DE102004025696A1

DE102004025696A1 - Verfahren, Oberfläche und Substrate zu hochparallelen Analysen von Nukleinsäureketten

Info

Publication number: DE102004025696A1
Application number: DE200410025696
Authority: DE
Inventors: Dmitry Cherkasov; Christian Hennig; Englbert BÄUML
Original assignee: Genovoxx GmbH
Current assignee: Genovoxx GmbH
Priority date: 2004-05-26
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2006-02-23

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten. Die Grundlage der Methode ist die Detektion von Fluoreszenzsignalen einzelner mit Farbstoffen markierter Nukleotidmoleküle, die durch eine Polymerase in eine wachsende Nukleinsäurekette eingebaut werden. Die Reaktion verläuft auf einer planen Oberfläche. An diese Oberfläche sind viele einzelne Nukleinsäure-Moleküle gebunden. Alle diese Nukleinsäure-Moleküle sind gleichen Bedingungen ausgesetzt, so dass an allen Nukleinsäure-Molekülen gleichzeitig eine Aufbaureaktion ablaufen kann.

Description

Beschreibung der Erfindung
1. Einführung
1.1 Einordnung in das technologische Feld
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten. Die Grundlage der Methode ist die Detektion von Fluoreszenzsignalen einzelner mit Farbstoffen markierter Nukleotidmoleküle, die durch eine Polymerase in eine wachsende Nukleinsäurekette eingebaut werden. Die Reaktion verläuft auf einer planen Oberfläche. An diese Oberfläche sind viele einzelne Nukleinsäure-Moleküle gebunden. Alle diese Nukleinsäure-Moleküle sind gleichen Bedingungen ausgesetzt, so dass an allen Nukleinsäure-Molekülen gleichzeitig eine Aufbaureaktion ablaufen kann.
Das Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs) mit optischen Mitteln, das folgende Schritte einschließt:

1. Bereitstellung einer festen Phase
2. Bindung von zu analysierenden Nukleinsäureketten an die feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexe,
3. Durchführung einer zyklischen Reaktion mit den auf der festen Phase fixierten Primer-Matrize-Komplexen, die folgende Schritte einschließt: 3.1 enzymatischer Einbau von markierten Nukleotiden an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen, 3.2 Waschen der festen Phase 3.3 Detektion der Markierung von eingebauten markierten Nukleotiden, wobei relative Koordinaten einzelner Signale identifiziert werden 3.4 Entfernung der Signale von eingebauten Nukleotiden, 3.5 Waschen der festen Phase 3.6 gegebenenfalls Wiederholung der Schritte 3.1 bis 3.5
4. Rekonstruktion der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäureketten aus den unter Schritt 3.3 erhaltenen Signalen

Nukleotidmoleküle sind mit einem oder mehreren Fluoreszenzmarkern markiert. Die Fluoreszenzmarker können sowohl niedermolekular als auch makromolekular sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Oberfläche einer festen Phase für das Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten. Da die Oberrfläche eine kritische Rolle im Verfahren spielt, wird zunächst die Oberfläche beschrieben.
1.2 Stand der Technik:
Die Nukleinsäurenketten-Sequenzanalyse ist in vielen Bereichen der Wissenschaft, Medizin und Industrie zu einem wichtigen Werkzeug geworden. Zur Analyse wurden mehrere Verfahren entwickelt.
Die bekanntesten Verfahren sind die Ketten-Terminations-Sequenzierung nach Sanger (F. Sanger et al. PNAS 1977 v.74 s. 5463), die auf dem Einbau von Kettenterminatoren basiert, und die Maxam-Gilbert-Methode, die auf Basen-spezifischer Modifikation und Spaltung von Nukleinsäureketten beruht (A.M. Maxam and W. Gilbert PNAS 1977, v.74 S.560). Beide Methoden liefern eine Anzahl von Nukleinsäurekettenfragmenten verschiedener Längen. Diese Fragmente werden der Länge nach in einem Gel aufgetrennt. Dabei müssen alle Nachteile der Elektrophorese (wie z.B. lange Laufzeit, relativ kurze Strecken von Sequenzen, die in einem Ansatz bestimmt werden können, begrenzte Anzahl der parallelen Ansätze sowie relativ große Mengen an DNA) in Kauf genommen werden. Diese Methoden sind sehr arbeitsintensiv und langsam.
Ein weiteres Verfahren zur Sequenzierung basiert auf der Hybridisierung von Nukleinsäureketten mit kurzen Oligonukleotiden. Dabei wird mit mathematischen Methoden berechnet, wie viele Oligonukleotide einer bestimmten Länge vorhanden sein müssen, um eine komplette Sequenz zu ermitteln (Z.T. Strezoska et al. PNAS 1991 v.88 S.10089, R.S.Drmanac et al. Science 1993 v.260 S.1649). Auch dieses Verfahren ist mit Problemen behaftet: Es kann nur eine Sequenz in einem Ansatz bestimmt werden, sekundäre Strukturen stören die Hybridisierung und Sequenzwiederholungen verhindern die korrekte Analyse.
Seit Mitte der 90er Jahre werden Verfahren entwickelt, die Ereignisse an einzelnen Molekülen oder an kleinen Gruppen einzelner Moleküle analysieren. Bei vielen Verfahren werden einzelne Moleküle während der Analyse an einer festen Phase gebunden. Zur Detektion werden Reaktionskomponenten beispielsweise mit Fluoreszenzmarker markiert. Da das Signal von einzelnen Molekülen in der Regel sehr schwach ist, benötigen solche Verfahren unter anderem auch Oberflächen von festen Phasen, die ein geringes Hintergrundsignal erzeugen.
Das Hintergrundsignal, z.B. Fluoreszenzsignal, kann von der festen Phase stammen, oder von markierten Komponenten ausgehen, die durch die Absorption (z.B. unspezifische Absorption) an die feste Phase während der Reaktion gebunden wurden.
Für die Analysen, die auf Einzelmolekülbasis basieren, ist es essentiell, dass das Hintergrundsignal von der festen Phase möglichst gering ist. Insbesondere stellt die Verringerung der unspezifischen Bindung von markierten Komponenten während der Analyse eine Herausforderung dar.
Allgemein bekannte Prozeduren zur Vorbereitung von Oberflächen zur Präparation von Biosensoren (Ligler, 1999) sind meist ineffektiv in Vorbereitung von Oberflächen für Verfahren, die auf Einzelmolekülanalyse basieren, da sie zu einem starken Hintergrund durch die unspezifische Bindung von markierten Komponenten führen.
Seit Mitte 80er Jahre werden Verfahren entwickelt, bei denen Nukleinsäuren zunächst auf einer festen Phase fixiert werden, um anschließend in einer biochemischen Reaktion, beispielsweise Hybridisierung oder Primer-Extension, analysiert zu werden. Dabei wurde festgestellt, dass die Reinigungsprozeduren und die Fixierung von Nukleinsäuren an die Oberflächen eine große Rolle spielen und eine eindeutige Vorhersage des Ergebnisses einer Reinigungsprozedur im Hinblick auf potenzielle Entstehung des Hintergrundsignals durch unspezifischen Bindung von markierten Komponenten nicht möglich ist (Taylor et al., 2003).
Trotz intensiver Suche nach geeigneten Oberflächen ist es bis jetzt nicht gelungen, eine Oberfläche zu finden, die trotz längeren und wiederholten Kontakts mit hohen Konzentrationen markierter Reagenzien, wie markierte Nukleinsäuren oder/und markierte Nukleotide, ein niedriges Hintergrundsignal durch unspezifische Bindung von markierten Komponenten aufweist.
1.3 Begriffe/Definitionen:
1.3.1. Makromolekulare Verbindung – ein Molekül, ein Molekülkomplex, ein Nanokristall oder Nanoteilchen, dessen Masse zwischen 2kDa und 100kDa, 100kDa und 200kDa, 200kDa und 1000kDa oder 1MDa und 100MDa oder 100 MDa und 1000Da liegt. Beispiele für makromolekulare Verbindungen sind Nukleinsäuren, wie Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 10 Nukleotiden, Polynukleotide, Polypeptide, Proteine oder Enzyme, Quantum Dots, Polymere wie PEG, Mowiol, Polyacrylat, Nanogold-Partikel.
1.3.2. Niedermolekulare Verbindung – ein Molekül oder ein Molekülkomplex, dessen Masse kleiner 2000 Da (2kDa) beträgt, z.B. natürliche Nukleotide, dATP, dUTP, viele Farbstoffe, wie Cy3, Rhodamine, Fluorescein, Linker mit einer durchschnittlichen Länge zwischen 5 und 30 Atomen, seltene Erden und konventionell modifizierte Nukleotide, wie Biotin-16-dUTP.
1.3.3. Ein Nuk-Makromolekül im Sinne dieser Anmeldung ist eine chemische Struktur, die eine oder mehrere Nuk-Komponenten, eine oder mehrere Linker-Komponenten und eine Marker-Komponente hat, 15 oder 16:
(Nuk-Linker)_n-Marker
wobei

Nuk: – eine Nuk-Komponente ist
Linker: – eine Linker-Komponente ist
Marker: – eine Makrer-Komponente ist
n: – eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist

In bevorzugter Ausführungsform besteht die Linker-Komponente aus einer Kopplungseinheit L für die Kopplung des Linkers an die Nuk-Komponente, aus einem wasserlöslichen Polymer und aus einer Kopplungseinheit T für die Kopplung des Linkers an die Marker-Komponente. In dieser bevorzugten Ausführungsform hat ein Nuk-Makromolekül folgende Struktur, 15 oder 16:
(Nuk-L- Polymer-T)_n-Marker
wobei:

Nuk: – ein Nukleotid oder ein Nukleotid ist (Nuk-Komponente)
L: – ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen Nuk und dem Linkerrest darstellt (Kopplungseinheit L)
T: – ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen dem Linkerrest und dem Marker darstellt (Kopplungseinheit T)
Polymer: – ein Teil des Linkers ist, das ein wasserlösliches Polymer mit einer durchschnittlichen Länge zwischen 100 und 10.000 Atome ist (Kopplungseinheit L, Polymerlinker, Kopplungseinheit T sind bei dieser Ausführungsform als Linker-Komponente zusammengefaßt)
Marker: – eine Marker-Komponente
n: – eine ganze Zahl zwischen 1 und 100

Nuk-Makromoleküle sind durch eine Kombination aus einer oder mehreren Nuk-Komponenten, entsprechend einem oder mehreren langen Linker-Komponenten und einer Marker-Komponente definiert.
1.3.3.1 Nuk-Komponente
Nuk-Komponente kann sowohl ein Nukleotid als auch ein Nukleosid darstellen. Im folgenden werden bei der Beschreibung Nukleotide betrachtet. Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, daß auch Nukleoside in entsprechender Weise modifiziert und in entsprechenden Reaktionen werden können. Prinzipiell können alle als Substrat für Nukleotid-akzeptierende Enzyme geeigneten konventionellen Nukleotid-Varianten als Nuk- Komponente des Nuk-Makromoleküls dienen, so daß sowohl natürliche als auch modifizierte Nukleotide (Nukleotid-Analoga) für die Nuk-Komponente in Frage kommen. Bei modifizierten Nukleotiden können Base-, Zucker- oder Phosphat-Teile modifiziert werden, 17A und B. Viele Beispiele für Nukleotid-Modifikationen sind dem Fachmann bekannt ("Advanced organic chemistry of nucleic acids", 1994, Shabarova, ISBN 3-527-29021-4, "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in cancer therapy", Cheson, 1997) im Text werden auch weitere Beispiele für die Modifikationen der Nukleotide angegeben.
Die Nuk-Komponente hat vorzugsweise eine Base-Komponente (Base), eine Zucker-Komponente (Zucker) und eine Phosphat-Komponente (Phosphat).
1.3.3.1.1 Variationen am Phosphat
In einer Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Monophosphat dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Diphosphat dar. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Triphosphat dar. Auch höhere Phosphat-Derivate (Tetraphosphat usw.) können verwendet werden.
Die genannten Phosphatmodifikationen können wie bei natürlichen Nukleosid-Triphosphaten an der 5'-Position oder auch an anderen Positionen des Zucker-Teils des Nukleotides sitzen, beispielsweise an 3'-Position.
1.3.3.1.2 Variationen an der Base
Die Nuk-Komponente kann ein in der Natur in den Nukleinsäuren vorkommendes Nukleotid darstellen (mit einer der Basen Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin, Uracil, Inosin), oder eine modifizierte Base, wie z.B. 7-Deazaadenin, 6-Thio-adenin, enthalten, Literatur s. oben..
1.3.3.1.3 Variationen am Zucker
Sowohl Ribose als auch 2'-Deoxyribose oder 2',3'-Dideoxyribose können das Grundgerüst der Nuk-Komponenten bilden. Auch am 3'-Hydroxyl modifizierte Ribose, bzw. 2'-deoxyribose können eingesetzt werden. In der Anmeldung werden 2'-Deoxynukleotide, beispielsweise 2'-Deoxyuridin-Triphosphat, 2'-Deoxycytidin-Triphosphat, 2'-Deoxyadenosin-Triphosphat, 2'-Deoxyguanosin-Triphosphat als dUTP, dCTP, dATP und dGTP bezeichnet.
1.3.3.1.4 Kopplung von NT und Linker
Die Nuk-Komponente ist an einer Kopplungsstelle mit dem Linker verbunden. Die Kopplungsstelle des Linkers an die Nuk-Komponente kann sich an der Base, am Zucker (Ribose bzw. Deoxyribose), oder am Phosphat-Teil befinden.
Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Nuk-Komponente ist vorzugsweise kovalent.
Wenn die Kopplungsstelle an der Base liegt, so befindet sie sich vorzugsweise an den Positionen 4 oder 5 bei Pyrimidin-Basen und an den Positionen 6,7,8 bei den Purin-Basen. Am Zucker können die Positionen 2', 3', 4' oder 5' die Kopplungsstellen darstellen. Die Kopplung an die Phosphatgruppen kann an der alpha, beta, oder gamma-Phosphatgruppe erfolgen. Beispiele für die Kopplungsstelle an der Base sind in Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382 (siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642., an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 beschrieben.
Die Position der Kopplungsstelle hängt vom Einsatzgebiet der NT-Makromoleküle ab. So werden beispielsweise für die Markierung von Nukleinsäuren, die am Nukleinsäurestrang verbleiben soll, vorzugsweise Kopplungsstellen am Zucker oder an der Base verwendet. Die Kopplung an die Gamma- oder Beta-Phosphatgruppen kann beispielsweise dann erfolgen, wenn die Markierung beim Einbau des Nuk-Makromoleküls freigesetzt werden soll.
Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente erfolgt über eine Kopplungseinheit (L), die ein Teil der Linker-Komponente ist.
Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 130°C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Diese spaltbare Verbindung ermöglicht die Entfernung der Linker- und der Marker-Komponenten. Dies kann beispielsweise in den Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese von Bedeutung sein, wie Pyrosequencing, BASS (Canard et al. US Patent 5.798.210, Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18 5.1021, Metzker et al. NAR 1994, V.22, S.4259, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18, S.19) oder single molecule sequencing, Tcherkassov WO 02088382. Ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, sofern sie unter den Bedingungen der enzymatischen Reaktion stabil bleibt, keine irreversible Störung der Enzyme (z.B. Polymerase) verursacht und unter milden Bedingungen abgespalten werden kann. Unter "milden Bedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, die zum Beispiel Nukleinsäure-Primer-Komplexe nicht zerstören, wobei z.B. der pH-Wert vorzugsweise zwischen 3 und 11 und die Temperatur zwischen 0°C und einem Temperaturwert (x) liegt. Dieser Temperaturwert (x) hängt von der Tm des Nukleinsäure-Primer-Komplexes (Tm ist der Schmelzpunkt) und wird beispielsweise als Tm (Nukleinsäure-Primer-Komplex) minus 5°C errechnet (z.B. Tm ist 47°C, dann liegt die maximale Temperatur bei 42°C; unter diesen Bedingungen eignen sich besonders Ester-, Thioester-, Acetale, Phosphoester-, Disulfid-Verbindungen und photolabile Verbindungen als spaltbare Verbindungen).
Vorzugsweise gehört die genannte spaltbare Verbindung zu chemisch oder enzymatisch spaltbaren oder photolabilen Verbindungen. Als Beispiele von chemisch spaltbaren Gruppen sind Ester-, Thioester-, Disulfid-, Acetal-Verbindungen bevorzugt (Short WO 9949082, „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al. Method in Enzymology 1990 V.184 S.584, Lomant et al. J.Mol.Biol. 1976 V.104 243, "Chemistry of carboxylic acid and esters" S.Patai 1969 Interscience Publ.). Beispiele für photolabile Verbindungen können in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Rothschild WO 9531429, "Protective groups in organic synthesis" 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 S.1, V. Pillai Org. Photochem. 1987 V.9 S.225, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" H.Giegrich, 1996, Konstanz, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" S.M.Bühler, 1999, Konstanz)..
1.3.3.1.5 Zahl der gekoppelten Nuk-Komponenten
In einer Ausführungsform der Erfindung ist pro ein Nuk-Makromolekül nur eine Nuk-Komponente gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind mehrere Nuk- Komponenten pro Nuk-Makromolekül gekoppelt. Mehrere Nuk-Komponenten können einheitlich oder unterschiedlich sein, wobei beispielsweise durchschnittlich 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 25, 25 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 250, 250 bis 500, 500 bis 1000 Nuk-Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül gekoppelt sein können.
1.3.3.2 Linker-Komponente Die Bezeichnung Linker oder Linker-Komponente wird synonym in der Anmeldung verwendet und bezieht sich auf den gesamten strukturellen Abschnitt des Nuk-Makromoleküls zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente.
1.3.3.2.1 Linker-Bestandteile
Die Linker-Komponente stellt einen Teil des Nuk-Markromoleküls dar, das zwischen der jeweiligen Nuk-Komponente und der Marker-Komponente liegt. Die Linker-Komponente hat in ihrer Struktur vorzugsweise folgende Bestandteile:

1) Kopplungseinheit L
2) wasserlösliches Polymer
3) Kopplungseinheit T

Die Aufteilung der Linker-Komponente in einzelne Bestandteile ist rein funktionell und soll lediglich der Anschaulichkeit der Struktur dienen. Je nach Betrachtungsweise können einzelne Strukturen des Linkers zum einen oder zum anderen funktionellen Bestandteil gerechnet werden.
Die Kopplungseinheit L hat die Funktion, die Linker-Komponente und die Nuk-Komponente zu verbinden. Ihre Struktur ist nicht eingeschränkt, solange das Nuk-Makromolekül als Substrat von den Enzymen akzeptiert wird. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, bis max. 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit L hängt von der Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid und von dem jeweiligen Polymer des Linkers. Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind in Beispielen 1 bis 33 angegeben. Viele konventionell modifizierte Nukleotide tragen einen kurzen Linker, diese kurzen Linker dienen als weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L, z.B. kurze Linker an der Base: Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382(siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), kurze Linker an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642., kurze Linker an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363. Noch weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L sind nachfolgend angegeben:
R₆-NH-R₇, R₆-O-R₇, R₆-S-R₇, R₆-SS-R₇, R₆-CO-NH-R₇, R₆-NH-CO-R₇, R₆-CO-O-R₇, R₆-O-CO-R₇, R₆-CO-S-R₇, R₆-S-CO-R₇, R₆-P(O)₂-R₇, R₆-Si-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-A-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-B-R₇, R₆-(CH=CH-)_n-R₇, R₆-(A-CH=CH-)_n-R₇, R₆-(CH=CH-B-)_n-R₇, R₆-A-CH=CH-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-CH=CH-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(-CH=CH-CH₂-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(C≡C-)_n-R₇, R₆-(A-C≡C-)_n-R₇, R₆-(C≡C-B-)_n-R₇, R₆-A-C≡C-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-C≡C-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(-C≡C-CH₂-CH₂)_n-B-R₇, wobei R₆ – die Nuk-Komponente ist, R₇ – de Polymer ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)₂-, -Si-, -(CH₂)_n-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 ist
Die Kopplungseinheit L ist auf einer Seite mit der Nuk-Komponente, auf der anderen mit Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind käuflich erwerblich (z.B. Fluka). Einige Varianten für die Kopplung von Polymeren an die Kopplungseinheiten sind unter Beispielen 1 bis 33 angegeben.
Das wasserlösliche Polymer bildet in einer bevorzugten Ausführungsform den Hauptanteil der Linker-Komponente. Es ist ein Polymer, vorzugsweise hydrophil, bestehend aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren. Beispiele für geeignete Polymere stellen Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Polyamide (z.B. Polypeptide), Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure und ihre Derivate, Poly-Acrylamide in ihre derivate, Poly(Vinylalkohol), Polylactat Säure, polyglycolic Säure, Poly(epsilon-caprolactone), Poly(beta-hydroxybutyrate), Poly(beta-hydroxyvalerate), Polydioxanone, Poly(ethylene terephthalate), Poly(malic Säure), Poly(tartronic Säure), Poly(ortho ester), Polyanhydride, Polycyanoacrylate, Poly(phosphoester), Polyphosphazene, Hyaluronidate, Polysulfones.
Dieses Polymer kann verzweigt sein oder nicht. Dieses Polymer kann aus mehreren unterschiedlich langen Abschnitten bestehen, wobei jeder Abschnitt aus gleichen Monomeren besteht und Monomere in unterschiedlichen Abschnitten unterschiedlich sind. Einem Fachmann sollte naheliegend erscheinen, daß für einen makromolekularen Linker meistens nur eine durchschnittliche Masse bestimmt werden kann, so daß die Angaben zu den Molmassen einen Mittelwert darstellen ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X). Aus diesem Grund kann für Nuk-Makromoleküle keine exakte Massenangabe gemacht werden.
1.3.3.2.2 Linker-Länge
Die Linkerlänge beträgt zwischen 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000 Atome, somit beträgt die durchschnittliche Linker-Länge zwischen 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000Angström (gemessen an einem potenziell maximal ausgestrecktem Molekül).
Einige Abschnitte des Linkers können rigide Bereiche enthalten und andere Abschnitte können flexible Bereiche enthalten.
Es wird einem Fachmann naheliegend erscheinen, daß die angeführten Linker-Längen eine beträchtlich größere Molekül-Größe und -Masse haben können, als die jeweilige Nuk-Komponente selbst.
1.3.3.2.3 Linker-Kopplung in einem Nuk-Makromolekül
Der Linker ist an einer Seite an die Nuk-Komponente und auf der anderen Seite an die Marker-Komponente gebunden. Dazu hat der Linker an seinen EndenKopplungseinheiten, die diese Funktion erfüllen. Die Verbindung mit der Nuk-Komponenten wurde oben erörtert. Die Verbindung zwischen dem Linker und der Marker-Komponenten erfolgt über Kopplungseinheit T.Ihre Struktur ist nicht eingeschränkt, solange das Nuk-Makromolekül als Substrat von den Enzymen akzeptiert wird. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, bis max. 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit T hängt von der Kopplungsstelle an der Marker-Komponente und von dem jeweiligen Polymer des Linkers. Die Kopplungseinheit T ist mit dem Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind kommerziell erhältlich (z.B. Fluka). Einige. Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind in Beispielen 1 bis 33 angegeben, Weitere Beispiele für die chemische und affine Kopplungen s. in der Literatur: „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996.
Der Linker kann auch andere funktionelle Gruppen, bzw. Abschnitte enthalten, beispielsweise eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Gruppen.
Eine spaltbare Verbindung innerhalb des Linkers ermöglicht eine Entfernung eines Teils des Linkers und der Marker-Komponente. Nach der Spaltung verbleibt ein Linker-Rest an der Nuk-Komponente, Beispiele für spaltbare Verbindungen sind im Abschnitt 1.3.3.1.4 angegeben.
1.3.3.3 Marker-Komponente
Die Marker-Komponente kann unterschiedliche Strukturen haben. Die Strukturen im einzelnen sind nicht eingeschränkt, solange sie die Substrateigenschaften der Nuk-Komponenten für Enzyme nicht komplett aufheben. Diese Struktur hat vorzugsweise eine signalgebende oder eine signalvermittelnde Funktion. Der Marker kann auch andere Funktionen haben, beispielsweise strukturturelle, antitoxische oder affine Funktion (beispielsweise in Arzneimittel oder Zuberetungen).
1.3.3.3.1 Die Zusammensetzung der Marker-Komponente
Der Marker kann aus einem Makromolekül bestehen oder aus einer Gruppe gleicher oder unterschiedlicher struktureller Einheiten (Marker-Einheiten) mit signalgebender oder signalvermittelnder Funktion. Diese Einheiten können Moleküle mit geringer Molekularmasse, z.B. unter 2000 Da, oder auch selbst Makromoleküle sein. Dabei liegt die Zahl der signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten, die zu einer Marker-Komponenten zusammengefaßt sind, zwischen 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. Die Einheiten sind an ein makromolekulares Gerüst gebunden, der Kern-Komponenten des Markers. Diese Kern-Komponente verbindet die Einheiten untereinander und stellt die Verbindung zu einem oder mehreren Nuk-Linker-Komponenten her.
1.3.3.3.2 Struktur der signalgebenden oder der signalvermittelnden Einheiten des Markers
Die strukturellen Marker-Einheiten können aus folgenden Gruppen gewählt werden:
1.3.3.3.2.1 Strukturen mit niedriger Molmasse:
Biotin-Moleküle, Napten-Moleküle (z.B. Digoxigenin), radioaktive Isotope (z.B. P ³², J ¹³¹), oder deren Verbindungen, seltene Erden, Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe (s. z.B. Molecular Probes, Inc.) mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften, Farbstoffe, die untereinander FRET eingehen.
Auch chemisch reaktive Gruppen, wie beispielsweise Amino-, Merkapto-, Aldehyd-, Jodacetat-, Acryl-, Dithio-, Thioester-Verbindungen können als signalvermittelnde strukturelle Einheiten dienen. Nach dem Einbau können diese reaktiven Gruppen mit signalgebenden Elementen, wie beispielsweise Farbstoffe mit entsprechenden reaktiven Gruppen (beispielsweise NHS-Ester, Merkapto-, Amino-Gruppen) modifiziert werden. Die Grundlagen für die Wahl eines passenden Paares sind in „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 dargestellt.
In einer speziellen Ausführungsform erfühlt die Kombination aus einer markomolekularen Linker-Komponente und einem Marker mit niedriger Molmasse bereits die Anforderungen der vorliegenden Erfindung. Solche Verbindungen sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung, da sie sowohl als Zwischenprodukte für die chemische Synthese von Nuk-Makromolekülen mit einem makromolekularen Marker, z.B. dUTP-PEG-Biotin, als auch selbständig in den enzymatischen Reaktionen verwendet werden können, wie beispielsweise mit nur einem Farbstoff markierte Nukleotide. Als Farbstoffe können verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe auftreten, ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, solange sie die enzymatische Reaktion nicht wesentlich beeinflußen. Beispiele für Farbstoffe sind Rhodamine (Rhodamin 110, Tetramethylrhodamin), Cyanin-Farbstoffe (Cy2, Cy3, Cy5, Cy7), Coumarine, Bodipy, Fluorescein, Alexa-Farbstoffe. Viele Farbstoffe sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande (im weiteren als Molecucular Probes bezeichnet) oder von Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Deutschland). Beispiele für die Synthese eines Nuk-Makromoleküls mit einem niedermolekularem Marker ist in Beispiel 19, 20, 23, 36, 37, 38 angegeben. Nach dem Einbau des Nukleotid-Teils in die Nukleinsäure befindet sich der am Linker gekoppelte Farbstoff in einem großen Abstand vom Nukleinsäurestrang, was zu Verringerung der Einflüße der Nukleobasen auf die Fluoreszenzeigenschaften des Farbstoffes führt. Fluoreszenzausbeuten einzelner Farbstoffe werden dadurch weniger von der lokalen Zusammensetzung der Nukleinsäuresequenz beeinflußt, was zum gleichmäßigen Signalenintesnitäten führt.
1.3.3.3.2.2 Strukturen mit hoher Masse (Makromoleküle)
1.3.3.3.2.2.1 Nanokristalle, z.B. Quantum Dots. Dabei können in einer Marker-Komponente Quantum Dots mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften verwendet werden, US Pat. 6.322.901, US Pat. 6.423.551, US Pat. 6.251.303, US Pat. 5.990.479).
1.3.3.3.2.2.2 Nano oder Mikro-Teilchen, wobei die größten Ausmaße dieser Teilchen von 1nm bis 2nm, von 2nm bis 5nm, von 5nm bis 10nm, von 10nm bis 20 nm, von 20nm bis 50nm, von 50nm bis 100nm, von 100 nm bis 200nm, von 200nm bis 500nm, von 500nm bis 1000nm, von 1000 nm bis 5000 nm betragen. Das Material der Teilchen können beispielsweise reine Metalle wie Gold, Silber, Aluminium (beispielsweise Teilchen mit surface plasmon resonance ), – Protein-Au-Konjugate: J. Anal.Chem. 1998, V. 70,S. 5177, – Nukleinsäure-Au-Konjugaten: J. Am. Chem. Soc. 2001, V. 123, 5.5164, J. Am. Chem. Soc. 2000, V. 122, S. 9071, Biochem. Biophys. Res. Commun 2000, V. 274, S. 817, Anal. Chem. 2001, V. 73, S. 4450), – Latex (z.B. Latex-Nanopartikel, Anal. Chem. 2000,V. 72, S. 1979) – Kunststoff (Polystyrene), – paramagnetische Verbindungen/Gemische Zhi ZL et al. Anal Biochem. 2003 Jul 15;318(2):236–43, Dressman D et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jul 22;100(15):8817–22„ – Metall-Teilchen, – magnetische Verbindungen/Gemische Jain KK. Expert Rev Mol Diagn. 2003 Mar;3(2):153–61, Patolsky F et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2003 May 30;42(21):2372–2376, Zhao X et al. Anal Chem. 2003 Jul 15;75(14):3144–51, Xu H et al. J Biomed Mater Res. 2003 Sep 15;66A(4):870–9, JOSEPHSON Lee et al. US 2003092029, KLICHE KAY-OLIVER et al. WO 0119405.
1.3.3.3.2.2.3 Proteinmoleküle,
aus folgenden Gruppen: Enzyme (z.B. Peroxidase, alkalische Phosphotase, Unease, beta-Galaktosidase), – fluoreszierenden Proteine (z.B. GFP), Antigen-bindende Proteine (z.B. Antikörper, Tetramere, Affibodies (Nord et. Al Nature Biotechnology, V. 15 (S.772–777) oder deren Bestandteile (z.B. Fab-Fragmente), Nukleinsäurebindende Proteine (z.B. Transcriptionsfaktor)
1.3.3.3.2.2.4 Nukleinsäureketten,
die Nukleinsäureketten einschließlich der Gruppe, Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, wobei die Nukleinsäureketten eine Länge von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5.000, von 5.000 bis 10.000, von 10.000 bis 100.000Nukleotiden haben. Es können DNA, RNA, PNA-Moleküle verwendet werden. Nukleinsäureketten können zusäzliche Modifikationen tragen, wie beispielsweise freie Aminogruppen, Farbstoffe und andere signalgebende Moleküle, z.B. makromolekulare Stoffe, wie Enzyme oder Nanokristalle (MWG-Biotech, Detschland).
Weitere Beispiele für Makromoleküle oder Makromolekülkomplexe, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Einheiten in der Marker-Komponente für die Signalverstärkung eingesetzt werden können, sind in US 4882269 , US 4687732 , WO 8903849, US 6017707 beschrieben.
1.3.3.3.3 Die Kern-Komponente der Marker-Komponente
Die Kernkomponente hat die Funktion mehrere strukturelle Elemente der Nuk-Makromoleküle zu binden. Vorzugsweise werden mehrere Nuk-Linker-Komponenten oder mehrere Marker-Einheiten an die Kernkomponente gekoppelt.
1.3.3.3.3.1 Bestandteile
In einer Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem wasserlöslichen Polymer, dabei kann das Polymer aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren bestehen.
Beispiele für den Kernteil-Komponennte stellen Derivate folgender Polymere: Polyamide (z.B. Polypeptide), Poly-Acrylsäure, Poly-Acrylamide, Poly-Vinylalkohole, Nukleinsäuren, Proteinen.. Diese Polymere können linear, globulär, z.B. Streptavidin oder Avidin, oder verzweigt sein, z.B. Dendrimere. Auch vernetzte lösliche Polymere, wie beispielswiese vernetzte Poly-Acrylamide (Crosslinker Bisacrylamid in Kombination mit Poly-Acrylamid), eingesetzt werden.
Die Kern-Komponennte hat mehrere Kopplungsstellen, an die weitere Elemente gebunden werden können, z.B. strukturelle Marker-Einheiten oder Nuk-Linker-Komponente.
Beispielsweise Poly-Lysin-Moleküle haben multiple freie Aminogruppen, an die mehrere Farbstoffmoleküle, Biotinmoleküle, Haptenmoleküle oder Nukleinsäureketten gekoppelt werden können. Poly-Lysine haben unterschiedliche Molmasse, z.B. 1000–2000, 2000–10000, 10000–50000 Da können käuflich erworben werden.
Als weiteres Beispiel für die Kernkomponente dienen Nukleinsäurenstränge, wobei die Nukleinsäureketten eine Länge von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5000, von 5000 bis 10000 Nukleotiden haben. Diese Nukleinsäuren dienen als Bindungspartner für sequenzkomplementäre Markereinheiten.
In einer weiteren Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem Dendrimer, z.B. Polypropylenimine, Polyaminoamine. Beispiele für andere Dendrimere sind bekannt: Cientifica "Dendrimers", 2003, Technology white papers Nr. 6, Klajnert et al. Acta Biochimica Polonica, 2001, v. 48, S. 199, Manduchi et al. Physiol. Genomics 2002, V.10, 5.169, Sharma et al. Electrophoresis. 2003, V. 24, S. 2733, Morgan et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Nov;5(6):966–73, Benters et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E10, Nilsen et al. J Theor Biol. 1997 Jul 21;187(2):273–84. Viele Dendrimere sind kommerziell erwerblich (Genisphere, www.genisphere.com, Chimera Biotech GmbH).
Weitere Kombinationen für die Kern-Komponennte aus den oben dargestellten Bestandteilen sind einem Fachmann naheliegend.
1.3.3.3.3.2 Kopplung der Marker-Einheiten an die Kern-Komponente
Strukturelle Marker-Einheiten können an die Kern-Komponente oder an die Linker-Komponente durch eine kovalente Bindung, beispielsweise über einen Cross-linker (Chemistry of protein conjugation and cross-linking, S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2), oder über eine affine Kopplung erfolgen, beispielsweise Biotin-Streptavidin-Verbindung oder Hybridisierung von Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkung ("Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).
Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt in einer Ausführungsform bereits während der Synthese der Nuk-Makromoleküle.
In einer anderen Ausführungsform erfolgt zunächst die chemische Synthese von Nuk-Makromoleküle, bei denen die Markerkomponente nur aus der Kern-Komponente besteht. Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt erst nach dem Einbau von Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette. Durch eine große Zahl der potenziellen Bindungsstellen am Kernteil ist die Wahrscheinlichkeit der Bindung der Marker-Einheiten an die Kern-Komponente und somit an die eingebaute Nuk-Komponente wesentlich größer im Vergleich zu konventionellen Nukleotid-Strukturen.
Die Kopplungschemie im einzelnen hängt von der Struktur der Marker-Einheiten und der Struktur der Kern-Komponente ab.
Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern-Komponente kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein (Beispiel 33), z.B. bei Temperaturen bis zu 100°C, für pH-Bereiche zwischen 3 und 12, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
Beispiele für die Kopplung von Nukleinsäuren an Dendrimere (entspricht einer Kopplung von Marker-Einheiten an eine Kernkomponente) sind z.B. in Shchepinov et al. Nucleic Acids Res. 1999 Aug 1;27(15):3035–41, Goh et al. Chem Commun (Camb). 2002 Dec 21;(24):2954 dargestellt.
1.3.3.3.3.3 Kopplung zwischen Linker und Marker
In einer Ausführungsform ist die Nuk-Linker-Komponente direkt an die signalgebende oder signalvermittelnde Marker-Einheit der Marker- Komponente gebunden.
In einer weiteren Ausführungsform sind ein oder mehrere Nuk-Linker-Komponenten an die Kern- Komponente des Markers gebunden.
Die Verbindung zwischen dem Linker und der Kern- Komponente oder dem Linker und der Marker- Komponente hängt von der jeweiligen Struktur der Marker-Einheiten bzw. der Struktur der Kern-Komponente. Die Bindung kann sowohl kovalent als auch affine erfolgen "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2.
Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen der Marker-Einheiten und der Kern-Komponennte kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 130°C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.
1.3.3.3.4 Das Verhältnis der Nuk- Komponenten in einem Nuk-Makromolekül
In einem Nuk-Makromolekül können 1–1000 Nuk-Komponenten vorkommen, s.o. Dabei kann die Verteilung von Nuk-Komponenten in einer Nuk-Makromolekül-Population schwanken und muß nicht notwendigerweise einen konstanten Wert für jedes einzelne Nuk-Makromolekül darstellen.
In einer Ausführungsform haben alle Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl an Nuk-Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, bei sättigender Konzentration von Nuk-Linker- Komponenten, eine einheitliche Population an Nuk-Makromolekülen entsteht.
In einer anderen Ausführungsform haben die Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Anzahl von Nuk- Komponenten pro Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Nuk- Komponenten statt. Die Verteilungsangaben von Nuk- Komponenten pro Nuk-Makromolekül stellen in diesem Fall einen Mittelwert dar. Solche Nuk-Makromoleküle können beispielsweise dann eingesetzt werden, wenn die Nuk- Komponente eine terminierende Eigenschaft aufweist.
1.3.3.3.5 Das Verhältnis von Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül
In einem Nuk-Makromolekül können 1–1000 Marker-Einheiten vorkommen, s.o. Dabei kann die Verteilung von Marker-Einheiten in einer Nuk-Makromolekül-Population schwanken und muß nicht notwendigerweise einen konstanten Wert für jedes einzelne Nuk-Makromolekül darstellen.
In einer Ausführungsform haben alle Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl der Marker-Einheiten pro ein Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, Avidin-Biotin-Technology, Methods in Enzymology v.184, 1990..
In einer anderen Ausführungsform haben die Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Zahl der Marker-Einheiten pro Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt. Bei sättigenden Konzentrationen bei der Synthese von Marker-Komponenten findet eine zunehmend einheitlichere Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt.
Solche Nuk-Makromoleküle sind beispielsweise für Verfahren von Bedeutung, bei denen Schwankungen in der Signalintensität innerhalbeiner Nuk-Makromolekül-Population zu vernachlässigen sind.
So spielt beispielsweise in Bereichen, wo es um den qualitativen Nachweis geht, die exakte Zahl der Marker-Einheiten pro Nuk-Makromolekül eine untergeordnete Rolle. In solchen Fällen ist das Vorhandensein eines stabilen Signals an sich von Bedeutung. Beispiele für solche Verfahren stellen Sequenzierverfahren mit einzelnen Molekülen dar.
Es sollte einem Fachmann naheliegend erscheinen, daß die angeführten Marker-Komponenten eine beträchtlich größere Molekül-Größe und -Masse haben, als die jeweilige Nuk-Komponente selbst. Weiterhin sollten andere Beispiele für makromolekulare Marker-Komponenten einem Fachmann naheliegend erscheinen.
1.3.3.3.6 Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle
Die Nuk-Komponente kann als Substrat für unterschiedliche Enzyme dienen. Beispielsweise dient die Nuk-Komponente, in dieser Ausführungsform als Nukleosid-Triphosphat, als Substrat für eine Polymerase, so daß die Nuk-Komponente in einen wachsenden Strang durch eine Polymerase eingebaut werden kann und somit das gesamte Nuk-Makromolekül an den Strang kovalent gekoppelt wird.
Weitere Beispiele für Enzyme stellen Kinasen, Phosphorylasen, Transferasen dar. Die Substrateigenschaften des/der Nuk-Komponente(n) bestimmt/bestimmen die Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle. So kann die Nuk-Komponente als ein Terminator dienen, so daß nur ein einziges Nuk-Makromolekül eingebaut werden kann. In einer anderen Ausführungsform dient die Nuk-Komponente als ein reversibler Terminator, der die Durchführung einer schrittweise kontrollierten B. in Tcherkassov WVerlängerungsreaktion erlaubt, wie z.O 02088382 dargestellt ist.
1.3.3.3.7 Funktion der Marker
Die makromolekulare Marker-Komponente kann in einer Ausführungsform eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion haben.
Bei der signalgebenden Funktion enthält die Marker-Komponente Bestandteile, die bereits während der chemischen Synthese an Nuk-Makromoleküle gebunden werden, s. Beispiel 33.
Bei der signalvermittelnden Funktion trägt die Marker-Komponente Bestandteile, die erst durch eine Reaktion mit signalgebenden Molekülen ihre Signaleigenschaften entfalten, s. Beispiel 32.
Beispielsweise können mehrere Biotin-Moleküle, z.B. 100, den Marker-Teil bilden. Nach dem Einbau der Nuk-Makromoleküle erfolgt eine Nachweisreaktion mit modifizierten Streptavidin-Molekülen. In einem anderen Beispiel haben die Nukleinsäureketten die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau von Nuk-Makromoleküle, erfolgt eine Hybridisierung von einheitlichen Oligonukleotiden mit detektierbaren Einheiten, z.B. Fluoreszenzfarbstoffen (MWG-Biotech) an die Marker-Komponente. In einem weiteren Beispiel haben Amino- oder Merkapto-Gruppen, beispielsweise 50 Aminogruppen pro Marker, die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau der Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette erfolgt eine chemische Modifikation mit reaktiven Komponenten, z.B. mit Farbstoffen, wie beispielsweise für eingebaute Allyl-Amino-dUTP beschrieben, Diehl et al. Nucleic Acid Research, 2002, V. 30, Nr. 16 e79.
In einer anderen Ausführungsform hat die makromolekulare Marker-Komponente eine katalytische Funktion (in Form eines Enzyms oder Ribozyms). Dabei können unterschiedliche Enzyme verwendet werden, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase. Dank der Kopplung an die Nuk-Komponente kann das jeweilige Enzym durch den Einbau von Nuk-Makromolekülen an den Nukleinsäurestrang kovalent gebunden werden.
In einer weiteren Ausführungsform hat die makromolekularer Marker-Komponente eine Affinitätsfunktionalität zu einem anderen Molekül. Beispiele für solche Marker bilden Streptavidin-Moleküle oder Nukleinsäureketten, Beispiel 30 oder 32.
1.3.4. Niedermolekularer Marker – zum Stand der Technik gehörende Markierung von Nukleotiden beispielsweise mit ein oder zwei Biotin-Molekülen, ein oder zwei Farbstoff-Molekülen, ein oder zwei Hapten-Moleküln (z.B. Digoxigenin).
1.3.5. Konventionell modifiziertes Nukleotid – ein Nukleotid mit einem Linker (durchschnittliche Länge zwischen 5 und 30 Atomen) und einem Marker. Üblicherweise trägt ein konventionell modifiziertes Nukleotid einen niedermolekularen Marker, z.B. ein Farbstoff- oder ein Biotinmolekül.
1.3.6 Anker-Funktion
Bezieht sich auf die Fähigkeit von auf der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten andere komplementäre Nukleinsäureketten zu binden. Der Vorgang wird Hybridisierung genannt. Diese Bindung wird zu affinen Bindungen gezählt.
1.3.7 Dichte
Dichte der fixierten Nukleinsäurestränge bzw. Dichte der Signale: Bei der Darstellung der Dichte wird jeweils ein Mittelwert der Anzahl einzelner Elemente oder Ereignisse pro 100 μm² angegeben.
1.3.8 Herstellung der Oberfläche
Herstellung der Oberfläche der festen Phase kann mehrere Schritte einschließen. Die erfindungswesentliche Schritte der Herstellung werden angegeben. Dem Fachmann sind auch andere Schritte bei der Verarbeitung von Oberflächen bekannt. Sie werden nicht expliziert genannt, wenn sie keinen wesentlichen Beitrag zur Erfindung haben.
1.3.9 Inkubationsschritt
Je nach Verfahren wird der Kontakt zwischen einer Lösung mit markierten Komponenten und der Oberfläche mit fixierten Nukleinsäuren unterschiedlich bezeichnet. Manchen Autoren nennen sie "Inkubationsschritte" andere bezeichnen sie als "Zyklus" oder "Einbauzyklus".
1.3.10 DNA – Desoxyribonukleinsäure verschiedenen Ursprungs und unterschiedlicher Länge (Oligonukleotide, PCR-Produkte, Plasmide, genomische DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA).
RNA – Ribonukleinsäure
1.3.11 dNTP – 2'-deoxi-Nucleosid-Triphosphate, Substrate für DNA-Polymerasen und Reverse-Transkriptasen
1.3.12 Markierte Komponenten
Unter markierten Komponenten werden Moleküle verstanden, die eine detektierbare Markierung tragen. Bevorzugt werden in dieser Anmeldung markierte Nukleotide (konventionell modifizierte Nukleltide als auch Nuk-Makromoleküle) und markierte Nukleinsäureketten betrachtet. Die markierten Komponenten können auch weitere Modifizierungen beinhalten.
1.3.13 NTP – Nukleosid-Triphosphate, Substrate für RNA-Polymerasen
1.3.14 NT – natürliches Nukleotid, meist dNTP, wenn nicht ausdrücklich anders gekennzeichnet.
Abkürzung "NT" wird auch bei der Längenangabe einer Nukleinsäuresequenz verwendet, z.B. 1.000 NT. In diesem Fall steht "NT" für Nukleosid-Monophosphate.
Im Text wird bei Abkürzungen die Mehrzahl durch Verwendung des Suffixes "s" gebildet, "NT" steht zum Beispiel für "Nukleotid", "NTs" steht für mehrere Nukleotide.
1.3.15 NT^* – modifiziertes Nukleotid (konventionell modifiziertes Nukleotid oder ein Nuk-Makromolekül), NTs^* bedeutet: modifizierte Nukleotide
1.3.16 NSK – Nukleinsäurekette.
1.3.17 NSKF – Nukleinsäurekettenfragment. Nach einem Fragmentierungsschritt kann eine Nukleinsäurekette mehrere NSKFs ergeben.
1.3.18 Plane Oberfläche: Oberfläche, die vorzugsweise folgende Merkmale aufweist: Sie erlaubt, mehrere Signale, vorzugsweise mehr als 100, noch besser mehr als 1000, mit dem jeweiligen gegebenen Objektiv-Oberfläche-Abstand bei einer Objektivposition gleichzeitig zu detektieren.
1.3.19 Polymerasen – Enzyme, die komplementäre Nukleotide in einen wachsenden DNA- oder RNA-Strang einbauen können (z.B. DNA-Polymerasen, Reverse-Transkriptasen, RNA-Polymerasen)
1.3.20 Primerbindungstelle (PBS) – Teil der Sequenz in der NSK oder NSKF, an den der Primer bindet.
1.3.21 Referenzsequenz – eine bereits bekannte Sequenz, zu der die Abweichungen in der zu untersuchenden Sequenz bzw. in den zu untersuchenden Sequenzen ermittelt werden. Als Referenzsequenzen können in Datenbanken zugängliche Sequenzen verwendet werden, wie z.B. aus der NCBI-Datenbank.
1.3.22 Regenerierte Oberfläche
Nach der Abtragung der Außenschicht der festen Phase entsteht eine regenerierte Oberfläche der festen Phase.
1.3.23 Tm – Schmelztemperatur
1.3.24 TCEP – Tris-carboxy-ethyl-phosphin
1.3.25 unspezifischen Bindung von markierten Komponenten
Grad der unspezifischen Bindung wird als die Zahl der Bindungsereignisse (Mittelwert) pro 100 μm² angegeben. Dabei werden in dieser Anmeldung folgende Abstufungen vorgenommen:
sehr hohe unspezifische Bindung: größer 100/100 μm²
hohe unspezifische Bindung: zwischen 50 und 100/100 μm²
mittelere unspezifische Bindung: zwischen 20 und 50/100 μm²
niedrige unspezifische Bindung: zwischen 10 und 20/100 μm²
sehr niedrige unspezifische Bindung: unter 10/100 μm²
Mit steigender Dichte der unspezifischen Signale wächst die Wahrscheinlichkeit, dass die Signale von den unspezifischen Ereignissen mit den Signalen von spezifischen Ereignissen überlappen und optisch nicht mehr zu unterscheiden sind. Das Ausmaß der unspezifischen Bindung an die Oberfläche, das die Analyse der Prozesse auf dem Einzelmolekülniveau schwer bis unmöglich macht, hängt stark von der Auflösung des Detektionssystems ab und Fähigkeiten nachfolgender Systeme, beispielsweise Bilderkennungssysteme (z.B. Kamera, Software), benachbarte Signale zu unterscheiden. Die Einteilung der Stufen der unspezifischen Bindung wurde für eine Auflösung von 0,25 μm bis 0,4 μm vorgenommen.
1.3.26 Weitfeldoptik
Unter Weitfeldoptik werden Detektionsvorrichtungen vorstanden, die eine Auflösung im Bereich von über 0,2 μm aufweisen, z.B. eine Auflösung von 0,5 μm oder 1 μm. Dieser Sammelbegriff grenzt sich von der Nahfeldoptik ab, die eine Auflösung im Bereich von wenigen Nanometern ermöglicht.
Der Begriff schränkt die in Frage kommenden Detektionsverfahren nicht ein. Beispielsweise können folgende Detektionsarten verwendet werden: Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop (Epifluoreszenz), Laser-Scanning-Mikroskop (Epifluoreszenz) oder einem TIRF-Mikroskop (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope).
Für die Detektion der Fluoreszenzsignale von einzelnen Molekülen sind verschiedene Varianten der Konstruktion einer solchen Apparatur möglich (Weston et al. J.Chem.Phys. 1998 v.109 5.7474, Trabesinger et al. Anal. Chem. 1999 v.71 S.279, Adachi et al. Journal of Microscopy 1999 v.195 S.125, Unger et al. BioTechniques 1999 v.27 5.1008, Ishijaima et al. Cell 1998 v.92 S.161, Dickson et al. Science 1996 v.274 S.966, Tokunaga et al. Bichem.Biophys.Res.Com. 1997 v.235 S.47, "Confocal Laser Scanning Microscopy" 1997 Ed. Sheppard, BIOS Scientific Publishers, "New Techniques of optical microscopy and microspectroscopy" 1991 Ed. R.Cherry CRC Press, Inc., "Fluorescence microscopy" 1998 2.ed. Herman BIOS Scientific Publishers, "Handbook of biological confocal microscopy" 1995 J.Pawley Plenum Press). Unterschiede in ihrem konkreten Aufbau ergeben sich aus der Variation ihrer Einzelteile. Die Vorrichtung für das Anregungslicht kann z.B. auf der Basis eines Lasers, einer Lampe oder von Dioden funktionieren. Für die Detektionsvorrichtung können sowohl CCD-Kameras, Zeilenkameras oder als auch Photomultiple Tube (PMT) oder Dioden dienen. Andere Beispiele für technische Details siehe ("Confocal Laser Scanning Microscopy" 1997 Ed. Sheppard, BIOS Scientific Publishers, "New Techniques of optical microscopy and microspectroscopy" 1991 Ed. R.Cherry CRC Press, Inc., "Fluorescence microscopy" 1998 2.ed. Herman BIOS Scientific Publishers, "Handbook of biological confocal microscopy" 1995 J.Pawley Plenum Press).
Besonders vorteilhaft sind Kombinationen der erfindungsgemäßen Oberflächen mit einer Weitfeldoptik mit einer örtlichen Auflösung, die in einem der folgenden Bereichen liegt: zwischen 0,2 μm bis 0,3 μm, 0,3 μm bis 0,4 μm, 0,4 μm bis 0,5 μm, 0,5 μm bis 0,6 μm, 0,6 μm bis 0,7 μm, 0,7 μm bis 0,8 μm, 0,8 μm bis 0,9 μm, 0,9 μm bis 1 μm, 1 μm bis 1,5 μm, 1,5 μm bis 2 μm.
1.4 Aufgabe der Erfindung:
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren zur Sequenzanalyse von Nukleinsäureketten bereitzustellen, das die Nachteile der oben erwähnten Methoden nicht aufweist und vor allem eine billigere, schnellere und effizientere Analyse von Nukleinsäuresequenzen ermöglicht. Insbesondere soll das Verfahren in der Lage sein, viele Sequenzen parallel zu bestimmen.
Die Aufgabe der Erfindung bestand weiterhin darin, eine Oberfläche einer festen Phase bereitzustellen, die bei den Analysen von Nukleinsäureketten eingesetzt werden kann und eine niedrige unspezifische Bindung von sowohl markierten und unmarkierten Nukleotiden als auch markierten und unmarkierten Nukleinsäuren aufweist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung bestand darin, eine Oberfläche einer festen Phase zu entwickeln, die eine niedrige unspezifische Bindung von markierten und unmarkierten Nukleotiden und markierten und unmarkierten Nukleinsäuren aufweist, wobei an diese Oberfläche der festen Phase Nukleinsäuren, z.B. Nukleinsäureketten mit einer Länge von 10 bis 1000 Nukleotide, gekoppelt werden können.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung bestand darin, eine Oberfläche zu entwickeln, die in einem Analyse-Verfahren eingesetzt werden kann, in dem markierte und/oder unmarkierte Nukleotide und/oder markierte und/oder unmarkierte Nukleinsäuren verwendet werden, beispielsweise ein Sequenzierungsverfahren (WO 02088382, WO 03020968, WO 02072892, WO 0070073, WO 03020968) oder auch in DNA-Chip-Technologie wie in ("DNA Microarrays", Bowtell, 2003, ISBN 0-87969-624-9, "Microarray-Biochip Technology" M Schena, 2000, ISBN 1-881299-37-6) beschrieben.
Die Nachteile des Standes der Technik wurden durch eine neue Methode der Vorbereitung der Oberfläche einer festen Phase überwunden.
1.5 Kurze Beschreibung der Erfindung:
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur hochparallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen mit optischen Mitteln (Nukleinsäureketten, NSKs) gelöst, das folgende Schritte einschließt:

