizable carbon sources, preferably the mixtures which are obtained from the use of biodiesel as a solvent for fats and paints and whose other Betandteile has no toxic effect on the yeast cultures used.
Gemäß der Erfindung ermöglichen insbesondere die Kohlenstoffquellen aus nachwachsenden Rohstoffen (Alkylester der Pflanzenöle) eine effiziente Biosynthese der organischen Di- und Tricarbonsäuren mit bevorzugt säureakkumulierende Hefen unter aeroben, submersen Bedingungen, wobei besonders bevorzugt Biodiesel als assimilierbare Kohlenstoffquelle dient.According to the invention enable especially the carbon sources from renewable raw materials (Alkyl esters of vegetable oils) an efficient biosynthesis of the organic di- and tricarboxylic acids with preferred säureakkumulierende Yeasts under aerobic, submerged conditions, most preferably biodiesel serves as an assimilable carbon source.
Biodiesel, der weltweit als alternativer Kraft- und Brennstoff gewonnen wird, ist eine neue preiswerte Substratklasse für Biosynthesen. Als Biodiesel werden Gemische von Methyl- und/oder Ethylestern der Fettsäuren natürlicher Pflanzenöle, aber auch aus Altfetten der fett- und ölverarbeitenden Industrie bezeichnet. Biodiesel wird derzeit als Kraftstoffersatz und -zusatz für Mineralöldiesel in der Kraftfahrzeugtechnik verwendet und steht praktisch unbegrenzt zur Verfügung. Seine Herstellung aus Triglyceriden und Methanol oder Ethanol ist technisch einfach zu realisieren (z.B. CD- Prozess). Als Nebenprodukt der katalytischen Umesterung entsteht Glycerol, welches in gereinigter Form eine breite Anwendung (z.B. Kosmetikindustrie) finden kann.biodiesel, which is won worldwide as an alternative fuel and fuel, is a new low-cost substrate class for biosyntheses. As biodiesel are mixtures of methyl and / or Ethyl esters of fatty acids naturally Vegetable oils, but also known from waste oils of the grease and oil processing industry. Biodiesel is currently used as a fuel substitute and additive for mineral oil diesel used in automotive engineering and is virtually unlimited to disposal. Its preparation is from triglycerides and methanol or ethanol technically easy to implement (e.g., CD process). As a byproduct of the catalytic Transesterification produces glycerol, which in purified form a broad Application (e.g., cosmetics industry).
Die Gewinnung von Biodiesel erfolgt z.B. aus Rapsöl, Sonnenblumenöl, Palmöl, Sojaöl und Talg um nur stellvertretend einige zu nennen. Sie werden je nach verwendeten Pflanzenölen (Triglyceriden) z.B. auch als Methylraps, Rapsmethylester (RME), Rapsethylester (REE), Palmmethylester (PME) oder Sojamethylester (SME) bezeichnet.The Recovery of biodiesel occurs e.g. from rapeseed oil, sunflower oil, palm oil, soybean oil and tallow just to name a few. They are used according to vegetable oils (Triglycerides) e.g. also as methyl rape, rapeseed methyl ester (RME), Rape ethyl ester (REE), Palmmethylester (PME) or Soyamethylester (SME) designated.
Im europäischen Raum ist Biodiesel insbesondere in der Form von Fettsäuremethylester-Gemischen, bevorzugt als Methylestergemische von Rapsöl eingeführt und wird auch als Methyl Raps, Rapsmethylester (RME) oder Rapsdiesel bezeichnet.in the European Space is biodiesel, especially in the form of fatty acid methyl ester mixtures, preferred as methyl ester mixtures of rapeseed oil introduced and is also called methyl rapeseed, rapeseed methyl ester (RME) or rapeseed diesel designated.