Markierte Nukleotide können dabei sowohl konventionell markierte bzw. modifizierte Nukleotide als auch Nuk-Makromoleküle darstellen.
Aus den ermittelten Teilsequenzen kann man beispielsweie die Gesamtsequenz der Nukleinsäurekette bestimmen. Unter einer parallelen Sequenzanalyse wird in diesem Zusammenhang die gleichzeitige Sequenzanalyse vieler NSKFs verstanden (beispielsweise 1.000.000 bis 10.000.000), wobei diese NSKFs von einer einheitlichen NSK-Population oder von mehreren unterschiedlichen NSK-Populationen abgeleitet sind.
Die erhaltene Population von überlappenden Teilsequenzen läßt sich beispielsweise bei de novo Sequenzierung mit kommerziell erhältlichen Programmen zur Gesamtsequenz der NSK zusammenfügen (Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v.1 S.257).
Bei der Analyse von Varianten einer bekannten Referenzsequenz lassen sich Mutationen oder Einzelnukleotidpolymorphismen durch einen Vergleich der erhaltenen überlappenden Teilsequenzen mit der Referenzsequenz feststellen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann das Verfahren durchgeführt werden, indem man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man

a) in jedem Zyklus nur jeweils ein markiertes NT^*,
b) in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte NTs^* oder
c) in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte NTs^*

Wenn die NSKs Varianten einer bekannten Referenzsequenz sind kann das Verfahren auch durchgeführt werden, indem man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in den Zyklen abwechselnd jeweils zwei unterschiedlich markierte NTs^* und zwei unmarkierte NTs einsetzt und man die Gesamtsequenzen durch Vergleich mit der Referenzsequenz ermittelt.
Die Anmeldung beschreibt eine Oberfläche einer festen Phase für das erfindungsgemäße Verfahren, die eine sehr geringe unspezifische Bindung von markierten Komponenten wie beispielsweise markierten Nukleotiden und markierten Nukleinsäuren aufweist (6A–D), s. Test 1.1 bis 1.4 Beispiele 1.1.
An die erfindungsgemäße Oberfläche der festen Phase können Nukleinsäureketten spezifisch gebunden werden. Die erfindungsgemäße Oberfläche der festen Phase mit fixierten Nukleinsäuren kann in Verfahren zur Analyse der Nukleinsäuren eingesetzt werden, die Hybridisierung von komplementären markierten Nukleinsäuren und/oder enzymatische Reaktionen an fixierten Nukleinsäureketten (1, Beispiel 6.1) einschließen, wobei sowohl Hybridisierung von markierten Nukleinsäuren als auch enzymatische Reaktionen mit fixierten Nukleinsäureketten mehrmals wiederholt werden können. Dabei bleibt das Hintergrundsignal, das bei dem einmaligen oder wiederholten Kontakt zwischen der festen Phase und den markierten Komponenten durch die unspezifische Bindung entstanden ist, gering. Diese Eigenschaften der Oberfläche ermöglichen eine bessere Leistung der Verfahren im Vergleich zu den Ergebnissen, die mit herkömmlichen Oberflächen erzielt werden können.
Die feste Phase hat in einer Ausführungsform Silica (SiO₂) als Hauptkomponente. Glas oder Quarz stellen bevorzugte Formen von Silica dar.
In einer anderen Ausführungsform hat die feste Phase als Hauptkomponente reines Silizium, wobei die äußere Schicht zu SiO₂ oxidiert ist.
In einer Ausführungsform ist die feste Phase auf einem Träger befestigt. Der Träger besteht beispielsweise aus Kunststoff.
Die Oberfläche der festen Phase ist vorzugsweise plan. Sie ist in einer Ausführungsform ein Bestandteil einer Vorrichtung, die zum Austausch von Lösungen geeignet ist, beispielsweise eine Flow-Cell.
In einer Ausführungsform ist die feste Phase oder ihre Bestandteile für die elektromagnetische Strahlung für Wellenlängen zwischen 400 und 1000 nm transparent. Wobei in einer Ausführungsform die Transparenz für alle Wellenlängen in diesem Bereich besteht, in einer anderen Ausführungsform ist sie für Wellen nur bestimmter Längen transparent, so dass die feste Phase eine Filterfunktion aufweist.
Die Herstellung der Oberfläche der festen Phase schließt in einer Ausführungsform folgende wesentliche Schritte ein:

1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase, wobei eine regenerierte Oberfläche der festen Phase entsteht, die eine SiO₂ Oberfläche ist.
2. Kopplung von Nukleinsäureketten an die regenerierte Oberfläche der festen Phase

In einer weiteren Ausführungsform schließt die Herstellung folgende wesentliche Schritte ein:

1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase, wobei eine regenerierte Oberfläche der festen Phase entsteht, die eine SiO₂ Oberfläche ist.
2. Kopplung einer Linker-Komponente an die regenerierte Oberfläche der festen Phase,
3. Kopplung von Nukleinsäureketten an die Linker-Komponente.

Die Entfernung der Außenschicht erfolgt durch chemische Reaktion in einer wässrigen oder wässrig-organischen Lösung. In einer Ausführungsform wird die regenerierte Oberfläche im weiteren Verlauf des Herstellungs- und des Analyseprozesses nicht ausgetrocknet. Diese Schritte können in einen Herstellungsprozess integriert werden, der auch weitere Schritte zur Bearbeitung der Oberfläche einschließt.
In einer Ausführungsform erfolgen die Herstellungsschritte nur an einem Teil der Oberfläche der festen Phase. Die restliche Oberfläche der festen Phase ist in dieser Ausführungsform vor Behandlung geschützt.
In einer Ausführungsform haben die an der festen Phase gebundenen Nukleinsäureketten eine Anker-Funktion, in einer anderen Ausführungsform der Anmeldung haben die gebundenen Nukleinsäuren eine Primer-Funktion.
Die erfindungsgemäß hergestellten Oberflächen der festen Phase können beispielsweise in einem Verfahren zur hoch parallelen Sequenzierung von einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen eingesetzt werden, wie beispielsweise (WO 02088382, WO 03020968, WO 02072892).
Dabei wird bei der Vorbereitung zur Sequenzierung aus dem genetischen Material zunächst eine Population an relativ kleinen, einzelsträngigen Nukleinsäurekettenfragmenten (NSKFs) gebildet, die eine Primer-Bindungsstelle tragen. Anschließend werden diese Fragmente an die auf der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten mit Primer-Funktion hybridisiert, wobei extensionsfähige Primer-Matrize-Komplexe entstehen.
Die NSKFs werden bei der Immobilisierung bzw. Bindung zufällig auf der Oberfläche verteilt, d.h. es muss also nicht auf eine exakte Positionierung der einzelnen Ketten geachtet werden. Die NSKF-Primer-Komplexe müssen dabei in einer solchen Dichte auf der Oberfläche fixiert werden, dass eine eindeutige Zuordnung der später detektierten Signale von den eingebauten markierten Nukleotiden zu einzelnen NSKFs gewährleistet ist.
Nach der Vorbereitung der NSKFs startet man mit allen auf der Oberfläche immobilisierten NSKF-Primer-Komplex-Molekülen die Sequenzierungsreaktion. Als Grundlage der Sequenzierung dient die Synthese des komplementären Stranges zu jedem einzelnen gebundenen NSKF. Dabei werden in den neu synthetisierten Strang markierte Nukleotiden eingebaut. Die Sequenzierungsreaktion verläuft in mehreren Zyklen. Ein Zyklus umfasst beispielsweise folgende Schritte:

a) Zugabe einer Lösung mit markierten Nukleotiden (NTs^*) und Polymerase zu den gebundenen NSKF-Primer-Komplexen,
b) Inkubation der gebundenen NSKF-Primer-Komplexe mit dieser Lösung unter Bedingungen, die zur enzymatischen Kopplung markierter Nukleotide geeignet sind,
c) Waschen,
d) Detektion der Signale von einzelnen eingebauten markierten Nukleotiden,
e) Entfernung der Markierung von den eingebauten Nukleotiden,
f) Waschen.

Gegebenenfalls erfolgt eine mehrfache Wiederholung des Zyklus (a–f).
Danach wird für jedes fixierte NSKF seine spezifische Sequenz aus der Reihenfolge der eingebauten NTs^* ermittelt.
Die Anzahl der durchzuführenden Zyklen hängt dabei von der jeweiligen Aufgabenstellung ab, ist theoretisch nicht beschränkt und liegt vorzugsweise zwischen 5 und 500.
Das Verfahren wird beispielsweise mit einer Apparatur durchgeführt, die in der Anmeldung WO 03031947 beschrieben ist. Die örtliche Auflösung dieser Apparatur (Gesamtauflösung, einschließend optische und elektronische örtliche Auflösung) liegt vorzugsweise zwischen 0,2 und 2 μm.
Die erfindungsgemäße Oberfläche der festen Phase weist eine sehr geringe unspezifische Bindung von markierten Komponenten. Das ermöglicht die Durchführung von vielen Inkubationsschritten mit markierten Komponenten, beispielsweise einen wiederholten längeren Kontakt zwischen den markierten Nukleotiden und der Oberfläche. Die Dichte der Signale von unspezifisch gebundenen markierten Komponenten bleibt während des Sequenzierungsverfahren gering und interferiert nur unwesentlich mit den spezifischen Signalen.
Insbesondere ist eine solche Oberfläche bei den Verfahren bevorzugt, die mehr als 3 Inkubationsschritte mit markierten Komponenten einschließen.
In der Anmeldung werden folgende Themen dargestellt:

– Verfahren zur Sequenzierung
– Oberfläche einer festen Phase mit einer geringen unspezifischen Bindung von markierten und unmarkierten Nukleotiden und/oder markierten und unmarkierten Nukleinsäuren,
– Oberfläche einer festen Phase mit einer geringen unspezifischen Bindung von markierten und unmarkierten Nukleotiden und/oder markierten und unmarkierten Nukleinsäuren, wobei an der Oberfläche der festen Phase Nukleinsäureketten spezifisch gebunden sind,
– Oberfläche einer festen Phase mit einer geringen unspezifischen Bindung von markierten und unmarkierten Nukleotiden und/oder markierten und unmarkierten Nukleinsäuren, wobei an der Oberfläche Nukleinsäureketten spezifisch gebunden sind, die an einer Hybridisierungsreaktion mit komplementären Nukleinsäuresträngen teilnehmen können.
– Oberfläche einer festen Phase mit einer geringen unspezifischen Bindung von markierten und unmarkierten Nukleotiden und/oder markierten und unmarkierten Nukleinsäuren, die in einem Verfahren zur hochparallelen Analyse von Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden kann,
– Methoden zur Herstellung solcher Oberflächen einer festen Phase
– Methoden zur spezifischen Bindung von Nukleinsäureketten an solche Oberflächen einer festen Phase
– Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäurenketten an solchen Oberflächen einer festen Phase
– Vorrichtung zum Austausch von Flüssigkeiten, die solche Oberflächen einschließt
– Vorteilhafte Ausführungen für Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren mit der erfindungsgemäßen Oberfläche
– Vorteilhafte Kombination von markierten Komponenten wie markierte Nukleotide und markierte Nukleinsäuren und der erfindungsgemäßen Reaktionsoberfläche
– Nuk-Makromoleküle, die im Sequenzierverfahren eingesetzt werden können.

1.6 Der Gegenstand dieser Erfindung betrifft folgende Aspekte:

1. Ein Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs) mit optischen Mitteln, das folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer festen Phase 2. Bindung von zu analysierenden Nukleinsäureketten an die feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexe, 3. Durchführung einer zyklischen Reaktion mit den auf der festen Phase fixierten Primer-Matrize-Komplexen, die folgende Schritte einschließt: 3.1 enzymatischer Einbau von markierten Nukleotiden an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen, 3.2 Waschen der festen Phase 3.3 Detektion der Markierung von eingebauten markierten Nukleotiden, wobei relative Koordinaten einzelner Signale identifiziert werden 3.4 Entfernung der Signale von eingebauten Nukleotiden, 3.5 Waschen der festen Phase 3.6 gegebenenfalls Wiederholung der Schritte 3.1 bis 3.5 4. Rekonstruktion der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäureketten aus den unter Schritt 3.3 erhaltenen Signalen
2. Feste Phase für Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 1, wobei die Oberfläche der festen Phase eine Eigenschaft der geringen unspezifischen Bindung von markierten Komponenten aufweist.
3. Feste Phase nach Aspekt 1 oder 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 200 Ereignisse/100 μm² während der Analyse beträgt. Als Ereignisse der unspezifischen Bindung werden hier detektierbare Signale von einzelnen markierten Komponenten verstanden. Dabei können markierte Komponenten ein oder mehrere signalgebende Moleküle aufweisen.
4. Feste Phase nach Aspekt 1 oder 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 100 Ereignisse/100 μm² während der Analyse beträgt.
5. Feste Phase nach Aspekt 1 oder 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 50 Ereignisse/100 μm² während der Analyse beträgt.
6. Feste Phase nach Aspekt 1 oder 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 20 Ereignisse/100 μm² während der Analyse beträgt.
7. Feste Phase nach Aspekt 1 oder 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 10 Ereignisse/100 μm² während der Analyse beträgt.
8. Feste Phase nach Aspekt 1 oder 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 5 Ereignisse/100 μm² während der Analyse beträgt.
9. Feste Phase nach Aspekt 1 oder 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 2 Ereignisse/100 μm² während der Analyse beträgt.
10. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 9, wobei die feste Phase eine Silica-Oberfläche einschließt.
11. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 9, wobei die feste Phase eine Glas- oder Quarz-Oberfläche einschließt.
12. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 9, wobei die feste Phase eine SiO₂-Oberfläche einschließt. Die feste Phase kann in einer Ausführungsform einen Anteil von SiO₂ aufweisen, der in folgenden Bereichen liegt: zwischen 1% und 10%, zwischen 10% und 50%, zwischen 50% und 80%, zwischen 80% und 100%.
13. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 9, wobei die feste Phase eine Si-OH-Oberfläche einschließt.
14. feste Phase nach Aspekten 1 bis 13, wobei die Oberfläche der festen Phase flach ist.
15. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 14, wobei an der Oberfläche dieser festen Phase Nukleinsäureketten fixiert sind.
16. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 14, wobei an diese feste Phase Nukleinsäureketten über eine Linker-Komponente fixiert sind.
17. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer regenerierten Oberfläche einer festen Phase durch die Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung von Nukleinsäureketten an die regenerierte Oberfläche der festen Phase
18. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer regenerierten Oberfläche einer festen Phase durch die Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung einer Linker-Komponente an die regenerierte Oberfläche der festen Phase 3. Kopplung von Nukleinsäureketten an die Linker-Komponente
19. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer regenerierten Oberfläche einer festen Phase durch die Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. chemische Synthese von Nukleinsäureketten an der regenerierten Oberfläche der festen Phase
20. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer regenerierten Oberfläche einer festen Phase durch die Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung einer Linker-Komponente an die regenerierte Oberfläche der festen Phase 3. chemische Synthese von Nukleinsäureketten an der festen Phase. Viele Verfahren zur Festphasensynthese von Nukleinsäureketten sind bekannt, z.B. mit konventioneller Oligonukleotidsythese (Capaldi et al., 2000; Damha et al., 1990; Devivar et al., 1999; Habus et al., 1998; Pon, 1993; Pon et al., 1988; Sinha, 1993; Song et al., 2003; Veiko et al., 1991; Vu et al., 1990) oder mit photolabilen Schutzgruppen (US Pat. Nr. 5753788, US Pat. Nr. 5831070, US Pat. Nr. 5919523, US Pat. Nr. 6022963, US Pat. Nr. 6147205, US Pat. Nr. 6153743, US Pat. Nr. 6262216, US Pat. Nr. 6310189, US Pat. Nr. 6480324, US Pat. Nr. 6486287)
21. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer regenerierten Oberfläche einer festen Phase durch die Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung von Nukleinsäureketten an die regenerierte Oberfläche der festen Phase 3. Kopplung weiterer Substanzen an die regenerierte Oberfläche der festen Phase
22. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer regenerierten Oberfläche einer festen Phase durch die Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung einer Linker-Komponente an die regenerierte Oberfläche der festen Phase 3. Kopplung von Nukleinsäureketten an die Linker-Komponente 4. Kopplung weiterer Substanzen an die regenerierte Oberfläche oder an die Linker-Komponente
23. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer regenerierten Oberfläche einer festen Phase durch die Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. chemische Synthese von Nukleinsäureketten an der regenerierten Oberfläche der festen Phase 3. Kopplung weiterer Substanzen an die regenerierte Oberfläche der festen Phase
24. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer regenerierten Oberfläche einer festen Phase durch die Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung einer Linker-Komponente an die regenerierte Oberfläche der festen Phase 3. chemische Synthese von Nukleinsäureketten an der regenerierten Oberfläche der festen Phase 4. Kopplung weiterer Substanzen an die regenerierte Oberfläche oder an die Linker-Komponente
25. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 24, wobei die Außenschicht nur an einem Teil der festen Phase abgetragen wird. In einer Ausführungsform kann die Entfernung auch nur an einem Teil der Oberfläche der festen Phase vorgenommen werden. Ebenso kann die Kopplung der Nukleinsäureketten an einem Anteil der bereitgestellten Oberfläche der festen Phase vorgenommen werden.
26. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 25, wobei die Entfernung der Außenschicht durch chemische Reaktion erfolgt
27. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekt 26, wobei die chemische Reaktion in Anwesenheit von HF erfolgt. Dem Fachmann sind viele chemische Kombinationen (Lösungen) bekannt, die HF enthalten und zur Abtragung der äußeren SiO₂-Schicht dienen. Beispielsweise sind gepufferte HF-Lösungen (z.B. HF und NH₄F) oder auch Mischungen aus HF, HNO₃ und CH₃COOH zur Entfernung der äußeren Schicht geeignet. Die Lösungen können dabei wässrig oder wässrig-organisch sein.
28. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekt 26, wobei die chemische Reaktion in Anwesenheit von Hydroxiden erfolgt. Dem Fachmann sind viele Hydroxide bekannt, die zur Entfernung der äußeren SiO₂-Schicht dienen können. Beispielsweise können Lösungen verwendet werden, die NaOH, KOH, NH₄OH, LiOH enthalten. Die Lösungen können dabei wässrig oder wässrig-organisch sein.
29. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 1 nm und 10 nm liegt.
30. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 10 nm und 100 nm liegt.
31. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 100 nm und 1 μm liegt.
32. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 1 μm und 10μm liegt.
33. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 10 μm und 100 μm liegt.
34. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 1 bis 28, wobei nach der Entfernung der Außenschicht der festen Phase keine Trocknungsschritte erfolgen und weitere Schritte in der flüssigen Phase stattfinden. Unter weiteren Schritten werden hier sowohl Herstellungsschritte, wie beispielsweise spezifische Kopplung von Linker-Komponenten oder Fixierung von Nukleinsäureketten an die regenerierte Oberfläche der festen Phase, als auch Schritte während der Analyse wie z.B. Inkubationsschritte, Waschschritte usw. Die flüssige Phase kann dabei beispielsweise wässrige Lösungen oder wässrig-organische Lösungen oder auch organische Lösungen einschließen. Die Lösungen können Salze enthalten und können Puffereigenschaften besitzen.
35. Methode zur Herstellung der festen Phase nach Aspekten 21 bis 24, wobei die Gruppe der "weiteren Substanzen" folgende Substanzen einschließen: Monomere (insbesondere Substanzen, die eine oder mehrere Phosphat-, Sulfat-, Carboxy-Gruppen tragen), Polymere (Polyethylenglycol, Polyacrylate, Polyacrylamide, Polyphosphate, Proteine)
36. Feste Phase für ein Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln, die nach Methoden in Aspekten 17 bis 35 hergestellt wird.
37. Feste Phase für ein Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln, die nach Methoden in Aspekten 17 bis 35 hergestellt wird, wobei an der Oberfläche Nukleinsäureketten fixiert sind.
38. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 37 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei fixierte Nukleinsäureketten eine einheitliche Population darstellen Die an der Oberfläche fixierte Nukleinsäureketten können eine Anker- oder eine Primerfunktion haben. In einer Ausführungsform können die zu analysierenden Nukleinsäureketten an die auf der regenerierten Oberfläche der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten hybridisiert werden. In einer weiteren Ausführungsform kann an den gebildeten Primer-Matrizenkomplexen eine enzymatische Reaktion durchgeführt werden.
39. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 37 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei fixierte Nukleinsäureketten mehrere unterschiedliche Populationen darstellen In einer Ausführungsform werden unterschiedlichen Populationen auf der festen Phase in einer vorgegebenen Anordnung fixiert, wobei ein Array entsteht. In einer anderen Ausführungsform werden unterschiedliche Populationen in einer zufälligen Anordnung an der Oberfläche fixiert (WO 02088382, WO 02072892). Die an der Oberfläche fixierte Nukleinsäureketten können eine Anker- oder eine Primerfunktion haben. In einer Ausführungsform können die zu analysierenden Nukleinsäureketten an die auf der regenerierten Oberfläche der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten hybridisiert werden. In einer weiteren Ausführungsform kann an den gebildeten Primer-Matrizenkomplexen eine enzymatische Reaktion durchgeführt werden.
40. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 39 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei Nukleinsäureketten eine Länge zwischen 5 und 50 Nukleotiden haben
41. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 39 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei Nukleinsäureketten eine Länge zwischen 20 und 200 Nukleotiden haben
42. Feste Phase nach Aspekten 1 bis 39 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei Nukleinsäureketten eine Länge zwischen 50 und 500 Nukleotiden haben
43. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 42, wobei die Fixierung von Nukleinsäureketten kovalent ist.
44. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 42, wobei die Fixierung affin ist.
45. Feste Phase nach Aspekten 16, 18, 20, 22, 24, wobei der Linker eine Länge von 1 bis 50 nm hat
46. Feste Phase nach Aspekten 16, 18, 20, 22, 24, 45, wobei der Linker ein nicht verzweigtes Polymer ist
47. Feste Phase nach Aspekten 16, 18, 20, 22, 24, 45 wobei der Linker ein verzweigtes Polymer ist
48. Feste Phase nach Aspekten 16, 18, 20, 22, 24, wobei Streptavidin oder Avidin als Linker auftritt.
49. Feste Phase nach Aspekten 16, 18, 20, 22, 24, wobei Nukleinsäureketten als Linker auftreten.
50. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 1/100 μm² und 10/100 μm² liegt.
51. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 10/100 μm² und 100/100 μm² liegt.
52. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 100/100 μm² und 1000/100 μm² liegt.
53. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 1000/100 μm² und 10.000/100 μm² liegt.
54. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 10.000/100 μm² und 1.000.000/100 μm² liegt. Die an der Oberfläche fixierte Nukleinsäureketten können eine Anker- oder eine Primerfunktion haben. In einer Ausführungsform können die zu analysierenden Nukleinsäureketten an die auf der regenerierten Oberfläche der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten komplementär hybridisiert werden. In einer weiteren Ausführungsform kann an den gebildeten Primer-Matrizenkomplexen eine enzymatische Reaktion durchgeführt werden. Die Dichte der extensionsfähigen Primer-Matrizenkomplexe liegt vorzugsweise in einem der folgenden Bereiche: 1/100 μm² bis 10/100 μm², 10/100 μm² bis 20/100 μm², 20/100 μm² bis 30/100 μm², 30/100 μm² bis 40/100 μm², 40/100 μm² bis 50/100 μm², 50/100 μm² bis 60/100 μm², 60/100 μm² bis 70/100 μm², 70/100 μm² bis 80/100 μm², 80/100 μm² bis 90/100 μm², 90/100 μm² bis 100/100 μm², 100/100 μm² bis 120/100 μm², 120/100 μm² bis 130/100 μm², 130/100 μm² bis 140/100 μm², 140/100 μm² bis 150/100 μm², 150/100 μm² bis 160/100 μm², 160/100 μm² bis 170/100 μm², 170/100 μm² bis 180/100 μm², 180/100 μm² bis 190/100 μm², 190/100 μm² bis 200/100 μm², 200/100 μm² bis 250/100 μm², 250/100 μm² bis 300/100 μm², 300/100 μm² bis 400/100 μm². In einer Ausführungsform ist die Dichte der an der regenerierten Oberfläche der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten über die gesamte Oberfläche der festen Phase gleich. In einer anderen Ausführungsform schließt die hergestellte feste Phase Bereiche ein, die unterschiedliche Dichte der fixierten Nukleinsäureketten aufweisen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn unbekannte Konzentrationen von zu analysierenden Nukleinsäureketten in einem Verfahren wie (WO 02088382, WO 02072892) eingesetzt werden.
55. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 54, wobei an der festen Phase ein erkennbares Muster angebracht ist. Dieses Muster kann beispielsweise eine Markierung sein, die mit optischen Mitteln erkannt werden kann.
56. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 55, wobei die feste Phase ein Teil einer Vorrichtung zum Austausch von Flüssigkeiten darstellt.
57. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 56, wobei die feste Phase für elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen im Bereich zwischen 200 nm bis 400 nm durchlässig ist.
58. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 56, wobei die feste Phase für elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen im Bereich zwischen 200 nm bis 2000 nm durchlässig ist.
59. Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Aspekten 1 bis 56, wobei die feste Phase für elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen im Bereich zwischen 400 nm bis 800 nm durchlässig ist. Feste Phase kann bestimmte Bereiche der elektromagnetischen Strahlung absorbieren und somit eine Filterfunktion besitzen.
60. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 1, wobei die feste Phase nach Aspekten 2 bis 59 verwendet wird.
61. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 60, wobei markierte Komponenten verwendet werden.
62. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 61, wobei die Markierung von den markierten Komponenten durch Abspaltung entfernt werden kann. Die Abspaltung kann dabei chemisch, photochemisch oder auch enzymatisch erfolgen. Die Abspaltung kann beispielsweise in einer wässrigen oder in einer wässrig-organischen Phase erfolgen.
63. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 61 und 62, wobei markierte Komponenten markierte Ribonukleosidtriphosphate oder Deoxyribonucleosidtriphosphate oder Dideoxyribonukleosidtriphosphate einschließen. Dabei können die sowohl in der Natur vorkommenden Nukleoside, wie Adenosin, Guanosin, Thymidin, Uridin, Cytosin als auch deren Modifikationen, Nukleotidanaloga, wie z.B. 7-Deazaadenosin oder 7-Deazaguanosin verwendet werden. Die Markierung kann am Nukleotid an der Base, am Zucker oder an dem Phosphat-Anteil gekoppelt sein.
64. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 61 bis 63, wobei markierte Komponenten reversibel markierte Ribonukleosidtriphosphate oder Deoxyribonucleosidtriphosphate oder Dideoxyribonukleosidtriphosphate einschließen.
65. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 61 und 62, wobei markierte Komponenten markierte Nukleinsäuren einschließen.
66. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 65, wobei markierte Komponenten reversibel markierte Nukleinsäuren einschließen.
67. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 66, wobei parallel 100 bis 10.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
68. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 66, wobei parallel 1000 bis 100.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
69. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 66, wobei parallel 10.000 bis 1.000.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
70. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 66, wobei parallel 100.000 bis 10.000.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
71. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 66, wobei parallel 1.000.000 bis 100.000.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
72. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 66, wobei parallel 100.000.000 bis 10.000.000.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
73. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 72, wobei Ereignisse an einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen optisch detektiert werden
74. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 0,3 μm ermöglichen
75. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 0,5 μm ermöglichen
76. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 0,8 μm ermöglichen
77. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 1 μm ermöglichen
78. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 1,2 μm ermöglichen
79. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 1,5 μm ermöglichen
80. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 2 μm ermöglichen
81. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 80, wobei die Analyse durch die Synthese eines komplementären Stranges verläuft (zyklische Sequenzierung).
82. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 81, wobei die Analyse durch die zyklische Sequenzierung verläuft und folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer festen Phase nach Aspekten 1 bis 59 2. Bindung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen an diese feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexen, 3. Durchführung einer zyklischen Reaktion mit den auf der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten, die folgende Schritte einschließt: 3.1 Inkubation einer Lösung mit einer oder mehreren Polymerase und einem oder mehreren markierten Nukleotiden (Polymerase-Nukleotid-Gemisch) mit der festen Phase unter Bedingungen, die eine Einbaureaktion von Nukleotiden an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen zulassen, 3.2 Entfernung des Polymerase-Nukleotid-Gemischs und Waschen der festen Phase 3.3 Detektion der Signale von eingebauten markierten Nukleotiden, wobei relative Koordinaten einzelne Signale identifiziert werden 3.4 Entfernung der Signale von eingebauten Nukleotiden, 3.5 gegebenenfalls Waschen der festen Phase 3.6 gegebenenfalls Wiederholung der Schritte 3.1 bis 3.5 4. Rekonstruktion der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäuremolekülen aus den unter Schritt 3.3 erhaltenen Signalen
83. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 81, wobei die Analyse durch zyklische Sequenzierung verläuft und folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer festen Phase nach Aspekten 2 bis 59 2. Bindung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen an diese feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexen, 3. Durchführung einer zyklischen Reaktion mit den auf der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten, die folgende Schritte einschließt: 3.1a Inkubation einer Lösung mit einer oder mehreren Polymerase mit der festen Phase unter Bedingungen, die ihre Bindung an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen zulassen, 3.1b Entfernung des Polymerase-Gemischs und Waschen der festen Phase 3.1c Inkubation einer Lösung mit einer oder mehreren Arten von Nukleotiden mit der festen Phase unter Bedingungen, die den Einbau von Nukleotiden an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen zulassen, 3.2 Entfernung der Lösung mit Nukleotiden und Waschen der festen Phase 3.3 Detektion der Signale von eingebauten markierten Nukleotiden, wobei relative Koordinaten einzelne Signale identifiziert werden 3.4 Entfernung der Signale von eingebauten Nukleotiden, 3.5 gegebenenfalls Waschen der festen Phase 3.6 gegebenenfalls Wiederholung der Schritte 3.1 bis 3.5 4. Rekonstruktion der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäuremolekülen aus den unter Schritt 3.3 erhaltenen Signalen
84. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 83, wobei die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle Nukleinsäureketten mit einer Länge zwischen 30 und 3000 Nukleotide darstellen.
85. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 84, wobei die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle Deoxyribonukleinsäureketten oder Ribonukleinsäureketten darstellen.
86. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 85, wobei die bereitgestellte feste Phase fixierte Nukleinsäuren trägt, die als Primer für die Sequenzierung dienen.
87. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 86, wobei die bereitgestellte feste Phase fixierte Nukleinsäuren trägt, die als Primer für die Sequenzierung dienen und die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle direkt an diese Primer hybridisiert werden, wobei extensionsfähige Primer-Matrize-Komplexe gebildet werden.
88. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 85, wobei zunächst die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle an die feste Phase fixiert werden und anschließend ein Primer an die zu analysierenden Nukleinsäureketten hybridisiert wird.
89. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 83, wobei die Fixierung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen kovalent an die feste Phase erfolgt.
90. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 83, wobei die Fixierung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen affin an die feste Phase erfolgt.
91. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 und 90, wobei die bereitgestellte feste Phase fixierte Nukleinsäureketten trägt, die als Anker für affine Fixierung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen dienen.
92. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 und 90, wobei die Fixierung von zu analysierenden Nukleinsäureketten durch die Hybridisierung bzw. affine Bindung an den Anker an der festen Phase erfolgt.
93. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 92, wobei die Dichte der fixierten extensionsfähigen Primer-Matrize-Komplexe auf der festen Phase zwischen 5 und 50 Komplexe pro 100 μm² liegt.
94. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 92, wobei die Dichte der fixierten extensionsfähigen Primer-Matrize-Komplexe auf der festen Phase zwischen 50 und 250 Komplexe pro 100 μm² liegt.
95. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 94, wobei die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle an die feste Phase in zufälliger Anordnung fixiert werden
96. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 60 bis 94, wobei die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle an die feste Phase in vorbestimmter Anordnung fixiert werden
97. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 bis 96, wobei im Schritt 3.1 verwendete Nukleotide markierte Ribonukleosidtriphosphate oder Deoxyribonucleosidtriphosphate oder Dideoxyribonukleosidtriphosphate einschließen.
98. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 bis 97, wobei im Schritt 3.1 verwendete Nukleotide eine reversibel terminierende Gruppe tragen, so dass nur ein markiertes Nukleotid in einem Inkubationsschritt 3.1 eingebaut werden kann.
99. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 98, wobei nach dem Detektionsschritt 3.3 ein weiterer Schritt zur Entfernung der reversibel terminierenden Gruppe im durchgeführt wird, so dass die Extensionsreaktion im weiteren Verlauf stattfinden kann.
100. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 bis 99, wobei verwendete Nukleotide eine einheitliche Markiertung tragen und im Inkubationsschritt 3.1 modifizierte Nukleotide gleicher Basenart zugegeben werden.
101. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 bis 99, wobei verwendete Nukleotide eine basenspezifische Markiertung tragen und im Inkubationsschritt 3.1 modifizierte Nukleotide unterschiedlicher Basenart zugegeben werden.
102. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 bis 101, wobei im Schritt 3.3 relative Intensität eines jeden Signals bestimmt wird.
103. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 bis 101, wobei die Zahl der Wiederholungen der Schritte 3.1 bis 3.5 zwischen 2 und 10 liegt.
104. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 bis 101, wobei die Zahl der Wiederholungen der Schritte 3.1 bis 3.5 zwischen 10 und 25 liegt.
105. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 bis 101, wobei die Zahl der Wiederholungen der Schritte 3.1 bis 3.5 zwischen 25 und 50 liegt.
105. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekten 82 bis 101, wobei die Zahl der Wiederholungen der Schritte 3.1 bis 3.5 zwischen 50 und 200 liegt.
106. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 60 bis 105, wobei als markierte Nukleotide konventionell modifizierte Nukleotide eingesetzt werden.
107. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 60 bis 105, wobei als markierte Nukleotide Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden.
108. Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Aspekt 60 bis 80, wobei die Analyse durch Hybridisierung komplementärer markierter Nukleinsäureketten verläuft.
109. Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten mit der festen Phase nach Aspekten 2 bis 59, wobei die zu analysierenden Nukleinsäureketten an der festen Phase fixiert sind und die Analyse durch die Hybridisierung von komplementären markierten Nukleinsäureketten erfolgt.
110. Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten mit der festen Phase nach Aspekten 2 bis 59, wobei an der festen Phase Nukleinsäurestränge in einer vordefinierten Anordnung fixiert sind und die zu analysierenden Nukleinsäureketten durch die Hybridisierung an die fixierten Nukleinsäurestränge analysiert werden.

Im Zusammenhang mit den Aspekten 1 bis 110 der Erfindung werden Nuk-Makromoleküle und deren Einsatz im Sequenzierverfahren nach Aspekten 1, 60 bis 105 als Zusatzaspekte 1 bis 64 der Erfindung dargestellt.

1. Zusatzaspekt der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen mit der Struktur: (Nuk-Linker)_n-Marker wobei:

Nuk

– ein Nukleotid oder ein Nukleosid ist (Nuk-Komponente) Linker – eine Linker-Komponente, die folgende Bestandteile einschließt: a) Kopplungseinheit L – ein Teil des Linkers, das die Verbindung zwischen Nuk und dem Linkerrest darstellt b) Polymer – ein Teil des Linkers, das ein wasserlösliches Polymer mit einer durchschnittlichen Länge zwischen 100 und 10.000 Atome ist c) Kopplungseinheit T – ein Teil des Linkers, das die Verbindung zwischen dem Linkerrest und dem Marker darstellt

Marker

– eine Marker-Komponente ist

n

– eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist

Ein weiterer Zusatzaspekt 2 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekt 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (17A):
Wobei:
Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen, wobei L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente darstellt (Kopplungseinheit L) und X die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an der Base ist
R₁ – ist H
R₂ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R₃ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, PO₃, SH, NH₂, O- R_3-1, P(O)_m- R_3-1, NH-R_3-1, S-R_3-1, Si-R_3-1 wobei R_3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist und m 1 oder 2 ist.
R₄ – ist H oder OH
R₅ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, oder Monophosphat-Gruppe, oder Diphosphat-Gruppe oder Triphosphat-Gruppe oder Polyphosphate
Ein weiterer Zusatzaspekt 3 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekt 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (17B):
Wobei:
Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R₁ – ist H
R₂ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, NH₂, SH oder geschützte OH-Gruppe
R₃ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R_3-2, P(O)_m- R_3-2, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R_3-2, S-R_3-2, Si-R_3-2 oder, wobei R_3-2 die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an das Nukleotid ist
Kopplungseinheit L – die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente
R₄ – ist H oder OH
R₅ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, oder Monophosphat-Gruppe, oder Diphosphat-Gruppe oder Triphosphat-Gruppe
Ein weiterer Zusatzaspekt 4 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekt 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (17B):
Wobei:
Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R₁ – ist H
R₂ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R₃ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, PO₃, SH, NH₂, O- R_3-1, P(O)m-R_3-1, NH-R_3-1, S-R_3-1, Si-R_3-1 wobei R_3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist und m 1 oder 2 ist.
R₄ – ist H oder OH
R₅ – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R_5-1-L, oder P-(O)₃- R_5-1-L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O)₃-P-(O)₃-R_5-1-L (modifizierte Diphosphat-Gruppe)
oder P-(O)₃-P-(O)₃-P-(O)₃- R_5-1-L (modifizierte Triphosphat-Gruppe), wobei R_5-1 die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an das Nukleotid ist und Kopplungseinheit L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente ist.
Ein weiterer Zusatzaspekt 5 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 4, wobei Kopplungseinheit L folgende strukturelle Elemente einschließt:
R₆-NH-R₇, R₆-O-R₇, R₆-S-R₇, R₆-SS-R₇, R₆-CO-NH-R₇, R₆-NH-CO-R₇, R₆-CO-O-R₇, R₆-O-CO-R₇, R₆-CO-S-R₇, R₆-S-CO-R₇, R₆-P(O)₂-R₇, R₆-Si-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-R₇, R₆-A-(CH₂)_n-R₇, R₆-(CH₂)_n-B-R₇, R₆-(CH=CH-)_n-R₇, R₆-(A-CH=CH-)_n-R₇, R₆-(CH=CH-B-)_n-R₇, R₆-(CH=CH-CH₂-B-)_n-R₇, R₆-A-CH=CH-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-CH=CH-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(C≡C-)_n-R₇, R₆-(A-C≡C-)_n-R₇, R₆-(A-C≡C-CH₂)_n-R₇, R₆-(C≡C-B-)_n-R₇, R₆-(C≡C-CH₂-B-)_n-R₇, R₆-A-C≡C-(CH₂-)_n-R₇, R₆-(-C≡C-CH₂)_n-B-R₇, R₆-(-C≡C-CH₂-CH₂)_n-B-R₇
wobei R₆ – die Nuk-Komponente ist, R₇ – der Linkerrest ist und A und B unabhängig folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)₂-, -Si-, -(CH₂)-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 ist
Ein weiterer Zusatzaspekt 6 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 5, wobei die Linker-Komponente ein wasserlösliches Polymer einschließt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 7 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekt 6, wobei die Linker-Komponente wasserlösliche Polymere unabhängig ausgewählt aus folgender Gruppe einschließt:
Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Dextran, Polyamide, Polypeptide, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure, Poly-Acrylamid, Poly(Vinylalkohol).
Ein weiterer Zusatzaspekt 8 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 7, wobei die Linker-Komponente eine durchschnittliche Länge zwischen 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10000, 10000 bis 100000 Atomen hat.
Ein weiterer Zusatzaspekt 9 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 8, wobei eine Marker-Komponente eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion hat
Ein weiterer Zusatzaspekt 10 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 9, wobei eine Marker-Komponente aus einer strukturellen Marker-Einheit besteht
Ein weiterer Zusatzaspekt 11 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 9, wobei eine Marker-Komponente aus mehreren strukturellen Marker-Einheiten gebunden an eine Kern-Komponente besteht
Ein weiterer Zusatzaspekt 12 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 10 oder 11, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden strukturellen Elemente einschließt:
Biotin, Hapten, radioaktives Isotop, seltenes Erdenelement, Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff.
Ein weiterer Zusatzaspekt 13 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 10 oder 11, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt:
Nanokristalle oder deren Modifikationen, Proteine oder deren Modifikationen, Nukleinsäureketten oder deren Modifikationen, Teilchen oder deren Modifikationen.
Ein weiterer Zusatzaspekt 14 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekt 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eines der folgenden Proteine einschließt:
Enzyme oder deren Konjugate oder Modifikationen,
Antikörper oder deren Konjugate oder Modifikationen,
Streptavidin oder seine Konjugate oder Modifikationen,
Avidin oder seine Konjugate oder Modifikationen
Ein weiterer Zusatzaspekt 15 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekt 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eine der folgenden Arten Nukleinsäureketten einschließt: DNA, RNA, PNA, wobei die Länge von Nukleinsäureketten zwischen 10 und 10.000 Nukleotiden oder deren Äquivalente liegt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 16 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 11 bis 15, wobei die Kern-Komponente der Marker-Komponente unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt: wasserlöslichen Polymer unabhängig ausgewählt aus der Gruppe von: Polyamide (z.B. Polypeptide), Poly-Acrylsäure und deren Derivate, Poly-Acrylamide und deren Derivate, Poly-Vinylalkohole und deren Derivate, Nukleinsäureketten und deren Derivate, Streptavidin oder Avidin und deren Derivate, Dendrimere, wobei einzelne Polymere linear oder verzweigt oder unter einander vernetzt sein können
Ein weiterer Zusatzaspekt 17 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 9, 11 bis 16, wobei die Verbindung zwischen mehreren strukturellen Marker-Einheiten und der Kern-Komponte kovalent oder affine erfolgt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 18 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 10, wobei die Verbindung zwischen einer strukturellen Marker-Einheit und dem Linker kovalent oder affine erfolgt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 19 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 9, 11 bis 17, wobei die Verbindung zwischen der Kern-Komponente und dem Linker kovalent oder affine erfolgt
Ein weiterer Zusatzaspekt 20 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 19, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000 Atome beträgt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 21 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 20, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000 Atome beträgt und die Linker-Komponente eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.
Ein weiterer Zusatzaspekt 22 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 21, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000 Atome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk-Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, daß nur eine Nuk-Komponente in einen wachsenden Strangeingebaut werden kann.
Ein weiterer Zusatzaspekt 23 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 19, wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt sind, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000 Atome beträgt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 24 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 19, 23, wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1001, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000 Atome beträgt und der jeweilige Linker eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.
Ein weiterer Zusatzaspekt 25 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Zusatzaspekten 1 bis 19, 23, 24, wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen Linker in einer Marker- Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000 Atome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk-Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, daß nur eine Nuk-Komponente in eine wachsende Nukleinsäurekette eingebaut werden kann.
Ein weiterer Zusatzaspekt 26 der Erfindung betrifft Oligonucleotide oder Polynucleotide die mindestens ein Nuk-Makromolekül nach Zusatzaspekten 1 bis 25 pro eine Nukleinsäurekette einschließen.
Ein weiterer Zusatzaspekt 27 der Erfindung betrifft Oligonucleotide oder Polynucleotide nach Zusatzaspekt 26, wobei Oligo- oder Polynucleotide RNA, DNA oder PNA sind, deren Länge zwischen 5 und 50.000 Nukleotide beträgt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 28 der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäureketten, wobei für die Kopplung Nuk-Makromoleküle nach Zusatzaspekten 1 bis 25 verwendet werden Ein weiterer Zusatzaspekt 29 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 28, wobei die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt:

– mindestens eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Zusatzaspekten 1 bis 25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt
– mindestens eine Population der Nukleinsäureketten,
– mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoleküle an die Nukleinsäureketten,

Ein weiterer Zusatzaspekt 30 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 28, wobei die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt:

– mindestans eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Zusatzaspekten 1–25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt
– mindestens eine Population der Nukleinsäureketten,
– mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoelküle an die Nukleeinsäureketten
– mindestens eine weitere Art von Nukleosidtriphosphaten

Ein weiterer Zusatzaspekt 31 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 29, 30, wobei die Enzymart unabhängig eine der folgenden Gruppen einschließt: DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Terminale Transferase,
Ein weiterer Zusatzaspekt 32 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 30, wobei die "weitere Art" der Nukleosidtriphosphaten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: Ribo-Nukleosidtriphosphaten (ATP, GTP, UTP, CTP), von 2'-Deoxyribonukleosid-Triphosphaten (dATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP), von 2',3'-Dideoxynukleosidtriphosphaten (ddATP, ddGTP, ddUTP, ddCTP, ddTTP).
Ein weiterer Zusatzaspekt 33 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 32, wobei die "weitere Art" der Nukleosidtriphosphaten konventionell modifizierte Nukleotide mit einer Markierung sind, wobei diese Markierung unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Biotin, ein Hapten, ein radioakives Element.
Ein weiterer Zusatzaspekt 34 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 28 bis 33, wobei mindestens zwei unterschiedliche Populationen an Nukleinsäureketten präsent sind
Ein weiterer Zusatzaspekt 35 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 34, wobei mindestens eine der Populationen der Nukleinsäureketten eine Primer-Funktion hat und mindestens eine Pupulation der Nukleinsäureketten eine Matrizen-Funktion.
Ein weiterer Zusatzaspekt 36 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 28, wobei die Modifizierung durch eine chemische Kopplung erfolgt, wobei die Kopplung der Nuk-Makromoleküle an Nukleinsäureketten durch Phosphoroamidit-Kopplung erfolgt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 37 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 28 bis 36, wobei im Markierungsverfahren Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden, die die Kopplung nur einer einzigen Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäure-Strang zulassen und der mehrfache Einbau durch Modifikationen an der Nuk-Komponente, und/oder der Linker-Komponente und/oder der Marker-Komponente verhindert wird.
Ein weiterer Zusatzaspekt 38 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 37, wobei die weitere Kopplung reversibel verhindert wird.
Ein weiterer Zusatzaspekt 39 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 37, wobei die weitere Kopplung irreversibel verhindert wird.
Ein weiterer Zusatzaspekt 40 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 28 bis 36, wobei im Markierungsverfahren Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden, die eine Kopplung mehrer Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäurestrang zulassen
Ein weiterer Zusatzaspekt 41 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 28–40, wobei die an der Reaktion teilnehmenden Nukleinsäureketten an eine feste Phase gekoppelt sind und adressierbare Positionen haben.
Ein weiterer Zusatzaspekt 42 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 41, wobei die Nukleinsäureketten eine einheitliche Population darstellen
Ein weiterer Zusatzaspekt 43 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 41, wobei die Nukleinsäureketten zwei oder mehrere unterschiedliche Populationen darstellen und jede der Populationen eine adressierbare Position auf der festen Phase hat
Ein weiterer Zusatzaspekt 44 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 41, 42, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukleinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.
Ein weiterer Zusatzaspekt 45 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 41, 42, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der in den wachsenden Nukleinsäurestrang eingebauten Nuk-Komponente abgetrennt wird.
Ein weiterer Zusatzaspekt 46 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 41, 43, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei diese Populationen jeweils unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukleinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.
Ein weiterer Zusatzaspekt 47 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 41, 43, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei diese Populationen unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der Nuk-Komponente abgetrennt wird.
Ein weiterer Zusatzaspekt 48 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen auf der festen Phase als Spots auf einer planen Oberfläche verteilt sind, wobei pro ein Spot Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.
Ein weiterer Zusatzaspekt 49 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen an den Kügelchen bzw. Partikel befestigt sind, wobei pro ein Kügelchen Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.
Ein weiterer Zusatzaspekt 50 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen in einem Multigefäßsystem, wie Mikrotiterplatte oder Nanotiterplatte oder Pikotiterplatte, verteilt sind, wobei in einem Gefäß des Multigefäßsystems die Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.
Ein weiterer Zusatzaspekt 51 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 28 bis 35 und 37 bis 50, das folgende Schritte einschließt:

a) Bereitstellung mindestens einer Population an einzelsträngigen Nukleinsäureketten
b) Hybridisierung von sequenzspezifischen Primern an diese Nukleinsäureketten, wobei extensionsfähige NSK-Primer-Komplexe entstehen
c) Inkubation von mindestens einer Art der Nuk-Makromoleküle nach Zusatzaspekten 1 bis 25 zusammen mit einer Art der Polymerase nach Zusatzaspekt 31 mit den in Schritten a und b bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
d) Entfernung der nicht eingebauten Nuk-Makromoleküle von den NSK-Primer-Komplexen
e) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen
f) Entfernung der Linker-Komponente und der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen
g) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

Ein weiterer Zusatzaspekt 52 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 28–40, wobei die Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung gekoppelt sind.
Ein weiterer Zusatzaspekt 53 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 28 bis 41, 52 zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs), bei dem man
Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man
die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier Nuk-Makromoleküle enthält, die eine mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Nakromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-Komponente mit der Marker-Komponente abspaltbar sind, man
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein Nuk-Makromolekül verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente von den am komplementären Strang angefügten Nuk-Komponenten abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,

Ein weiterer Zusatzaspekt 54 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus nur jeweils eine Art der Nuk-Makromoleküle einsetzt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 55 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 56 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 57 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass die NSKs Varianten einer bekannten Referenzsequenz sind und man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in den Zyklen abwechselnd jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle und zwei unmarkierte NTs einsetzt und man die Gesamtsequenzen durch Vergleich mit der Referenzsequenz ermittelt.
Ein weiterer Zusatzaspekt 58 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach den Zusatzaspekten 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man in die NSKFs jeweils eine Primerbindungsstelle (PBS) einführt, wobei man bei doppelsträngigen NSKs an beiden komplementären Einzelsträngen jeweils eine PBS einführt und wobei die Primerbindungsstellen für alle NSKFs jeweils gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.
Ein weiterer Zusatzaspekt 59 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach den Zusatzaspekten 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs mit Primern in einer Lösung unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen, und man die gebildeten NSKF-Primer-Komplexe anschließend auf der Reaktionsoberfläche bindet.
Ein weiterer Zusatzaspekt 60 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach den Zusatzaspekten 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs zunächst auf der Reaktionsoberfläche immobilisiert und erst anschließend mit Primern unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei NSKF-Primer-Komplexe gebildet werden, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.
Ein weiterer Zusatzaspekt 61 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 53 bis 60, bei dem an 10 bis 100.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführt
Ein weiterer Zusatzaspekt 62 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 53 bis 60, bei dem an 100.000 bis 100.000.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführt.

Ein weiterer Zusatzaspekt 63 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 28 bis 62, wobei die Sequenzen der Nukleinsäureketten ermittelt werden

Ein weiterer Zusatzaspekt 64 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Zusatzaspekten 28 bis 63, wobei die Marker-Komponente fluoreszent markiert ist

2. Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

In der modernen Analytik werden zunehmend Verfahren eingesetzt, die hochempfindlich sind. Stellvertretend für solche Verfahren werden in dieser Anmeldung Verfahren betrachtet, die auf der Analyse einzelner Moleküle basieren. Sie steilen ultimative Anforderungen an die eingesetzten Materialien, was beispielsweise die Stärke des Hintergrundsignals angeht. Verfahren wie (WO 02088382, WO 02072892, WO 0070073) basieren auf dem optischen Nachweis der Ereignisse (beispielsweise Einbau von markierten Nukleotiden in die Nukleinsäureketten), die auf Einzelmolekülniveau stattfinden (es werden z.B. Fluoreszenzsignale von einzelnen markierten eingebauten Nukleotiden detektiert). Beispielsweise schließt ein solches Verfahren folgende Schritte ein:

Bei solchen Verfahren wird üblicherweise eine hohe Konzentration an markierten Reagenzien eingesetzt, damit enzymatische Reaktionen in Schritt 3.1 ablaufen können. Der Kontakt zwischen markierten Komponenten (sowohl konventionell modifizierte Nukleotide als auch Nuk-Makomleküle) und der Oberfläche der festen Phase führt zu ihrer unspezifischen Bindung an die Oberfläche. Diese unspezifische Bindung von markierten Bestandteilen an die Oberfläche stellt eine wichtige Quelle für das Hintergrundsignal dar.

Da die Analyse auf der Detektion der Fluoreszenz von einzelnen Molekülen basiert, unterscheiden sich die spektralen und geometrischen Eigenschaften der Signale von eingebauten Nukleotiden und Signale von unspezifisch an die Oberfläche gebundenen, markierten Nukleotiden kaum. Bei einer großen Dichte von unspezifisch gebundenen Signalen überlappen sich die spezifischen und die unspezifischen Signale, was zu einer fehlerhaften Analyse führt.

Für die Sequenzierungsverfahren werden optische Mittel verwendet, die eine Auflösung von 0,2 μm bis 2 μm haben (WO 03031947). Solche optische Mittel werden allgemein als "Weitfeldoptik" bezeichnet. Das Vermögen der Apparatur, die Signale von einzelnen Moleküle als individuelle Signale zu unterscheiden, hängt von der Dichte der Signale auf der Oberfläche und von der Auflösung der Apparatur ab: Mit sinkender Auflösung der Detektionsapparatur sinkt das Vermögen, dicht aneinander liegende Signale zu unterscheiden; mit steigender Dichte bei bleibender Auflösung steigt die Wahrscheinlichkeit, dass die Signale von der Detektionsapparatur als überlappend detektiert werden. Bei einer großen Dichte der unspezifisch gebundenen markierten Komponenten ist auch die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Überlappung der spezifischen und unspezifischen Signale groß. Somit besteht ein großer Bedarf, Oberflächen mit einer möglichst geringen unspezifischen Bindung zu entwickeln.

Beispielsweise bei einer Auflösung von 0,3 μm und einer Dichte von 40 bis 60 spezifischen Signale pro 100 μm² ist es wünschenswert, dass die Dichte der unspezifisch gebundenen Signale über die Dauer der Analyse (beispielsweise 100 Zyklen) weniger als 20 pro 100 μm² beträgt. Dies ermöglicht eine gute Unterscheidung von spezifischen und unspezifischen Signalen.

Eine geringe unspezifische Bindung von markierten Komponenten ist insbesondere dann wichtig, wenn mehrere Inkubationsschritt mit markierten Nukleotiden erwünscht sind, beispielsweise 5 bis 100 Schritte oder sogar bis 500 Schritte.

Problematik der Entwicklung einer Oberfläche mit geringer unspezifischer Bindung:

Da die Bausteine der Nukleinsäuren, die Nukleotide, sowohl hydrophile als auch hydrophobe Anteile beinhalten, ist es nicht verwunderlich, dass sie an Oberflächen unterschiedlicher Materialien in einem bestimmten Maß unspezifisch binden. Die mit Farbstoffen modifizierte Nukleotide haben noch mehr potentiellen Stellen, die zu Bindung an die Oberfläche führen können. Diese Tatsachen machen in der Regel die Entwicklung einer Oberfläche der festen Phase mit eine niedrigen unspezifischen Bindung von markierten Komponenten besonders schwierig.

Es wurden bereits mehrere Varianten der Oberflächenvorbereitung bzw. Verfahrensgestaltung vorgeschlagen, die zu einem reduzierten Hintergrundsignal durch die unspezifische Bindung markierter Komponenten führen.

Es ist dem Fachmann bekannt, dass Nukleinsäuren durch die Bindung an Silica isoliert werden können (Boom et al., 1990; Boom et al., 1999; Chiu et al., 2003; Dederich et al., 2002; Diehl et al., 2001; Dolan et al., 2001; Hackler et al., 2003; Maitra and Thakur, 1994; Marko et al., 1982; Merkelbach et al., 1997; Miller et al., 1999; Mygind et al., 2003; Smith et al., 1995; Vogelstein and Gillespie, 1979; Zeillinger et al., 1993). Dies beruht auf der Tatsache, dass Nukleinsäuren in der Lage sind, an Silica unspezifisch zu binden, wobei sowohl lange als auch kurze Nukleinsäuren an Silica binden können. Dies ist einer der Gründe, warum auf Glas basierende DNA-Chip ein hohes Maß an unspezifischer Bindung von Nukleinsäuren aufweisen ("DNA Microarrays", Bowtell, 2003, ISBN 0-87969-624-9, "Microarray-Biochip Technology" M Schena, 2000, ISBN 1-881299-37-6).

Die erfindungsgemäße Oberfläche ist die Oberfläche einer festen Phase, die SiO₂ als Hauptkomponente beinhaltet. Überraschenderweise gelang es, die Glas-Oberfläche dermaßen vorzubereiten und zu modifizieren, dass die unspezifische Bindung von markierten Nukleotiden und markierten Nukleinsäuren drastisch reduziert wurde. Auch eine nachfolgende chemische Modifizierung der Oberflächen zur Kopplung der Nukleinsäuren führt nicht zu einem signifikanten Anstieg der unspezifischen Bindung von markierten und nicht markierten Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemäße Oberfläche der festen Phase zeichnet sich durch eine viel geringere unspezifische Bindung von markierten Nukleotiden und markierten Nukleinsäureketten im Vergleich zum Stand der Technik aus. Diese Eigenschaft führt zu einer besseren Diskriminierung des spezifischen Signals gegenüber dem unspezifischen Signal und bringt viele Vorteile bei ihrer Anwendung in hoch sensitiven Verfahren.

Desweiteren weiteren zeichnet sich die erfindungsgemäße Oberfläche durch eine niedrige unspezifische Bindung bei wiederholten Inkubationsschritten von markierten Komponenten mit der Oberfläche aus. Die erfindungsgemäße Oberfläche kann somit in Verfahren mit sowohl geringer als auch großer Zahl an Inkubationsschritten eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche in Verfahren eingesetzt, bei denen die Zahl der Inkubationsschritte mit markierten Komponenten in folgenden Bereichen liegt: 1 bis 10 Inkubationsschritte, 5 bis 10 Inkubationsschritte, 10 bis 20 Inkubationsschritte, 20 bis 50 Inkubationsschritte, 50 bis 100 Inkubationsschritte, 100 bis 200 Inkubationsschritte, 200 bis 500 Inkubationsschritte, 500 bis 1000 Inkubationsschritte.

Markierte Komponenten können unterschiedliche Marker tragen. In einer Ausführungsform sind markierte Komponenten mit konventionellen Makrern markiert, wie beispielsweise konventionelle markierte Nukleotide. Solche Nukleotide können beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sein, wie beispielsweise Rhodamine und deren Derivate (Rhodamin 110, Tetramethylrhodamin, Rhodamin 6G), Cyanin-Farbstoffe (z.B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland), Alexa-Farbstoffe (z.B. Alexa 546, Alexa 555, Alexa 568, Alexa 590 (Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands im weiteren als Molecular Probes), Atto-Farbstoffe (Atto-Tec GmbH, Siegen, Deutschland).

In einer anderen Ausführungsform stellen markierte Komponenten Nuk-Makromoleküle dar.

Markierte Komponenten können in verschiedenen Puffern aufgelöst werden, beispielsweise in Acetat-, Glycin-, Phosphat-, Carbonat-, Borat-, Tris-Puffer. Der pH-Wert liegt vorzugsweise im Bereich zwischen 6 und 10.

Beispiele für markierte Komponenten stellen konventionell modifizierte Nukleotide (Ribonukleosidtriphosphate, 2'-Deoxyribonukleosidtriphosphate, 2',3'-Dideoxyribonukleosidtriphosphate) wie dUTP-Cy3, dCTP-Cy3, dUTP-Fluorescein, dUTP-Alexa 555, dUTP-Rhodamin dar. Viele weitere Modifikationen sind kommerziell erhältlich (Molecular Probes, Inc, Amersham Bioscience, Sigma, NEN-Perkin Elmer Inc.). Markierung wird dabei oft an den Linker gekoppelt Hobbs et al. US Pat. Nr. 5.047.519 oder an andere Linker z.B. Klevan US Pat. Nr. 4,828,979, Seela US pat. Nr. 6211158, US pat. Nr. 4804748, EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. Nr. 6579704, Odedra WO 0192284, Odedra WO 03048178, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Canard US. Pat. Nr. 5798210, Kwiatkowski US Pat. Nr. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691 , Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002.

In einer weiteren Ausführungsform kann die Markierung vom konventionell modifizierten Nukleotid unter milden Bedingungen abgespalten werden. Viele Beispiele sind für solche Nukleotide bekannt Tcherkassov WO 02088382, Short US Pat. Nr. 6579704, Odedra WO 0192284, Odedra WO 03048178, Canard US Pat. Nr. 5798210, Kwiatkowski US Pat. Nr. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691 , Ju et al. WO 02/29003, Milton et al. WO 2004/018493, Milton et al. WO 2004/018497,
Nuk-Makromoleküle sind im Beispiel 8 dargestellt.

Markierte Nukleinsäuren wie Oligonukleotide können kommerziell erworben werden (Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Deutschland) im weiteren als Sigma bezeichnet, MWG-Biotech, Ebersberg bei München, Deutschland, (im weiteren als MWG-Biotech bezeichnet). Die Markierung von längeren Nukleinsäuren wie cDNA oder Plasmid-DNA kann nach bekannten Methoden erfolgen ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory).

Im weiteren zeichnet sich die erfindungsgemäße Oberfläche der festen Phase dadurch aus, dass Nukleinsäureketten an diese Oberfläche kovalent gebunden werden können und die Oberfläche trotzdem eine niedrige unspezifische Bindung von markierten Komponenten aufweist.

Die Dichte der an die Oberfläche der festen Phase gebundenen Nukleinsäureketten kann variieren. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten in einem der folgenden Bereiche (Angabe: Zahl der Nukleinsäuresträngen pro 100 μm²): 0,1–1/100 μm², 1–10/100 μm², 10–20/100 μm², 20–30/100 μm², 30–40/100 μm², 40–50/100 μm², 50–60/100 μm², 60–70/100 μm², 70–80/100 μm², 80–90/100 μm², 90–100/100 μm², 110–120/100 μm², 120–130/100 μm², 130–140/100 μm², 140–150/100 μm², 150–160/100 μm², 160–170/100 μm², 170–180 i 100 μm², 180–190/100 μm², 190–200/100 μm², 200–220/100 μm², 220–240/100 μm², 240–260/100 μm², 260–280/100 μm², 280–300/100 μm², 300–350/100 μm², 350–400/100 μm², 400–450/100 μm², 450–500/100 μm², 500–550/100 μm², 550–600/100 μm², 600–700/100 μm², 700–800/100 μm², 1–50/100 μm², 1–100/100 μm², 10–100/100 μm², 50–200/100 μm², 50–500/100 μm².

In einer weiteren Ausführungsform liegt die Dichte der extentionsfähigen Primer-Matrizenkomplexe in einem oder mehreren der folgenden Bereichen (Angabe: Zahl der extensionsfähigen Primer-Matrizenkomplexe pro 100 μm²): 0,1–1/100 μm², 1–10/100 μm², 10–20/100 μm², 20–30/100 μm², 30–40/100 μm², 40–50/100 μm², 50–60/100 μm², 60–70/100 μm², 70–80/100 μm², 80–90/100 μm², 90–100/100 μm², 110–120/100 μm², 120–130/100 μm², 130–140/100 μm², 140–150/100 μm², 150–160/100 μm², 160–170/100 μm², 170–180/100 μm², 180–190/100 μm², 190–200/100 μm², 200–220/100 μm², 220–240/100 μm², 240–260/100 μm², 260–280/100 μm², 280–300/100 μm², 300–350/100 μm², 350–400/100 μm², 400–450/100 μm², 450–500/100 μm², 500–550/100 μm², 550–600/100 μm², 600–700/100 μm², 700–800/100 μm², 1–50/100 μm², 1–100/100 μm², 10–100/100 μm², 50–200/100 μm², 50–500/100 μm².

Bei einer zufälligen Verteilung von Primer-Matrizenkomplexen auf der Oberfläche kann ein gewisser Anteil der Population als einzelne Sequenzierstellen von den benachbarten Sequenzierstellen unterschieden werden. Die Größe des Anteils der Population, in dem Signale von eingebauten Nukleotiden an Primer-Matrizenkomplexen individuell erkannt werden können, d.h. ohne Überlappung mit den Signalen von den benachbarten Stellen, hängt im wesentlichen von der Dichte der fixierten und extensionsfähigen Primer-Matrizenkomplexe und von der Auflösung der Detektionsapparatur ab. Beispiel für die Berechnung von Anteilen von Primer-Matrizenkomplexen, die ohne Überlappung mit den benachbarten Stellen detektiert werden, sind in Tabelle 1 bis 8 angegeben. In dieser Ausführungsform werden nur extensionsfähige Primer-Matrizekomplexe betrachtet.

Man sieht deutlich, dass der relativer Anteil der individuell erkannten Primer-Matrizekomplexe bei einer geringen Dichte der Primer-Matrizenkomplexe auf der Oberfläche groß ist. Mit steigender Dichte oder mit sinkender Auflösung sinkt der relative Anteil der einzeln erkannten Ereignissen an Primer-Matrizenkomplexen, da immer mehr Stellen mit den benachbarten Stellen überlappen und von der Apparatur nicht als Ereignisse an einzelnen Primer-Matrizekomplexen unterscheiden lassen.

Für die Sequenzierung der Nukleinsäurestränge mit einem Verfahren wie (WO 02088382, WO 03020968) ist es nicht notwendig, dass die Signale von allen an der Reaktion teilnehmenden Primer-Matrizekomplexen als Einzelmolekülsignale unterschieden werden. Es genügt, wenn Ereignisse von nur einem Teil der Population, die an der Sequenzierungsreaktion teilnimmt, als Ereignisse an einzelnen Primer-Matrizekomplexen identifiziert werden.

Als Ereignisse können in dieser Ausführungsform beispielsweise Einbau von markierten Nukleotiden oder Abspaltung der Markierung definiert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung werden Kombinationen zwischen der erfindungsgemäßen Oberfläche und der Detektionsapparatur verwendet, bei denen der Anteil der Population von Primer-Matrizekomplexen, an dem die Ereignisse individuell (d.h. abgrenzbar von den Ereignissen an benachbarten Primer-Matrizekomplexen) detektiert werden, in folgenden Bereichen liegt: 5% bis 10%, 10% bis 15%, 15% bis 20%, 20% bis 30%, 30% bis 40%, 40% bis 50%, 50% bis 60%, 60% bis 70%, 70% bis 80%, 80% bis 90%, 90 bis 95%.

Beispiele für Zusammenhänge zwischen der Auflösung des optischen Systems, der Dichte der extensionsfähigen Primer-Nukleinsäurekomplexe und dem prozentuellen Anteil der Gesamtpopulation an Signalen von eingebauten Nukleotiden, die individuell erkannt werden können, sind in der Tabelle 1 bis 8 angegeben. In diesen Tabellen werden Ergebnisse einer Computersimmulation für den Einfluss der Auflösung des Detektionssystems und der Dichte der extensionsfähigen Primer-Nukleinsäure (als "Stellen" genannt, eine Abkürzung für Sequenzierungsstellen) auf den Grad der Überlappung der benachbarten Stellen präsentiert. Der Grad der Überlappung wird als prozentualler Anteil an Stellen, die als individuell erkannt werden, wiedergegeben.

Tabelle 1, Auflösung 0,2 μm

Bei einer Auflösung von 0,2 μm liegt die bevorzugte tatsächliche Dichte zwischen 40 und 1300 Stellen pro 100μm², in einer weiteren Ausführungsform liegt die bevorzugte Dichte zwischen 100 und 600 Stellen pro 100μm².

Tabelle 2, Auflösung 0,3 μm

Bei einer Auflösung von 0,3 μm liegt die bevorzugte tatsächliche Dichte zwischen 30 und 500 Stellen pro 100μm², in einer weiteren Ausführungsform liegt die bevorzugte Dichte zwischen 70 und 300 Stellen pro 100μm².

In 2 sind Beispiele für unterschiedliche Signaldichten angegeben, die mit eine Auflösung von 0,3 μm aufgenommen wurden.

Tabelle 3, Auflösung 0,4 μm

Bei einer Auflösung von 0,4 μm liegt die bevorzugte tatsächliche Dichte zwischen 10 und 250 Stellen pro 100μm², in einer weiteren Ausführungsform liegt die bevorzugte Dichte zwischen 30 und 200 Stellen pro 100μm².

Tabelle 4, Auflösung 0,5 μm

Bei einer Auflösung von 0,5 μm liegt die bevorzugte tatsächliche Dichte zwischen 7 und 200 Stellen pro 100μm², in einer weiteren Ausführungsform liegt die bevorzugte Dichte zwischen 30 und 150 Stellen pro 100μm².

Tabelle 5, Auflösung 0,6 μm

Bei einer Auflösung von 0,6 μm liegt die bevorzugte tatsächliche Dichte zwischen 5 und 100 Stellen pro 100μm², in einer weiteren Ausführungsform liegt die bevorzugte Dichte zwischen 20 und 80 Stellen pro 100μm².

Tabelle 6, Auflösung 0,8 μm

Bei einer Auflösung von 0,8 μm liegt die bevorzugte tatsächliche Dichte zwischen 5 und 50 Stellen pro 100μm², in einer weiteren Ausführungsform liegt die bevorzugte Dichte zwischen 10 und 40 Stellen pro 100μm².

Tabelle 7, Auflösung 1 μm

Bei einer Auflösung von 1 μm liegt die bevorzugte tatsächliche Dichte zwischen 5 und 50 Stellen pro 100μm², in einer weiteren Ausführungsform liegt die bevorzugte Dichte zwischen 10 und 30 Stellen pro 100μm².

Tabelle 8, Auflösung 2 μm

Bei einer Auflösung von 2 μm liegt die bevorzugte tatsächliche Dichte zwischen 2 und 10 Stellen pro 100μm².

Wie man aus den Tabellen 1 bis 8 entnehmen kann, spielen die Auflösung und die Dichte der Stellen (wobei Stellen im weitesten Sinne unabhängige, zufällig auf der Oberfläche verteilte Ereignisse bedeuten) eine große Rolle bei der Frage, wie groß der Anteil von einzelnen, d.h. unabhängig von den benachbarten Stellen detektierbaren Ereignissen in der Gesamtpopulation ist.

Im Zusammenhang mit diesen Beispielen wird die Bedeutung der erfindungsgemäßen Oberfläche mit einer sehr geringen unspezifischen Bindung von markierten Komponenten noch deutlicher. Bei niedrigen Zahlen der unspezifisch gebundenen Komponenten steigt die Ausbeute an Sequenzen von Primer-Matrizekomplexen, die nach einer Sequenzierungsreaktion ausgewertet werden können. Für die Detektion können Detektionsvorrichtungen verwendet werden, die eine geringere Auflösung besitzen.

Im weiteren zeichnet sich die erfindungsgemäße Oberfläche der festen Phase dadurch aus, dass viele Enzyme, wie Polymerasen und Ligasen die auf der Oberfläche fixierten Nukleinsäureketten als Substrate erkennen. Für die enzymatische Reaktion eignen sich beispielsweise folgende Polymerasen:
DNA-abhängige DNA-Polymerasen, DNA-abhängige RNA-Polymerasen, RNA-abhängige DNA-Polymerasen, RNA-abhängige RNA-Polymerasen.

Die erfindungsgemäße Oberfläche wird im hochparallelen Sequenzierverfahren von einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen eingesetzt. Dieses Verfahren schließt im wesentlichen folgende Schritte ein:

Die Zahl der Wiederholungen von Zyklen in denen Nukleotide eingebaut werden liegt vorzugsweise in einem der folgenden Bereiche: zwischen 3 und 10, 5 bis 20, 10 bis 50, 20 bis 100, 20 bis 200, 50 bis 500.

Dabei können sowohl konventionell modifizierte Nukleotide als auch Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden. Dieses Verfahren kann in mehreren Ausführungsformen durchgeführt werden, wobei sie sich unter anderem in der Art der Kontrolle der zyklischen Reaktkion unterscheiden:
Eine Ausführungsform (A) dieses Verfahren schließt folgende Schritte ein:
Bindung von zu analysierenden Nukleinsäureketten an die feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexe,
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der zu analysierenden Nukleinsäuren unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

a) zu den an die Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nukleotide (NTs^*) enthält, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei NTs^* jeweils an den NTs^* befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten NTs^* durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die NTs^* strukturell an der Base so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen NT^* in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres NT^* in denselben Strang einzubauen, wobei der Fluoreszenzfarbstoff abspaltbar ist und die strukturelle Modifikation ein abspaltbarer sterisch anspruchsvoller Ligand ist, man
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein NT^* verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter NTs^* geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten NTs^* durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Fluoreszenzfarbstoffe und die sterisch anspruchsvollen Liganden von den am komplementären Strang angefügten NTs^* abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Fluoreszenzfarbstoffe und der Liganden geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,

wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den NTs bestimmt.

Beispiele für Nukleotide, die ein sterisches Hindernis tragen, sind in Beispielen 7A bis 7D dargestelt.

Eine weitere Ausführungsform (B) dieses Verfahren schließt folgende Schritte ein:
Bindung von zu analysierenden Nukleinsäureketten an die feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexe,
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der zu analysierenden Nukleinsäuren unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

a) zu den an die Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nukleotide (NTs^*) enthält, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei NTs^* jeweils an den NTs^* befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten NTs^* durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die NTs^* strukturell an der 3'-OH-Nukleotidposition so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen NT^* in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres NT^* in denselben Strang einzubauen, wobei der Fluoreszenzfarbstoff und die strukturelle Modifikation an der 3'-OH-Nukleotidposition abspaltbar sind, man
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein NT^* verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter NTs^* geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten NTs^* durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Fluoreszenzfarbstoffe und die strukturelle Modifikation an der 3'-OH-Nukleotidposition von den am komplementären Strang angefügten NTs^* abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Fluoreszenzfarbstoffe und der Liganden geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,

Beispiele für Nukleotide, die an der 3'-OH-Nukleotidposition eine Strukturelle Modifikation tragen, sind in (Odedra WO 0192284, Odedra WO 03048178, Canard US Pat. Nr. 5798210, Kwiatkowski US Pat. Nr. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691 , Ju et al. WO 02/29003, Milton et al. WO 2004/018493, Milton et al. WO 2004/018497) dargestellt.