Fettsäuremethylester (FAME) besitzen eine ca. auf 1/10 reduzierte Viskosität bei 20°C im Vergleich mit den natürlichen Pflanzenölen. Ebenso sind die Schmelzpunkte im Vergleich mit Triglyceriden und Fettsäuren erheblich erniedrigt. Im Vergleich zu freien Fettsäuren sind die FAME pH-neutral.fatty acid methyl ester (FAME) have an approximately 1/10 reduced viscosity at 20 ° C compared with the natural one Vegetable oils. Similarly, the melting points are compared with triglycerides and fatty acids considerably lowered. Compared to free fatty acids are the FAME pH neutral.
Biodiesel ist bekanntermaßen biologisch leicht abbaubar und eine Gefährdung für Boden und Grundwasser wird ausgeschlossen. So ist z.B. auch die Aufnahme in Säugetierzellen und die Metabolisierung von C16- und C18-Fettsäuremethylestern über die Hydrolyse zu freien Fettsäuren und dem korrespondierenden Alkohol (Methanol) bis hin zur vollständigen Oxidation zu CO2 und Wasser beschrieben, so dass von einer physiologischen Unbedenklichkeit von Biodiesel für den Menschen ausgegangen werden kann.Biodiesel is known to be easily biodegradable and a threat to soil and groundwater is excluded. Thus, for example, the uptake into mammalian cells and the metabolization of C 16 - and C 18 -Fettsäuremethylestern on the hydrolysis to free fatty acids and the corresponding alcohol (methanol) to complete oxidation to CO 2 and water is described, so that of a physiological Harmlessness of biodiesel for humans can be assumed.
Die erfindungsgemäße Herstellung von funktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren, insbesondere unter Verwendung von Biodiesel, ermöglicht die vollständige Utilisierung (inklusive β-Oxidation) der Substrate und erlaubt eine anschließende de novo Synthese der Zielprodukte. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden hohe substratbezogene Ausbeuten von ca. 1,5 g bis 1,8 g Di- oder Tricarbonsäure pro g eingesetzten Fettsäurealkylestern erzielt, welche weit über den bekannten Verfahren liegen.The preparation according to the invention of functionalized di- and tricarboxylic acids, in particular using biodiesel, enables the complete utilization (including β-oxidation) of the substrates and allows a subsequent de novo synthesis of the target products. With the method according to the invention High substrate-related yields of about 1.5 g to 1.8 g of di- or tricarboxylic acid per g of fatty acid alkyl esters used are achieved, which are far beyond the known methods.
Die erfindungsgemäße Verwendung von Fettsäurealkylestern als Substrate ist mit deutlichen verfahrenstechnischen und ökonomischen Vorteilen im Vergleich zum gegenwärtigen Stand der Technik verbunden. Diese Vorteile können wie folgt zusammengefasst werden:
- – Anwendung als 100 Substrat ohne Verdünnung oder Vorlösung, wie bei Glucose, Saccharose oder Melassen erforderlich,
- – Bevorratung der Kohlenstoffquelle für die Gesamtzeit der Fermentation bei batch-Betrieb,
- – keine Gefahr einer Zersetzung oder Karamelisierung bei der Sterilisation, wie bei Glucose oder Stärkehydrolysaten,
- – niedrige Viskosität der Fermentationslösung auch bei hohen Konzentrationen des Substrates (im Vergleich mit Pflanzenölen oder tierischen Ölen), was einen deutlich geringeren Energieeintrag für Rührung und Belüftung bedeutet,
- – keine beobachtete Toxizität gegenüber Mikroorganismen auch bei hohen Konzentrationen (im Gegensatz zu Acetat, Ethanol),
- – keine Schaumbildung (im Gegensatz zu Glucose, Saccharose, Hydrolysaten und Fettsäuren),
- – keine zusätzliche Ansäuerung des Fermentationsmediums, wie bei Einsatz freier Fettsäuren (Einsparung von Neutralisationsreagenzien)
- – Fettsäurealkylester lösen Sauerstoff in höheren Konzentrationen als Wasser und stellen somit ein O2-Reservoir für die Hefekulturen dar,
- – Mischsubstratverwertung von festen ölen und Biodiesel wird ermöglicht,
- – erleichterte kontinuierliche Prozessführung durch einfache Substratdosierung (keine Entmischung von Lösungen, niedrige Viskosität),
- – keine physiologischen Bedenken (im Gegensatz zu Paraffinen).
- Use as a substrate without dilution or preliminary solution, as required for glucose, sucrose or molasses,
- Stocking the carbon source for the total fermentation time in batch mode,
- No risk of decomposition or caramelization during sterilization, as with glucose or starch hydrolysates,
- Low viscosity of the fermentation solution even at high concentrations of the substrate (in comparison with vegetable oils or animal oils), which means a significantly lower energy input for stirring and aeration,
- No observed toxicity to microorganisms even at high concentrations (in contrast to acetate, ethanol),
- No foaming (as opposed to glucose, sucrose, hydrolysates and fatty acids),
- - no additional acidification of the fermentation medium, as with the use of free fatty acids (saving of neutralization reagents)
- Fatty acid alkyl esters dissolve oxygen in higher concentrations than water and thus represent an O 2 reservoir for the yeast cultures,
- - Mixed substrate utilization of solid oils and biodiesel is made possible
- - facilitated continuous process control by simple substrate dosing (no segregation of solutions, low viscosity),
- - no physiological concerns (as opposed to paraffins).
Anhand einiger ausgewählter Synthesen von bevorzugt produzierten Säuren des Tricarbonsäurezyklus wird die Erfindung im Detail dargestellt ohne sie darauf zu beschränken.Based some selected Syntheses of preferred produced acids of the tricarboxylic acid cycle the invention is illustrated in detail without being limited thereto.
Citronensäure wird bevorzugt dadurch gewonnen, dass man an sich bekannte citronensäureakkumulierende Hefestämme der Gattungen Candida, Pichia und Yarrowia, vorzugsweise von Yarrowia lipolytica, verwendet, die zur β-Oxidation befähigt sind. Dabei können sowohl Hefen genutzt werden, die in Form von Mutanten oder rekombinanten Stämme zur überwiegenden Akkumulierung von Citronensäure (> 90% der gebildeten Säuren) befähigt sind als auch Wildtypstämme, die ein Gemisch von Citronen- und Isocitronensäure bilden und bei deren Kultivierung eine Aconitase-hemmende Verbindung wie z.B. Fluoressigsäure zugegeben wird.Citric acid is preferably obtained by adding to known citronensäureabkumulierende yeast strains genera Candida, Pichia and Yarrowia, preferably from Yarrowia lipolytica, used for β-oxidation capable are. It can Both yeasts are used in the form of mutants or recombinants strains for the most part Accumulation of citric acid (> 90% of educated acids) capable are as well as wild-type strains, which form a mixture of citric and isocitric acids and during their cultivation an aconitase-inhibiting compound, e.g. Fluoroacetic acid is added.