Eine weitere Ausführungsform (C) dieses Verfahren schließt folgende Schritte ein:
Bindung von zu analysierenden Nukleinsäureketten an die feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexe,
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der zu analysierenden Nukleinsäuren unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

a) zu den an die Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen enthält, wobei die Polymerasen an die NSKF-Primer-Komplexe binden, man
b) die erhaltene Oberfläche unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung von nicht gebundenen Polymasen geeignet sind, man
c) zu den an die erhaltene Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Polymerase-Komplexen eine Lösung mit modifizierten Nukleotiden zugibt, wobei Nukleotide die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei NTs^* jeweils an den NTs^* befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten NTs^* durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei der Fluoreszenzfarbstoff abspaltbar ist, man
d) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein NT^* verlängert werden, man
e) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter NTs^* geeignet sind, man
f) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten NTs^* durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
g) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Fluoreszenzfarbstoffe von den am komplementären Strang angefügten NTs^* abspaltet, man
h) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Fluoreszenzfarbstoffe geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,

In dieser Ausführungsform können sowohl prozessive Polymerasen wie beispielsweise Sequenase 2 oder Klenow-Fragment Exo minus als auch destributive Polymerasen, beispielsweise Polymerase Beta, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden bei dieser Ausführungsform destributive Polymerasen verwendet, beispielsweise Polymerase Beta ("Animal Cell DNA Polymerases" 1983, Fry M., CRC Press Inc., kommerziell erhältlich bei Chimerx). Nach dem Einbau eines einzelnen Nukleotids löst sich die Polymerase von den Primer-Matrize-Komplexen ab und ist somit nicht in der lage ein weiteres markiertes Nukleotid einzubauen.

Die Bindung von Polymerasen an die Primer-Matrizekomplexe ist reversiblel. Nach einer gewissen Zeit verläßt die Polymerase die Polymerase-Primer-Matrize-Komplexe. Dies geschiet mit einer Halbwertzeit T. Es ist vorteilhaft, die Schritte (b) bis (d) in dieser Ausführungsform der Anmeldung innerhalb von Bruchteilen der Halbwertzeit (T) bis zu einer Halbwertzeit (T) durchzuführen. Wenn die Halbwertzeit der Polymerase-Primer-Matrize-Komplexe beispielsweise 1 sec beträgt, sollten die Schritte (b) bis (d) innerhalb einer Sekunde erfolgen. Bei längeren Habwertzeiten können entsprechend die Zeiten für die Schritte b bis d angepaßt werden. Für einen schnellen Austausch von Lösungen in Reaktionsgefäßen sind viele Beispiele bekannt, z.B. Stop-Flow-Apparatur.

Die in dieser Ausführungsform (C) einsetzbaren Nukleotide können unterschiedliche Strukturen haben. Die Modifikationen betreffen sowohl die Position der Modifikation (Base oder Zucker) als auch die Länge des Linkers, der zwischen der Markierung und dem Nukleotid liegt.

1) Nukleotide mit einem kurzen Linker: a) mit einem sterischen Hindernis (wie Nukleotide in Beispielen 7A–D), b) mit einer an die 3'-Nukleotidposition gekoppelten Gruppe, wie in (Odedra WO 0192284, Odedra WO 03048178, Canard US Pat. Nr. 5798210, Kwiatkowski US Pat. Nr. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691 , Ju et al. WO 02/29003, Milton et al. WO 2004/018493, Milton et al. WO 2004/018497) dargestellt.
2) Nukleotide mit einem langen Linker, wie Beispiel 7E angegeben. Solche Nukleotide haben mehrere Vorteile den mit einem kurzen Linker: a) Durch einen langen Linker ist die sterische Beeinflußung der Polymerase durch den Farbstoff sehr gering, b) nach den Einbau eines solchen Nukleotides liegt der Marker (in der Regel ein Fluoreszenzfarbstoff) in einem relativ großen Abstand vom Doppelstrang, so dass die Fluoreszenzeigenschaften, wie Quantumausbeute, Spektrum, Quenching usw. von der Basenzusammensetzung weniger abhängig sind als bei Nukleotiden mit einem kurzen Linker.

Falls in dieser Ausführungsform Nukleotidmodifikationen verwendet werden, die außer Farbstoff eine zusätzliche Modifikation tragen, so können weitere Schritte in dieser Ausführungsform aufgenommen werden: Entfernung der Modifikation kann beispielsweise parallel zum Schritt (g) oder nach diesem Schritt erfolgen.

Eine weitere Ausführungsform (D) dieses Verfahren schließt folgende Schritte ein:
Bindung von zu analysierenden Nukleinsäureketten an die feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexe,
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der zu analysierenden Nukleinsäuren unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

a) zu den an die Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und nur eine Art der vier modifizierten Nukleotide (NTs^*) enthält, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.
b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein oder mehrere NT^* verlängert werden, man
c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter NTs^* geeignet sind, man
d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten NTs^* durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals und der Signalintensität detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Fluoreszenzfarbstoffe von den am komplementären Strang angefügten NTs^* abspaltet, man
f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Fluoreszenzfarbstoffe geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,

Beispiele für Nukleotide, die ein großes sterisches Hindernis tragen, sind in Beispielen 7A bis D, Nukleotid mit einem geringeren sterischen Hindernis ist in Beispiel 7F dargestelt.

Polymerasen unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, modifizierte Nukleotide zu akzeptieren (Augustin et al. "Progress towards single-molecule sequencing: enzymatic synthesis of nucleotide-specifically labeled DNA". J Biotechnol 2001, v.86, 289–301). In dieser Ausführungsform des Verfahrens können Polymeresen eingesetzt werden, die mehrere modifizierte Nukleotide nacheinander einbauen. Vorteilhaft sind Nukleotide mit einem langen Linker, wie in Beispiel 7E, da in bei diesen Nukleotiden eine geringere Wahrscheinlichkeit der Beeinflußung der Fluoreszenzeigenschaft durch die benachbarten eingebauten Nukleotidmoleküle besteht.

Beim Einbau von mehreren Nukleotiden hintereinander kann man aus der relativen Intensität auf die Zahl der eingebauten Nukleotide schließen.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten Teilsequenzen haben vorzugsweise eine Länge von 10 bis 100 Nukleotide.

Die oben angeführten Ausführungsformen des Verfahrens können weitere zusätzliche Schritte einschließen. Diese Schritte können regelmäßig in jedem Zyklus vorhanden sein oder in Abständen zwischen den zyklen eingesetzt werden. In einer Ausführungsform der Verfahren dienen diese Schritte zu Modifizierung von reaktiven Gruppen nach der Spaltung von Fluorophoren (s. Beispiel 6.1). In einer anderen Ausführungsform der Verfahren dienen solche Schritte zu Entfernung bestimmter Reagenzien von der Oberfläche, beispielsweise an die Nukleinsäurestränge gebundenen Polymerasen. Dies kann beispielsweise durch die Behandlung der festen Phase mit einer Puffer-Lösung erfolgen, die Mg2+ komplexieren kann (z.B. EDTA-Puffer-Lösung), oder durch Behandlung der festen Phase mit einer Lösung mit hoher Salzkonzentration. Eine weitere Möglichkeit, die an die Nukleinsäureketten gebundene Proteine zu entfernen, besteht in einer Protease-Behandlung.

Aus den ermittelten Teilsequenzen kann man beispielsweie die Gesamtsequenz der NSKs bestimmen. Unter einer parallelen Sequenzanalyse wird in diesem Zusammenhang die gleichzeitige Sequenzanalyse vieler NSKFs verstanden (beispielsweise 1.000.000 bis 10.000.000), wobei diese NSKFs von einer einheitlichen NSK-Population oder von mehreren unterschiedlichen NSK-Populationen abgeleitet sind.

Die erhaltene Population von überlappenden Teilsequenzen läßt sich beispielsweise bei de novo Sequenzierung mit kommerziell erhältlichen Programmen zur Gesamtsequenz der NSK zusammenfügen (Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v.1 S.257).

Bei der Analyse von Varianten einer bekannten Referenzsequenz lassen sich Mutationen oder Einzelnukleotidpolymorphismen durch einen Vergleich der erhaltenen überlappenden Teilsequenzen mit der Referenzsequenz feststellen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann das Verfahren durchgeführt werden, indem man in den Ausführungsformen (A) und (B) die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion und in der Ausführungsform (C) die Stufen a) bis h) mehrfach wiederholt, wobei man

einsetzt.

Wenn die NSKs Varianten einer bekannten Referenzsequenz sind kann das Verfahren auch durchgeführt werden, indem man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in den Zyklen abwechselnd jeweils zwei unterschiedlich markierte NTs^* und zwei unmarkierte NTs einsetzt und man die Gesamtsequenzen durch Vergleich mit der Referenzsequenz ermittelt.

Die erfindungsgemäße Methode dient zur Ermittlung der Nukleinsäuresequenzen und kann in verschiedenen Bereichen der Genetik eingesetzt werden. Dazu zählen insbesondere die Bestimmung unbekannter, langer Sequenzen, Analysen von Sequenz- Polymorphismen und Punktmutationen sowie die parallele Analyse einer großen Zahl an Gensequenzen.

Im weiteren wird die Ausführungsform (A) des Verfahrens wird zur Anschaulichkeit genauer betrachtet, wobei dies sollte nicht zur Einschränkung des erfinderischen Verfahrens führen.

Die Vorbereitung des zu analysierenden Materials (einzel- und doppelsträngige Nukleinsäuresequenzen) hängt von der Aufgabenstellung ab und hat das Ziel, aus einer langen Nukleinsäurekette eine Population an relativ kleinen, einzelsträngigen Nukleinsäurekettenfragmenten (NSKFs) zu bilden, diese Fragmente mit einem für den Start der Sequenzierungsreaktion geeigneten Primer zu versehen (NSKF-Primer-Komplexe) und auf einer planen Oberfläche zu fixieren.

Dabei werden einzelne NSKFs auf einer planen Oberfläche in einer solchen Weise fixiert, dass eine enzymatische Reaktion an diesen Molekülen ablaufen kann. Prinzipiell sind verschiedene Arten der Immobilisation möglich, die von der Zielsetzung, der Art der NSK und der für die Reaktion eingesetzten Polymerase abhängen. Die NSKFs werden bei der Immobilisierung bzw. Bindung zufällig auf der Oberfläche verteilt, d.h. es muß also nicht auf eine exakte Positionierung der einzelnen Ketten geachtet werden. NSKF-Primer-Komplexe können über die NSKFs oder Primer an die Oberfläche gebunden werden. Die NSKF-Primer-Komplexe müssen dabei in einer solchen Dichte auf der Oberfläche fixiert werden, dass eine eindeutige Zuordnung der später detektierten Signale von den eingebauten NT*s zu einzelnen NSKFs gewährleistet ist.

Nach der Vorbereitung der NSKFs startet man mit allen auf der Oberfläche immobilisierten NSKF-Primer-Komplex-Molekülen die Sequenzierungsreaktion. Als Grundlage der Sequenzierung dient die Synthese des komplementären Stranges zu jedem einzelnen gebundenen NSKF. Dabei werden in den neu synthetisierten Strang markierte NTs^* eingebaut. Die Polymerase baut nur ein einziges markiertes NT^* in die wachsende Kette ein. Dies wird durch die reversible Ankopplung einer zur Termination führenden, sterisch anspruchsvollen Gruppe an die NTs^* erreicht. Der Einbau eines weiteren markierten NT^* wird dadurch unmöglich gemacht. Diese sterisch anspruchsvolle Gruppe ist vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff.

Die Sequenzierungsreaktion verläuft in mehreren Zyklen. Ein Zyklus umfasst folgende Schritte:

a) Zugabe einer Lösung mit markierten Nukleotiden (NTs^*) und Polymerase zu den gebundenen NSKF-Primer-Komplexen,
b) Inkubation der gebundenen NSKF-Primer-Komplexe mit dieser Lösung unter Bedingungen, die zur Verlängerung der komplementären Stränge um ein NT geeignet sind,
c) Waschen,
d) Detektion der Signale von einzelnen Molekülen,
e) Entfernung der Markierung von den eingebauten Nukleotiden,
f) Waschen.

Gegebenenfalls erfolgt eine mehrfache Wiederholung des Zyklus (a–f).

Die Reaktionsbedingungen des Schrittes (b) in einem Zyklus werden so gewählt, dass die Polymerasen an mehr als 50% der an der Sequenzierungsreaktion beteiligten NSKFs (extensionsfähige NSKF-Primer-Komplexe) in einem Zyklus ein markiertes NT^* einbauen können, vorzugsweise an mehr als 80%.

Die Anzahl der durchzuführenden Zyklen hängt dabei von der jeweiligen Aufgabenstellung ab, ist theoretisch nicht beschränkt und liegt vorzugsweise zwischen 10 und 200.

Danach wird für jedes fixierte NSKF seine spezifische Sequenz aus der Reihenfolge der eingebauten NTs^* ermittelt.

Aus den überlappenden NSKF-Sequenzen kann in einer Ausführungsform die ursprüngliche NSK-Sequenz rekonstruiert werden ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 5.868, Huang Genomics 1996 v.33 5.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v.1 S.257). Dabei sucht man in der gesamten Population von NSKF-Sequenzen nach Übereinstimmungen/Überlappungen in den Sequenzen von NSKFs.

Dabei können die Fehler der Methode mit verschiedenen Mitteln erfasst und korrigiert werden. Sämtliche Schritte des Verfahrens können weitgehend automatisiert werden.

Auswahl des Materials

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Methode ist es möglich, sowohl vorselektionierte DNA-Sequenzen (z.B. in YAC-, PAC-, oder BAC-Vektoren (R. Anand et al. NAR 1989 v.17 S.3425, H. Shizuya et al. PNAS 1992 v.89 5.8794, "Construction of bacterial artificial chromosome libraries using the modified PAC system" in "Current Protocols in Human genetics" 1996 John Wiley & Sons Inc.) klonierte Abschnitte eines Genoms) als auch nicht vorselektionierte DNA (z.B. genomische DNA, cDNA-Gemische) zu analysieren. Durch eine Vorselektion ist es möglich, im Vorfeld relevante Informationen, wie z.B. Sequenz-Abschnitte aus einem Genom oder Populationen an Genprodukten, aus der große Menge genetischer Informationen herauszufiltern und damit die Menge der zu analysierenden Sequenzen einzuschränken.

Vorbereitung des Materials

Ziel der Materialvorbereitung ist es, gebundene einzelsträngige NSKFs mit einer Länge von vorzugsweise 50–1000 NTs, einer einzelnen Primerbindungsstelle und einem hybridisierten Primer (gebundene NSKF-Primer-Komplexe) zu erhalten. Im einzelnen können sehr variable Konstruktionen aus dieser allgemeinen Struktur abgeleitet werden. Zur Verbesserung der Anschaulichkeit folgen nun einige Beispiele, wobei die angeführten Methoden einzeln oder in Kombination eingesetzt werden können.

Erzeugung kurzer Nukleinsäurekettenfragmente (50–1000 NTs) (Fragmentierungsschritt)

Wichtig ist, dass die Fragmentierung der NSKs so erfolgt, dass Fragmente erhalten werden, die überlappende Teilsequenzen der Gesamtsequenzen darstellen. Dies wird durch Verfahren erreicht, bei denen unterschiedlich lange Fragmente als Spaltprodukte in zufallsmäßiger Verteilung entstehen.

Erfindungsgemäß kann die Erzeugung der Nukleinsäurekettenfragmente (NSKFs) durch mehrere Methoden erfolgen, z.B. durch die Fragmentierung des Ausgangsmaterials mit Ultraschall oder durch Endonukleasen ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press), wie z.B. durch unspezifische Endonukleasegemische. Erfindungsgemäß wird die Ultraschall-Fragmentierung bevorzugt. Man kann die Bedingungen so einstellen, dass Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von 100 bp bis 1 kb entstehen. Diese Fragmente werden anschließend an ihren Enden durch das Klenow-Fragment (E.coli-Polymerase I) oder durch die T4-DNA-Polymerase aufgefüllt ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press).

Ausserdem können aus einer langen NSK unter Verwendung randomisierter Primer komplementäre kurze NSKFs synthetisiert werden. Besonders bevorzugt wird diese Methode bei der Analyse der Gen-Sequenzen. Dabei werden an der mRNA einzelsträngige DNA-Fragmente mit randomisierten Primern und einer reversen Transkriptase gebildet (Zhang-J et al. Biochem.J. 1999 v.337 S.231, Ledbetter et al. J.Biol.Chem. 1994 v.269 S.31544, Kolls et al. Anal.Biochem. 1993 v.208 S.264, Decraene et al. Biotechniques 1999 v.27 S.962).

Einführung einer Primerbindungsstelle in das NSKF.

Die Primerbindungsstelle (PBS) ist ein Sequenzabschnitt, der eine selektive Bindung des Primers an das NSKF ermöglichen soll.

In einer Ausführungsform können die Primerbindungsstellen unterschiedlich sein, so dass mehrere unterschiedlche Primer verwendet werden müssen. In diesem Fall können bestimmte Sequenzabschnitte der Gesamtsequez als natürliche PBSs für spezifische Primer dienen. Diese Ausführungsform ist besonders für die Untersuchung bereits bekannter SNP-Stellen geeignet.

In einer anderen Ausführungsform ist es aus Gründen der Vereinfachung der Analyse günstig, wenn eine einheitliche Primerbindungsstelle in allen NSKFs vorhanden ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Primerbindungsstellen daher in die NSKFs extra eingeführt. Auf diese Weise können Primer mit einheitlicher Struktur für die Reaktion eingesetzt werden.

Im folgenden wird diese Ausführungsform detailliert beschrieben.

Die Zusammensetzung der Primerbindungsstelle ist nicht eingeschränkt. Ihre Länge beträgt vorzugsweise zwischen 20 und 50 NTs. Die Primerbindungsstelle kann eine funktionelle Gruppe zur Immobilisation des NSKF tragen. Diese funktionelle Gruppe kann z.B. eine Biotingruppe sein.

Als Beispiel für die Einführung einer einheitlichen Primerbindungsstelle werden im folgenden die Ligation und das Nukleotid-Tailing an DNA-Fragmente beschrieben.

a) Ligation:

Dabei wird ein doppelsträngiger Oligonukleotidkomplex mit einer Primerbindungsstelle verwendet. Dieser wird mit kommerziell erhältlichen Ligasen an die DNA-Fragmente ligiert ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press). Es ist wichtig, dass nur eine einzige Primerbindungsstelle an das DNA-Fragment ligiert wird. Das erreicht man z.B, durch eine Modifikation einer Seite des Oligonukleotidkomplexes an beiden Strängen. Die modifizierenden Gruppen am Oligonukleotidkompex können zur Immobilisation dienen. Die Synthese und die Modifikation eines solchen Oligonukleotidkomplexes kann nach standardisierten Vorschriften durchgeführt werden. Zur Synthese kann z.B. der DNA-Synthesizer 380 A Applied Biosystems verwendet werden. Oligonucleotide mit einer bestimmten Zusammensetzung mit oder ohne Modifikationen sind aber auch als Auftragssynthese kommerziell erhältlich, z.B. von MWG-Biotech GmbH, Germany.

b) Nukleotid-Tailing:

Statt der Ligation mit einem Oligonukleotid kann man mit einer terminalen Deoxynucleotidyltransferase mehrere (z.B. zwischen 10 und 20) Nukleosidmonophosphate an das 3'-Ende eines ss-DNA-Fragments anknüpfen ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press, "Method in Enzymology" 1999 v.303, S.37–38), z.B. mehrere Guanosin-Monophosphate ((G)n-Tailing genannt). Das entstehende Fragment wird zur Bindung des Primers, in diesem Beispiel eines (C)n-Primers, verwendet.

Einzelstrang-Vorbereitung

Für die Sequenzierungsreaktion werden einzelsträngige NSKFs benötigt. Falls das Ausgangsmaterial in doppelsträngiger Form vorliegt, gibt es mehrere Möglichkeiten, aus doppelsträngiger DNA eine einzelsträngige Form zu erzeugen (z.B. Hitze-Denaturierung oder Alkali-Denaturierung) ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laborotary Press).

Primer für die Sequenzierungsreaktion

Dieser hat die Funktion, den Start an einer einzigen Stelle des NSKF zu ermöglichen. Er bindet an die Primerbindungsstelle im NSKF. Die Zusammensetzung und die Länge des Primers sind nicht eingeschränkt. Außer der Startfunktion kann der Primer auch andere Funktionen übernehmen, wie z.B. eine Verbindung zur Reaktionsoberfläche zu schaffen. Primer sollten so an die Länge und Zusammensetzung der Primerbindungsstelle angepaßt werden, dass der Primer den Start der Sequenzierungsreaktion mit der jeweiligen Polymerase ermöglicht.

Bei der Verwendung unterschiedlicher, beispielsweise natürlich in der ursprünglichen Gesamtsequenz vorkommender Primerbindungsstellen, werden die für die jeweilige Primerbindungsstelle sequenzspezifischen Primer verwendet. In diesem Fall wird für die Sequenzierung ein Primergemisch eingesetzt.

Bei einer einheitlichen, beispielsweise durch die Ligation an die NSKFs angekoppelten Primerbindungsstelle wird ein einheitlicher Primer verwendet.

Vorzugsweise beträgt die Länge des Primers zwischen 6 und 100 NTs, optimalerweise zwischen 15 und 30 NTs. Der Primer kann eine Funktionsgruppe tragen, die zur Immobilisierung des NSKF dient, beispielsweise ist eine solche Funktionsgruppe eine Biotingruppe (s. Abschnitt Immobilisierung). Sie soll die Sequenzierung nicht stören. Die Synthese eines solchen Primers kann z.B. mit dem DNA-Synthesizer 380 A Applied Biosystems ausgeführt werden oder aber als Auftragssynthese bei einem kommerziellen Anbieter, z.B. MWG-Biotech GmbH, Germany erstellt werden).

Der Primer wird in einer Ausführungsform auf der Oberfläche fixiert, wie in dieser Anmeldung beschrieben ist. Der Primer oder das Primergemisch wird mit NSKFs unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert, die ihn selektiv an die Primerbindungsstelle des NSKF binden lassen. Diese Primer-Hybridisierung (Annealing) kann vor (1), während (2) oder nach (3) der Bindung der NSKFs an die Oberfläche erfolgen. Die Optimierung der Hybridisierungsbedingungen hängt von der genauen Struktur der Primerbindungsstelle und des Primers ab und läßt sich nach Rychlik et al. NAR 1990 v.18 S.6409 berechnen. Im folgenden werden diese Hybridisierungsbedingungen als standardisierte Hybridisierungsbedingungen bezeichnet.

Falls eine für alle NSKFs gemeinsame Primerbindungsstelle mit bekannter Struktur beispielsweise durch Ligation eigeführt wird, können Primer mit einheitlicher Struktur eingesetzt werden. Die Primerbindungsstelle kann an ihrem 3'-Ende eine funktionelle Gruppe tragen, die z.B. zur Immobilisation dient. Beispielsweise ist diese Gruppe eine Biotin-Gruppe. Der Primer hat eine zur Primerbindungsstelle komplementäre Struktur. Fixierung von NSKF-Primer-Komplexe an die Oberfläche (Bindung bzw. Immobilisierung von NSKFs).

Ziel der Fixierung (Immobilisierung) ist es, NSKF-Primer-Komplexe auf einer geeigneten planen Oberfläche in einer Art und Weise zu fixieren, dass eine zyklische enzymatische Sequenzierungsreaktion ablaufen kann. Dies kann beispielsweise durch Bindung des Primers (s.o.) oder des NSKF an die Oberfläche erfolgen.

Die Reihenfolge der Schritte bei der Fixierung von NSKF-Primer-Komplexen kann variabel sein:

1) Die NSKF-Primer-Komplexe können zunächst in einer Lösung durch Hybridisierung (Annealing) gebildet und anschließend an die Oberfläche gebunden werden.
2) Primer können zunächst auf einer Oberfläche gebunden werden und NSKFs anschließend an die gebundenen Primer hybridisiert werden, wobei NSKF-Primer-Komplexe entstehen (NSKFs indirekt an die Oberfläche gebunden)
3) Die NSKFs können zunächst an die Oberfläche gebunden werden (NSKFs direkt an die Oberfläche gebunden) und im anschließenden Schritt die Primer an die gebundenen NSKFs hybridisiert werden, wobei NSKF-Primer-Komplexe enstehen.

Die Immobilisierung der NSKFs an die Oberfläche kann daher durch direkte oder indirekte Bindung erfolgen.

Falls die Fixierung der NSKF-Primer-Komplexe auf der Oberfläche über die NSKFs erfolgt, kann dies beispielsweise durch die Bindung der NSKFs an einem der beiden Ketten-Enden erfolgen. Dies kann durch entsprechende kovalente, affine oder andere Bindungen erreicht werden. Beispiele für Fixierung von Nukleinsäureketten sind in dieser Anmeldung angeführt. Weitere Beispiele der Immobilisierung von Nukleinsäuren sind bekannt (McGall et al. US Pat. Nr. 5412087, Nikiforov et al. US Pat. Nr. 5610287, Barrett et al. US Pat. Nr. 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v.198, S.138, Allemand et al. Biophysical Journal 1997, v.73, 5.2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v.71, S.279, Osborne et al. Analytical Chemistry 2000, v.72, S.3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 S.1679).

Zur weiteren Reduzierung von unspezifischen Bindung von markierten Komponenten an die Oberfläche können blockierende Substanzen verwendet werden. Solche Substanzen sind dem Fachmann bekannt. Oft werden Puffer-Lösungen von Proteinen (z.B. Serumalbumin-Lösung) eingesetzt als blockierende Reagenzien. Auch Polymer-Lösungen, wie z.B. Moviol- oder Polyethylenglycol-Lösung (Molmasse 10.000) wird verwendet.

Wahl der Polymerase

Bei der Wahl der Polymerase spielt die Art der zu analysierenden fixierten Nukleinsäure (RNA oder DNA) eine entscheidende Rolle:
Falls RNA als Substrat (z.B. mRNA) in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt wird, können handelsübliche RNA-abhängige DNA-Polymerasen eingesetzt werden, z.B. AMV-Reverse Transcriptase (Sigma), M-MLV Reverse Transcriptase (Sigma), HIV-Reverse Transcriptase ohne RNAse-Aktivität. Für bestimmte Anwendungen, können Reverse Transcriptasen von RNAse-Aktivität weitgehend frei sein ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory), z.B. bei mRNA-Makrierung für Hybridisierungsexperimente.

Falls DNA als Substrat (z.B. cDNA) verwendet wird, eignen sich als Polymerasen prinzipiell alle DNA-abhängigen DNA-Polymerasen ohne 3'-5' Exonuklease-Aktivität (DNA-Replication" 1992 Ed. A.Kornberg, Freeman and company NY), z.B. modifizierte T7-Polymerase vom Typ "Sequenase Version 2" (Amersham Pharmacia Biotech), Klenow Fragment der DNA-Polymerase I ohne 3'-5' Exonukleaseaktivität (Amersham Pharmacia Biotech), Polymerase Beta verschiedenen Ursprungs (Animal Cell DNA Polymerases" 1983, Fry M., CRC Press Inc., kommerziell erhältlich bei Chimerx) thermostabile Polymerasen wie beispielsweise Taq-Polymerase (GibcoBRL), proHA-DNA-Polymerase (Eurogentec), Vent exo minus, Pwo-Polymerse. Auch DNA-abhängige RNA-Polymerasen können verwendet werden, z.B. E.coli RNA-Polymerase, T7-RNA-Polymerase, SP6 RNA Polymerase.

In der Anmeldung werden DNA-abhängige DNA-Polymerasen als Beispiele für alle Polymerasen betrachtet.

Chemie, allgemeines Prinzip

Für die Sequenzierungsreaktion bei hoch paralleler Sequenzanalyse an einzelnen Nukleinsäure-Molekülen (parallele Analyse von bis zu 10.000.000 NSKF-Sequenzen) ist wichtig, dass jedes eingebaute NT^* identifiziert wird.

Die Schwierigkeiten bei der Entwicklung passender NT-Analoga für das Verfahren basieren auf folgenden Rahmenbedingungen:

1) Es ist vorteilhaft, wenn die Reaktion so gesteuert wird, dass die Polymerase NT*s einzeln einbaut (Kontrolle der Reaktion).
2) NT*s müssen eine Markierung tragen, der den Anforderungen der Detektion genügt.
3) Die Markierung muß unter milden Bedingungen abspaltbar sein, so dass weder die NSKF-Primer-Komplexe, noch einzelne Komponenten des Systems beschädigt werden.
4) Die Abspaltung muss möglichst schnell und quantitativ erfolgen.
5) Der Stop des Einbaus muss reversibel sein und unter milden Bedingungen aufgehoben werden können.

Die Markierung dabei kann niedermolekular (z.B. konventionell modifizierte Nukleotide) oder makromolekular (z.B. Nuk-Makromoleküle) sein.

Konventionell modifizierte Nukleotide schließen mehrere Arte ein:
Eine Art von Nukleotiden, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann, trägt eine sterisch anspruchsvolle Gruppe, die an der Base gekoppelt ist. Die sterisch anspruchsvolle Gruppe übt einen starken sterischen Einfluß auf die Reaktion aus. Beispiele für solche Nukleotide stellen Modifikationen, die unter Beispielen 7 A bis D angegeben sind.

Eine weitere Art von Nukleotiden, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann, ist an der 3'-OH-Nukleotidposition modifiziert. Beispiele für diese Nukleotide sind in Odedra WO 0192284, Odedra WO 03048178, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Canard US. Pat. Nr. 5798210, Kwiatkowski US Pat. Nr. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642 angegeben.

Eine weitere Art von Nukleotiden, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann, ist an der 3'-ON-Nukleotidposition modifiziert und ist an der Base reversibel markiert. Beispiele für solche Nukleotide sind in Milton et al. WO 2004/018493, Milton et al. WO 2004/018497 dargestellt,

Eine weitere Art von Nukleotiden, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann, trägt eine Markierung, die über einen langen Linker an das Nukleotid gekoppelt ist, s. Beispiel 7E. Diese Modifizierung übt einen schwachen sterischen Einfluß auf die Reaktion aus.

Nuk-Makromoleküle werden im Beispiel 8 dargestellt.

Im folgenden werden konventionell modifizierte Nukleotide mit einer sterisch anspruchsvollen Gruppe näher behandelt.

Eine an die Base gekoppelte sterisch anspruchsvolle Gruppe kann zur Behinderung der weiteren Synthese führen. Biotin, Digoxigenin und Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluoreszein, Tetramethylrhodamine, Cy3-Farbstoff stellen Beispiele einer solchen sterisch anspruchsvollen Gruppe dar (Zhu et al. Cytometry 1997, v.28, S.206, Zhu et al. NAR 1994, v.22, S.3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v.15, S.4513, Wiemann et al. Analytical Biochemistry 1996, v.234, S.166, Heer et al. BioTechniques 1994 v.16 S.54).

Bei der Sequenzierungsreaktion im erfindungsgemäßen Verfahren werden markierte NTs^* mit einer Polymerase und Nukleinsäureketten inkubiert. Die NTs^* tragen dabei eine an die Base reversibel gekoppelte sterisch anspruchsvolle Gruppe. Wenn ein Reaktionsgemisch, das nur modifizierte NTs^* enthält, in der Reaktion eingesetzt wird, dann kann die Polymerase vorzugsweise ein einziges NT^* einbauen. Der Einbau eines nächsten NT^* wird sterisch gehemmt. Diese NTs^* treten somit als Terminatoren der Synthese auf. Nach der Entfernung der sterisch anspruchsvollen Gruppe kann das nächste komplementäre NT^* eingebaut werden.

Allgemeine Struktur des NT^*

Diese Struktur ist dadurch charakterisiert, dass an der Base über einen spaltbaren Linker ein Fluoreszenzmarker gebunden sind.

Als Grundlage für die NTs^* dienen Deoxynukleosid-Triphosphate mit Adenosin (A), Guanosin(G), Cytidin (C) und Thymidin (T) als Nukleosidrest. Anstelle von Thymidin wird bevorzugt Uridin als Nukleosidrest verwendet. Anstelle von Guanosin kann Inosin verwendet werden.

Marker, Fluorophore

Jede Base ist mit einem für sie charakteristischen Marker (F) markiert. Der Marker ist ein fluoreszierender Farbstoff. Mehrere Faktoren beeinflussen die Wahl des Fluoreszenzfarbstoffes. Die Wahl ist nicht eingeschränkt, sofern der Farbstoff folgenden Anforderungen genügt:

a) Die verwendete Detektionsapparatur muß diesen Marker als einziges Molekül gebunden an DNA unter milden Bedingungen (vorzugsweise Reaktionsbedingungen) identifizieren können. Die Farbstoffe haben vorzugsweise große Photostabilität. Ihre Fluoreszenz wird vorzugsweise von der DNA nicht oder nur unwesentlich gequencht.
b) Der an das NT gebundene Farbstoff darf keine irreversible Störung der enzymatischen Reaktion verursachen.
c) mit dem Farbstoff markierte NTs^* müssen von der Polymerase in die Nukleinsäurekette eingebaut werden.
d) Bei einer Markierung mit verschiedenen Farbstoffen sollen diese Farbstoffe keine beträchtlichen Überlappungen in ihren Emissionsspektren aufweisen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbare Fluoreszenzfarbstoffe sind in "Handbook of Fluorescent Probes und Research Chemicals" 6th ed. 1996, R.Haugland, Molecular Probes mit Strukturformeln zusammengestellt. Erfindungsgemäß werden vorzugsweise folgende Farbstoffklassen als Marker eingesetzt: Cyanin-Farbstoffe und deren Abkömmlinge (z.B. Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 Amersham Pharmacia Biotech, Waggoner US Pat. Nr. 5.268.486), Rhodamine und deren Abkömmlinge (z.B. TAMRA, TRITC, RG6, R110, ROX, Molecular Probes, s. Handbuch), Xanthene-Derivate (z.B. Alexa 568, Alexa 594, Molecular Probes, Mao et al. US Pat. Nr. 6.130.101). Atto-Farbstoffe (Attotec GmbH, Siegen, Deutschland) Diese Farbstoffe sind kommerziell erhältlich.

Dabei kann man je nach spektralen Eigenschaften und vorhandener Apparatur entsprechende Farbstoffe auswählen. Die Farbstoffe werden an den Linker z.B. über Thiocyanat- oder Ester-Bindung gekoppelt ("Handbook of Fluorescent Probes und Research Chemicals" 6th ed. 1996, R.Haugland, Molecular Probes, Jameson et al. Methods in Enzymology 1997 v.278 5.363, Waggoner Methods in Enzymology 1995 v.246 S.362).

Natur der sterisch anspruchsvollen Gruppe

Fluoreszenzfarbstoffe stellen Beispiele einer sterisch anspruchsvollen Gruppe dar (Zhu et al. Cytometry 1997, v.28, S.206, Zhu et al. NAR 1994, v.22, S.3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v.15, S.4513, Wiemann et al. Analytical Biochemistry 1996, v.234, S.166, Heer et al. BioTechniques 1994 v.16 S.54). Die chemische Struktur dieser Gruppe ist nicht eingeschränkt, sofern sie den Einbau des markierten NT^*, an das sie geknüpft ist, nicht wesentlich stört und keine irreversible Störung der enzymatischen Reaktion verursacht.

Durch die Spaltung des Linkers wird diese sterisch anspruchsvolle Gruppe (D) nach der Detektion des Signals entfernt, so dass die Polymerase ein weiteres markiertes NT^* einbauen kann.

Linker

Der Marker (Fluoreszenzfarbstoff) ist an die Base vorzugsweise über einen Abstandhalter unterschiedlicher Länge, einen sog. Linker, gebunden. Vorzugsweise ist dieser Linker an einer der Stellen an die Base gebunden, die nicht an der Basenpaarung teilnimmt. Im bevorzugten Fall sind die Stellen, an die der Linker gebunden ist: die 4 oder 5-Position im Pyrimidinring und die 7-Position oder 6-Position im Purinring. Beispiele der Ankoppelung eines Linkers an die Base können aus folgenden Quellen entnommen werden (Hobbs et al. US Pat. Nr. 5.047.519, Khan et al. US Pat. Nr. 5.821.356, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Herman et al. Methods in Enzymology 1990 v.184 S.584, J.L.Ruth et al. Molecular Pharmacology 1981 v.20 5.415, L. Ötvös et al. NAR 1987 v.15 S.1763, G.E.Wright et al. Pharmac Ther. 1990 v.47, 5.447, „Nucleotide Analogs; Synthesis and Biological Function" K.H. Scheit 1980, Wiley-Interscience Publication, "Nucleic acid chemistry" Ed. L.B.Townsend, v.1-4, Wiley-Interscience Publication, "Chemistry of Nucleosides and Nucleotides" Ed. L.B.Townsend, v.1-3, Plenum Press).

Die gesamte Länge des Linkers kann variieren. Sie entspricht der Anzahl der Ketten-Atome und liegt vorzugsweise zwischen 3 und 50. Optimalerweise beträgt sie zwischen 4 und 10 Atomen. Die chemische Zusammensetzung des Linkers ist nicht eingeschränkt, sofern sie unter Reaktionsbedingungen stabil bleibt und keine Störung der enzymatischen Reaktion verursacht.

Spaltbare Verbindung, Spaltung

Der Linker trägt eine spaltbare Verbindung oder spaltbare Gruppe. Diese spaltbare Verbindung ermöglicht die Entfernung des Markers und des sterischen Hindernisses am Ende jedes Zyklus. Ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, sofern sie unter den Bedingungen der enzymatischen Sequenzierungsreaktion stabil bleibt, keine irreversible Störung der Polymerase verursacht und unter milden Bedingungen abgespalten werden kann. Unter "milden Bedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, die den NSKF-Primer-Komplex nicht zerstören, wobei z.B. der pH-Wert vorzugsweise zwischen 3 und 11 liegt, die Temperatur zwischen 0°C und einem Temperaturwert (x). Dieser Temperaturwert (x) hängt von der Tm des NSKF-Primer-Komplexes (Tm ist "melting Point") und wird beispielsweise als Tm (NSKF-Primer-Komplex) minus 5°C errechnet (z.B. Tm ist 47°C, dann liegt die maximale Temperatur bei 42°C; unter diesen Bedingungen eignen sich besonders Ester-, Thioester-, Disulfid-Verbindungen und photolabile Verbindungen als spaltbare Verbindungen).

Vorzugsweise gehört die genannte Verbindung zu chemisch oder enzymatisch spaltbaren oder photolabilen Verbindungen. Als Beispiele von chemisch spaltbaren Gruppen sind Ester-, Thioester- und Disulfid-Verbindungen bevorzugt („Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al. Method in Enzymology 1990 v.184 S.584, Lomant et al. J.Mol.Biol. 1976 v.104 243, "Chemistry of carboxylic acid and esters" S.Patai 1969 Interscience Publ.). Beispiele für photolabile Verbindungen können in folgenden Literaturstellen gefunden werden: "Protective groups in organic synthesis" 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 S.1, V. Pillai Org. Photochem. 1987 v.9 S.225, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" H.Giegrich, 1996, Konstanz, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" S.M.Bühler, 1999, Konstanz)..

Die Position der spaltbaren Verbindung/Gruppe im Linker ist vorzugsweise nicht weiter als 10 Atome von der Base entfernt, noch bevorzugter nicht weiter als 3 Atome. Besonders bevorzugt liegt die spaltbare Verbindung oder Gruppe direkt an der Base.

Der Spaltungs- und Entfernungs-Schritt ist in jedem Zyklus vorhanden und muß unter milden Bedingungen (s.o.) verlaufen, so dass die Nukleinsäuren nicht beschädigt oder modifiziert werden.

Die Spaltung läuft bevorzugt chemisch (z.B. in milder saurer oder basischer Umgebung für eine Ester-Verbindung oder durch Zugabe eines Reduktionsmittel, z.B. Dithiothreitol oder Mercaptoethanol (Sigma) bei der Spaltung einer Disulfid-Verbindung), oder physikalisch (z.B. durch Beleuchtung der Oberfläche mit Licht einer bestimmten Wellenlänge für die Spaltung einer photolabilen Gruppe, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" H. Giegrich, 1996, Konstanz) ab.

Nach der Spaltung verbleibt an der Base ein Linkerrest. Durch die Spaltung können am Linker-Rest reaktive Gruppe entstehen, wie beispielsweise eine Mercaptogruppe. Solche Gruppen können bei Bedarf chemisch modifiziert werden. Viele Beispiele für Modifikation von Mercaptogruppen sind bekannt („Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.) z.B. Disulfid-, wie Dithiodinitro- Phenol, Dithiomercaptoethanol, Cystamine, z.B. oder Iodacetatverbindungen, z.B. Iodacetamid, Iodacetat oder Maleimide).

Einige Beispiele für Synthesen von Nukleotidanaloga sind im Beispiel 7 dargestellt.

Farbiges Kodierungsschema, Anzahl der Farbstoffe

Einen Zyklus kann man durchführen mit:

a) vier verschieden markierten NT*s
b) zwei verschieden markierten NT*s
c) einem markierten NT*
d) zwei verschieden markierten NT*s und zwei unmarkierten NTs,

d.h.

a) Man kann alle 4 NTs mit verschiedenen Farbstoffen markieren und alle 4 gleichzeitig in die Reaktion einsetzten. Dabei erreicht man die Sequenzierung einer Nukleinsäurekette mit einer minimalen Anzahl von Zyklen. Diese Variante der Erfindung stellt allerdings hohe Anforderungen an das Detektionssystem: 4 verschiedene Farbstoffe müssen in jedem Zyklus identifiziert werden.
b) Zur Vereinfachung der Detektion kann eine Markierung mit zwei Farbstoffen gewählt werden. Dabei werden 2 Paare von NTs^* gebildet, die jeweils verschieden markiert sind, z.B. A und G tragen die Markierung "X", C und U tragen die Markierung "Y". In die Reaktion in einem Zyklus (n) werden 2 unterschiedlich markierte NTs^* gleichzeitig eingesetzt, z.B. C^* in Kombination mit A^*, und im darauffolgenden Zyklus (n+1) werden dann U^* und G^* zugegeben.
c) Man kann auch nur einen einzigen Farbstoff zur Markierung aller 4 NTs^* verwenden und pro Zyklus nur ein NT^* einsetzen.
d) In einer technisch vereinfachten Ausführungsform werden pro Zyklus zwei unterschiedlich markierte NT^*s eingesetzt und zwei unmarkierte NTs (sogen. 2NT*s/2NTs-Methode). Diese Ausführungsform kann verwendet werden, um Varianten (z.B. Mutationen, oder alternativ gespleißte Gene) einer bereits bekannten Sequenz zu ermitteln.