Die Hefestämme werden unter aeroben, submersen Bedingungen in üblichen, bekannten synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedien für die Citratausscheidung kultiviert, wobei die eigentliche Bildung und Akkumulation der Säure in bekannter Weise durch Limitation der Stickstoffquelle (z.B. NH4 +) oder einer anderen Medienkomponente wie Phosphor oder Schwefel ausgelöst wird. Dem Medium wird eine optimale stammspezifische Thiaminkonzentration im Bereich von 100 μg bis 2 mg/l Thiamin × HCI zugegeben. Die Kultivierung erfolgt bei einem pH-Wert von 3,5 bis 6,5 und einer Temperatur von 26 bis 33°C, vorzugsweise bei pH = 5,0 und einer Temperatur von T = 30°C. Die Gelöstsauerstoffkonzentration wird während der gesamten Kultivierung im Bereich von 10% bis 90% der Luftsättigung gehalten, wobei vorzugsweise Belüftungsraten einge stellt werden, welche eine Luftsättigung von über 40% gewährleisten. Dementsprechend wird bei Verwendung von Schüttelkolben die Einstellung einer hohen Schüttelfrequenz vorgesehen.The yeast strains are cultured under aerobic, submerged conditions in conventional, known synthetic or semi-synthetic nutrient media for citrate excretion, the actual formation and accumulation of the acid in a known manner by limiting the nitrogen source (eg NH 4 + ) or other media component such as phosphorus or sulfur is triggered. The medium is given an optimal strain-specific thiamine concentration in the range of 100 μg to 2 mg / l thiamine × HCl. The cultivation is carried out at a pH of 3.5 to 6.5 and a temperature of 26 to 33 ° C, preferably at pH = 5.0 and a temperature of T = 30 ° C. The dissolved oxygen concentration is maintained throughout the cultivation in the range of 10% to 90% of the air saturation, wherein preferably ventilation rates are set, which ensure an air saturation of over 40%. Accordingly, when using shake flasks, the setting of a high shaking frequency is provided.
Die Kohlenstoffquelle wird dem Medium nach bekannten Kultivierungsregimes entweder bereits zu Beginn der Kultivierung (batch-Betrieb) vollständig zugeführt oder es erfolgt zu bestimmten Zeitpunkten eine Nachdosierung des Substrates (fed-batch). Selbstverständlich sind auch semikontinuierliche und kontinuierliche Verfahren mit Fettsäurealkylestern durchführbar. Der Verlauf der Kultivierung lässt sich, wie für die Citratbildung mit Hefen typisch in eine Wachstums- und Produktbildungsphase unterteilen. Die mikrobielle Wachstumsphase bis zur Auszehrung der limitierenden Medienkomponente (z.B. Stickstoff) beträgt in Abhängigkeit von deren Konzentration gewöhnlich zwischen 10 und 24 Stunden. Die daran anschließende Produktbildungsphase für Citronensäure erfolgt bis zur vollständigen Utilisation des Fettsäurealkylesters als Kohlenstoffquelle. Üblicherweise wird sie aber zu einem ökonomischen Zeitpunkt bezüglich der Raum-Zeit-Ausbeuten abgebrochen. Die Gesamtkultivierungszeit dauert im Allgemeinen etwa 90 bis 250 Stunden in Abhängigkeit von der eingesetzten Menge der Kohlenstoffquelle und den gewählten Kultivierungsbedingungen (z.B. Schüttelkolben- oder Reaktorkultivierung).The Carbon source becomes the medium after known cultivation regimes either completely added at the beginning of the cultivation (batch operation) or There is at certain times a subsequent dosing of the substrate (Fed-batch). Of course are also using semi-continuous and continuous processes fatty acid alkyl esters feasible. The course of cultivation leaves yourself, as for citrate formation with yeasts typically in a growth and product formation phase divide. The microbial growth phase until the consumption of the limiting media component (e.g., nitrogen) is dependent on their concentration usually between 10 and 24 hours. The subsequent product development phase for citric acid until the complete Utilization of the fatty acid alkyl ester as a carbon source. Usually But it becomes an economic one Time regarding the space-time yields canceled. The total cultivation time generally takes about 90 to 250 hours depending from the amount of carbon source used and the culturing conditions chosen (e.g., shake flask or Reactor cultivation).
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden hohe substratbezogene Ausbeuten bis zu 1,5 g Citronensäure pro g eingesetzten Fettsäurealkylestern erzielt, welche weit über den bekannten Verfahren mit A. niger unter Verwendung von Kohlenhydraten liegen und die Ausbeuten bei Verwendung von Triglyceriden und Fettsäuren erreichen. Im Gegensatz zu den bekannten Verfahren mit anderen Kohlenstoffquellen ist das Verfahren aufgrund einer mit ihr verbundenen reduzierten Viskosität und Oberflächenspannung des Kultivierungsmediums (Absenkung des Energieeintrages, verbesserte Dispergierung), Vermeidung der Verseifung des Mediums (Unterdrückung der Schaumbildung) und effizienten Nutzung von Alkansäuren, die bei Kultivierungstemperaturen von 26–33°C in fester Form vorliegen, von Vorteil.With the method according to the invention will be high substrate yields up to 1.5 g of citric acid per g fatty acid alkyl esters used scores which far over the known A. niger method using carbohydrates and reach the yields when using triglycerides and fatty acids. In contrast to the known methods with other carbon sources the process is due to a reduced associated with it viscosity and surface tension of culture medium (lowering of energy input, improved Dispersion), avoid saponification of the medium (suppression of the Foaming) and efficient use of alkanoic acids, the are present in solid form at cultivation temperatures of 26-33 ° C, advantageous.
Auch für die Gewinnung von D-Isocitronensäure (1-Hydroxy– propan-1,2,3-tricarbonsäure) kann vorteilhafterweise jeder bekannte Hefestamm der Gattungen Candida oder Yarrowia, der zur β-Oxidation befähigt ist, verwendet werden, der als Wildtypstamm ein Gemisch von Citronen- und Isocitronensäure akkumuliert, wobei der Isocitratgehalt gewöhnlich zwischen 40% und 60% der Gesamtsäurebildung liegt. Daneben können Mutanten oder gentechnisch veränderte Stämme von Candida oder Yarrowia genutzt werden, die befähigt sind, höhere Anteile an Isocitronensäure zu akkumulieren. Abweichend zur Gewinnung von Citronensäure ist der pH-Wert vorzugsweise bei pH = 6,0 zu statieren.Also for the Recovery of D-isocitric acid (1-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid) Advantageously, any known yeast strain of the genera Candida or Yarrowia, which leads to β-oxidation is capable used as wild-type strain a mixture of citric and isocitric acid accumulated, with the isocitrate content usually between 40% and 60% the total acid formation lies. In addition, mutants or genetically modified strains be used by Candida or Yarrowia, who are capable higher Proportions of isocitric acid to accumulate. Unlike the extraction of citric acid is the pH value preferably at pH = 6.0.
Die Gewinnung von 2-Oxoglutarsäure (2-Oxo-pentan-1,5-dicarbonsäure) erfolgt bevorzugt mit Hilfe von thiaminauxotrophen Hefestämmen, wie z.B. der Hefeart Yarrowia lipolytica. Bekanntermaßen bilden diese Hefen unter Thiaminmangelbedingungen überwiegend 2-Oxoglutarsäure, wenn Kohlenstoffquellen eingesetzt werden, die über die β-Oxidation metabolisiert werden. Für die effiziente selektive Gewinnung von 2-Oxoglutarsäure aus Fettsäurealkylestern kann z.B. die Leistungsmutante Yarrowia lipolytica H222-27-11 (DSM 8068) kultiviert werden. Im Unterschied zur Gewinnung von Citronensäure ist eine geringere Thiaminkonzentration von 0,05–1 μg/l erforderlich und pH-Wert während der Kultivierung auf einen Bereich von vorzugsweise 3,0–4,0 einzustellen.The Recovery of 2-oxoglutaric acid (2-oxo-pentane-1,5-dicarboxylic acid) takes place preferably with the aid of thiamine auxotrophic yeast strains, such as e.g. yeast Yarrowia lipolytica. As is known, form these yeasts under thiamine deficiency conditions predominantly 2-oxoglutaric acid when Carbon sources are used, which are metabolized via the β-oxidation. For the efficient selective recovery of 2-oxoglutaric acid from fatty acid alkyl esters can e.g. the performance mutant Yarrowia lipolytica H222-27-11 (DSM 8068) be cultivated. In contrast to the extraction of citric acid a lower thiamine concentration of 0.05-1 μg / l is required and pH while the cultivation to a range of preferably 3.0-4.0.