Austausch von Reagenzien mit dem Fortschritt der Sequenzieung:

In einer Ausführungsform des Verfahrens werden mehrere Modifikationen einer Nukleotid-Art verwendet.

Beispielsweise werden mehrere Modifikationen von dCTP-Nukleotide verwendet. Diese Modifikationen können in einer Ausführungsform im selben Reaktionsgemisch vorhanden sein. In einer anderen Ausführungsform werden einzelne Varianten der modifizierten Nukleotide mit dem Fortschritt der Sequenzierung ausgewechselt. Beispielsweise werden am Anfang einer Sequenzierunsreaktion Nukleotid-Modifikationen mit einem kurzen Linker verwendet, beispielsweise Beispiel 7C oder 7D. Im Verlauf der Sequenzierung werden dann Nukleotidanaloga mit längeren Linkern eingesetzt, beispielsweise Beispiel 7A oder 7E. Zum Ende der Sequenzierung können dann auch Nukleotide mit einem noch längeren Linker eingesetzt werden, beispiesweise Beispiel 7B. In einer Ausführungsform des Verfahrens ist es vorteilhaft die ersten 25% der entsprechenden Zyklen mit einem Nukleotidanalog durchzuführen, die nächsten 25% der entsprechenden Zyklen mit einem anderen usw. Der Austausch von Nukleotiden kann auch in einer anderen Abfolge durchgeführt werden, beispielsweise nach 10% aller Zyklen, nach 20% usw. dabei können Nukleotide mit beispielsweise immer längeren Linker zwischen einer Base und einem Farbstoff eingesetzt werden. Der Austausch von Nukleotid-Analoga kann auch nach einer festen Zykluszahl erfolgen. Beispielsweise können die ersten 10 Zyklen mit einem Nukleotidanalog durchgeführt werden, dann wird beispielsweise ein anderer Nukletidanalog eingesetzt. Nach 30 Zyklen wird ein weiterer Nukleotidanalog eingesetzt und nach 60 Zyklen wird ein noch weiterer Nukleotidanalog eingesetzt.

Der Vorteil eines solchen Austausches von verwendeten Nukleotiden liegt darin, dass mit zunehmender Zahl der bereits eingebauter Nukleotide wächst der Grad der Modifizierung der Nukleinsäuren, so dass Nukletide mit einem kürzeren Linker schlechter eingebaut werden, als die mit einem längeren. Durch Austausch der eingesetzter Nukleotide können somit längere Sequenzsträchen analysiert werden. Ein solcher Austausch kann für alle eingesetzten modifizierten Nukleotide erfolgen oder auch nur für ein Teil davon.

Insgesamt spielen die Größe, die Ladung und die chemische Struktur des Markers, die Länge des spaltbaren Linkers und des Linker-Rests sowie auch die Wahl der Polymerase eine wichtige Rolle. Sie bestimmen gemeinsam, ob das markierte NT^* durch die Polymerase in die wachsende Nukleinsäurekette eingebaut wird, und ob dadurch der Einbau des nächsten markierten NT^* verhindert wird.

Ähnlich wie bei Austausch von eingesetzten Nukleotidmodifikationen können auch eingesetzte Polymerasen mit dem Fortschritt der Sequenzierung ausgetauscht werden.

So beispielsweise können die ersten 10% von Zyklen mit einer Klenow-Polymerase durchgeführt werden, dann wird beispielsweise Sequenase 2 eingesetzt. Nach 50% aller Zyklen wird beispielsweise Vent Exo minus eingesetzt und für die letzten 20 % aller Zyklen wird Pwo-Polymerase eingesetzt. Der Austausch von Polymerasen kann auch nach einer festen Zykluszahl erfolgen. Beispielsweise können die ersten 10 Zyklen mit einer Klenow-Polymerase durchgeführt werden, dann kann beispielsweise Sequenase 2 eingesetzt werden. Nach weiteren 10 Zyklen wird beispielsweise Vent Exo minus eingesetzt und nach noch weiteren 20 Zyklen wird Pwo-Polymerase eingesetzt. Allgemein gesprochen startet man mit Polymerasen, die weniger tolerant zu modifikationen sind und mit der steigenden Zykluszahl, und somit mit dem steigenden Modifizierungsgrad der DNA, zu Polymerasen wechseld, die toleranter zu modifikationen sind. Unterschiede in Polymerasen bezüglich Nukleotidmodifikationen sind in Augustin et al. "Progress towards single-molecule sequencing: enzymatic synthesis of nucleotide-specifically labeled DNA". J Biotechnol 2001, v.86, 289–301.

Da mit dem Fortschritt der Sequenzierung auch die Länge des neu gebildeten Doppelstranges steigt, können auch die Reaktionsbedingungen mit dem Fortschritt der Sequenzierung geändert werden, beispielsweise kann die Temperatur angehoben werden.

Einsatz der Oberfläche:

Die Eigenschaft der Oberfläche, markierte und nicht markierte Nukleotide und Nukleinsäure nur im geringen Maß unspezifisch zu binden, sowie die Möglichkeit, an die erfindungsgemäße Oberfläche spezifisch Nukleinsäuren zu binden, bietet insgesamt einen großen Vorteil gegenüber den bestehenden Oberflächen und ermöglicht den Einsatz solcher Oberflächen in Biosensoren für die Durchführung von Experimenten mit markierten Komponenten wie z.B. als Substrat für DNA-Chip-Technologie ("DNA Microarrays" Ed. by D. Bowtell & J. Sambrook, 2003, CSHL Press, ISBN: 0-87969-625-7). Insbesondere eignet sich die erfindungsgemäße Oberfläche der festen Phase für Analysenverfahren mit Einbau von markierten Nukleotiden in die an eine festen Phase gekoppelten Nukleinsäuren, wie beispielsweise Minisequencing (Suomalainen A et al. Methods Mol Biol. 2003;226:361–6. Liljedahl U et al. Pharmacogenetics. 2003 Jan;13(1):7–17, Olsson C et al. Methods Mol Biol. 2003;212:167–76), Primer-Extension (Pirrung MC et al. Bioorg Med Chem Lett. 2001 Sep 17;11(18):2437–40, Cai H, et al. Genomics. 2000 Jun 1;66(2):135–43., Kurg A et al. Genet Test. 2000;4(1):1–7., Pastinen T et al. Genome Res. 1997 Jun;7(6):606–14). US Pat. Nr. 6287766, US Pat. Nr. 2003148284, US Pat. Nr. 2003082613, EP 1256632 , WO 0194639. Single-Molecular-Sequencing (Tcherkassov WO 02088382, Seeger WO 0018956, Kartalov WO 02072892).

Im weiteren wird der Einsatz einer solchen Oberfläche am Bespiel der hochparallelen Sequenzierung einzelner Nukleinsäuremoleküle dargestellt.

Material

Die erfindungsgemäße Oberfläche stellt die Oberfläche einer festen Phase dar. Die feste Phase besteht vorzugsweise aus SiO₂ (Silica) als Hauptkomponente. Dabei kann Silica als Glas oder Quarz vorliegen.

In einer Ausführungsform liegt der Anteil des SiO₂ in der festen Phase zwischen 10 und 50%. In einer anderen Ausführungsform besteht die feste Phase zu über 50% aus SiO₂, in einer anderen Ausführungsform besteht die feste Phase zu über 70% aus SiO₂, in einer anderen Ausführungsform besteht die feste Phase zu über 90% aus SiO₂, in einer anderen Ausführungsform besteht die feste Phase zu über 95% aus SiO₂, in einer anderen Ausführungsform besteht die feste Phase zu über 99% aus SiO₂.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung besteht die feste Phase aus Silizium, wobei die Oberfläche der festen Phase eine Schicht von SiO₂ aufweist. Die chemischen Modifikationen, die in dieser Anmeldung beschrieben werden, beziehen sich auf die Veränderungen und Modifikationen dieser SiO₂-Schicht.

Im weiteren dient Glas als Beispiel für die feste Phase, die eine SiO₂-Obefläche aufweist. Es können verschiedene Glas-Arten verwendet werden, beispielsweise Borosilikat-Glas. Das geeignete Material ist kommerziell erhältlich, beispielsweise Menzel-Deckgläser und Objektträger (Omnilab-Laborzentrum GmbH, Bremen, Deutschland). Vorzugsweise weist das Material der festen Phase nur wenige oder keine fluoreszierenden Komponenten auf.

In einer Ausführungsform ist die Oberfläche der festen Phase plan.

In einer weiteren Ausführungsform ist die feste Phase für die elektromagnetische Strahlung in folgenden Bereichen transparent: 200 nm bis 500 nm, 200 nm bis 800 nm, 400 nm bis 700 nm, 400 nm bis 1000 nm, 500 nm bis 2000 nm.

In einer Ausführungsform wird nur die feste Phase als Material im Herstellungsprozess verwendet. Die Einbindung der Oberfläche der festen Phase in eine Vorrichtung zum Austausch der Lösungen, z.B. in ein Reagenzgefäßes oder eine Mikrokanalvorrichtung, erfolgt dementsprechend erst nach der Herstellung der erfindungsgemäßen Oberfläche.

In einer anderen Ausführungsform stellt die feste Phase einen Bestandteil eines Reagenzgefäßes, einer Mikrokanalvorrichtung oder eines Arrays von Reagenzgefäßen, beispielsweise einer Mikrotiterplatte, dar und die Herstellung der Oberfläche erfolgt direkt in einem solchen Reagenzgefäß oder Mikrokanal. Unterschiedliche Gestaltungsmöglichkeiten für Mikroflüssigkeitskanäle sind dem Fachmann bekannt (z.B. "Integrated microfabicated biodevices" 2002 ISBN 0-8247-0606-4).

In einer anderen Ausführungsform können einzelne Schritte der Herstellung der Oberfläche auf unterschiedlichen Stadien des Zusammenbaus von Reagenzgefäßen und Mikrokanalvorrichtungen erfolgen.

In einer weiteren Ausführungsform schließt eine Mikrokanalvorrichtung zwei oder mehr getrennte Bestandteile ein, die die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Oberfläche der festen Phase aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform ist eine Schutzschicht (eine Maske) auf der Oberfläche der festen Phase aufgetragen, so dass die Bearbeitungsprozesse nur bestimmte Areale der festen Phase betreffen. Diese Maske kann beispielsweise aus einem photosensitiven Material bestehen und anschließend durch Lichteinwirkung entfernt werden. Beispiele solcher Masken sind dem Fachmann bekannt.

Herstellung, allgemein:

Die Herstellung einer Oberfläche für die Verfahren zur hochparallelen Sequenzierung einzelner Nukleinsäureketten beinhaltet im wesentlichen eine Kombination aus einem Abtragungsschritt der Außenschicht der festen Phase durch eine chemische oder physikalische Einwirkung und einer Kopplung von Nukleinsäuren an diese Oberfläche.

Die Abtragung der Außenschicht der festen Phase führt zu einer drastischen Senkung der unspezifischen Bindung von Nukleotiden und Nukleinsäuren an die neu entstandene Oberfläche der festen Phase, s. Beispiel 1. Nach der Abtragung der Außenschicht entsteht eine Oberfläche der festen Phase, die in dieser Anmeldung als "regenerierte Oberfläche" bezeichnet wird.

Die Herstellung der Oberfläche schließt in einer Ausführungsform folgende wesentliche Schritte ein:

1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase, wobei eine regenerierte Oberfläche der festen Phase entsteht, die eine SiO₂ Oberfläche ist.
2. Kopplung bzw. Synthese von Nukleinsäureketten an die regenerierte Oberfläche der festen Phase
3. gegebenenfalls Kopplung weiterer Substanzen

1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase, wobei eine regenerierte Oberfläche der festen Phase entsteht, die eine SiO₂ Oberfläche ist.
2. Kopplung bzw. Synthese einer Linker-Komponente an die regenerierte Oberfläche der festen Phase,
3. Kopplung bzw. Synthese von Nukleinsäureketten an die/an der Linker-Komponente.
4. gegebenenfalls Kopplung weiterer Substanzen

Die Entfernung der Außenschicht erfolgt durch chemische Reaktion in einer wässrigen oder wässrig-organischen Lösung. In einer Ausführungsform wird die regenerierte Oberfläche im weiteren Verlauf des Herstellungs- und der Analyseprozesses nicht ausgetrocknet. Diese Schritte können in einen Herstellungsprozess integriert werden, der auch weitere Schritte zur Bearbeitung der Oberfläche einschließt.

An die regenerierte Oberfläche der festen Phase können unterschiedliche Substanzen gekoppelt werden. Viele Beispiele für die Kopplungen an eine Glas- oder SiO₂-oberfläche sind bekannt ("Silane Coupling Agents" 2. Ed. 1991, ISBNO-306-43473-3, "DNA Microarrays", Bowtell, 2003, ISBN 0-87969-624-9, "Microarray-Biochip Technology" M Schena, 2000, ISBN 1-881299-37-6, Kumar et al. Nucleic Acid Research, 2000 v. 28, e71, Guo et al. Nucleic Acid Research, 1994 v. 22, 5456-, Lindroos et al. Nucleic Acid Research, 2001 v. 29, Nr. 13, e69, Taylor et al. Nucleic Acid Research, 2003 v. 31, e87,).

In einer Ausführungsform werden Substanzen, beispielsweise Nukleinsäureketten oder deren Bausteine, Nukleotide, Proteine, wie Streptavidin oder Antikörper, lineare und verzweigte Polymere, wie PEG, Polyphosphate, Polyacrylate, Polyacrylamide (vernetzt und nicht vernetzt), Dendrimere direkt an die Oberfläche gekoppelt werden.

In einer weiteren Ausführungsform können Linker-Moleküle zwischen den oben genannten Substanzen und der regenerierten Oberfläche eingeführt werden. Diese Linker können reaktive Gruppen tragen, die zur Kopplung von Substanzen dienen, wie beispielsweise Epoxy-, Aldehyd-, Carboxy-Gruppen ("Silane Coupling Agents" 2. Ed. 1991, ISBNO-306-43473-3, "DNA Microarrays", Bowtell, 2003, ISBN 0-87969-624-9, "Microarray-Biochip Technology" M Schena, 2000, ISBN 1-881299-37-6, Kumar et al. Nucleic Acid Research, 2000 v. 28, e71, Guo et al. Nucleic Acid Research, 1994 v. 22, 5456-, Lindroos et al. Nucleic Acid Research, 2001 v. 29, Nr. 13, e69, Taylor et al. Nucleic Acid Research, 2003 v. 31, e87,).

An die regenerierte Oberfläche können einheitliche Substanzpopulationen, wie beispielsweise einheitliche Proteinmoleküle, z.B. Streptavidin, oder einheitliche Nukleinsäurepopulationen, wie beispielsweise Oligo-Nukleotide oder PCR-Produkte, als auch gemischte Populationen von Molekülen, wie beispielsweise cDNA, fragmentierte genomische DNA, gebunden werden.

An die Oberfläche können gleichzeitig oder nacheinander auch unterschiedliche Substanzklassen gebunden werden, beispielsweise Proteine, Nukleinsäuren, Polymere wie PEG, Polyacrylamid, Polyphosphate.

Überraschenderweise weist die erfindungsgemäße Oberfläche trotz weiterer Modifikationen generell ein sehr schwaches unspezifisches Bindungsverhalten gegenüber unterschiedlichen markierten Nukleotiden und Nukleinsäureketten. Dieses Verhalten wurde in mehreren, in der molekularen Biologie und Biochemie gebräuchlichen Puffer-Systemen, wie beispielsweise Tris-HCl, Phosphat-Puffer und Borat-Puffer über weite pH-Bereiche, vorzugsweise zwischen 7 und 11, und Konzentrationsbereiche von Puffer-Substanzen nachgewiesen. Die Konzentration der Puffer-Lösungen liegt vorzugsweise in folgenden Breichen: zwischen 5 und 50 mmol/l, zwischen 20 und 200 mmol/l, zwischen 100 und 1000 mmol/l.

Im weiteren wird die Kopplung von Nukleinsäureketten an die regenerierte Oberfläche genauer betrachtet und dient als Beispiel für weitere Kopplungsmöglichkeiten anderer Substanzen.

Die Kopplung von Nukleinsäuren erfolgt vorzugsweise kovalent oder affin. Viele Kopplungsmethoden für kovalente Kopplungen sind dem Fachmann bekannt ("Silane Coupling Agents" 2. Ed. 1991, ISBNO-306-43473-3, "DNA Microarrays", Bowtell, 2003, ISBN 0-87969-624-9, "Microarray-Biochip Technology" M Schena, 2000, ISBN 1-881299-37-6, Kumar et al. Nucleic Acid Research, 2000 v. 28, e71, Guo et al. Nucleic Acid Research, 1994 v. 22, 5456-, Lindroos et al. Nucleic Acid Research, 2001 v. 29, Nr. 13, e69, Taylor et al. Nucleic Acid Research, 2003 v. 31, e87,). Beispiele für affine Kopplungen sind Kopplungen über Biotin-Streptavidin-Bindunen oder Kopplung durch Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuresträngen. Nukleinsäureketten können auch direkt an der Oberfläche synthetisiert werden (Capaldi et al., 2000; Damha et al., 1990; Devivar et al., 1999; Habus et al., 1998; Pon, 1993; Pon et al., 1988; Sinha, 1993; Song et al., 2003; Veiko et al., 1991; Vu et al., 1990) oder (US Pat. Nr. 5753788, US Pat. Nr. 5831070, US Pat. Nr. 5919523, US Pat. Nr. 6022963, US Pat. Nr. 6147205, US Pat. Nr. 6153743, US Pat. Nr. 6262216, US Pat. Nr. 6310189, US Pat. Nr. 6480324, US Pat. Nr. 6486287).

In einer Ausführungsform kann die Kopplung von Nukleinsäureketten in einer bestimmten Anordnung erfolgen. In einer anderen Ausführungsform werden Nukleinsäuren in zufälliger Weise an die Oberfläche gebunden (WO 02088382).

An der erfindungsgemäßen Oberfläche können in unterschiedlichen Stadien der Herstellung Muster (z.B. Justierungsmuster oder "Landmarker", WO 02088382, WO 03031947) aufgebracht werden. Beispielsweise können Mikroteilchen mit einem Durchmesser von wenigen Mikrometern an die Oberfläche gebunden werden. Diese Teilchen binden vorzugsweise markierte Nukleotide oder Nukleinsäuren nicht.

In einer bevorzugten Ausführungsform können diese Teilchen sichtbar gemacht werden. Beispielsweise absorbieren diese Teilchen elektromagnetische Strahlung einer bestimmten Wellenlänge oder besitzen Fluoreszenzeigenschaften. In einer weiteren Ausführungsform können sie durch Lichtstreuung sichtbar gemacht werden. Beispiel für solche Teilchen stellen Tusche-Partikel oder auch Polysterene-Kügelchen dar.

Die erfindungsgemäße Oberfläche wurde für die Analysen entwickelt, bei denen markierte Nukleotide oder Nukleinsäureketten verwendet werden. Diese Komponenten tragen in Puffer-Lösungen in der Regel eine negative Ladung und können durch elektrostatische Bindung an unterschiedliche Oberflächen binden. Aus diesem Grund ist es nicht vorteilhaft, an die erfindungsgemäße Oberfläche positive Ladungen aufzubringen. Beispielsweise kann eine Kopplung von Amino-Gruppen an die Oberfläche zu Entstehung von positiven Ladungen beitragen. Solche Behandlungen der Oberfläche sind nicht vorteilhaft. Beispielsweise führen Behandlungen mit Aminopropyl-trimethoxysilane oder Polylysin zu einer starken Bindung von Nukleinsäuren und Nukleotiden an die Oberfläche.

3. Beispiele:

Beispiele sollten zur Anschaulichkeit der Erfindung dienen und nicht zu Einschränkung. Zunächst wird die Herstellung der festen Phase dargestellt, anschließend werden Beispiele für Sequenzierung angegeben.

Die Herstellung der Oberflächen wird am Beispiel der im Handel erhältlichen Deckglasern und Objektträgern für Mikroskopie gezeigt. Diese Gläser sind normalerweise vorgereinigt und können in trockenem Zustand erhalten werden (Menzel Deckgläser und Objektträger, von Omnilab-Laborzentrum, Bremen, Deutschland).

Die feste Phase, die als Material zur Herstellung der Oberfläche diente, wurde als ein Teil eines Reagenzgefäßes eingesetzt. Das Reagenzgefäß lag in einer Ausführung als Mikroflüssigkeitskanal vor. In einer anderen Ausführung wurden Mikrotiterplatten mit einem planen Glasboden (z.B. Firma Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland oder Molecular Machines & Industries GmbH, Glattburg, Schweitz) verwendet. Die Ergebnisse der Herstellung der Oberfläche waren in beiden Typen der Reagenzgefäße im wesentlichen ähnlich. Die Beispiele werden für die Oberfläche der festen Phase dargestellt, die als Teil eines Mikroflüssigkeitskanals diente.

Mikroflüssigkeitskanal (MFC)

Die Mikroflüssigkeitskanäle (3a) wurden wie folgt zusammengebaut: Aus Parafilm (Merck, Darmstadt) wird eine Maske ausgeschnitten. Diese Maske wird faltenfrei auf einen Objektträger gelegt. Der Objektträger (Menzel) mit der Maske wird auf 130°C 30 sec erhitzt, was zum Schmelzen des Parafilms führt, und anschließend auf RT abgekühlt, was zum Erstarren des Parafilms führt. Auf die Maske wird das Deckglas (Menzel) gelegt und leicht angedrückt. Der Objekträger mit der Maske und dem Deckglas wird nun auf 120°C erhitzt, was erneut zum Schmelzen des Parafilms führt. Auf diese Weise werden Objektträger und das Deckglas miteinander verbunden, wobei in der Mitte ein Mikrokanal entsteht mit einer konstanten Höhe von ca. 0,2 mm. Durch den Mikrokanal erfolgt der Austausch von Lösungen (3b). Das Volumen des Mikrokanals beträgt 10 μl.

Im Mikroflüssigkeitskanal kann die Flüssigkeit ausgetauscht werden. Durch diesen Austausch können verschiedene Reagenzien als Lösungen in Kontakt mit der festen Phase gebraucht werden und in sequentiellen Schritten ausgetauscht werden. Bei Bedarf wurde ein Mikrokanal mehrmals gewaschen, indem ein größeres Gesamtvolumen einer Lösung durch den Mikrokanal ausgetauscht wurde.

Detektion:

Der prinzipielle Aufbau der verwendeten Apparatur für die Einzelmolekülmikroskopie ist schematisch in 4a erläutert und ist in Patentanmeldungen WO 03031947, WO 02088382 ausführlich dargestellt.

In dieser Arbeit wurde ein Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop Axioplan 2 (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) mit Quecksilberdampflampe HBO 100, Objektiv Planneofluar 100x, NA 1.4 (Zeiss), Kamera AxioCam (Zeiss) und Computer mit Software zur Steuerung und Analyse verwendet. Bilder werden von der Oberfläche aufgenommen, wie in 4b gezeigt. Expositionszeit war 7 sec. Jedes Bild gibt die zweidimensionale Verteilung der Signale, die vom CCD-Chip (1388 × 1040 Pixel) der Kamera aufgenommen wurden, wieder. Dabei stellt eine Aufnahme einen Bereich von 60 μm × 80 μm der Oberfläche dar. Die Signale von einzelnen Molekülen hoben sich vom Hintergrundrauschen ab (5). Ihr apparenter Durchmesser betrug ca. 6 Pixel oder etwa 300 nm. Die Gesamtauflösung des System betrug 0,3 μm.

An die Oberfläche der festen Phase wurde ein Justiermuster oder Landmarker aufgebracht. Beispielsweise wurde eine verdünnte Tusche-Lösung (Pelickan AG, Hannover, Deutschland) in Phosphat-Puffer in Kontakt mit der Oberfläche gebracht. Die Tusche-Teilchen (ihr apparenter Durchmesser ca. 0,3 bis 2 μm) banden an die Oberfläche und konnten mit Mikroskop (z.B. mit Durchlicht) sichtbar gemacht werden. Die Bindung der Tusche-Teilchen erfolgte an zufälligen Stellen der Oberfläche. Die Dichte der Bindung der Tusche kann variieren und lag beispielsweise bei 3 bis 100 Teilchen pro 100 μm², diese Teilchen sind als dunkle Bereiche auf den Fluoreszenzaufnahmen zu sehen, z.B. in 1A,B,C,D, 7A, 8A. Es entstand für jeden Bereich der Oberfläche spezifische Muster an Tusche-Teilchen. Da diese Teichen an die Oberfläche gebunden sind und ihre Position beibehalten, können sie zur Auffindung derselben Positionen und zur Justierung genutzt werden (WO 03031947, WO 02088382).

Bei weiterer Beschreibung der Verarbeitung der Oberfläche wird vorausgesetzt, dass grobe Verunreinigungen von der Oberfläche der festen Phase entfernt worden sind. Auch andere sowohl chemische, physikalische als auch mechanische Schritte können der Herstellung der erfindungsgemäßen Oberfläche vorangehen, mit der Einschränkung, dass sie die Herstellung der Oberfläche nicht beeinträchtigen.

In den folgenden Beispielen werden zunächst Varianten der Herstellung der Oberfläche dargestellt, anschließend werden funktionelle Tests beschrieben, die eine niedrige unspezifische Bindung von markierten Komponenten an die Oberfläche nachweisen. Im weiteren werden Beispiele der Nutzung der erfindungsgemäßen Oberflächen dargestellt.

Beispiel für einen Test-Ablauf.
Die regenerierte Oberfläche wird in Kontakt mit einer Puffer-Lösung gebraucht, die markierte Nukleotide, z.B. dUTP-Cy3, enthält. Nach einer Inkubationszeit von 5 min wird diese Lösung entfernt und die Oberfläche mit einer reinen Puffer-Lösung gewaschen. Danach wird die Oberfläche unter einem Fluoreszenzmikroskop auf die Anwesenheit der Signale von dUTP-Cy3 untersucht. Dabei wird eine Fläche von ca. 4800 μm² abgescannt und die Fluoreszenzsignale von einzelnen Molekülen durch ein Programm ausgezählt. Als Ergebnis wird der Mittelwert gebildet, der die Dichte der Signale pro 100 μm² repräsentiert.
Abtragung der Außenschicht der festen Phase, Bereitstellung einer regenerierten Oberfläche.
Beispiel 1.1:
10 μl einer frischen 1% wässriger HF-Lösung werden in den trockenen Mikrokanal eingeführt, nach 2 min bei RT wird HF-Lösung durch einen 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, ersetzt und der Kanal wird fünf mal mit diesem Puffer gewaschen. Die erste Kontrolle der unspezifischen Bindung von markierten Nukleotiden und Oligonukleotiden erfolgte unmittelbar nach dem Wasch-Schritt.
Kontrolle der unspezifischen Bindung
Folgende Tests werden zur Charakterisierung der unspezifischen Bindung verwendet:
Test 1.1
10 μl einer 1 μmol/l Lösung von dCTP-Cy3 (Amersham Bioscience, Freiburg, Deutschland) in 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, wird in den Kanal gegeben und 5 min lang bei RT inkubiert. Anschließen wird der Kanal fünf mal mit 50μl 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, gewaschen. Signale von den unspezifisch an die Oberfläche gebundenen Nukleotiden wurden unter dem Mikroskop analysiert.
Test 1.2
10 μl einer 1 μmol/l Lösung von dUTP-AA-SS-Cy3 (synthetisiert nach Vorschrift in WO 02088382, sieh 7f-1 und 7f-4, wobei die Aminogruppe am Linker mit einem Cy3-Farbstoff modifiziert ist, s. Beispiel 2 derselben Anmeldung) in 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, wird in den Kanal gegeben und 5 min lang bei RT inkubiert. Anschließen wird der Kanal fünf mal mit 50μl 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, gewaschen. Signale von den unspezifisch an die Oberfläche gebundenen Nukleotiden wurden unter dem Mikroskop analysiert.
Test 1.3
10 μl einer 1 μmol/l Lösung von jeweils einem markierten Oligonukleotid (Sequenz: s. Tabelle 19) in 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, wird in den Kanal gegeben und 5 min lang bei RT inkubiert. Anschließen wird der Kanal fünf mal mit 50μl 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, gewaschen. Signale von den unspezifisch an die Oberfläche gebundenen Oligonukleotiden wurden unter dem Mikroskop analysiert.
Test 1.4
10 μl einer 50 μmol/l Lösung von dUTP-Cy3 (Amersham Bioscience, Freiburg, Deutschland) in 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, wird in den Kanal gegeben und 5 min lang bei RT inkubiert. Anschließen wird der Kanal fünf mal mit 50μl 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, gewaschen. Signale von den unspezifisch an die Oberfläche gebundenen Nukleotiden wurden unter dem Mikroskop analysiert.
Ergebnisse:
Die Daten zur Bindung von markierten Substanzen an die Oberfläche sind in der Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9:
Behandlung der Oberfläche: wässrige HF-Lösung (v/v %)
Spalte A) Ergebnis des Tests 1.1:
dCTP-Cy3, 1μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm²,
Spalte B) Ergebnis des Tests 1.2:
dUTP-AA-SS-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm²,
Spalte C) Ergebnis des Tests 1.3:
Oligo-T7-19-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte D) Ergebnis des Tests 1.3:
Oligo-B1-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte E) Ergebnis des Tests 1.3:
Oligo-F1-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte F) Ergebnis des Tests 1.3:
Oligo-T40-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte G) Ergebnis des Tests 1.3:
Oligo-dA26-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte H) Ergebnis des Tests 1.3:
Oligo-2-TMR, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte I) Ergebnis des Tests 1.4:
dUTP-Cy3, 50 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Das Ergebnis zeigt eine sehr niedrige bis niedrige Bindung von markierten Substanzen an die Oberfläche. Die Konzentrationen von markierten Nukleotiden betrugen 1 μmol/l, da diese Konzentrationen in Analyse-Verfahren wie im Beispiel 6.1 und 6.2 verwendet werden. Die verwendete Detektionsapparatur ist für die Einzelmolekülanalysen geeignet und ist vergleichbar mit Apparatur für die Sequenzierung (WO 03031947). Die Konzentration 50 μmol/l von dUTP-Cy3 zeigt eine niedrige Bindung von markierten Komponenten auch bei höheren Konzentrationen.
Eine solche Dichte der unspezifisch gebundenen Signale erlaubt eine gute Unterscheidung individueller Signale von einzelnen Molekülen an der Oberfläche und führt zu einer geringeren Überlappung mit spezifischen Signalen (vergleiche Tabelle 1 bis 8).
Die Tests können unmittelbar nach einer HF-Behandlung oder auch nach einer gewissen Zeit durchgeführt werden. Wenn die Tests nach einer Zeit durchgeführt werden sollten, wird die regenerierte Oberfläche vorzugsweise nicht ausgetrocknet, sondern im Kontakt mit einer Lösung aufbewahrt. Die Test-Ergebnisse des Beispiels 1.1 können nach einem Monat Aufbewahrung in 50 mmol/l Tris-HCl, pH 8, RT, mit den Test 1.1, 1.2, 1.3 und 1.4 reproduziert werden.
Beispiel 1.2
Zur Anschaulichkeit der Auswirkung der Abtragung der Außenschicht durch die HF-Behandlung werden im folgenden Ergebnisse einer Oberflächenbehandlung durch eine Titrierungsreihe einer HF-Lösung vorgestellt. Die feste Phase wurde dabei mit unterschiedlichen Konzentrationen der HF-Lösung behandelt. Der Ablauf der Inkubation mit HF-Lösung und weitere Behandlung erfolgte ähnlich wie im Beispiel 1.1. In der Tabelle 10 sind Ergebnisse des Test 1.1 und 1.3 mit dem Oligo-T7-19-Cy3 nach Anwendung unterschiedlicher Konzentrationen von HF-Lösung dargestellt. Tabelle 10
Spalte A) wässrige HF-Lösung (v/v %)
Spalte B) dCTP-Cy3, 1μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte C) Oligo-T7-19-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Abtragung der äußeren Schicht der Glas-Phase durch die Behandlung der festen Phase mit HF-Lösung zu einer starken Reduzierung der Bindung von markierten Nukleotiden und Oligonukleotiden führt, verglichen mit einer nicht behandelter Oberfläche.
Durch die Einwirkung der HF-Lösung wird die Außenschicht der Glas-Phase abgetragen. Die Reduzierung der unspezifischen Bindung ist abhängig vom Ausmaß der Entfernung der äußeren Schicht, was in diesem Beispiel durch die Abhängigkeit von der Konzentration der HF-Lösung deutlich wird. Je intensiver die Einwirkung einer HF-Lösung ist (z.B. durch hohe Konzentration oder gesteigerte Temperatur oder durch Zufuhr frischer Lösung in den Kanal) desto größer ist die Dicke der abgetragenen Schicht.
Erfolgreiche Abtragung der Außenschicht der festen Phase im Sinne dieser Anmeldung wurde für folgende Konzentrationsbereiche der HF-Lösung nachgewiesen: 0,03 bis 0,1 v/v %, 0,1 bis 1 v/v %, 1 bis 10 v/v %, 4 bis 40 v/v %.
Vorzugsweise liegt die Dicke der abgetragenen Schicht in einem der folgenden Intervalle: von 1 nm bis 15 nm, 10 nm bis 100 nm, 50 nm bis 500 nm, 100 nm bis 1000 nm, 0,5 μm bis 5 μm, 1 μm bis 20 μm, 5 μm bis 100 μm, 20 μm bis 500 μm, 100 μm bis 2 mm.
Varianten der Behandlung:
Steigerung der Temperatur (z.B. bis zu 50°C), Verlängerung der Zeit des Kontaktes zwischen HF-Lösung und der festen Phase (z.B. bis zu mehreren Stunden), Zugabe von organischem Lösungsmittel (z.B. Ethanol oder DMF bis zu Konzentration von 50%), Zugabe anderer anorganischen Säuren (z.B. HCl, HNO₃ oder H₂SO₄) oder einer Puffernden Substanz wie NH₄F verändern nicht grundsätzlich die Eigenschaften der regenerierten Oberfläche, die durch die Einwirkung der HF-Lösung gewonnen wurden.
Die HF-Lösung kann auch erst nach einer anderen Lösung in Kontakt mit fester Phase gebracht werden. Beispielsweise kann die feste Phase erst mit wässrigen Lösungen von Salzen (z.B. NaCl), Puffern (wie z.B. Tris-HCl, Borat-Puffer) oder auch organischen Lösungsmittel (z.B. Ethanol, DMF, Acetonitril, Aceton) vorbehandelt werden und erst dann in Kontakt mit HF-Lösung gebracht werden. Dies ist insbesondere bei Herstellung von Mikro- und Nano-Flüssigkeitsvorrichtungen vom Interesse, da unterschiedliche Teile der Vorrichtung unterschiedliche Vorbehandlung benötigen können.
Varianten der OF-Tests
Ähnlich wie in Test 1.1, 1.2 und 1.4 können auch weitere Modifikationen von Nukleotiden eingesetzt werden. Es können kommerziell erhältliche Nukleotide mit unterschiedlichen Farbstoffen, wie beispielsweise dUTP-Fluorescein, dUTP-TAMRA (NEN, Perkin Elmer Inc. ), dUTP-Alexa 555 (Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherland) verwendet werden. Auch spaltbare Nukleotide synthetisiert wie im Beispiel 7 können eingesetzt werden.
Die Konzentration der Nukleotide liegt bei solchen Tests vorzugsweise in folgenden Bereichen: 0,1 und 1 μmol/l, 1 und 10 μmol/l, 10 und 100 μmol/l.
Aus dem dargestellten Beispielen folgt, dass die HF-Behandlung der Oberfläche die unspezifische Bindung von Nukleotiden und Oligonukleotiden an die Oberfläche stark herabsetzt. Diese Eigenschaft ist essentiell für Analysemethoden, die auf dem Nachweis der Signale von einzelnen Molekülen beruhen.
Die feste Phase, die auf diese Weise hergestellt ist, enthält auf der Oberfläche Si-OH-Gruppen, an die weitere chemische Kopplungen vorgenommen werden können. Beispielsweise lassen sich Nukleinsäureketten an die regenerierte Oberfläche koppeln.
Beispiel 2.1:
10 μl einer frischen 5 M NaOH-Lösung werden in den trockenen Mikrokanal eingeführt, nach 2 Std bei RT wird 5 M NaOH-Lösung durch einen 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, ersetzt und der Kanal wird fünf mal mit diesem Puffer gewaschen. Die erste Kontrolle der unspezifischen Bindung von markierten Nukleotiden und Oligonukleotiden erfolgte unmittelbar nach dem Wasch-Schritt.
Kontrolle der unspezifischen Bindung:
Test 1.1
10 μl einer 1 μmol/l Lösung von dCTP-Cy3 (Amersham Bioscience, Freiburg, Deutschland) in 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, wird in den Kanal gegeben und 5 min lang bei RT inkubiert. Anschließen wird der Kanal fünf mal mit 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, gewaschen.
Test 1.3
10 μl einer 1 μmol/l Lösung von Oligo T7-19-Cy3 (Sequenz: Tabelle 19) in 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, wird in den Kanal gegeben und 5 min lang bei RT inkubiert. Anschließen wird der Kanal fünf mal mit 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0, gewaschen.
Ergebnisse:
Die Bindung von markierten Substanzen an die Oberfläche ist in der Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11:
Behandlung: 5 mol/l wässrige NaOH-Lösung
Spalte A) dCTP-Cy3, 1μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte B) Oligo-T7-19-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Das Ergebnis zeigt eine sehr niedrige Bindung von markierten Substanzen an die Oberfläche. Die Konzentrationen von markierten Nukleotiden betrugen 1μmol/l, da diese Konzentrationen in Analyse-Verfahren wie im Beispiel 6.1 verwendet werden.
Eine solche Dichte der unspezifisch gebundenen Signale erlaubt eine gute Unterscheidung individueller Signale von einzelnen Molekülen an der Oberfläche, s. Tabelle 1 bis 8 und führt zu einer geringeren Überlappung mit spezifischen Signalen.
Beispiel 2.2
Zur Anschaulichkeit der Auswirkung der Abtragung der Außenschicht durch die NaOH-Behandlung werden im folgenden Ergebnisse einer Titrierungsreihe vorgestellt. Die feste Phase wurde dabei mit unterschiedlichen Konzentrationen der NaOH-Lösung behandelt. Der Ablauf der Titrierung und weitere Behandlung erfolgte ähnlich wie im Beispiel 2.1. In der Tabelle 12 sind Ergebnisse des Test 1.1 und 1.3 dargestellt. Kontrolle der unspezifischen Bindung: Tabelle 12
Spalte A) wässrige NaOH-Lösung, Angabe für mol/l
Spalte B) dCTP-Cy3, 1μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte C) Oligo-T7-19-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Steigerung der Temperatur bis zu 50°C, Verlängerung der Zeit des Kontaktes zwischen NaOH-Lösung und der Glas-Phase bis zu mehreren Stunden, Zugabe von organischen Lösungsmittel wie Ethanol oder DMF bis zu Konzentration von 50%, verändern nicht grundsätzlich die Eigenschaften der Oberfläche, die durch die Einwirkung der NaOH-Lösung entstanden ist.
Durch die Einwirkung der NaOH-Lösung wird die Außenschicht der Glas-Phase abgetragen. Je intensiver die Einwirkung der NaOH-Lösung ist (z.B. durch hohe Konzentration oder gesteigerte Temperatur oder durch Zufuhr frischer Lösung in den Kanal) desto größer ist die abgetragene Schicht.
Vorzugsweise liegt die Dicke der abgetragenen Schicht in einem der Interwale von 1 nm und 15 nm, 10 nm und 100 nm, 50 nm und 500 nm, 100 nm und 1000 nm, 0,5 μm und 5 μm, 1 μm und 20 μm, 5 μm und 100 μm, 20 μm und 500 μm, 100 μm und 2 mm.
Die NaOH-Lösung kann auch erst nach einer anderen Lösung in Kontakt mit fester Phase gebracht werden. Beispielsweise kann die feste Phase erst mit wässrigen Lösungen von Salzen (z.B. NaCl), Puffern (wie Tris-HCl, Borat-Puffer) oder auch organischen Lösungsmittel (z.B. Ethanol, DMF, Acetonitril) vorbehandelt werden und erst dann in Kontakt mit NaOH-Lösung gebracht werden. Dies ist insbesondere bei Herstellung von Mikro- und Nano-Flüssigkeitsvorrichtungen vom Interesse, da unterschiedliche Teile der Vorrichtung unterschiedliche Vorbehandlung benötigen können.
Die im Beispiel 1 und 2 beschriebenen Methoden eignen sich zur Herstellung von festen Phasen mit einer Oberfläche mit geringer unspezifischer Bindung von markierten Nukleotiden.
Die feste Phase, die auf diese Weise hergestellt ist, enthält auf der Oberfläche Si-OH-Gruppen, an die weitere chemische Kopplungen vorgenommen werden können. Beispielsweise lassen sich Nukleinsäureketten an die regenerierte Oberfläche koppeln.
Beispiel 3: Aufbewahrung der regenerierten festen Phase
Die im Beispiel 1 und 2 erhaltene regenerierte Oberfläche der festen Phase kann mehrere Monate lang bedeckt mit einer Lösung ihre Eigenschaft der geringen unspezifischen Bindung von markierten Substanzen, beibehalten. Zur Aufbewahrung der festen Phase mit einer regenerierten Oberfläche eigenen sich beispielsweise wässrige Salz-Lösungen (z.B. NaCl bis zu 1 mol/l), Puffer-Lösungen (z.B. Tris-HCl Puffer, pH 7.0–9.0, Borat-Puffer, pH 8.0–10.0 und viele andere gebräuchliche Puffer wie Acetat-, Phosphat-, Glycin-Puffer), wässrige Lösungen mit einem organischen Lösungsmittel (wie z.B. ethanolische Lösungen, Gemische aus Wasser und DMF oder Acetonitril), wässrige Lösungen mit organischen Zusätzen wie Glycerol oder Glukose, organische Lösungsmittel wie Ethanol, DMF, DMSO, Methanol und andere. Zum Verhindern des bakteriellen Wachstum kann NaN₃ zugegeben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die feste Phase mit einer regenerierten Oberfläche während alle nachfolgenden Behandlungsschritte nicht ausgetrocknet und zu keinem Zeitpunkt einen direkten Kontakt mit Luft hat. Die Aufbewahrung der frisch regenerierten Oberfläche erfolgt im Kontakt mit einer Lösung, beispielsweise mit Wasser oder einer anderen Lösung, die oben beschrieben wurde. Alle weiteren modifizierenden Schritte bei der Herstellung erfolgen durch einen Lösungsaustausch.
In einer anderen Ausführungsform wird die regenerierte Oberfläche durch eine der folgenden Prozeduren getrocknet:
Prozedur A:

1) die im Kontakt mit der Oberfläche stehende wässrige Salz- oder Puffer-Lösung wird durch reines Wasser ersetzt, wobei alle Salze durch mehrmaliges Waschen entfernt werden.
2) das Wasser wird durch ein Gemisch aus einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln und Wasser ersetzt. Als organische Lösungsmittel können eins oder mehrere mit Wasser mischbare Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol, Aceton eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Gemisch Wasser-Ethanol 50:50 eingesetzt werden.
3) Hauptmasse des Gemischs wird entfernt und die Reste des Gemischs werden langsam von der Oberfläche verdampft (z.B. im Vakuum).