Die Gewinnung von Aconitsäure und Itaconsäure erfolgt analog.The Recovery of aconitic acid and itaconic acid takes place analogously.
In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher beschrieben.In The following examples describe the invention in more detail.
Beispiel 1example 1
Der
Stamm Yarrowia lipolytica H181 (DSM 7806) wurde auf Pepton Hefeextrakt
Agar (Fluka, Nr. 77196) oder einem anderen geeigneten Agarmedium
(z.B. Reader-Agar) für
Hefen für
12 bis 24 Stunden bei 30°C
kultiviert. Von der gewachsenen Agarkultur wurden 2 bis 3 Impfösen auf
100 ml sterilisierte mit destilliertem Wasser hergestellte YM-Bouillon
(BD Difco, Nr. 271120) folgender Zusammensetzung
Von
dieser Vorkultur erfolgte die Überimpfung
des Inokulum in sterile 500 ml Schüttelkolben mit Schikanen mit
einem Füllvolumen
von insgesamt 100 ml. Das Volumenverhältnis der Überimpfung betrug 1:10. Das Kultivierungsmedium
wurde bei 121 C und 1 bar Überdruck
für 20
min sterilisiert und enthielt folgende unter Verwendung von destilliertem
Wasser zugefügte
Komponenten:
Thiamin × HCI wurde
abweichend von den anderen Komponenten sterilfiltriert. Dem Medium
wurde als Substrat ein sterili sierter (15 min, 121°C, 1 bar)
oder pasteurisierter (30 min, 80°C)
aus Rapsöl
gewonnener Biodiesel (Methyl Raps) in einer Konzentration von 50
g/l zugesetzt. Der Biodiesel bestand aus einem Gemisch (Masseprozente)
folgender Fettsäuremethylester
(FAME):
Die Kultivierung erfolgte bei 30°C auf einer Schüttelapparatur bei einer Schüttelfrequenz von 130 bis 150 rpm. Der pH-Wert in den Schüttelkolben wurde durch Zugabe von 5 g/l CaCO3 und steriler 20%iger NaOH im Bereich pH 4,5 bis 5,5 gehalten. Nach 142 Stunden wurde die Kultivierung beendet. Die Konzentration der gebildeten organischen Säuren betrug 58 g/l Citronensäure und 2,3 g/l Isocitronensäure, entsprechend einer Gesamtsäureproduktion 60 g/l. Die substratbezogene Ausbeute für Citronensäure betrug 1,2 g CS/g Biodiesel bei einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,4 g CS/(l·h).The cultivation was carried out at 30 ° C. on a shaking apparatus at a shaking frequency of 130 to 150 rpm. The pH in the shake flasks was increased by adding 5 g / l CaCO 3 and sterile 20% NaOH in the range of pH 4.5 to 5 , 5 held. After 142 hours, the cultivation was stopped. The concentration of the organic acids formed was 58 g / l citric acid and 2.3 g / l isocitric acid, corresponding to a total acid production of 60 g / l. The substrate-related yield of citric acid was 1.2 g CS / g biodiesel with a space-time yield of 0.4 g CS / (lh).
Beispiel 2Example 2
Die Kultivierung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Anstelle von Biodiesel (Methyl Raps) wurden 50 g/l Ölsäureethylester (Ethyl Oleat) als Substrat dem Medium zugesetzt. Nach 142 Stunden Kultivierung betrug die im Kulturmedium gebildete Menge an Säuren 53 g/l, davon waren 51 g/l Citronensäure und 2 g/l Isocitronensäure. Dies entsprach einer substratbezogenen Ausbeute für Citronensäure von 1 g/g und Raum-Zeit-Ausbeute von 0,36 g CS/(l·h).The Cultivation was carried out as described in Example 1. Instead of Biodiesel (methyl rape) was 50 g / l of ethyl oleate (ethyl oleate) as a substrate added to the medium. After 142 hours of cultivation The amount of acids formed in the culture medium was 53 g / L, of which 51 were g / L citric acid and 2 g / l isocitric acid. This corresponded to a substrate-related yield of citric acid 1 g / g and space-time yield of 0.36 g CS / (lh).