Prozedur B:

1) die im Kontakt mit der Oberfläche stehende wässrige Salz- oder Puffer-Lösung wird direkt durch ein Gemisch aus einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln und Wasser ersetzt. Als organische Lösungsmittel können eins oder mehrere mit Wasser mischbare Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol, Aceton eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Gemisch Wasser-Ethanol 50:50 eingesetzt werden.
2) Hauptmasse des Gemischs wird entfernt und die Reste des Gemischs werden langsam von der Oberfläche verdampft (z.B. im Vakuum).

Prozedur C:

1) die im Kontakt mit der Oberfläche stehende wässrige Salz- oder Puffer-Lösung wird direkt durch ein organisches Lösungsmitteln oder ein Gemisch aus mehreren organischen Lösungsmittel ersetzt. Als organische Lösungsmittel können eins oder mehrere mit Wasser mischbare Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol, Aceton eingesetzt werden.
2) Hauptmasse des Gemischs wird entfernt und die Reste des Gemischs werden langsam von der Oberfläche verdampft (z.B. im Vakuum).

Die frisch regenerierten Oberflächen, die ein Trocknungsschritt durchlaufen haben, weisen höhere unspezifische Bindung von markierten Nukleotiden auf, als die Oberflächen ohne Trocknungsschritt.
Aus diesem Grund werden alle nachfolgenden Behandlungsschritte nur für Oberflächen der festen Phase beschrieben, die nach dem Schritt der Abtragung der Außenschicht keinen Trocknungsschritt durchlaufen.
Beispiele für Fixierung von Nukleinsäuren
Beispiel 4.
Modifizierung der regenerierten Oberfläche mit einem reaktiven Linker
Modifizierung der unter Beispiel 1, 2 oder 3 erhaltenen regenerierten Oberflächen erfolgt beispielsweise mit Silylierungsreagentien. Viele Beispiele der Silica Modifizierung sind bekannt ("Silane Coupling Agents" 2. Ed. 1991, ISBNO-306-43473-3).
Beispiel 4.1 Modifizierung der Oberfläche mit Glycidyloxypropyl-Trimethoxisitan
Regenerierte Oberfläche der festen Phase stellt in diesem Beispiel einen Bestandteil eines Mikroflüssigkeitskanals dar.
Die regenerierte feste Phase wurde wie unter Beispiel 1.1 erhalten und ohne Austrocknung weiter wie folgt verarbeitet:

1. Puffer-Lösung im Mikroflüssigkeitskanal wurde gegen reines Wasser (Biddest-Qualität) ausgetauscht: Der Mikrokanal mit der regenerierten Oberfläche der festen Phase wurde mit 200 μl Wasser gespült.
2. Das Wasser wurde gegen Aceton, 100%, ausgetauscht, indem der Mikrokanal mit 500 μl Aceton gewaschen wurde.
3. Glycidyloxypropyl-Trimethoxisilan, 100%, wurde in den Mikrokanal eingeführt, bis Aceton komplett ausgetauscht wurde (100 μl). Die Reaktion dauerte 1 h, bei RT.
4. Glycidyloxypropyl-Trimethoxisilan wurde durch Aceton, 100%, ausgetauscht, 1 ml.
5. Aceton wurde durch Wasser, 200 μl, ersetzt.

Auf diese Weise wurde regenerierte Oberfläche mit Epoxi-Gruppen aktiviert. An diese Oberfläche können nun unterschiedliche Substanzen gekoppelt werden.
Aceton kann beispielsweise durch ein anderes organisches Lösungsmittel ersetzt werden, beispielsweise Ethanol, DMAA, DMSO oder DMF.
Das Ausmaß der Modifikation der Oberfläche kann durch die Zeit, Konzentration der Reagenzien und Temperatur beeinflusst werden. Anstatt 100% Glycidyloxypropyl-Trimethoxisilan kann auch ein anderes Silylisrungsreagez oder auch ein Gemisch aus mehreren Silylierungsreagenzien eingesetzt werden. Dabei können unterschiedliche funktionelle Gruppen an die Oberfläche gekoppelt werden. Silylierungsreagenzien können in organischen Lösungsmitteln, wie DMAA, DMF, DMSO verdünnt werden. Es können auch wässrige Gemische verwendet werden. Die Zeit der Modifikation kann z.B. zwischen wenigen Minuten und mehreren Stunden liegen.
Durch Silylierungsreagentien können unterschiedliche reaktive Gruppen, beispielsweise Epoxi,- Carboxy-, Acryl-, Mercapto-, Aldehydgruppen, an die Oberfläche gekoppelt werden. Die Wahl einer entsprechenden Gruppe richtet sich nach Kompatibilität mit Reagenzien, die in späteren Schritten in Kontakt mit Oberfläche kommen.
Durch die Einführung einer Linker-Komponente mit einer aktiven Gruppe können weitere Modifikationen vorgenommen werden. Beispielsweise können weitere Linker angekoppelt werden.
In diesem Beispiel wurde die Oberfläche nach der Kopplung der Linker-Komponente nicht ausgetrocknet, sondern in einer Puffer-Lösung aufbewahrt bis zur Kopplung weiterer Substanzen.
Die Durchführung der Tests 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 zeigte, dass die unspezifische Bindung von Testsubstanzen an die Oberfläche sehr niedrig war und der Mittelwert der Dichte der Signale unter 10 pro 100 μm² lag.
Schlechtere Test-Ergebnisse wurden bei Modifizierung der Oberflächen durch Einführung von Amino-Gruppen erzielt. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu werden, wird angenommen, dass die mit Amino-Gruppen modifizierten Oberflächen in wässrigen Puffer-Lösungen positiv geladen sind (insbesondere bei pH-Werten um 9), was zu verstärkten unspezifischen Bindung von Nukleinsäureketten und Nukleotiden an die Oberfläche führt, das Ergebnis des Tests 1.1 (s. Beispiel 1.1) ergab mehr als 100 Signale pro 100 μm².
Beispiel 5
Spezifische Kopplung von Nukleinsäuren an die Oberfläche.
Die Bindung von Nukleinsäuren an die Oberfläche kann beispielsweise an einem der beiden Enden der Kette erfolgen oder über eine Gruppe, die an eines der Nukleotide innerhalb der Kette gekoppelt ist. Die kovalente Kopplung von Nukleinsäuren kann an die auf der Oberfläche gebundenen Linker oder auch direkt an die Glasoberfläche erfolgen. Die affine Bindung kann beispielsweise zwischen einem auf der Oberfläche fixierten Streptavidin und dem an die Nukleinsäure gebundenen Biotin erfolgen. Ein weiteres Beispiel für die affine Bindung von Nukleinsäuren stellt die Hybridisierung komplementärer Nukleinsäureketten an die auf der Oberfläche fixierte Nukleinsäuren dar. Im Folgenden werden Beispiele der kovalenten und affinen Kopplung der Nukleinsäureketten an die Oberfäche dargestellt.
Beispiel 5.1 kovalente Kopplung
5.1.1 Kovalente Kopplung von Nukleinsäureketten an die aktiven Gruppen eines Linkers an der Oberfläche
In diesem Beispiel enthielten die Nukleinsäureketten an der 3'-Position eine über einen Linker (6-Atome) gekoppelte Aminogruppe und an 5'-Position einen über einen Linker gekoppelten Fluoreszenz-Farbstoff. Die Aminogruppe kann beispielsweise an die Epoxi-Gruppe der Linker-Komponente der festen Phase gekoppelt werden. Der Nachweis der Kopplung der Nukleinsäurestränge an die Oberfläche erfolgte über die Detektion des an die Nukleinsäure gekoppelten Farbstoffs.
Die wie im Beispiel 4.1 erhaltene regenerierte und mit Epoxi-Gruppen aktivierte Oberfläche wurde direkt weiter verarbeitet:
Wasser wurde durch 10 μl 50 mmol/l Borat-Puffer pH 10.0 ausgetauscht und unmittelbar danach wurden 10 μl einer 30 μmol/l Lösung von Cy3-Oligo-dT31-NH₂ (Sequenz: Tabelle 18) in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 10, in den Kanal eingeführt. Die Reaktion dauerte 12 h bei RT. Danach wurde der Mikrokanal mit 100 μl 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, gewaschen.
Die dadurch erhaltene Oberfläche der festen Phase wurde auf Präsenz der Signale von markierten Nukleinsäuren überprüft. Das Ergebnis zeigte, dass die Nukleinsäurestränge an die Oberfläche in einer Dichte von 40 bis 200 Stränge/100μm² gekoppelt wurden. Durch die Variierung der Konzentration der Oligonukleotide mit Aminogruppen und/oder der Zeit und/oder Temperatur der Inkubation gelang es Nukleinsäurestränge auch in anderen Dichte an die Oberfläche zu binden. Es wurden folgende Bereiche der Dichten von Nukleinsäuresträngen pro 100 μm² erreicht: 10 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000.
5.1.2 Kovalente Kopplung von Nukleinsäureketten an die aktiven Gruppen eines Linkers an der Oberfläche
In diesem Beispiel enthielten die Nukleinsäureketten an der 3'-Position eine über einen Linker (6-Atone) gekoppelte Aminogruppe. Die 5'-Position der Nukleinsäurekette enthielt keinen Fluoreszenzfarbstoff. Die Aminogruppe kann an die Epoxi-Gruppe der Linker-Komponente der festen Phase gekoppelt werden. Der Nachweis der Kopplung erfolgte über Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotids, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert war. Die Detektion erfolgte durch den Nachweis der Signale von den hybridisierten Nukleinsäuresträngen.
Die wie im Beispiel 4.1 erhaltene regenerierte und mit Epoxi-Gruppen aktivierte Oberfläche wurde direkt weiter verarbeitet:
Wasser wurde durch 10 μl 50 mmol/l Borat-Puffer pH 10.0 ausgetauscht und unmittelbar danach wurden 10 μl einer 30 μmol/l Lösung von Oligo-dT31-NH₂ (Sequenz s. Tabelle 18) in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 10, in den Kanal eingeführt. Die Reaktion dauerte 12 h bei RT. Danach wurde der Mikrokanal mit 100 μl 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, gewaschen.
Auf diese Weise wurde eine Oberfläche erhalten, die kovalent fixierte Nukleinsäureketten trägt. Die Oberfläche wurde nicht ausgetrocknet. Sie konnte direkt weiter verwendet oder in einer Pufferlösung z.B. Phosphat-Puffer 50 mmol/l pH 8 aufbewahrt werden, bis die nächsten Schritte erfolgten.
Prüfung der Oberfläche:
Testen der unspezifischen Bindung an die feste Phase
Prüfung der unspezifischen Bindung der markierten Nukleotide und Oligonucleotide an die erhaltene Oberfläche (Test 1.1, 1.2, 1.3, 1.4) zeigte eine sehr geringe unspezifische Bindung an die Oberfläche. Die Dichte der Signale durch unspezifische Bindung lag unter 10 pro 100 μm². Tabelle 13
Spalte A) Ergebnis des Tests 1.1:
dCTP-Cy3, 1μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm²,
Spalte B) Ergebnis des Tests 1.2:
dUTP-AA-SS-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm²,
Spalte C) Ergebnis des Tests 1.3 (7A):
Oligo-T7-19-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte D) Ergebnis des Tests 1.4:
dUTP-Cy3, 50 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Testen der Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotides:
Die hier erhaltene Oberfläche der festen Phase wurde auf Präsenz der gekoppelten Nukleinsäureketten überprüft. Dafür wurden 10 μl einer 100 nmol/l Lösung mit Oligo-dA26-Cy3 (Sequenz s. Tabelle 18) in 50 mmol/l Tris-HCl, pH 9.0, für 5 min bei RT in Kontakt mit der Oberfläche gebracht. Anschließend wurde die Oberfläche mit 50 mmol/l Tris-HCl pH 9.0 gewaschen und es erfolgte die Detektion der Signale von hybridisierten Nukleinsäuren.
Das Ergebnis zeigte, dass die Nukleinsäurestränge an die Oberfläche in einer Dichte von 100 bis 200 Stränge/100 μm² gekoppelt wurden (7B).
Durch die Variierung der Konzentration der Oligonukleotide mit Aminogruppen und/oder der Zeit und/oder Temperatur der Inkubation bei der kovalenten Kopplung gelang es Nukleinsäurestränge auch in anderen Dichte an die Oberfläche zu binden. Es wurden folgende Bereiche der Dichten von Nukleinsäuresträngen pro 100 μm² erreicht: 10 bis 50, 50 bis 200, 100 bis 400, 200 bis 1000, 1000 bis 5000.
5.1.3 Kovalente Kopplung von Nukleinsäureketten an die aktiven Gruppen eines Linkers an der Oberfläche
In diesem Beispiel enthielten die Nukleinsäureketten an der 5'-Position eine über einen Linker (6-Atone) gekoppelte Aminogruppe. Die 3'-Position der Nukleinsäurekette war frei. Die Aminogruppe kann an die Epoxi-Gruppe der Linker-Komponente der festen Phase gekoppelt werden. Diese Nukleinsäureketten können als Primer verwendet werden. Der Nachweis der Kopplung erfolgte über Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotids, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert war. Die Detektion erfolgte durch den Nachweis der Signale von den hybridisierten Nukleinsäuresträngen.
Die wie im Beispiel 4.1 erhaltene regenerierte und mit Epoxi-Gruppen aktivierte Oberfläche wurde direkt weiter verarbeitet:
Wasser wurde durch 10 μl 50 mmol/l Borat-Puffer pH 10.0 ausgetauscht und unmittelbar danach wurden 10 μl einer 30 μmol/l Lösung von Oligo-dA50-NH₂ (Sequenz s. Tabelle 18) in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 10, in den Kanal eingeführt. Die Reaktion dauerte 12 h bei RT. Danach wurde der Mikrokanal mit 100 μl 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, gewaschen.
Auf diese Weise wurde eine Oberfläche erhalten, die kovalent fixierte Nukleinsäureketten trägt. Die Oberfläche wurde nicht ausgetrocknet. Sie konnte direkt weiter verwendet oder in einer Pufferlösung z.B. Phosphat-Puffer 50 mmol/l pH 8 aufbewahrt werden, bis die nächsten Schritte erfolgten.
Prüfung der Oberfläche:
Testen der unspezifischen Bindung an die feste Phase
Prüfung der unspezifischen Bindung der markierten Nukleotide und Oligonucleotide an die erhaltene Oberfläche (Test 1.1, 1.2, 1.3, 1.4) zeigte eine sehr geringe unspezifische Bindung an die Oberfläche. Die Dichte der Signale durch unspezifische Bindung lag unter 10 pro 100 μm².
Testen der Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotides:
Die dadurch erhaltene Oberfläche der festen Phase wurde auf Präsenz der gekoppelten Nukleinsäureketten überprüft. Dafür wurden 10 μl einer 100 nmol/l Lösung mit Oligo-dT30-Cy3 (s. Tabelle 18) 100 nmol/l in 50 mmol/l Tris-HCl, pH 9.0, für 5 min bei RT in Kontakt mit der Oberfläche gebracht. Anschließend wurde die Oberfläche mit 50 mmol/l Tris-HCl pH 9.0 gewaschen und es erfolgte die Detektion der Signale von hybridisierten Nukleinsäuren.
Das Ergebnis zeigte, dass die Nukleinsäurestränge an die Oberfläche in einer Dichte von 100 bis 400 Stränge/100μm² gekoppelt wurden.
Durch die Variierung der Konzentration der Oligonukleotide mit Aminogruppen und/oder der Zeit der Inkubation bei der kovalenten Kopplung gelang es Nukleinsäurestränge auch in anderen Dichten an die Oberfläche zu binden. Es wurden folgende Bereiche der Dichten von Nukleinsäuresträngen pro 100 μm² erreicht: 10 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 400, 200 bis 1000, 1000 bis 5000.
5.1.4 direkte kovalente Kopplung von Nukleinsäureketten an die Oberfläche
In diesem Beispiel enthielten die Nukleinsäureketten an der 3'-Position eine über einen Linker gekoppelte Trimethoxysilylgruppe. Solche Oligonukleotide können von der Firma Thermo Electron Corporation GmbH, Ulm, Deutschland, bezogen werden. Die 5'-Position der Nukleinsäurekette enthielt keinen Fluoreszenzfarbstoff. Der Nachweis der Kopplung erfolgte über Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotids, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert war. Die Detektion erfolgte durch den Nachweis der Signale von den hybridisierten Nukleinsäuresträngen.
Die wie im Beispiel 1.1 erhaltene Oberfläche wurde direkt weiter verarbeitet. Folgende Schritte wurden durchgeführt:

1. Puffer-Lösung im Mikroflüssigkeitskanal wurde gegen reines Wasser (Biddest-Qualität) ausgetauscht: Der Mikrokanal mit der regenerierten Oberfläche der festen Phase wurde mit 200 μl Wasser gespült.
2. Das Wasser wurde gegen Aceton, 100%, ausgetauscht, indem der Mikrokanal mit 500 μl Aceton gewaschen wurde.
3. 10 μl einer 0,5 μmol/l Lösung von Oligo-dT31-Si(O-Me)₃ (Sequenz s. Tabelle 18) in DMF wurden in den Mikrokanal gegeben. Die Reaktion verlief 30 min bei RT.
4. Der Mikrokanal wurde mit Aceton 100% 1ml gewaschen.
5. Aceton wurde durch Wasser (Biddest-Qualität) ersetzt (200 μl)
6. Eine Puffer-Lösung (50 mmol/l Phosphat-Puffer, pH 8,0) wurde in den Mikrokanal gegeben. In dieser Lösung wurde die feste Phase aufbewahrt.

Auf diese Weise wurde eine Oberfläche erhalten, die kovalent fixierte Nukleinsäureketten trägt. Die Oberfläche der festen Phase wurde nicht ausgetrocknet. Sie konnte direkt weiter verwendet oder in einer Pufferlösung z.B. Phosphat-Puffer 50 mmol/l pH 8 aufbewahrt werden, bis die nächsten Schritte erfolgten.
Aceton kann beispielsweise durch ein anderes organisches Lösungsmittel ersetzt werden, beispielsweise DMAA, DMSO oder DMF oder Acetonitril.
Das Ausmaß der Modifikation der Oberfläche kann durch die Zeit, Konzentration der Reagenzien und Temperatur beeinflusst werden. Anstatt einer Trimethoxysilyl-Gruppe kann auch ein anderes Silylisrungsreagez, gekoppelt an das Oligonucleotid verwendet werden. Oligonucleotide mit aktivierten Silyl-Gruppen können in organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise DMAA, DMF, DMSO oder Acetonitril verdünnt werden. Die Zeit der Modifikation kann z.B. zwischen wenigen Minuten und mehreren Stunden liegen. Die Wahl einer entsprechenden aktiven Silyl-Gruppe richtet sich nach Kompatibilität mit Reagenzien, die in späteren Schritten in Kontakt mit Oberfläche kommen.
Prüfung der Oberfläche:
Testen der unspezifischen Bindung an die feste Phase
Prüfung der unspezifischen Bindung der markierten Nukleotide und Oligonucleotide an die erhaltene Oberfläche (Test 1.1, 1.2, 1.3, 1.4) zeigte eine sehr geringe unspezifische Bindung an die Oberfläche. Die Dichte der Signale durch unspezifische Bindung lag unter 10 pro 100 μm². Tabelle 14
Spalte A) Ergebnis des Tests 1.1:
dCTP-Cy3, 1μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm²,
Spalte B) Ergebnis des Tests 1.2:
dUTP-AA-SS-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm²,
Spalte C) Ergebnis des Tests 1.3 (8A):
Oligo-T7-19-Cy3, 1 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Spalte D) Ergebnis des Tests 1.4:
dUTP-Cy3, 50 μmol/l, 5' RT, Mittelwert der gemessenen Signale auf einer Fläche von 100μm².
Testen der Hybridisierung eines komplementären Oligonucleotides:
Die dadurch erhaltene Oberfläche der festen Phase wurde auf Präsenz der gekoppelten Nukleinsäureketten überprüft. Dafür wurden 10 μl einer 100 nmol/l Lösung mit Oligo-dA26-Cy3 (Sequenz s. Tabelle 18) in 50 mmol/l Tris-HCl, pH 9.0, für 5 min bei RT in Kontakt mit der Oberfläche gebracht. Anschließend wurde die Oberfläche mit 50 mmol/l Tris-HCl pH 9.0 gewaschen und es erfolgte die Detektion der Signale von hybridisierten Nukleinsäuren.
Das Ergebnis zeigte, dass die Nukleinsäurestränge an die Oberfläche in einer Dichte zwischen 300 und 1000 Stränge/100μm² gekoppelt wurden (8B).
Durch die Variierung der Konzentration der Oligonukleotide mit reaktiven Silylgruppen und/oder der Zeit der Inkubation bei der kovalenten Kopplung gelang es, Nukleinsäurestränge auch in anderen Dichten an die Oberfläche zu binden. Es wurden folgende Bereiche der Dichten von Nukleinsäuresträngen pro 100 μm² erreicht: 10 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 400, 200 bis 1000, 1000 bis 5000.
5.1.5 direkte kovalente Kopplung von Nukleinsäureketten an die Oberfläche
In diesem Beispiel enthielten die Nukleinsäureketten an der 5'-Position eine über einen Linker gekoppelte Trimethoxysilylgruppe. Die 3'-Position der Nukleinsäurekette ist frei, so dass die Nukleinsäurekette als Primer dienen konnte. Der Nachweis der Kopplung erfolgte über Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotids, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert war. Die Detektion erfolgte durch den Nachweis der Signale von den hybridisierten Nukleinsäuresträngen.
Die in Beispiel 1.1 erhaltene Oberfläche wurde direkt weiter verarbeitet. Folgende Schritte wurden durchgeführt:

1. Puffer-Lösung im Mikroflüssigkeitskanal wurde gegen reines Wasser (Biddest-Qualität) ausgetauscht: Der Mikrokanal mit der regenerierten Oberfläche der festen Phase wurde mit 200 μl Wasser gespült.
2. Das Wasser wurde gegen Aceton, 100%, ausgetauscht, indem der Mikrokanal mit 500 μl Aceton gewaschen wurde.
3. 10 μl einer Lösung von Oligo-dA50-Si(O-Me)₃ (Sequenz s. Tabelle 18) 0,5 μmol/l in DMF wurden in den Mikrokanal gegeben. D e Reaktion verlief 30 min bei RT.
4. Der Mikrokanal wurde mit Aceton 100% 1ml gewaschen.
5. Aceton wurde durch Wasser (Biddest-Qualität) ersetzt (200 μl)
6. Eine Puffer-Lösung (50 mmol/l Phosphat-Puffer, pH 8,0) wurde in den Mikrokanal gegeben. In dieser Lösung wurde die feste Phase aufbewahrt.

Auf diese Weise wurde eine Oberfläche erhalten, die kovalent fixierte Nukleinsäureketten trägt.
Die Oberfläche der festen Phase wurde nicht ausgetrocknet. Sie konnte direkt weiter verwendet oder in einer Pufferlösung z.B. Phosphat-Puffer 50 mmol/l pH 8 aufbewahrt werden, bis die nächsten Schritte erfolgten.
Aceton kann beispielsweise durch ein anderes organisches Lösungsmittel ersetzt werden, beispielsweise DMAA, DMSO oder DMF oder Acetonitril.
Das Ausmaß der Modifikation der Oberfläche kann durch die Zeit, Konzentration der Reagenzien und Temperatur beeinflusst werden. Anstatt einer Trimethoxysilyl-Gruppe kann auch ein anderes Silylisrungsreagez, gekoppelt an das Oligonucleotid verwendet werden. Oligonucleotide mit aktivierten Silyl-Gruppen können in organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise DMAA, DMF, DMSO oder Acetonitril verdünnt werden. Es können auch wässrige Gemische verwendet werden. Die Zeit der Modifikation kann z.B. zwischen wenigen Minuten und mehreren Stunden liegen. Die Wahl einer entsprechenden aktiven Silyl-Gruppe richtet sich nach Kompatibilität mit Reagenzien, die in späteren Schritten in Kontakt mit Oberfläche kommen.
Prüfung der Oberfläche:
Testen der unspezifischen Bindung an die feste Phase:
Prüfung der unspezifischen Bindung der markierten Nukleotide und Oligonucleotide an die erhaltene Oberfläche (Test 1.1, 1.2, 1.3, 1.4) zeigte eine sehr geringe unspezifische Bindung an die Oberfläche. Die Dichte der Signale lag unter 10 pro 100 μm².
Testen der Hybridisierung eines komplementären Oligonucleotides:
Die dadurch erhaltene Oberfläche der festen Phase wurde auf Präsenz der gekoppelten Nukleinsäureketten überprüft. Dafür wurden 10 μl einer Lösung mit Oligo-dT30-Cy3 (Sequenz s. Tabelle 18) 1 nmol/l in 50 mmol/l Tris-HCl, pH 9.0, für 5 min bei RT in Kontakt mit der Oberfläche gebracht. Anschließend wurde die Oberfläche mit 50 mmol/l Tris-HCl pH 9.0 gewaschen und es erfolgte die Detektion der Signale von hybridisierten Nukleinsäuren.
Das Ergebnis zeigte, dass die Nukleinsäurestränge an die Oberfläche in einer Dichte von 200 bis 1000 Stränge/100μm² gekoppelt wurden.
Durch die Variierung der Konzentration der Oligonukleotide mit reaktiven Silylgruppen und/oder der Zeit und/oder der Temperatur der Inkubation bei der kovalenten Kopplung gelang es, Nukleinsäurestränge auch in anderen Dichten an die Oberfläche zu binden. Es wurden folgende Bereiche der Dichten von Nukleinsäuresträngen pro 100 μm² erreicht: 10 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000.
5.2 Affine Bindung von Nukleinsäureketten an die Oberfläche:
5.2.1 Bindung an das auf der Oberfläche fixierte Streptavidin
In diesem Beispiel wurde zunächst Streptavidin an die Oberfläche gekoppelt. Anschließend wurden die Nukleinsäureketten an das Streptavidin über Streptavidin-Biotin-Gruppe gebunden. Die Nukleinsäureketten trugen an der 5'-Position eine über einen Linker (TEG) gekoppelte Biotingruppe. Die 3'-Position der Nukleinsäurekette war frei. Diese Nukleinsäureketten können als Primer verwendet werden. Der Nachweis der Kopplung erfolgte über Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotids, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert war. Die Detektion erfolgte durch den Nachweis der Signale von den hybridisierten Nukleinsäuresträngen.
Die wie im Beispiel 4.1 erhaltene regenerierte und mit Epoxi-Gruppen aktivierte Oberfläche wurde direkt weiter verarbeitet:
Wasser wurde durch 10 μl 50 mmol/l Borat-Puffer pH 10.0 ausgetauscht und unmittelbar danach wurden 10 μl einer 1 μg/μl Lösung von Streptavidin in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 10, in den Kanal eingeführt. Die Reaktion dauerte 2 h bei RT. Danach wurde der Mikrokanal mit 100 μl 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, gewaschen. Anschließend wurden 10 μl einer 1 μmol/l Lösung von dT40-Biotin (Sequenz s. Tabelle 18) in Tris-HCl in den Mikrokanal gebracht und 5 min bei RT inkubiert. Danach wurde der Mikrokanal mit 200 μl 50 mmol/l Tris-HCl Puffer, pH 9.0 gewaschen.
Auf diese Weise wurde eine Oberfläche erhalten, die affin fixierte Nukleinsäureketten trägt. Die Oberfläche wurde nicht ausgetrocknet. Sie konnte direkt weiter verwendet oder in einer Pufferlösung z.B. Phosphat-Puffer 50 mmol/l pH 8 aufbewahrt werden, bis die nächsten Schritte erfolgten.
Prüfung der Oberfläche:
Testen der unspezifischen Bindung an die feste Phase:
Prüfung der unspezifischen Bindung der markierten Nukleotide und Oligonucleotide an die erhaltene Oberfläche (Test 1.1, 1.3, 1.4) zeigte eine sehr geringe unspezifische Bindung an die Oberfläche. Die Dichte der Signale lag unter 10 pro 100 μm².
Testen der Hybridisierung eines komplementären Oligonukleotides:
Die dadurch erhaltene Oberfläche der festen Phase wurde auf Präsenz der gekoppelten Nukleinsäureketten überprüft. Dafür wurden 10 μl einer 100 nmol/l Lösung mit Oligo-dA26-Cy3 (Sequenz s. Tabelle 18) in 50 mmol/l Tris-HCl, pH 9.0, für 5 min bei RT in Kontakt mit der Oberfläche gebracht. Anschließend wurde die Oberfläche mit 50 mmol/l Tris-HCl pH 9.0 gewaschen und es erfolgte die Detektion der Signale von hybridisierten Nukleinsäuren.
Das Ergebnis zeigte, dass die Nukleinsäurestränge an die Oberfläche in einer Dichte von 200 bis 1000 Stränge/100μm² gekoppelt wurden.
Durch die Variierung der Konzentration oder Zeit der Inkubaiton der Oligonukleotide mit Biotingruppen und/oder der Konzentration und/oder Zeit der Inkubation bei der kovalenten Kopplung von Streptavidin gelang es Nukleinsäurestränge auch in anderen Dichten an die Oberfläche zu binden. Es wurden folgende Bereiche der Dichten von Nukleinsäuresträngen pro 100 μm² erreicht: 10 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000.
Beispiel 6
Hier wird ein Beispiel für das erfindungsgemäße Verfahren dargestellt, bei dem die erfindungsgemäße Oberfläche eingesetzt werden kann.
6.1 Einbaureaktion von markierten Nukleotiden an den Nukleinsäure-Primer-Komplexen, die auf der Oberfläche gebunden sind.
Wie oben dargestellt, können Nukleinsäuren an die regenerierten Oberflächen der festen Phase gebunden werden, wobei sie spezifisch an Hybridisierungsreaktionen mit komplementären Oligonukleotiden teilnehmen und die unspezifische Bindung von markierten Komponenten wie Nukleinsäuren oder Nukleotiden sehr gering bleibt. In folgenden Beispielen wird dargestellt, dass die erfindungsgemäß hergestellte feste Phase für die Analysen von einzelnen Nukleinsäuremolekülen geeignet ist, wobei sie eine sehr geringe unspezifische Bindung von markierten Komponenten aufweist. Dabei werden zunächst extensionsfähige Nukleinsäureketten-Primer-Komplexe auf der Oberfläche gebildet. Anschließend wird eine zyklische Reaktion durchgeführt, die im wesentlichen folgende Schritte schließt:

a) Inkubation einer Lösung mit einer oder mehreren Polymerase und einem oder mehreren markierten Nukleotiden (Polymerase-Nukleotid-Gemisch) mit der festen Phase unter Bedingungen, die eine Einbaureaktion an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen zulassen,
b) Waschen der festen Phase
c) Detektion der Signale von eingebauten markierten Nukleotiden, wobei relative Koordinaten einzelne Signale identifiziert werden
d) Entfernung der Signale von eingebauten Nukleotiden,
e) Waschen der festen Phase
f) gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (a) bis (e)

Aus der Reihenfolge der ermittelten Signale mit identischen x,y-Koordinaten wird anschließen die Sequenz rekonstruiert (WO 02088382).
Die Zahl der Schritte kann variieren. In manchen Anwendungen, wie beispielsweise bei "Minisequencing" oder Primerextension, s.o., wird nur ein Nukleotid eingebaut. Bei einer Sequenzierung werden mehrere Zyklen durchgeführt, ihre Zahl liegt beispielsweise zwischen 5 und 100.
6.1 Sequenzierungsreaktion an einem Oligonukleotid
In diesem Beispiel wird eine hochparallele Sequenzierungsreaktion an einem Oligonukleotid durchgeführt. Es wurden folgende Komponenten verwendet:
Die Oberfläche der festen Phase trägt Anker-Oligonukleotide. Sie wurde wie im Beispiel 5.1.2 beschrieben hergestellt.
dUTP-SS-Cy3, dCTP-SS-Cy3 (beide synthetisiert nach Vorschrift in WO 02088382, sieh 7f-1 und 7f-4, wobei die Aminogruppe am Linker mit einem Cy3-Farbstoff modifiziert ist, s. Beispiel 2 derselben Anmeldung oder auch nach Prozedur im Beispiel 7A).
dATP, dGTP (Sigma-Aldrich)
Polymerase: Klenow Exo minus (Amersham Bioscience)
Matrize: Oligo-31 (Sequenz s. Tabelle 18)
Primer: T7-19 (Sequenz s. Tabelle 18)
Puffer und Arbeitslösungen:
Einbaupuffer: 50 mmol/l Tris-HCl, pH 8.7, 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgCl₂
Spaltungspuffer: TCEP 100 mmol/l, pH 8.0
Alkylierungspuffer: Iodacetamid 100 mmol/l in 50 mmol/l Borat-Puffer pH 9.0
Waschpuffer entspricht dem Einbaupuffer
Lösung "U" 1 μmol/l dUTP-SS-Cy3 in Einbaupuffer + Polymerase 1 Unit in 50 μl
Lösung "C" 1 μmol/l dCTP-SS-Cy3 in Einbaupuffer + Polymerase 1 Unit in 50 μl
Lösung "A,G" 0,1 μmol/l dATP und dGTP im Einbaupuffer + Polymerase 1 unit in 50 μl
Polymerase wurde in diesem Beispiel wie folgt mit Iodacetamid modifiziert: zu 75 μl des Aliquot von Klenow Exo minus Polymerase (Amersham-Bioscience, 750 Unit Klenow Exo minus) wurde Iodacetamid (Sigma-Aldrich) bis zu Konzentration von 20 mmol/l zugegeben und bei RT für 30 min gerührt. Weitere Hinweise für die Modifizierung sind im Anhang 1 angegeben:
An die Anker-Oligonukleotide wurde ein Oligo-31 hybridisiert:
Eine 100 nmol/l Lösung von Oligo 31 im Einbaupuffer (20 μl) wurde für 5 min bei RT in Kontakt mit der Oberfläche der festen Phase gebracht, anschließend wurde die Oberfläche mit dem Einbaupuffer (100 μl) gewaschen. Anschließend wurde der Primer T7-19 an die Primerbindungsstelle im Oligo 31 hybridisiert:
Eine 10 nmol/l Lösung von T7-19 im Einbaupuffer (20 μl) wurde für 5 min bei RT in Kontakt mit der Oberfläche der festen Phase gebracht, anschließend wurde die Oberfläche mit dem Einbaupuffer (100 μl) gewaschen.
Zur Detektion wurde das oben dargestellt optische System verwendet, wobei mehrere Positionen auf der Oberfläche analysiert wurden. Eine Position hat eine Fläche von 4800 μm². Die Signalauszählung erfolgte mit einer Software, die Fluoreszenzsignale von einzelnen Molekülen identifizieren kann. Detailliert ist das Sequenzierungsverfahren in den Anmeldungen WO 02088382, WO 03031947 dargestellt, wobei hier der Einsatz der neuen festen Phase für solche Verfahren beschrieben wird. Zur reproduzierbaren Auffindung derselben Positionen auf der festen Phase über mehrere Zyklen wurde ein Justiermuster aufgetragen. In diesem Fall bestand das Muster aus Tusche-Teilchen, die sich aus einer wässrigen Lösung auf die Oberfläche der festen Phase absorbiert haben. Diese Teilchen ermöglichen eine optische Rejustierung der Positionen der Oberfläche und die Wiedefindung einzelner Sequenzierstellen (Primer-Plasmid-Komplexe).
Die Zahl der Signale von einzelnen in die Nukleinsäure eingebauten markierten Nukleotidmolekülen an einzelnen Positionen ist in der Tabelle 15 präsentiert.
Es wurden insgesamt 20 Zyklen durchgeführt.
Zyklus (A) schließt folgende Schritte ein:

1) die Oberfläche der festen Phase mit den fixierten Primer-Matrizekomplexen wurde mit Spaltungspuffer (10 μl) 5 min bei RT inkubiert, anschließend mit dem Waschpuffer gewaschen, dann für 5 min bei RT mit Alkylierungspuffer (20 μl) gewaschen (zur Blockade von freien SH-Gruppen) und dann mit Waschpuffer gewaschen.
2) es wurde der Lösung "A,G" (10 μl) auf die Oberfläche gegeben und bei RT 5 min inkubiert, so dass gegebenenfalls eine Einbaureaktion von dATP und oder dGTP stattfinden kann. Anschließend wurde die Oberfläche mit dem Waschpuffer gewaschen.
3) Detektion

Zyklus (U) schließt folgende Schritte ein:

1) die Oberfläche der festen Phase mit den fixierten Primer-Matrizekomplexen wurde mit Lösung "U" 5 min bei RT inkubiert und anschließend mit dem Waschpuffer gewaschen.
2) Detektion

Zyklus (C) schließt folgende Schritte ein:

1) die Oberfläche der festen Phase mit den fixierten Primer-Matrizekomplexen wurde mit Lösung "C" 5 min bei RT inkubiert und anschließend mit dem Waschpuffer gewaschen.
2) Detektion

Tabelle 15
Die Zahl der detektierten Signale ändert sich in einzelnen Zyklen. Wenn Signale von einzelnen Nukleiotidmolekülen mit denselben Koordinaten in die Reihenfolge ihres Erscheinens vom Zyklus 1 bis Zyklus 20 anordnet werden, ergibt sich eine Verteilung von Reihenfolgen der Signalen. Diese Reihenfolgen (Sequenz-Rohdaten) wurden für Position 2 und 3 rekonstruiert und sind in der 9a und 9b präsentiert. Da parallel über 3500 Oligonukleotide an einer Position sequenziert wurden, Reihenfolgen mit identischen Sequenzen wurden zusammengefaßt. Die Zahl der identischen Sequenzreihenfolgen ist rechts von der jeweiligen Sequenz zu sehen. Einzelne Buchstaben bedeutet jeweils das detektierte Signal: "U" steht für eingebautes markiertes dUMP-SS-Cy3, "C" steht für eingebautes markiertes dCMP-SS-Cy3, "A" steht für die nach dem Abspaltungsschritt verbliebenen Signale an der Oberfläche, Bindestriche zwischen einzelnen Buchstaben bedeuten, dass kein Signal im jeweiligen Zyklus entsprechenden Koordinaten zugeordnet wurde.
In diesem Beispiel wurden nur zwei markierte und zwei unmarkierte Nukleotide verwendet. Die Sequenzierungsreaktion läuft an einzelnen Oligonukleotidmolekülen unterschiedlich schnell ab, so dass es zu einer Verteilung der tatsächlich gemessenen Sequenzen kommt. Die Sequenzen sind in der Tabelle 20 (s. Anhang 3) in unterschiedliche Längen zusammengefaßt, korrespondierend zur Zahl der gemessenen Signale mit denselben Koordinaten. Man sieht Spalten mit der Bezeichnung Länge 1, Länge 2 ... Länge 5.
Die zu ermittelnde Sequenz "--U--U--U--U-C------" wurde 215 mal an beiden Position detektiert. Andere Sequenzen stellen nur partiell verlängerte oder fehlerhafte Sequenzen dar.
Im Zusammenhang mit dieser Anmeldung sind folgende Tatsachen von großer Bedeutung:

1) an der erfindungsgemäßen Oberfläche kann eine hochparallele Sequenzierungsreaktion durchgeführt werden, wobei Signale von einzelnen Molekülen detektiert werden.
2) Die unspezifische Bindung von markierten Komponenten, wie beispielsweise dCTP-SS-Cy3 ist sehr gering: bei Inkubationsschritten, die keinen Einbau von dCTP-SS-Cy3 zulassen (die Sequenz hat die potenzielle Stelle noch nicht erreicht), beträgt die unspezifische Bindung weniger als 10 Ereignisse pro 100 μm² (s. z.B. Zyklen 1, 5, 8, 11).

In einem anderen Beispiel der Sequenzierung der Oligonukleotide mit der erfindungsgemäßen Oberfläche wurde die Konzentration des Oligo-31, was an die feste Phase über den Linker gebunden war, um die Hälfte reduziert. Alle anderen Schritte wurde identisch wie im oben beschriebenen Beispiel durchgeführt. Man sieht in der Tabelle 16, dass die Zahl der Signale, die durch Einbau von markierten Nukleotiden zustande kommen, nur die Hälfte der Signale im entsprechenden Schritt im anderen Beispiel (Tabelle 15) beträgt. Die unspezifische Bindung von markierten Nukleotiden ist aber genauso gering (unter 10 Ereignisse pro 100 μm²).
Tabelle 16
In ähnlicher weise können auch andere erfindungsgemäße Oberflächen der festen Phase eingesetzt werden.
6.2 Reaktion am M-13-Plasmids
In diesem Beispiel wird gezeigt, dass mit der erfindungsgemäßen festen Phase eine sequenzabhängige Einbaureaktion an langen Nukleinsäurekettenfragmenten (NSKFs) durchgeführt werden kann. Die unspezifische Bindung von NSKFs an die Oberfläche ist gering.
Die feste Phase wurde wie im Beispiel 5.1.3 vorbereitet, so dass Oligonukleotide mit einer freien 3'-Gruppe an der Oberfläche der festen Phase fixiert sind und als Primer für die Extensionsreaktion dienen können. An diese Oligonukleotide wurden Fragmente des M-13-Plasmid hybridisiert, die mit einer poly-dT-Strecke zur Hybridisierung versehen wurden.
Die Reaktion verlief in mehren Schritten, einzelne Schritte in der Tabelle 17 dargestellt. Zur Detektion wurde das oben dargestellt optische System verwendet, wobei mehrere Positionen auf der Oberfläche analysiert wurden. Eine Position hat eine Fläche von 4800 μm². Die Signalanalyse erfolgte mit einer Software, die Fluoreszenz-Signale von einzelnen Molekülen identifizieren kann. Detailliert ist das Verfahren in Anmeldungen (WO 02088382, WO 03031947) dargestellt, wobei hier der Einsatz der neuen festen Phase für solche Verfahren beschrieben wird.
Im einzelnen:
Material-Vorbereitung
Ein einzelsträngiges M-13-Plasmid, ca. 7.4 kB lang, (Amersham Bioscience) in der Konzentration 100 ng/μl, 100μl, in 20mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,5, wurde mit Ultraschall (400 Watt) 10 sec fragmentiert. Anschließend erfolgte eine "tailing"-Reaktion mit einem Gemisch aus dTTP (100 μmol/l) und dUTP-Cy3 (Amersham-Bioscience), 1 μmol/l, mit der Terminalen Deoxynukleotidyltransferase (Amersham Bioscience), wie in WO 02088382 oder in "Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory dargestellt ist. Das Reaktionsprodukt wurde mit Qiaquick-Kit (Qiagen) für PCR-Produkte gereinigt. Die aufgereinigten Plasmid-DNA-Fragmente (aufgelöst in Wasser) wurden auf 95°C erhitzt und auf RT abgekühlt.
Fixierung an die Oberfläche
Fragmente von M-13-Plasmid wurden bis Konzentration von 5 ng/μl verdünnt im 50 mmol/l Tris-HCl-Puffer, 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgCl₂ verdünnt und für 30 min in Kontakt mit der festen Phase gebracht. Es erfolgte dabei eine Hybridisierung von M-13-Fragmenten mit poly-dT-Strecken an die auf der Oberfläche fixierten Oligo-dA50. Die Bindung an die Oberfläche betrug zwischen 100 und 400 Stränge pro 100 μm². In Kontrollexperimenten wurden M-13-Fragmente in Kontakt mit den Oberflächen der festen Phasen gebracht, die keine Oligo-dA50 enthielten und nach der Prozedur im Beispiel 1.1, 4.1 oder 5.1.2 hergestellt wurden. In diesen Kontrollexperimenten wurde nur eine geringe unspezifische Bindung von M-13-Fragmenten an die feste Phase detektiert (unter 30 Signale pro 100 μm²).
Die Signale an den M-13-Fragmenten stammen von den beim "Tailing" eingebauten dUTP-Cy3-Molekülen. Nach der Detektion der Dichte der M-13-Fragmente wurden diese Farbstoffe durch Bestrahlung der Oberfläche ausgeblichen, so dass sie in späteren Schritten keine Fluoreszenzsignale abgeben.
Zur reproduzierbaren Auffindung derselben Positionen auf der festen Phase über mehrere Zyklen wurde ein Justiermuster aufgetragen. In diesem Fall bestand das Muster aus Tusche-Teilchen, die sich aus einer wässrigen Lösung auf die Oberfläche der festen Phase absorbiert haben. Diese Teilchen ermöglichen eine optische Rejustierung der Positionen der Oberfläche und die Wiederfindung einzelner Sequenzierstellen (Primer-Plasmid-Komplexe).
Die Sequenzierungsreaktion wurde mit dUTP- und dCTP-Analoga durchgeführt, die im Beispiel 7B beschrieben sind (dUTP-SOS-Cy3 und dCTP-SOS-Cy3). Eine ähnliche Sequenzierungsreaktion kann auch mit anderen Nukleotiden durchgeführt werden, die wie in Beispiel 7 oder WO 02088382 dargestellt, synthetisiert werden.
Als Polymerase wurde Klenow Exo – (Amersham Bioscience) in Konzentration 1 Unit/50 μl eingesetzt.
Puffer und Arbeitslösungen:
Einbaupuffer: 50 mmol/l Tris-HCl, pH 8.7, 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgCl₂
Spaltungspuffer: Merkaptoethanol 100 mmol/l, im Einbaupuffer
Block-Puffer: Iodacetamid 100 mmol/l im Einbaupuffer
Waschpuffer entspricht dem Einbaupuffer.
Lösung "U" 1 μmol/l dUTP-SOS-Cy3 in Einbaupuffer + Polymerase 1 unit in 50 μl
Lösung "C" 1 μmol/l dCTP-SOS-Cy3 in Einbaupuffer + Polymerase 1 unit in 50 μl
Lösung "A,G" 0,1 μmol/l dATP und dGTP im Einbaupuffer + Polymerase 1 unit in 50 μl
Alle Reaktionsschritte (Einbaureaktion, Spaltung) wurden bei Raumtemperatur (RT) für 5 min durchgeführt.
Es wurden insgesamt 104 Zyklen durchgeführt.
Zyklus (T) Schließt folgende Schritte ein:

1) Hybridisierung von Fragmenten von M-13-Plasmid
2) Detektion
3) Bleichen der Signale von den eingebauten markierten Nukleotiden.

Zyklus (A) schließt folgende Schritte ein:

1) die Oberfläche der festen Phase mit den fixierten Primer-Matrizekomplexen wurde mit Spaltungspuffer (10 μl) 5 min bei RT inkubiert und anschließend mit dem Waschpuffer gewaschen, anschließend Block-Puffer für 5 min bei RT behandelt.
2) es wurde die Lösung "A,G" (10 μl) auf die Oberfläche gegeben und bei RT 5 min inkubiert, so dass gegebenenfalls eine Einbaureaktion von dATP und oder dGTP stattfinden kann. Anschließend wurde die Oberfläche mit dem Waschpuffer gewaschen.
3) Detektion

Zyklus (a) schließt folgende Schritte ein:

1) die Oberfläche der festen Phase mit den fixierten Primer-Matrizekomplexen wurde mit Spaltungspuffer (10 μl) 5 min bei RT inkubiert und anschließend mit dem Waschpuffer gewaschen, anschließend Block-Puffer für 5 min bei RT behandelt.
2) Detektion

Zyklus (U) schließt folgende Schritte ein:

1) die Oberfläche der festen Phase mit den fixierten Primer-Matrizekomplexen wurde mit der Lösung "U" 5 min bei RT inkubiert und anschließend mit dem Waschpuffer gewaschen.
2) Detektion

Zyklus (C) schließt folgende Schritte ein:

1) die Oberfläche der festen Phase mit den fixierten Primer-Matrizekomplexen wurde mit der Lösung "C" 5 min bei RT inkubiert und anschließend mit dem Waschpuffer gewaschen.
2) Detektion

Ergebnis:
Die Veränderungen der Zahl der Signale von einzelnen eingebauten markierten Nukleotiden sieht man in der Tabelle 17.
Tabelle 17
In der Tabelle stehen Zeilen für zyklische Schritte, die Spalten für Positionen. Die Zahlen geben die jeweils gemessene Anzahl der Fluoreszenzsignale von einzelnen Molekülen pro eine Position im jeweiligen Zyklus wieder. Der Mittelwert bedeutet die durchschnittliche Zahl der Signale aus 4 Positionen.
In diesem Beispiel sollte sich die Auswertung der Daten auf die Tatsache der Sequenzabhängigkeit der Einbaureaktion von markierten Nukleotiden und der geringen unspezifischen Bindung von markierten Nukleotiden an die Oberfläche während der Analyse beschränken. Die Sequenzen werden in diesem Beispiel nicht ausgewertet.
Auswertung:
Es wurde eine sequenzabhängige Reaktion beobachtet. Durch Variationen in der Reihenfolge der Zugabe von markierten Nukleotiden wird gezeigt, dass der Einbau sequenzspezifisch ist: durch mehrfach nacheinander wiederholte Zugabe von Nukleotiden gleicher Art verringert sich der Einbau von diesen Nukleotiden, da zur Verfügung stehenden Stellen abgesättigt werden (s. Zyklen 16 bis 28 und 30 bis 35). In den darauf folgenden Schritten wurde der Einbau wieder aufgenommen, da alle Sequenzen potenziell auf Angebot von markierten Nukleotide warten.
Wenn alle potenzielle Stellen zum Einbau abgesättigt sind, beobachtet man nur unspezifisch an die Oberfläche gebundenen markierte Nukleotide. Dabei wird bei der Berechnung der Zahl von unspezifisch gebundenen markierten Nukleotiden die durchschnittliche Zahl der nach der Spaltung verbliebenen Signale abgezogen. In den Zyklen 28, 34 und 68 sieht man, dass die Zahl der Signale von markierten Nukleotiden unter 40 pro 100 μm² liegt. Dabei in den Zyklen 28 und 34 besteht die Möglichkeit einer Einbaureaktion (die Polymerase ist in der Lösung). Im Zyklus 68 wurde lediglich dUTP-SOS-Cy3 zugegeben ohne Polymerase, man sieht entsprechend weniger Signale.
Die Formel für die Berechnung der Dichte der unspezifisch gebundenen markierten Komponenten: D = ((N – A) × 100)/4800Wobei:

D: = Dichte der unspezifisch gebundenen markierten Komponenten
N: = Zahl der Signale im Zyklus N mit markierten Nukleotiden
A: = Zahl der Signale im vorangegangenen Abspaltungszyklus
4800: = Fläche einer Position, μm
100: = Bezugsfläche für die Dichteberechung, μm

Beispiel 7
Synthese von mofifizierten Nukleotiden
Beispiele für Synthesen von Nukleotid-Analoga und deren Spaltungsbedingungen, die in einem Sequenzierverfahren eingesetzt werden können, s. Beispiel 6.
Analog zu diesen Synthesen können auch andere Nukleotidanaloga synthetisiert werden. Als Ausgangssubstanzen können dabei beispielsweise für Synthesen 7A–7C, 7E: 7-Deaza-ATP-7-Propargylamin, 7-Deaza-dATP-7-Propargylamin, 7-Deaza-ddATP-7-Propargylamin, 7-Deaza-GTP-7-Propargylamin, 7-Deaza-dGTP-7-Propargylamin, 7- Deaza-ddGTP-7-Propargylamin, UTP-5-Propargylamin, dUTP-5-Propargylamin, ddUTP-5-Propargylamin, CTP-5-Propargylamin, dCTP-5-Propargylamin, ddCTP-5-Propargylamin usw. eingesetzt werden (erhältlich von Chembiotech, Münster, Deuschland, Jena Bioscience, Jena, Deutschland). Im weiteren können beispielsweise folgende Vorstufen von anderen Nukleotid-Analogen ähnlich zu der Synthese 7D am 5-Iod-2'-Deoxyuridin eingesetzt werden: 7-Iod-7-Deaza-2'-Deoxyadenosin, 7-Iod-7-Deaza-2'-DeoxyGuanosin, 5-Iod-2'-Deoxycytidine (erhältlich von Chembiotech, Münster, Deuschland, Jena Bioscience, Jena, Deutschland).
Trennungsmethoden:
Dünnschichtchromatographie, DC:

Analytisch: „DC-Alufolien 20 × 20 cm Kieselgel 60F 254" (VWR), beschichtet mit Fluoreszenzindikator. Visualisierung erfolgt mittels UV-Licht. Laufmittel Ethanol-Wasser-Gemisch (70:30) (Laufmittel, LM 1) oder Ethanol-Wasser-Gemisch (90:10) (LM 2).
Präparativ: Kieselgel-Glasplatten mit Sammelschicht (VWR). LM 1 oder LM 2.

Umkehrphasen-Chromatographie (RP-Chromatographie), RP-18:
C-18 Material (Fluka), Säulenvolumen 10ml, Wasser-Methanol-Gradient. Fraktionen je 1ml wurden gesammelt und mit UV-Vis-Spektrometer analysiert. Fraktionen mit ähnlichen Spektren wurden vereinigt und lyophilisiert.
HPLC-Säulen mit ähnlichem Material können verwendet werden (Sigma), Gradient: wässriger Puffer:Acetonitril (Acetat-Puffer:Acetonitril).
Ionenaustausch-Chromatographie
DEAE-Zellulose (VWR), Gradient NH₄HCO₃ 20mmol/l – 1mol/l, Fraktionen wurden unter UV/Vis -Kontrolle gesammelt und auf Grundlage gleicher Spektren vereinigt.
Material:

dUTP-AA (dUTP-5-Allylamine, Jena-Bioscience,) dCTP-PA (dCTP-5-Propargylamin, Jena-Bioscience), PDTP-NHS (3-(2-Pyridinyl-dithio)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma-Aldrich-Fluka, Taufkirchen, Deutschland, (im weiteren als Sigma oder Aldrich oder Fluka bezeichnet)), CDI (1,1'-Carbonyldiimidazol, Sigma), Cy3 (Farbstoff, Amerscham Bioscience, Freiburg, Deutschland, im weiteren als Amersham Bioscience bezeichnet)), Cy3- NHS (Cy3-N- hydroxysuccinimidyl-ester, Amerscham Bioscience), MEA (Mercaptoethylamine, Sigma), DTT (1,4-Dithio-DL-threit, Sigma), CA (Cystamine, Sigma), TCEP – (Tris-(2-carboxyethyl)phosphine, Sigma), DTBP (3,3'-Dithio-Bis-Propionsäure, Fluka), J-Ac (Iodoacetat, Sigma), Iodacetamid (Sigma), TMR-NHS (Tetramethylrhodaminhydroxysuccinimidyl-ester, Sigma), Diamin-PEG (6kDa, Fluka).

Lösungsmittel wurden, wenn nötig, absolutiert verwendet (Fluka) oder nach Standardverfahren getrocknet. Bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich die angegebenen Mischungsverhältnisse auf die eingesetzten Volumina (v/v).
Beispiel 7A:
Synthese von dUTP-SS-Farbstoff (10).
dUTP-AA-PDTP,
20 mg dUTP-AA wurden in 1ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit NaOH auf 8.5 eingestellt. Zur dUTP-AA – Lösung wurde PDTP-NHS 60mg in 0.5 ml Methanol, tropfenweise unter Rühren zugegeben. Reaktion wurde 2 h bei 40°C durchgeführt. DC-Kontrolle: dUTP-AA-PDTP (in LM 1 Rf 0.45).
Die Trennung von überschüssigem PDTP-NHS und PDTP erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2. Das Produkt, dUTP-AA-PDTP, und dUTP-AA bleiben auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.
Dieses dUTP-Analog trägt nun eine Disulfid-Bindung, die in einer Thiolaustauschreaktion mit anderen Thiolen reagieren kann und eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung darstellt.
Kopplung von Farbstoff:
Zu 1ml wässriger CA-Lösung, 200 mmol/l, pH 8.5 eingestellt mit NaOH, wurde Cy3-NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy3-Farbstoffs 10 mmol/l betrug. Die Reaktion wurde 10 min bei RT gerührt. Anschließend wurde 1 ml TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0 eingestellt mit NaOH, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt (Cy3-MEA) wurde auf RP-18 getrennt (Wasser-Methanol-Gradient).
Zu 100μl, 10mmol/l MEA-Cy3 in 50mM Borat, pH 9.5, wurde 50μl 30mmol/l dUTP-AA-PDTP in 50mM Borat, pH 9.5 zugegeben. Nach 1 Stunde wurde das dUTP-SS-Cy3 durch Dünnschicht-Chromatographie, LM 1, Rf. 0.6, von MEA-Cy3, Rf. 0.9, getrennt. Anschließend wurde dUTP-SS-Cy3 auf RP-18-HPLC getrennt.
Anstelle von Cy3-NHS kann ein anderer Farbstoff, z.B. TMR-NHS, Alexa 568-NHS, Alexa 590-NHS, Alexa-555-NHS in ähnlicher Weise gekoppelt werden.
Spaltung der Disulfidbindung kann durch 100 mmol/l TCEP-NaOH Lösung erfolgen.
Beispiel 7B:
Synthese von dUTP-SOS- Farbstoff (11).
dUTP-AA-Propionat-SH,
Zu 200μl 40mmol/l Lösung von dUTP-AA-PDTP wurde 1ml TCEP-Lösung 250mmol/l, pH 8, eingestellt mit NaOH, zugegeben und 10 min bei RT gerührt.
Die Trennung der Nukleotide von anderen Reagenzien erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2. Produkt, dUTP-AA-Propionat-SH, bleibt auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.
Dieses dUTP-Analog trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise durch Maleimide oder Acetohalogenide wie Iodacetat.
Kopplung von Farbstoff:
Zu 100 μl wässriger CA-Lösung, 200 mmol/l, pH 8.5 eingestellt mit NaOH, wurde Cy3-NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy3-Farbstoffs 10 mmol/l betrug. Die Reaktion wurde 10 min bei RT gerührt. Anschließend wurde 0,2 ml TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0 eingestellt mit NaOH, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt (Cy3-MEA) wurde auf RP-18 getrennt (Wasser-Methanol-Gradient), lyophilisiert und dann in 100 μl 200 mmol/l Acetat-Puffer pH 5.5 aufgelöst.
Zu 1 ml 1 mol/l Iodacetat in DMF wurde ein Äquivalent von CDI zugegeben. Nach 30 min bei RT wurden 10 μl dieser Lösung zu 100 μl Cy3-MEA in Acetat-Puffer zugegeben. Nach 30 min wurde NH₄HCO₃ bis zu Konzentration von 100 mmol/l zugegeben und nach weiteren 30 min wurde das Produkt, modifizierter Cy3-Farbstoff, auf RP-18 in Wasser-Methanol-Gradient aufgereinigt. Der dadurch erhaltene Cy3-Farbstoff trägt einen Linker, der eine Thioester-Bindung enthält und eine thiolreaktive Iodacetat-Bindung.
Der erhaltene Cy3-Farbstoff wurde an das dUTP-AA-Propionat-SH gekoppelt:
Zu 30 μl 5 mmol/l Cy3-Derivat in 50 mmol/l Borat-Puffer pH 9.0 wurden 20 μl 20 mmol/l dUTP-AA-Propionat-SH in 50 mmol/l Borat-Puffer pH 9.0 zugegeben. Reaktion verlief 20 h bei RT. Anschließend wurde das Nukleotid mit dem Farbstoff gereinigt:
Dünnschicht-Chromatographie, LM 1, Rf. 0.6., Elution, dann RP-18-Säule im Wasser-Methanol-Gradient.
Anstelle von Cy3-NHS kann ein anderer Farbstoff, z.B. TMR-NHS, Alexa 568-NHS, Alexa 590-NHS, Alexa-555-NHS in ähnlicher Weise gekoppelt werden.
Spaltung des Thioesters kann durch 100 mmol/l Mercaptoethanol-Lösung in 50 mmol/l Tris-HCl 50 mmol/l, pH 9.0, NaCl und 1 mmol/l MgCl₂ erfolgen.
Beispiel 7C:
Synthese von dCTP-SCO- Farbstoff (12).
dCTP-PA-Propionat-SH,
Zu 200μl 40mmol/l Lösung von dCTP-PA-PDTP (synthetisiert analog zu dUTP-AA-PDTP) wurde 1ml TCEP-Lösung 250mmol/l, pH 8, eingestellt mit NaOH, zugegeben und 10 min bei RT gerührt.
Die Trennung der Nukleotide von anderen Reagenzien erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2. Produkt, dCTP-PA-Propionat-SH, bleibt auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.
Dieses dCTP-Analog trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Thioestern.
Zu 20 μl einer 10 mmol/l Lösung von dCTP-PA-Propionat-SH in 50 mmol/l Borat-Puffer, 20 % Ethanol, pH 8.0 wird ein Äquivalent von TMR-NHS zugegeben (TMR-NHS ist ein Isomer mit der aktivierten Carboxygruppe in 5-Position). Reaktion verlieft 3 h bei RT. Anschließend wurde das Nukleotid mit dem Farbstoff gereinigt: Dünnschicht-Chromatographie, LM 1, Rf. 0.5., Elution, dann RP-18-Säule im Wasser-Methanol-Gradient.
Anstelle von TMR-NHS kann ein anderer Farbstoff, z.B. Cy5-NHS, Cy3-NHS, Alexa-555-NHS, Alexa 568-NHS, Alexa 590-NHS in ähnlicher Weise gekoppelt werden.
Spaltung des Thioesters kann durch 100 mmol/l Mercaptoethanol-Lösung in 50 mmol/l Tris-HCl 50 mmol/l, pH 9.0, NaCl und 1 mmol/l MgCl₂ erfolgen.
Beispiel 7D:
Synthese von dUTP-COS-Farbstoff (13).
Das dUTP-R-COOCH₃ wurde analog zur Vorschrift (Heike A. Held, Abhijit Roychowdhury, and Steven A. Benner, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, Vol 22,391–404 (2003)) synthetisiert. Die Triphosphatsynthese erfolgte nach T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, Vol 29, 4525–4588 (1988)).
500 mg (1.41 mmol) 5-Iod-2'-Deoxyuridin wurden bei Raumtemperatur in 10 ml wasserfreiem DMF unter Stickstoffatmosphäre suspendiert und 10 min. gerührt. Nun gibt man 160 mg ( 0.14 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0) zu. Nach weiteren 10 min gibt man nacheinander 400 μl Triethylamin, 480 mg (4.28 mmol) Pent-1-insäuremethylester und 55 mg (0.29 mmol) Kupfer-(I)-iodid zu. Nach 15 h wird die Reaktionsmischung am Rotationsverdampfer eingeengt und das erhaltene rote Öl chromatographisch an Kieselgel gereinigt (Dichlormethan : Methanol = 20 : 1).
Man erhält 400 mg (84%) Produkt. Nach Triphosphorylierung wurde dUTP-R-COOCH₃.erhalten.
In ähnlicher Weise können auch Cytosin, Adenosin und Guanosin-Derivaten mit dem Pent-1-insäuremethylester modifiziert werden (Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002).
Weitere Modifikation erfolgt am dUTP-R-COOCH₃:
Zu 100 μl einer 50 mmol/l Lösung der dUTP-R-COOCH₃ in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wird 100 μl einer 1 mol/l Lösung des Merkaptoethanolamins, pH 9, zugegeben und bei 40°C 3 h gerührt. Das Produkt der Reaktion,
das dUTP-R-CO-S-CH₂-CH₂-NH₂, wird vom überschüssigen Merkaptoethanolamin auf DEAE-Cellulose im Borat-Puffer 10 mmol/l abgetrennt und mit 0,3 mol/l NaCl von der Säule eluiert.
Dieses Nukleotid hat eine unter milden Bedingungen spaltbare Thioester-Gruppe und kann an der Aminogruppe am Linker modifiziert werden. An diese Amino-Gruppe können weitere Modifikationen vorgenommen werden. Beispielsweise kann an sie ein Farbstoff gekoppelt werden:
Synthese von dUTP-COS-Cy3
Zu 100 μl einer 10 mmol/l Lösung des dUTP-R-CO-S-CH₂-CH₂-NH₂ in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wurde Cy3-NHS bis zu Konzentration von 15 mmol/l zugegeben. Die Reaktion erfolgte bei RT über 30 min. Anschließend wurde das mit Cy3-modifiziertes Nukleotid auf Kieselgel-Platte und RP-18 Säule gereinigt, ähnlich wie in anderen Beispielen dargestellt.
Anstelle von Cy3-NHS kann ein anderer Farbstoff, z.B. TMR-NHS, Alexa 568-NHS, Alexa 590-NHS, Alexa-555-NHS in ähnlicher Weise gekoppelt werden.
Spaltung des Thioesters kann durch 100 mmol/l Mercaptoethanol-Lösung in 50 mmol/l Tris-HCl 50 mmol/l, pH 9.0, NaCl und 1 mmol/l MgCl₂ erfolgen.
Solche Analoga sind kompatibel mit der erfindungsgemäßen Oberfläche und können für Sequenzierungsverfahren eingesetzt werden.
Beispiel 7E:
Synthese von dUTP-AA-SS-PEG-Farbstoff, (14).
dUTP-AA-SS-PEG-Cy3,
Zunächst wurde SH-PEG-Cy3 hergestellt. Zu 200 μl einer 10 mmol/l Lösung von Diamin-PEG (6kDa, Fluka) in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 8, wurde Cy3-NHS (Amersham-Bioscience) bis zu Endkonzentration von 15 mmol/l zugegeben. Die Reaktion wurde bei RT 30 min lang durchgeführt. Anschließend wurde NH₂-PEG-Cy3 von Farbstoffresten durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 abgetrennt, 3 mal mit 1 ml 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 8, gewaschen und in einem Volumen von 200 μl 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 8, aufgelöst.
Zu dieser Lösung wurde PDTP-NHS bis zu Endkonzentration von 50 mmol/l zugegeben. Die Reaktion wurde bei RT 30 min lang durchgeführt. Anschließend wurden 50 μl einer 1 mol/l Lösung von NH₄HCO₃, pH 8, zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde weitere 60 min inkubiert. Zur Reduktion der Disulfidbindungen wurden 100 μl einer 1 mol/l TCEP-Lösung, pH 8, zum Reaktionsgemisch zugegeben. Nach 5 min bei RT wurde das Produkt der Reaktion, das SH-PEG-Cy3, von den niedermolekularen Komponenten durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 abgetrennt, 5 mal mit 1 ml 50 mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 7, gewaschen und in einem Volumen von 200 μl 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7, aufgelöst. Unmittelbar vor Kopplung des Nukleotid-Teils wurde der pH-Wert auf 9.0 mit 1 mol/l NaOH eingestellt.
Kopplung des SH-PEG-Cy3 an den Nukleotid-Teil:
Zu 100μl 20 mmol/l dUTP-AA-PDTP in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wurden 100 μl der Lösung mit SH-PEG-Cy3 in 50 mmol/l Tris-HCl, pH 9.0, zugegeben. Reaktion wurde bei RT über 30 min durchgeführt. Das Produkt der Reaktion wurde durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 von niedermolekularen Komponenten abgetrennt, 5 mal mit 1 ml 50 mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 7, gewaschen und in einem Volumen von 200 μl 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7, aufgelöst.
Das auf diese Weise erhaltene dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 kann von DNA-Polymerasen, beispielsweise Klenow-Fragment Exo-minus oder Taq-Polymerase, in den wachsenden Strang der Nukleinsäuren eingebaut werden.
Das dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 enthält eine unter milden Bedingungen spaltbare Gruppe, so daß der Linker mit dem Farbstoff von dem Nukleotid abgespalten werden kann.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino-dCTP, 5-Propargylamino-dUTP, 7-Deaza-7-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza-7-Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide als auch 2',3'-Deoxyribonukletide verwendet werden.
Beispiel 8
Nuk-Makromoleküle für das Sequenzierungsverfahren
Allgemeine Hinweise für die Synthesen von Nuk-Makromolekülen
Die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle können auf unterschiedliche Art und Weise synthetisiert werden. Die Reihenfolge der Kopplungsschritte kann variieren. Beispielsweise kann zunächst eine Linker-Komponente an die Nuk-Komponente gekoppelt werden, anschließend wird die Marker-Komponente gekoppelt. Andererseits können ein oder mehrere Linker an die Marker-Komponente gekoppelt werden und anschließend der/die Nuk-Komponenten.
Die Kopplung zwischen einzelnen Komponenten der Nuk-Makromoleküle kann kovalent oder affin erfolgen. Wobei sowohl chemische als auch enzymatische Kopplung zur Verknüpfung einzelner Komponenten eingesetzt werden kann. Kopplungen an Amino- und Thiolgruppen dienen als Beispiele für kovalente Kopplungen (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, 363, "The chemistry of the amino group" S. Patai, 1968, "The chemistry of the thiol group" S. Patai, 1974). Biotin-Streptavidin-Bindung oder Hybridisierung zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen stellen Beispiele für affine Kopplungen dar.
Die makromolekularen Marker bieten oft eine Vielfalt an Kopplungsmöglichkeiten. Ein makromolekularer Marker kann mehrere Kopplungsstellen für den Linker haben, beispielsweise mehrere Bindungsstellen für Biotin, wie es bei Streptavidin der Fall ist. Ein makromolekularer Marker kann auch mehrere Amino- bzw. Thiol-Gruppen aufweisen.
Falls Nukleinsäuren als makromolekulare Marker eingesetzt werden, so können diese unterschiedliche Abschnitte zur Kopplung anderer Makromoleküle besitzen.
An einen makromolekularen Marker können andere Makromoleküle gebunden werden, z.B. Enzyme.
Ein Nuk-Makromolekül kann makromolekulare Marker mit unterschiedlichen Detektionseigenschaften tragen, beispielsweise kann ein Nuk-Makromolekül sowohl mehrere Farbstoffmoleküle als auch Stellen zur affinen Bindung (z.B. durch Hybridisierung) weiterer Makromoleküle tragen.
Die Kopplung zwischen der Nuk-Komponenten und der Linker-Komponenten erfolgt vorzugsweise kovalent. Viele Beispiele für eine kovalente Kopplung an Nukleotide oder deren Analoga sind bekannt (Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Dabei kann die Kopplung beispielsweise an Phosphat, Amino-, Hydroxy- oder Mercaptogruppen erfolgen.
Oft kann die Linker-Komponente in mehreren Schritten aufgebaut werden. Beispielsweise wird im ersten Schritt ein kurzer Linker mit einer reaktiven Gruppe an das Nukleotid oder Nucleosid angekoppelt, z.B. Propargylamin-Linker an Pyrimidine Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691 , Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002. Einige Verbindungen kann man käuflich erwerben, z.B. bei Trilink Biotechnologies, Eurogentec, Jena Bioscience.
Diese kurzen Linker dienen als Kopplungseinheiten L oder deren Teile, und sind ein Bestandteil der Linker-Komponente im fertigen Nuk-Makromolekül.
Im zweiten Schritt kann die Kopplung des Nukleotides oder Nucleosides mit einem kurzen Linker an das Linker-Polymer erfolgen. Polymere mit reaktiven funktionellen Gruppen können käuflich erworben werden (Fluka).
Nach der Kopplung des Nukleotids an das Polymer kann nun die Marker-Komponente als letzter Schritt gekoppelt werden.
Oft ist es vorteilhaft an ein Nukleosid einen kurzen Linker zu koppeln, dann, falls erforderlich, dieses modifizierte Nucleosid in ein Nucleosid-Triphosphat umzuwandeln (Synthesen von Triphosphaten können beispielsweise in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Faulstich et al. DE 4418691 , T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, Vol 29, 4525–4588 (1988) oder Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002).
Weitere Modifikationen können am Nukleosid-Triphosphat-Analog durchgeführt werden.
Vorstufen für modifizierte Nukleoside können sind beispielsweise bei Trilink Biotechnologies (San Diego, CA, USA) oder bei Chembiotech (Münster, Deutschland) kommerziel erhältlich.
Die Kopplung zwischen der Linker-Komponente und der Marker-Komponente kann beispielsweise zwischen reaktiven Gruppen an der Linker-Komponente und der Marker-Komponente erfolgen. Reagenzien für solche Kopplungen sind in "Chemistry of protein conjugation and cross-linking", S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, ausführlich dargestellt. Die Verfahren zur Handhabung und zur Kopplung von mehreren Makromolekülen sind für unterschiedliche Typen von Makromolekülen auch in oben genannten Patenten dargestellt. Weitere Beispiele für Kopplungen an die und zwischen den Makromolekülen sind für Proteine in "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2; "Reactive dyes in protein an enzyme technology", D. Clonis, 1987, ISBN 0-333-34500-2; "Biophysical labeling methods in molecular biology" G. Likhtenshtein, 1993, 1993, ISBN 0-521-43132-8; "Techniques in protein modification" R. Lundblad, 1995, ISBN 0-8493-2606-0; "Chemical reagents for protein modification" R. Lundblad, 1991, ISBN 0-8493-5097-2; für Nukleinsäuren in "Molecular-Cloning", J. Sambrook, band 1–3, 2001, ISBN 0-87969-576-5, für andere Polymerarten "Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X beschrieben.
Da die Marker-Komponente meistens viele Kopplungsstellen aufweist, können weitere Modifikationen an kompletten Nuk-Makromolekülen vorgenommen werden. Beispielsweise können überschüssige Amino-Gruppen abgeblockt werden oder durch weiterführende Modifikationen verändert werden.
Je nach Einsatzgebiet und Reaktionsbedingungen, unter denen Nuk-Makromoleküle verwendet werden, können unterschiedliche chemische Bindungsarten zwischen einzelnen Teilen der Makromoleküle von Vorteil sein. So eignen sich beispielsweise bei Verfahren mit Schritten mit höheren Temperaturen, wie z.B. bei Hybridisierung oder PCR, Nuk-Makromoleküle, die kovalente, thermostabile Bindungen zwischen einzelnen Teilen haben.
Nachfolgend sollen beispielhaft einige Möglichkeiten zur Synthese von Nuk-Makromolekülen dargestellt werden. Diese dienen nicht zur Einschränkung der möglichen Synthesewege und nicht zur Einschränkung der möglichen Nuk-Makromolekülstrukturen.
In folgenden Beispielen werden Nuk-Makromoleküle mit Polyethylenglycol (PEG) als Linker-Komponente angegeben. Beispiele für die Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in "Poly(ethylene glycol): chemistry and biological applications", 1997 beschrieben. Im einzelnen können sehr unterschiedliche reaktive Gruppen zur Kopplung eingesetzt werden: N-succinimidyl carbonate (U.S. Pat.. 5,281,698, US 5,468,478 ), Amine (Buckmann et al. Makromol. Chem. V.182, S.1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. V.19, S. 1177 (1983)), succinimidyl propionate und succinimidyl butanoate (Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, 170–181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; U.S. Pat. No. 5,672,662), Succinimidyl succinate (Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. v. 7, S.175 (1984), Joppich et al., Makromol. Chem. 1v. 80, S.1381 (1979), Benzotriazole carbonate (U.S. Pat. No. 5,650,234), Glycidylether (Pitha et al. Eur. J. Biochem. v. 94, S.11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. v.13, S. 354 (1991), Oxycarbonylimidazole (Beauchamp, et al., Anal. Biochem. v.131, S. 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release v.1, S.251 (1985)), p-nitrophenyl carbonate (Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., v.11, 5.141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., v.27, S.45 (1991)), Aldehyde (Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. v.22, S. 341 (1984), US. Pat. 5824784, US. Pat. 5252714), Maleimide (Goodson et al. Bio/Technology v.8, S. 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins v.2, S.29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. v.22, 5.2417 (1992)), Orthopyridyl-disulfide (Woghiren, et al. Bioconj. Chem. v. 4, S. 314 (1993)), Acrylol (Sawhney et al., Macromolecules, v. 26, S.581 (1993)), Vinylsulfone (U.S. Pat. No. 5,900,461). Weitere Beispiele für Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in Roberts et al. Adv. Drug Deliv. Reviews v. 54, S. 459 (2002), US 2003124086 , US 2003143185 , WO 03037385, US 6541543 , US 2003158333 , WO 0126692 zu finden.
Andere ähnliche Polymere können in ähnlicher Art gekoppelt werden. Beispiele für solche Polymere stellen andere Poly(Alkylenglykole), Copolymere aus Ethylenglykol und Propyleneglykol, Poly(olefiniische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(saccharide), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly(Acrylsäure), Poly(Vinylalkohol).
Die Aufreinigung der Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle erfolgt mit konventionellen Mitteln der Nukleotidchemie: beispielsweise mit Kieselgel-Chromatographie in einem Wasser-Ethanol-Gemisch, Ionenaustausch-Chromatographie in einem Salz-Gradienten und Reverse-Phase-Chromatographie in einem Wasser-Methanol-Gradienten. Für die Nukleotid-Aufreinigung optimierte Chromatographie-Säulen werden z.B. von der Firma Sigma-Aldrich angeboten.
Die Aufreinigung von makromolekularen Linker-Komponenten und Marker-Komponenten kann durch Ultrafiltration, Gel-Elektrophorese, Gelfiltration und Dialyse erfolgen, siehe "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2.
Die Masse der Nuk-Makromoleküle unterscheidet sich wesentlich von der Masse der Nukleotide. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, bei den Endreinigungsschritten die Ultrafiltration einzusetzen. Da für die Nuk-Makromoleküle nur eine durchschnittliche Masse bereichnet wird, eignet sich Ultrafiltration auch als analytische Methode zu Trennung von Syntheseprodukten.
Zur Charakterisierung der Nuk-Makromoleküle können unterschiedliche Methoden der makromolekularen Chemie angewendet werden, z.B. UV-Vis-Spektroskopie, Fluoreszenzmessung, Massenspektroskopie, Fraktionierung, Größenausschlußchromatographie, Ultrazentrifugation und elektrophoretische Techniken, wie IEF, denaturierende und nicht denaturierende Gel-Elektrophorese ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).
Die Messung von freien SH-Gruppen in einer Substanz erfolgte mit Ellmans Reagenz (5,5'-Dithiobis (2-Nitrobenzolsäure), Riddles et al. Method in Enzym. 1983, V.91, S. 49.
Synthesen von modifizierten Nukleotiden
Trennungsmethoden:
Dünnschichtchromatographie, DC:

Analytisch: „DC-Alufolien 20 × 20 cm Kieselgel 60 F 254" (VWR), beschichtet mit Fluoreszenzindikator. Visualisierung erfolgt mittels UV-Licht. Laufmittel Ethanol-Wasser-Gemisch (70:30) (Laufmittel, LM 1) oder Ethanol-Wasser-Gemisch (90:10) (LM 2).
Präparativ: Kieselgel-Glasplatten mit Sammelschicht (VWR). LM 1 oder LM 2.

Umkehrphasen-Chromatographie (RP-Chromatographie), RP-18:
C-18 Material (Fluka), Säulenvolumen 10ml, Wasser-Methanol-Gradient. Fraktionen je 1ml wurden gesammelt und mit UV-Vis-Spektrometer analysiert. Fraktionen mit ähnlichen Spektren wurden vereinigt und lyophilisiert.
HPLC-Säulen mit ähnlichem Material können verwendet werden (Sigma).
Ionenaustausch-Chromatographie
DEAE-Zellulose (VWR), Gradient NH₄HCO₃ 20mmol/l – 1mol/l, Fraktionen wurden unter UV/Vis -Kontrolle gesammelt und auf Grundlage gleicher Spektren vereinigt.
Die Affinitätsisolierung von Nuk-Makromolekülen kann beispielsweise eingesetzt werden, wenn Nuk-Makromoleküle Oligonukleotide Bestandteil der Marker-Komponente sind. Durch die Hybridisierung an eine komplementäre, auf einer festen Phase fixierte Nukleinsäure können sie selektiv isoliert werden.
Die Bestimmung der Ausbeuten für farbstoffmarkierte Produkte erfolgte an UV-Vis-Spektrometer.
Die Vollständigkeit der Kopplung an Strepavidin wurde durch eine Kontrolltitration mit einem Biotin-Farbstoff (Biotin-4-Fluoreszein, Sigma) 100 μmol/l in 50 mmol/l Borat, pH 8, 5 min bei RT durchgeführt. Bei einer kompletten Besetzung von Biotin-Bindungsstellen an Strepavidin während der Synthese erfolgt keine Markierung von Streptavidin. Bei einer nicht ausreichenden Reaktion erfolgt eine Bindung an SA. Analyse mit UV-Vis.
Material:

Diamono PEG 10.000 (Diamino-Polyethylenglycol 10.000, Sigma), dUTP-AA (dUTP-Allylamine, Jena-Bioscience, Jena, Deutschland (im weiteren als Jena-Bioscience bezeichnet)), TTP (Thymidin-Triphosphat, kann auch als dTTP gekennzeichnet werden, Sigma), 3'-Amino-TTP (3'-Amino-3'-deoxy-Thymidin-Triphosphat, Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, CA, USA, (im weiteren als Trilink bezeichnet)), PDTP (3-(2-PYridinyl-dithio)-propionsäure), PDTP-NHS (3-(2-Pyridinyl-dithio)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma-Aldrich-Fluka, Taufkirchen, Deutschland, (im weiteren als Sigma oder Aldrich oder Fluka bezeichnet)), Cy3 (Farbstoff, Amerscham Bioscience, Freiburg, Deutschland, im weiteren als Amersham Bioscience bezeichnet)), Cy3- NHS (Cy3- N- hydroxysuccinimidyl-ester, Amerscham Bioscience), MEA ( Mercaptoethylamine, Sigma), DTT (1,4-Dithio-DL-threit, Sigma), CA (Cystamine, Sigma), TCEP – (Tris-(2-carboxyethyl)phosphine, Sigma), DTBP (3,3'-Dithio-Bis-Propionsäure, Fluka), Biotin-NHS (Biotin-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma). J-Ac (Iodoacetat, Sigma), Iodacetamid (Sigma), TEAE (Tris-(2-Aminoethyl)amine, Sigma), Maleimido-ES-NHS (Maleimido-Essigsäure-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma), EDA (Ethylendiamin, Sigma), CDI (1,1'-Carbonyldiimidazol, Sigma), NHS-PEG-Maleimid, 3.400 Da, Biotin-PEG-NHS, 5.000 Da, mPEG-SPA 5.000 Da, mPEG-SPA 20.000 Da (Nektar Molecular engineering, früher Shearwater Corporation, Huntsville, AL, USA, (im weiteren als Nektar bezeichnet)), Diamin-PEG, 6.000 Da (Fluka), 3'-Biotin-dT31 ein Oligonucleotid mit einer Sequenz aus 31 Thymidinmonophosphaten, mit einem Biotin-Molekül am 3'-Ende (MWG-Biotech, Ebersberg bei München, Deutschland, (im weiteren als MWG-Biotech bezeichnet)), 3'-SH-Oligo-dT30 ein Oligonucleotid mit einer Sequenz aus 30 Thymidinmonophosphaten, mit einer Merkaptogruppe am 3'-Ende (MWG-Biotech, Deutschland), 3'-Amino-Oligo-dT31-5'-Cy3 ein Oligonucleotid mit einer Sequenz aus 31 Thymidinmonophosphaten, mit einer über einen Linker aus 6 Atomen am 3'-Ende gekoppelten Amino-Gruppe und einem Cy3-Farbstoff, gekoppelt am 5'-Ende (MWG-Biotech, Deutschland), SA ( Streptavidin, Roche, Mannheim, Deutschland), SA-Cy2 ( mit Cy2-Farbstoff modifiziertes Streptavidin, Amersham). QDot (Qdot 605 Streptavidin Conjugat, Quantum Dot, Hayward, CA, USA, (im weiteren als Quantum Dot bezeichnet). Poly-Lysin 1000–2000 (Poly-L-lysin-hydrobromid 1000–2000 Da, Fluka), Poly-Lysin 10.000–20.000 (Poly-L-lysin-hydrobromid 10.000–20.000 Da, Fluka).