Beispiel 3Example 3
Der
Hefestamm Yarrowia lipolytica H181 (DSM7806) wurde für 12 bis
24 h bei 30°C
auf Pepton Hefeextrakt Agar (Fluka, Nr. 77196) inkubiert. Von der
Agarkultur wurden 2 bis 3 Impfösen
abgeimpft und in 500 ml Schüttenkolben
mit Schikanen für
24 h bei 30°C
auf einer Schüttelmaschine
bei einer Schüttelfrequenz
von 130 bis 150 rpm kultiviert. Die Schüttelkulturen für Inokulumgewinnung
enthielten 100 ml sterile Nährlösung (Vorkulturmedium)
folgender Zusammensetzung:
Die
Nährsalze
wurden in dest. Wasser gelöst,
die sterile Spurensalzlösung
enthielt folgende Komponenten:
Diesem
Vorkulturmedium wurde als Substrat der in Beispiel 1 beschriebene
Biodiesel (Rapsmethylester) in einer Konzentration von 20 g/l zugesetzt.
Ausgehend von dieser Vorkultur erfolgte die Überimpfung des Inokulum in
einem Verhältnis
von 1:10 in sterile 500 ml Schüttelkolben
mit Schikanen mit einem Füllvolumen von
100 ml. Die sterile Nährlösung (Hauptkulturmedium)
enthielt
Mit Ausnahme des Thiamin (gesonderte Sterilisation durch Filtration) wurden die Nährsalze in dest. Wasser gelöst wurden und für bei 121 °C und 1 bar Überdruck für 15 min sterilisiert. Die Spurensalzlösung hatte die gleiche Zusammensetzung wie für die Inokulumgewinnung. Dem Medium wurde als Substrat der in Beispiel 1 beschriebene Biodiesel (Methyl Raps) in einer Konzentration von 70 g/l zugesetzt. Die anschließende Kultivierung erfolgte bei 30°C auf einer Schüttelapparatur bei einer Schüttelfrequenz von 130 bis 150 rpm. Der pH-Wert in den Schüttelkolben wurde durch Zugabe von 5 g/l CaCO3 und steriler 20%iger NaOH im Bereich pH 4,5 bis 5,5 gehalten. With the exception of thiamine (separate sterilization by filtration), the nutrient salts were dissolved in dist. Water were dissolved and sterilized at 121 ° C and 1 bar overpressure for 15 min. The trace saline solution had the same composition as for the inoculum recovery. The medium was added as substrate of the biodiesel (methyl rape) described in Example 1 in a concentration of 70 g / l. The subsequent cultivation was carried out at 30 ° C. on a shaking apparatus at a shaking frequency of 130 to 150 rpm. The pH in the shake flasks was increased by addition of 5 g / l CaCO 3 and sterile 20% NaOH in the range of pH 4.5 to 5.5 held.
Nach 217 Stunden wurde die Kultivierung beendet. Die Gesamtkonzentration der gebildeten organischen Säuren betrug 98 g/l davon waren 94 g/l Citronensäure und 4 g/l Isocitronensäure. Die substratbezogene Ausbeute für Citronensäure betrug 1,3 g CS/g Biodiesel und die Raum-Zeit-Ausbeute für Citronensäure lag bei 0,4 g/(l·h).To The cultivation was stopped for 217 hours. The total concentration the formed organic acids 98 g / L thereof were 94 g / L citric acid and 4 g / L isocitric acid. The substrate-related yield for citric acid was 1.3 g CS / g biodiesel and the space-time yield for citric acid was at 0.4 g / (lh).
Beispiel 4Example 4
Das Inokulum (Vorkultur) des Hefestammes Yarrowia lipolytica H181 wurde wie in Beispiel 3 gewonnen. Ein 2 l-Rührreaktor wurde mit 1.075 ml des in Beispiel 3 beschriebenen Hauptkulturmediums und 120 ml des 24 h gewachsenen Inokulum befüllt. Dem Rührreaktor wurden als C- und Energiequelle 105 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Biodiesels zugesetzt, was einer Substratkonzentration von 70 g/l entsprach.The Inoculum (preculture) of the yeast strain Yarrowia lipolytica H181 was as obtained in Example 3. A 2 L stirred reactor was charged with 1075 ml of the main culture medium described in Example 3 and 120 ml of the 24 h grown inoculum filled. The stirred reactor were used as C and energy source 105 ml of that described in Example 1 Biodiesels added, resulting in a substrate concentration of 70 g / l corresponded.
Die Kultivierung erfolgte unter sterilen Bedingungen bei einer Temperatur von 30°C und einer Gelöstsauerstoffkonzentration von pO2 = 40%. Die sterile Belüftung betrug dementsprechend 0,5–1,2 VVM und die Rührerdrehzahl 800–1200 rpm. Der pH-Wert wurde bei pH = 5,0 mit 30%iger NaOH statiert. Nach 96 Stunden Kultivierung hatten sich 102 g/l Citronensäure und 4 g/l Isocitronensäure gebildet. Dies entsprach einer substratbezogenen Ausbeute für Citronensäure von 1,5 g/g Biodiesel. Die Raum-Zeit-Ausbeuten betrug 1,05 g/(l·h). Als Nebenprodukt wurden nur 4 g/l Isocitronensäure gebildet.The cultivation was carried out under sterile conditions at a temperature of 30 ° C and a dissolved oxygen concentration of pO 2 = 40%. The sterile aeration was accordingly 0.5-1.2 VVM and the stirrer speed 800-1200 rpm. The pH was measured at pH = 5.0 with 30% NaOH. After 96 hours of culture, 102 g / L of citric acid and 4 g / L of isocitric acid had formed. This corresponded to a substrate-related yield of citric acid of 1.5 g / g biodiesel. The space-time yields were 1.05 g / (lh). As a by-product, only 4 g / l of isocitric acid was formed.
Beispiel 5Example 5
Die in Beispiel 4 beschriebene Kultivierung wurde in der Form wiederholt, dass der verwendete Hefestamm durch den Stamm Yarrowia lipolytica H222 (MATA), Wildtyp ersetzt und der pH-Wert auf 6,0 statiert wurde. Nach einer Kultivierungsdauer von 92 Stunden wurde ein Gemisch von 103 g/l organischen Säuren gebildet, welches 48 g/l Isocitronensäure (ICS) und 55 g/I Citronensäure (CS) enthielt. Die substratbezogene Ausbeute für die gebildeten Gesamtsäuren (CS + ICS) betrug 1,5 g/g Biodiesel, speziell für Isocitronensäure 0,7 g/g und für Citronensäure 0,8 g/g.The Cultivation described in Example 4 was repeated in the form that the yeast strain used by the strain Yarrowia lipolytica H222 (MATA), wild type was replaced and the pH was adjusted to 6.0. After a Cultivation period of 92 hours was a mixture of 103 g / l organic acids containing 48 g / l isocitric acid (ICS) and 55 g / l citric acid (CS) contained. The substrate-related yield for the total acids formed (CS + ICS) was 1.5 g / g biodiesel, especially for isocitric acid 0.7 g / g and for citric acid 0.8 g / g.
Claims (16)
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|---|---|---|---|
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Cited By (1)
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| WO2009106627A3 (en) * | 2008-02-28 | 2010-07-22 | Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH-UFZ | Method for biotechnologically manufacturing itaconic acid |
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