Lösungsmittel wurden, wenn nötig, absolutiert verwendet (Fluka) oder nach Standardverfahren getrocknet. Bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich die angegebenen Mischungsverhältnisse auf die eingesetzten Volumina (v/v).
Synthese einzelner Komponenten:
Beispiel 8.1:
dUTP-AA-PDTP, s. Beispiel 7A.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 7-Deaza-Aminopropargyl Guanosin-Triphosphat und 7-Deaza-Aminopropargyl Adenosin-triphosphate, 5-Amino-Propargyl-Uridin-Triphosphate können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide verwendet werden, 18 bis 21.
Beispiel 8.2:
dCTP-PA-PDTP,
Die Synthese wurde wie für dUTP-AA-PDTP, Beispiel 7A, beschrieben durchgeführt.
Beispiel 8.3:
Biotin-PEG-Ethyl-SH, 22
Zu 200 μl wässriger CA-Lösung (100mmol/l), pH 8.5, eingestellt mit NaOH, wurden 10 mg Biotin-PEG-NHS zugegeben und bei 40°C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde 200 μl TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration auf 3.000 MWCO (Molecular weight cut off) von anderen Reagenzien getrennt.
Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.
Beispiele für Kopplung von Linker-Komponenten und Marker-Komponenten an Nuk-Komponenten
Beispiel 8.4:
dUTP-AA-PEG-Biotin, 23
Zu 100μl wässriger Lösung dUTP-AA, 50mmol/l, pH 8.0, wurden 10mg Biotin-PEG-NHS gegeben und bei 40°C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde das nicht umgesetzte Nukleotid durch Ultrafiltration, 3.000 MWCO, abgetrennt und das Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-PEG-Biotin, mehrmals mit Wasser gewaschen.
Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin, ohne daß die Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen.
Biotin kann auch als eine niedermolekulare Marker-Einheit mit signalvermittelnden Funktion betrachtet werden, die an den langen Linker gekoppelt ist.
Das Produkt der Reaktion ist definitionsgemäß eine Zwischenstufe eines Nuk-Makromoleküls: die Linker-Länge ist deutlich größer als 30 Atome und an die Kopplungseinheit T können weitere Makromoleküle gekoppelt werden.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino-dCTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP und 7-Deaza-Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide verwendet werden, 18 bis 21.
Die Synthese dieses Nukleotids dient als Beispiel für die Synthese von Vorstufen für die Nuk-Makromoleküle.
Beispiel 8.5:
dCTP-PA-PEG-Maleimid,
Die Synthese erfolgte wie für dUTP-AA-PEG-Biotin, Beispiel 8.4, beschrieben. Als Edukte wurden dCTP-PA und Maleimid-PEG-NHS eingesetzt.
Diese Verbindung hat eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. Kopplungseinheit T an diesem Linker ist die Maleimid-Gruppe. An Maleimid-Funktionalität können makromolekulare signaltragende Moleküle gekoppelt werden, die eine oder mehrere SH-Gruppen tragen.
Maleimid-Gruppe kann auch als eine niedermolekulare Marker-Einheit mit signalvermittelnden Funktion betrachtet werden, die an den langen Linker gekoppelt ist.
Das Produkt der Reaktion ist definitionsgemäß eine Zwischenstufe eines Nuk-Makromoleküls: die Linker-Länge ist deutlich größer als 30 Atome, die Marker-Komponente ist niedermolekular. An diese Marker-Komponente können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, ohne daß die Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Allylamino-dUTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7- Deaza-Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide verwendet werden, 18 bis 21.
Die Synthese dieses Nukleotids dient als Beispiel für die Synthese von Vorstufen für die Nuk-Makromoleküle.
Beispiel 8.6:
dUTP-AA-SS-PEG-Biotin, 24,
Zu 100μl, 10mmol/l Biotin-PEG-Ethyl-SH in 50mM Borat, pH 9.5, wurde 50μl 30mmol/l dUTP-AA-PDTP in 50mM Borat, pH 9.5 zugegeben. Reaktion wurde 18 Stunden bei RT gerührt. Die Trennung erfolgt ähnlich wie für die Synthese von dUTP-AA-PEG-Biotin, Beispiel 8.4 beschrieben.
Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin, ohne daß die Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen. Über Streptavidin können auch weitere makromoleküle, beispielsweise Enzyme oder Nukleinsäurenge koppelt werden.
Das Produkt der Reaktion ist definitionsgemäß eine Zwischenstufe eines Nuk-Makromolekül: die Linker-Länge ist deutlich größer als 30 Atome.
Biotin kann auch als signalvermittelnde niedermolekulare Marker-Einheit bezeichnet werden.
Die Linker-Komponente kann zusammen mit der Marker-Komponente von der Nuk-Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden. Solche Nukleotide können im Sequenzierungsverfahren eingesetze werden.
Ein weiteres Beispiel für die Nuk-Makromoleküle mit einer unter milden Bedingungen spaltbaren Gruppe: dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin (25).
Für diese Reaktion wurde das dUTP-AA-PDTP zunächst auf RP-HPLC in Wasser-Methanol-Gradient gereinigt.
Zu 10μl einer 50 mmol/l Lösung von dUTP-AA-PDTP in Wasser wurden 20 μl einer 100 mmol/l Lösung von TCEP, pH 8, zugegeben. Die Reaktion wurde bei RT 10 min durchgeführt. Das Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-Propioat-SH, wurde von anderen Reagenzien auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2, getrennt. Das Produkt, dUTP-AA-Propionat-SH, bleibt auf der Startlinie. Es wurde von der Platte mit Wasser eluiert, eingeengt und in 50 μl 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 8, aufgelöst.
Zu dieser Lösung wurden 50 μl einer frisch angesetzten 2 % wässrigen Lösung von Biotin-PEG-NHS zugegeben. Die Reaktion erfolgte be RT 30 min lang. Anschließend wurde das Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin, durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 von niedermolekularen Reaktionskomponenten abgetrennt, fünf mal mit 0,5 ml Wasser gewaschen und in einem Volumen von 50 μl aufgelöst.
Das auf diese Weise erhaltene das dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin kann von DNA-Polymerasen, beispielsweise Klenow-Fragment Exo minus oder Taq-Polymerase, in den wachsenden Strang der Nukleinsäuren eingebaut werden.
An das Biotin können über das Straptavidin weitere Marker-Komponenten gekoppelt werden.
Das das dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin enthält eine unter milden Bedingungen spaltbare Gruppe, so daß der Linker mit dem Farbstoff von dem Nukleotid abgespalten werden kann. Solche Nukleotide können im Sequenzierungsverfahren eingesetze werden.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino-dCTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza-Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide verwendet werden, 18 bis 21.
Kopplungen an Marker-Komponenten
Beispiel 8.7:
(dUTP-16-Biotin)4-SA,
Zu 200μl einer Lösung von Biotin-16-dUTP 200μmol/l in 50mM Tris-HCl, pH 8.0, wurden 200μl einer Streptavidin-Lösung, 1mg/ml, in 50mM Tris-HCl, pH 8.0, zugegeben. Nach 1 Stunde bei RT wurde wurde das (dUTP-16-Biotin)4-SA vom nicht umgesezten Biotin-16-dUTP durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, abgetrennt.
Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten trägt.
Das Produkt der Reaktion ist definitionsgemäß ein konventionell modifiziertes Nukleotid: die Linker-Länge ist kleiner als 30 Atome, die Marker-Komponente ist makromolekular. Es kann stellvertretend für konventionell modifizierte Nukleotide mit einem makromolekularen Markern betrachtet werden.
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation führt zum Verlust der Substrateigenschaften. Eigenschaften der Biotin-Streptavidin-Bindung sind z.B.in Gonzalez et al. Journal Biolog. Chem. 1997, v. 272, S. 11288 beschrieben.
Beispiel 8.8:
(dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy2,
Die Kopplung von dUTP-16-Biotin an SA-Cy2 wurde wie für (dUTP-16-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt. Die Verbindung dient als Äquivalent zu Verbindung aus Beispiel 8.7, wobei zur Visualisierung Streptavidin fluoreszent markiert ist.
Beispiel 8.9:
(dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2 und (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA, 26
Die Kopplung von dUTP-AA-PEG-Biotin an SA-Cy2 bzw. an SA wurde wie für (dUTP-16-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt. Zu 200μl 1μg/μl Streptavidin wurden 10μl einer Lösung von dUTP-AA-PEG-Biotin, ca. 1mmol/l, gegeben, und bei RT 1 h gerührt. Danach wurde das Produkt durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, von dem nicht gekoppelten dUTP-AA-PEG-Biotin abgetrennt und das Produkt 2 mal mit Wasser gewaschen.
Ein Teil des gewonnenen (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2 wurde mit Cy3-NHS modifiziert: 50μl (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2 wurden in 50mmol/l Borat, pH 8.5, aufgelöst, bis zur Konzentration von 1.4μg/μl, und anschließend mit Cy3-NHS versetzt. Endkonzentration von Cy3 betrug 10mmol/l. Die Reaktion wurde 1 Std. bei RT durchgeführt. Das Produkt, (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2/Cy3, wurde durch Ultrafiltration mit 30.000 MWCO getrennt.
Dadurch wurde ein Nuk-Makromolekül hergestellt, dass sehr wenige freie Amino-Gruppen am Marker-Teil aufweist.
Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker-Komponente trägt.
Das Produkt der Reaktion ist definitionsgemäß ein Nuk-Makromolekül: die Linker-Länge ist deutlich größer als 30 Atome, die Marker-Komponente ist makromolekular. Es kann stellvertretend für Nuk-Makromoleküle betrachtet werden.
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.
Beispiel 8.10:
(dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-TEG-Biotin)2- SA-Cy2,, 27
Die Kopplung von dUTP-AA-PEG-Biotin an SA-Cy2 wurde wie für (dUTP-16-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt:
Zu 100μl einer Streptavidin-Cy2-Lösung, 20μmol/l (1.2mg/ml), in Tris-HCl, 50mmol/l, pH 8, wurden 80μl 80μmol/l dT31-3'-TEG-Biotin (MWG Biotech) zugegeben und 10 min bei RT inkubiert. (TEG ist ein kurzer Linker zwischen Biotin und dT31). Danach wurden 100μl einer Lösung dUTP-AA-PEG-Biotin 50μmol/l in 50mM Tris-HCl, pH 8.0, zugegeben. Nach 10 min bei RT wurde (dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-TEG-Biotin)2- SA-Cy2 durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, gereinigt.
Die Substanz trägt eine Nukleosid-Triphosphat-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten (Oligo-dT31). Das Oligo-dT31 besteht aus Nukleosidmonophosphaten, die allerdings an der enzymatischen Reaktion nicht teilnehmen und nur eine signalvermittelnde Funktion haben. An ein solches Oligonukleotid können komplementäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, die eine signalgebende Funktion haben (28). (allgemeine Regeln zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999).
Das Produkt der Reaktion ist definitionsgemäß ein Nuk-Makromolekül: die Linker-Länge ist deutlich größer als 30 Atome, die Marker-Komponente ist makromolekular. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.
Dieses Derivat kann beispielsweise an Poly-dA oder poly-A (z.B. mit durchschnittlicher Länge 260NT, Amersham Bioscience) durch Hybridisierung gekoppelt werden. Sowohl ein einziges als auch mehrere (dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-Biotin)2- SA-Cy2 Moleküle können an ein Poly-dA-Molekül gekoppelt werden. Das Verhältnis wird durch die Konzentrationsverhältnisse bestimmt. Auch andere Oligonukleotide, beispielsweise markiert mit Farbstoffen, können zusammen mit(dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-Biotin)2- SA-Cy2 an denselben Strang der Poly-dA oder poly-A gekoppelt werden, wobei die Verhältnisse zwischen einzelnen Molekülen variabel sind. Dadurch ist es möglich, ein polyfunktionales Nuk-Makromolekül herzustellen. Der große Vorteil eines solchen Nuk-Makromoleküls besteht in einer leicht spaltbaren makromolekularen Markierung: die an die poly-dA bzw. poly-A Stränge hybridisierten markierten Oligonukleotide können durch Denaturierung abgelöst werden. Durch die Wahl der Länge der markierten Oligonukleotide, kann die Tm dieser Oligonukleotide für die jeweiligen Anforderungen der reversiblen Markierung angepasst werden. Die Regeln zur Tm-Berechnung sind dem Fachmann bekannt ("Molecular-Cloning", J. Sambrook, band 1–3, 2001). Beispielsweise können dT₂₅-Oligonukleotide, markeirt mit einem Cy3-Molekül an Poly-dA gekoppelt werden. Durch den Einsatz von RNA, z.B. poly-A, zur Bindung mehrer (dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-Biotin)2-SA Moleküle, kann die Spaltung durch eine RNase erfolgen.
Da Streptavidin 4 Bindungsstellen für Biotin hat, entsteht ein Gemisch von Nuk-Makromolekülen, bei dem 4 Bindungsstellen unterschiedlich besetzt sind. Dieses Gemisch kann mit unterschiedlichen Mitteln getrennt werden. Eine der Möglichkeit besteht in Isolierung von Nuk-Makromolekülen, die mindestens ein Oligo-dT31 tragen, beispielsweise durch eine Absorbtion an einem Anionaustauscher (z.B. einer DEAE-Cellulose-Säule). Auf Gel-Elektrophorese eignet sich zur Trennung einzelner Derivaten.
Auch längere Nukleinsäureketten, die ein Biotin-Molekül tragen, beispielsweise poly-dA-Biotin, hergestellt beispielsweise durch eine terminale Kopplung von ddUTP-18-Biotin durch eine TdT-abhängige Reaktion ("Molecular-Cloning", J. Sambrook, Band 1–3, 2001), können in ähnlicher Weise an das Streptavidin gekoppelt werden, so dass Moleküle mit einer durchschnittlichen Zusammensetzung von (dUTP-AA-PEG-Biotin)_N-(Nukleinsäureketten-Biotin)_M-SA entstehen. Sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäureketten können gekoppelt werden. Die Länge der gekoppelten Nukleinsäureketten kann zwischen 10 und 100, 100 und 1000 Nukleotiden liegen.
Die hybridisierten Oligonukleotide, die einen Farbstoff tragen, können an den Poly-dA Strang auch kovalent durch Cross-Linker gebunden werden.
Beispiel 8.11:
(dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA und (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA-Cy2, 29
Die Kopplung von dUTP-AA-SS-PEG-Biotin an SA bzw. an SA-Cy2 wurde wie für (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt. Als Edukte wurden Streptavidin und dUTP-AA-SS-PEG-Biotin eingesetzt.
Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker-Komponente trägt. Die Linker-Komponente und die Marker-Komponente können von der Nuk-Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden.
Das Produkt der Reaktion ist definitionsgemäß ein Nuk-Makromolekül: die Linker-Länge ist deutlich größer als 30 Atome, die Marker-Komponente ist makromolekular. Es kann stellvertretend für Nuk-Makromoleküle betrachtet werden, die eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung in der Linker-Komponente tragen.
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.
Beispiel 8.12: Substrateigenschaften von Nuk-Makromolekülen
Dieses Beispiel soll nicht zur Einschränkung der möglichen Markierungsreaktionen dienen, sondern lediglich Unterschiede in den Substrateigenschaften verdeutlichen.
Als Matrizen dienten sowohl kurze Oligonucleotide als auch poly-dA. Primer und Oligonukleotide wurden von MWG-Biotech, Deutschland synthetisiert.
Reaktionen wurden in 20mmol/l Tris-Puffer, pH 8.5, 5mmol/l MgCl₂, 10% Glycerin, durchgeführt. Die Konzentrationen der Primer betrugen 1μmol/l, die der Oligonukleotide 1μmol/l und die Konzentration der poly-dA, 0.1μg/μl (für die Konzentrationsverhältnisse an der festen Phase s.u.). Als Polymerase wurde Klenow Exo minus 1Unit/100μl (Amersham) verwendet. Die Konzentrationen von Nukleotiden betrugen 20μmol/l für konventionell modifizierte Nukleotide und 5 μmol/l für Nuk-Makromoleküle. Nicht modifizierte Nukleotide wurden in Konzentrationen von 50μmol/l eingesetzt.
Zunächst wurden Primer an die jeweilige Matrize hybridisiert: Das Reaktionsgemisch ohne Polymerase wurde auf 75°C erhitzt und über 5 min auf 37°C abgekühlt. Danach wurde die Polymerase zugegeben. Alle Reaktionen wurden über 1 h bei 37°C durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA (Endkonzentration von 10mmol/l) gestoppt.
Zu einigen Ansätzen wurde nach dem Stop der Reaktion Streptavidin, bis zu Endkonzentration von 1mg/ml, zugegeben und der Ansatz weitere 10 min bei 37°C inkubiert. Dadurch können bereits eingebaute Nukleotide, die ein Biotin tragen, mit Streptavidin reagieren und somit Streptavidin und Oligonukleotid verbinden. Diese Experimente eignen sich als Kontrolle für die Laufeigenschaften von modifizierten Primern.
Zu entsprechend gekennzeichneten Ansätzen wurde Mercaptoethanol (bis 20mmol/l Endkonzentration) zugegeben und der jeweilige Ansatz wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Mercaptoethanol wurde bei einigen Anstzen während, bei anderen Ansätzen auch nach der Reaktion zugegeben.
Die Analyse der Reaktion erfolgte mittels denaturierender Gel-Elektrophorese, 20% Polyacrylamid-Gel, 50mmol/l Tris-HCl, pH 8.7, wie in "Gel electrophoresis of nucleic Acids", Ed. D. Rickwood, 1990, dargestellt. Zur Denaturierung der Proben wurde anstatt von 7M Urea eine erhöhte Temperatur bei der Gelelektrophorese eingesetzt (60°C). Die Elektrophorese wurde in Biorad-Gelkammern (Protean 3) durchgeführt, 200V, ca. ih. Die Visualisierung erfolgte auf einer UV-Vis Gel-Dokumentationsanlage (Biorad).
Beispiel 8.12A, 30
Substrateigenschaften von Nuk-Makromolekülen
Sequenzen:

Primer: Primer-dT₃₅-5'-Cy3 (dT35-Cy3): 5' Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
Matrize: Poly-dA (Amersham), durchschnittlich 270 Nukleotide lang.
Nukleotide: (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, (dUTP-16-Biotin)4-SA, dUTP-16-Biotin

Legende 30:
Spuren 1–9:

1) Leiter: T-7-20-Cy3, dT35-Cy3, dT40-Cy3, dT50-Cy3
2) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase
3) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA
4) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase
5) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA
6) (dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy3 + dT35-Cy3 + Poly-dA

Im Kontroll-Ansatz, Spuren 7–9:

7) dUTP-16-Biotin + dT35-Cy3 + Poly-dA + Polymerase, Inkubation 1 std. 37°C danach + EDTA bis 10mmol/l Endkonzeentration, danach + Streptavidin 10 min 37°C
8) dUTP-16-Biotin + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase, Inkubation 1 std. 37°C danach + EDTA bis 10mmol/l Endkonzeentration,
9) Leiter: T-7-20-Cy3, dT35-Cy3, dT40-Cy3, dT50-Cy3

Ein Nuk-Makromolekül, (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, wird in den Primer eingebaut (Spur 2). Der markierte Primer hat nach dem Einbau eines Nuk-Makromoleküls eine stark veränderte elektrophoretische Beweglichkeit. Bloße Anwesenheit von Nuk-Makromolekülen hat keinen Einfluß auf den Primer (Spur 3).
Ein konventionell modifiziertes Nukleotid, (dUTP-16-Biotin)4-SA, mit einem makromolekularen Marker wird nicht in den Primer eingebaut (Spur 4). Trotz der Anwesenheit der Polymerase in Reaktion 4 (Spur 4) lassen sich keine Unterschiede zwischen Spur 4 und Spur 5 feststellen.
Spur 6 zeigt die Position des konventionell modifizierten Nukleotids mit einem makromolekularen Marker, (dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy3, die obere Bande, und die Position des markierten Primers (die untere Bande).
Spur 7 zeigt das Ergebnis des Einbaus von dUTP-16-Biotin mit einer nachfolgenden Reaktion mit dem Streptavidin: die mit Biotin makrierten Primer reagieren mit Streptavidin und verändern ihre Laufeigenschaften. Die nicht modifizierten Primer behalten ihre elektrophoretischen Eigenschaften bei.
Spur 8 zeigt das Ergebnis der Einbaureaktion eines konventionell modifizierten Nukleotides, dUTP-16-Biotin. Man sieht eine verbreitete Primer-Bande, die durch den Einbau von dUTP-16-Biotin in den Primer zustande kommt. Die Verlängerung von Primer ist eingeschränkt, da dUTP-16-Biotin nicht unbegrenzt nacheinander eingebaut werden kann, durchschnittlich wird ca. 3 dUTP-Analoga eingebaut, so daß die Länge von Primer durchschnittlich auf 38 NT ansteigt. Erwartungsgemäß führt der Einbau von konventionell modifizierten Nukleotiden mit einem niedermolekularen Marker nicht zu einer starken Veränderung in der elektrophoretischen Mobilität der Primer.
In diesem Experiment wurden Eigenschaften der Nuk-Makromoleküle, (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, mit denen der Konventionell modifizierten Nukleotide verglichen. Man sieht deutlich, daß die Kopplung eines makromolekularen Markers an ein kommerziell erworbenen dUTP-16-Biotin zum vollständigen Verlust der Substrateigenschaften der Nukleotide führt. Spuren 7 und 8 zeigen allerdings, daß die Polymerase sehr wohl in der Lage ist, dUTP-16-Biotin ohne makromolekularen Marker in den Primer einzubauen. Die Koppung von Streptavidin an das Biotin nach der Einbaureaktion führt zu genannten Veränderungen in Primer-Eigenaschaften.
Im Gegensatz dazu können Nuk-Makromoleküle (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA in den Primer ohne Schwierigkeiten durch die Polymerasen eingebaut werden. Das Auftreten von mehreren Banden im Gel führen die Erfinder auf einen mehrfachen Einbau von Nuk-Makromolekülen in den Primer (3 Banden) zurück.
Beispiel 8.12B, 31:
Vergleich von Substrateigenschaften von Nuk-Makromolekülen, Einbau-Reaktion in der Lösung und an einer festen Phase
Sequenzen:

Primer: (dT35-Cy3) Primer-dT-35-5'-Cy3: 5' Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
Matrize: Poly-dA (Amersham), durchschnittlich 270 Nukleotide lang. Oligo-dA50-3'-TEG-Biotin (MWG-Biotech)
Nukleotide: (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, (dU-AA-PEG-Biotin)4-SA Streptavidin-polystyre Particle, 2.17μ, Spherotech Inc,

Vorbereitung von Streptavidin-polystyre Particle (feste Phase).
Drei Ansätze wurden in gleicher Weise vorbereitet.
Je 0.5 ml der Lösung mit Kügelchen (im Hersteller-Puffer) wurde kurz zentrifugiert und Kügelchen-Pellet wurde in 100μl Einbaupuffer (20 mmol/l Tris, pH 8.5, 5mmol/l MgCl2) resuspendiert. Anschließend wurden 100μl Oligo-dA50-3'-TEG-Biotin Konz. 50μmol/l zugegeben und 1 h bei RT gerührt. In dieser Zeit binden die Oligo-dA-Moleküle an die Kügelchen. Anschließend wurden Kügelchen kurz abzentrifugiert und drei mal im Einbaupuffer gewaschen. Endvolumen der festen Phase betrugt je 100μl. Diese Menge an Oligo-dA50-feste-Phase kann Primer-dT-35-Cy3 in 2μmol/l hybridisieren.
Die Hybridisierung von Primer-dT-35-Cy3 erfolgte bei 40°C 10 min, mit anschließender Abkühlung auf RT innerhalb von 10 min. Alle anderen Schritte wurden gleich bei allen Ansätzen durchgeführt.
Legende, 31:
Spuren 1–10:

1) Leiter: dT35-Cy3, dT40-Cy3,

Reaktionen in der Flüssigphase:

2) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase
3) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA
4) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA
5) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA, anschließend + Mercaptoethanol bis zu 200mmol/l (Endkonzentration), für 30 min.
6) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA + EDTA

Reaktionen an der Festphase:

7) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Oligo-dA50-feste-Phase+ Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA
8) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Oligo-dA50-feste-Phase + Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA, anschließend + Mercaptoethanol bis zu 200mmol/l (Endkonzentration), für 30 min.
9) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Oligo-dA50-feste-Phase, vor Elektrophorese + EDTA
10) Leiter: dT35-Cy3, dT40-Cy3,

Man sieht deutlich das Ergebnis der Einbaureaktion von Nuk-Makromolekülen in Spuren 2, 4, 5, 7, 8. Sowohl in der Lösung, als auch an der festen Phase läuft die enzymatische Markierungsreaktion gut ab.
Nach Zugabe von Mercaptoethanol zu mit EDTA gestoppten Reaktionen erfolgt die Abspaltung von Linker-Komponenten mit dem gebundenen Streptavidin von den Primern. Dies fühhrt zu Wiederherstellung der elektrophoretischen Eigenschaften der Primer. Die Verschiebung der Primer-banden in Spuren 5 und 8 ist durch multiplen Einbau von Nuk-Makromolekülen in die Primer zu begründen. Tatsächlich, liegen die Primer-Banden nach der Spaltung in Höhe von dT40-Cy3 (s. Leiter). Dies bedeutet, daß bis zu 5 Nuk-Makromolekülen während der Reaktion in die Primer eingebaut wurden.
Beispiel 8.13:
Synthese von dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 (32)
Hestellung von SH-R-PEG-Oligo-dT₃₁-Cy3 (33):
Zu 200 μl einer 100 μmol/l Lösung von 3'-Amino-Oligo-dT₃₁-Cy3 im 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wurde NHS-PEG-Maleimid zugegeben, bis die Konzetration von 20% (w/v) erreicht wurde. Das Gemisch wurde 2 h bei 40°C kräftig gerührt. Die Trennung des Maleimid-PEG-Oligo-dT₃₁-Cy3 vom Überschuß an PEG-Derivat erfolgte aug DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie: Das Reaktionsgemisch wurde in 10 mmol/l Borat, pH 9, auf die Säule aufgetragen, und mit 20 Säulenvolumina 50 mmol/l Borat, pH 9, gewaschen. Elution von Maleimid-PEG-Oligo-dT₃₁-Cy3 von der Säule erfolgte mit 1 M NaCl in 50 mmol/l Borat, pH 9. Das Eluat wurde durch Ultrafiltration (MWCO 3000) zunächst eingeengt und das Produkt wurde in 20 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, umgepuffert. Das Maleimid-PEG-Oligo-dT₃₁-Cy3 wurde vom Oligo-dT₃₁-Cy3 auf präparativem 15% Polyacrylgel durch die Elektrophorese getrennt, aus dem Gel isoliert und in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, aufgelöst. Zu Lösung mit Maleimid-PEG-Oligo-dT₃₁-Cy3 wurde DTT bis zu Konzentration 0,5 mol/l zugegeben und das Gemisch wurde 16 h bei RT gerührt. Durch Reaktion von DTT mit Maleimid entsteht SH-R-PEG-Oligo-dT₃₁-Cy3. Diese Substanz wurde auf DEAE-Säule vom DTT-Überschuß abgetrennt: Das Reaktionsgemisch wurde in 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, auf die Säule aufgetragen, und mit 20 Säulenvolumina 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0 gewaschen. Elution von SH-R-PEG-Oligo-dT₃₁-Cy3 von der Säule erfolgte mit 1 mol/l NaCl in 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0. Das Eluat wurde mit Ultrafiltration (MWCO 3000) zunächst eingeengt und das Produkt, SH-R-PEG-Oligo-dT₃₁-Cy3, wurde in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0 umgepuffert. Die Konzentration von SH-R-PEG-Oligo-dT₃₁-Cy3 betrug 100 μmol/l.
Zu dieser Lösung wurden 50 Äquivalente an dUTP-AA-PDTP (synthetisiert wie im Beispiel 7A) zugegeben. Nach 3 h bei RT erfolgte Trennung auf DEAE-Cellulose: Das Gemisch wurde in 50 mmol/l Na-Acetat-Puffer, pH 6.0, auf die Säule aufgetragen, und mit 20 Säulenvolumina 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, gewaschen. Elution von dUTP-AA-PDTP erfolgte mit 0,3 mol/l NaCl in 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, Elution von dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 erfolgte mit 0,8 mol/l NaCl in 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0. Das Eluat wurde mit Ultrafiltration (MWCO 3000) zunächst eingeengt und das Produkt wurde in 50 mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, umgepuffert.
Die Substanz trägt eine Nukleosid-Triphosphat-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten (Oligo-dT31). Das Oligo-dT31 besteht aus Nukleosid-Monophosphaten, die allerdings an der enzymatischen Reaktion nicht teilnehmen und nur eine signalvermittelnde Funktion haben. An ein solches Oligonukleotid können komplementäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, die eine signalgebende Funktion haben. (allgemeine Regeln zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999.).
Das Nukleotid ist definitionsgemäß ein Nuk-Makromolekül: die Linker-Länge ist deutlich größer als 30 Atome, die Marker-Komponente ist makromolekular.
Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.
In ähnlicher Weise können auch andere Oligonukleotide an das dUTP-Derivat gekoppelt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung können andere Homopolymer-Oligonukleotide, wie z.B. Poly-dC, poly-dG oder poly-dU oder poly-dA. In einer anderen Ausführungsform können auch Oligonukleotide mit spezifischen Sequenzen eingesetzt werden. Durch die spezifische Sequenzen von Oligonukleotiden können Nukleinsäureketten sequenzspezifisch hybridisiert werden. Zur Synthese von Nuk-Makromolekülen können auch Oligonukleotide eingesetzt werden, die Haarnadel-Strukturen (Stemloops) beinhalten.
In diesem Beispiel trägt das Oligonukleotid eine am 3'-Ende über einen Linker gekoppelte Amino-Gruppe, die als Kopplungsstelle für Maleimid-PEG-NHS auftritt, und den Cy3-Fluoreszenzfarbstoff. Auch andere Kopplungsgruppen, wie SH-, Carboxy-, Aldehyd-Gruppen können eingesetzt werden.
Die Position der Kopplungsgruppe kann an einem der Enden der Oligonukleotide sein, oder auch mitten in der Sequenz liegen. Solche Oligonukleotide können von der Firma MWG-Biotech, Deutschland, synthetisiert werden.
Als Modifikationen können Oligonukleotide Fluoreszenzfarbstoffe oder andere Reporter-Gruppen, wie Biotin, Digaxygenin tragen. Auch mehrere Modifikationen pro ein Oligonukleotid sind möglich. Beispielsweise können FRET-Paare oder Fluoreszenzfarbstoff-Quanchermolekül-Paar in ein Oligonukleotid eingefügt werden.
Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino-dCTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza-Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide verwendet werden, 18 bis 21. Auch andere basenmodifizierte Nukleotide können in ähnlicher Weise eingesetzt werden.
Durch Zugabe von Poly-dA oder Poly-A können mehrere dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3, z.B. 10–20, zu einem Nuk-Makromolekül gekoppelt werden. Dabei entsteht ein Nuk-Makromolekül mit linear angeordneten Nuk-Linker-Komponenten (34).
Durch Zugabe von anderen modifizierten Oligonukleotiden, die an Poly-dA oder Poly-A binden können, können auch weitere Modifikationen eingeführt werden, z.B. Fluoreszenzmarkierung.
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Anhang 1:
Modifizierung der Polymerase
Die Modifizierung der Polymerase ist vorzugsweise eine kovalente Modifizierung. Beispiele für eine solche Modifizierung stellt eine Alkylierung an der SH-Gruppe dar, z.B. mit alpha-Halogen-Acetyl-Derivate, wie beispielsweise Iodacetamid und seinen Derivaten, Iodacetat und seinen Derivaten, oder mit N-Maleimid-Derivaten, weitere selektive SH-Gruppen Reagenten sind in „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc. beschrieben. Diese Modifizierung kann auch durch einen Fluoreszenzfarbstoff erfolgen. Aktivierte Fluoreszenzfarbstoffe, die selektiv mit SH-Gruppen reagieren, sind kommerziell erhältlich, z.B. von Molecular Probes Inc. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine selektive Modifikation des Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase an SH-Gruppe des Cysteins. Das an dem Cysten modifizierte Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase kann in einer Ausführungsform an stelle eines nicht modifizierten Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase in der enzymatischen Einbau-Reaktion eingesetzt werden. Anhang 2 Tabelle 18, Oligonukleotide
Spalte A – Bezeichnung der Oligo
Spalte B – Hersteller
Spalte C – Sequenz der Oligo
Hersteller 1: MWG-Biotech, Deutschland, synthetisiert.
Hersteller 2: Thermo electron corporation GmbH, Ulm, Deutschland.
bei Oligo 31 ist die Primerbindungsstelle unterstrichen. Tabelle 19 Liste der markierten Oligonukleotiden, die im Test 1.3 eingesetzt wurden.
Spalte A – Bezeichnung der Oligo
Spalte B – Hersteller
Spalte C – Sequenz der Oligo
Hersteller 1: MWG-Biotech, Deutschland, synthetisiert.
Anhang 3, Tabelle 20
Erläuterungen zu Tabelle 20:
Buchstaben (U, C) bedeuten detektierte Signale von markierten Nukeotide in einem Zyklus, (A) steht für nicht abgespaltene Signale.
Falls X,Y-Koordinaten von den auf der Oberfläche verteilten Signalen zwischen verschiedenen Zyklen übereinstimmen, werden diese Signale zu einer Sequenz zusammengefaßt, beispielsweise:
--U-----U----C------: 180
--U--U--U--U-C------: 215
In den Abspaltungszyklen und in den Zyklen, in denen ein nicht komplementäres Nukleotid angeboten wird, fehlen Signale an Primer-Matrize-Komplexen. Das Fehlen der Signale mit für die jeweilige Position spezifischen Koordinaten wird mit Strich (-) dargestellt.
Wegen Bleaching der Fluoreszenz der markierten Nukleotide fehlen bei einigen Sequenzen Signale in der Sequenzmitte, z.B.
-----U--U--U-C------: 115
--U-----U--U-C------: 162
--U--U-----U-C------: 135
--U--U--U----C------: 138
vergliechen zu korreten Sequenz
--U--U--U--U-C------: 215
Sequenzen mit denselben Abfolgen von Signale werden zu einer Sequenz-Gruppe zusammengefaßt. Die Zahl nach den Doppelpunkt gibt die Zahl der Sequenzen, in einer Sequenz-Gruppe an.
Die Sequenzen-Gruppen mit gleicher Zahl an Signalen (Buchstaben) werden in Kategorien zusammengefaßt, Länge 2, 3, 4 usw.
Legenden für Figuren:
1 zeigt Aufnahmen einer sequenzspezifischen Einbaureaktion. Dargestellt sind Ausschnitte der Aufnahmen der Zyklen 1 bis 6 im Beispiel 6.1 MFC 1330 Channel B, Pos 2.
2 zeigt Beispiele für unterschiedliche Dichten der Signale von einzelnen Molekülen. Experimente wurden wie im Beispiel 6.1 durchgeführt, wobei nur der erste Einbau von markierten Nukleotiden detektiert wurde. Auflösung der Apparartur betrug 300 nm.
3a zeigt den Aufbau der Fließkammer (Mikrokanal): A) Ansicht von oben, B) Seitenansicht, C) schematische Darstellung von einzelnen Komponenten der Fließkammer am Mikrokanal. 1. Deckglas, 2. Parafilmmaske, 3. Objektträger, 4. Mikrokanal
3b zeigt schematische Darstellung der Flußrichtung beim Austausch von Lösungen im Mikrokanal.
4a zeigt schematische die Bestandteile der Detektionsapparatur: 1. Kamera, 2. Lichtweg für Fluoreszenzsignale, 3. Farbteiler mit Sperrfilter und Bandfilter, 4. Objektiv, 5. Objekttisch, 6. Kondensor, 7. Lichtweg für Durchlicht, 8. Lichtspiegel, 9. Lichtquelle für Anregungslicht für Fluoreszenz, 10. Lichtquelle für Durchlicht, 11. Fokussierungsoptik mit Shutter für Anregungslicht, 12. Fokussierungsoptik mit Shutter für Durchlicht, 13. Fluoreszenzmikroskop, 14. Rechner, 15. Bildschirm für Visualisierung der Daten
4b zeigt schematische Darstellung von Bildaufnahmen von der Oberfläche:
1. Objektiv, 2. Anregungslicht, 3. Immersionsöl, 4. Deckglas (Dach des Mikrokanals), 5. an der Oberfläche fixierte Nukleinsäureketten, 6. Mikrokanal mit einer Lösung, 7. Objektträger (Boden des Mikrokanals), 8. Fokusebene des Objektivs. In dieser Anmeldung wurden Mikrokanalvorrichtungen verwendet, die zwei im Sinne dieser Anmeldung modifizierten Glasoberflächen einschließen: eine auf der zum Mikrokanal gerichteten Seite des Deckglases, eine auf der zum Mikrokanal gerichteten Seite des Objektträgers. Die Signale wurden von der Deckglasoberfläche detektiert.
5 zeigt eine Bildaufnahme von der Oberfläche im Beispiel 5.1.2 nach der Hybridisierung von dA26-Cy3 an die fixierten dT31-Amino-Nukleinsäuren. Abbildung A zeigt das gesamte Bild (1030 × 1300 pixel), das entspricht 60 μm × 80μm. Abbildung B zeigt einen Ausschnitt aus der Abbildung A. Einige Signale von einzelnen Farbstoffmolekülen werden mit Kreisen hervorgehoben. Mit Rechtecken sind helle Signale markiert, die vemutlich Konglomerate von Molekülen darstellen.
6 zeigt Beispiele für unspezifische Bindung an der Oberfläche:
6A – Test 1.1 im Beispiel 1, 6B – Test 1.2 im Beispiel 1.1, 6C – Test 1.3 Oligo-T7-19-Cy3 im Beispiel 1.1, 6D – Test 1.4 im Beispiel 1.1.
7 zeigt Ausschnitte von den Oberflächenaufnahmen im Beispiel 5.1.2
Abbildung A zeigt Oberfläche nach der Prüfung unspezifischer Bindung markierter Oligonukleotide. Abbildung B zeigt denselben Abschnitt der Oberfläche nach einer spezifischen Hybridisierung von markierten Oligonukleotiden.
8 zeigt Ausschnitte von den Oberflächenaufnahmen im Beispiel 5.1.4
Abbildung A zeigt Oberfläche nach der Prüfung unspezifischer Bindung markierter Oligonukleotide. Abbildung B zeigt denselben Abschnitt der Oberfläche nach einer spezifischen Hybridisierung von markierten Oligonukleotiden.
9a zeigt eine Sequenzierungsreatkion an der Oberfläche mit einzelnen Molekülen, s. Beispiel 6.1. Dargestellt ist deselbe Ausschnitt von den Oberfläche, in unterschiedlichen Stadien der zyklischen Sequenzierung von Zyklus 1 bis Zyklus 20, Beispiel 6.1, MFC 1330 Channel B, Pos 2, Mitte. Reihenfolge der Zugabe von Reagenzien s. Tabelle 15.
9b zeigt die Position des Ausschnitts in 9a in Pos. 2 (Abbildung von Pos 2 im Zyklus 3).
10 Schematische Darstellung eines reversibel markierten dUTP-Analogs, s. Beispiel 7A
11 Schematische Darstellung eines reversibel markierten dUTP-Analogs, s. Beispiel 7B
12 Schematische Darstellung eines reversibel markierten dCTP-Analogs, s. Beispiel 7C
13 Schematische Darstellung eines reversibel markierten dUTP-Analogs, s. Beispiel 7D
14 Schematische Darstellung eines reversibel markierten dUTP-Analogs, s. Beispiel 7E

Claims

Ein Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs) mit optischen Mitteln, das folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer festen Phase 2. Bindung von zu analysierenden Nukleinsäureketten an die feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexe, 3. Durchführung einer zyklischen Reaktion mit den auf der festen Phase fixierten Primer-Matrize-Komplexen, die folgende Schritte einschließt: 3.1 enzymatischer Einbau von markierten Nukleotiden an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen, 3.2 Waschen der festen Phase 3.3 Detektion der Markierung von eingebauten markierten Nukleotiden, wobei relative Koordinaten einzelner Signale identifiziert werden 3.4 Entfernung der Signale von eingebauten Nukleotiden, 3.5 Waschen der festen Phase 3.6 gegebenenfalls Wiederholung der Schritte 3.1 bis 3.5 4. Rekonstruktion der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäureketten aus den unter Schritt 3.3 erhaltenen Signalen
Feste Phase für Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 1, wobei die Oberfläche der festen Phase eine Eigenschaft der geringen unspezifischen Bindung von markierten Komponenten aufweist.
Feste Phase nach Anspruch 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 200 Ereignisse/100 μm² während Analyse beträgt.
Feste Phase nach Anspruch 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 100 Ereignisse/100 μm² während Analyse beträgt.
Feste Phase nach Anspruch 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 50 Ereignisse/100 μm² während Analyse beträgt.
Feste Phase nach Anspruch 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 20 Ereignisse/100 μm² während Analyse beträgt.
Feste Phase nach Anspruch 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 10 Ereignisse/100 μm² während Analyse beträgt.
Feste Phase nach Anspruch 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 5 Ereignisse/100 μm² während Analyse beträgt.
Feste Phase nach Anspruch 2, wobei die unspezifische Bindung von markierten Komponenten eine Bindung von weniger als 2 Ereignisse/100 μm² während Analyse beträgt.
Feste Phase nach Anspruch 1 bis 9, wobei die feste Phase eine Silica-Oberfläche einschließt
Feste Phase nach Anspruch 1 bis 9, wobei die feste Phase eine Glas-Oberfläche einschließt
Feste Phase nach Anspruch 1 bis 9, wobei die feste Phase eine SiO₂-Oberfläche einschließt
Feste Phase nach Anspruch 1 bis 9, wobei die feste Phase eine Si-OH-Oberfläche einschließt
feste Phase nach Anspruch 1 bis 13, wobei die Oberfläche der festen Phase flach ist
Feste Phase nach Ansprüchen 1 bis 14, wobei an Oberfläche dieser festen Phase Nukleinsäureketten fixiert sind.
Feste Phase nach Ansprüchen 1 bis 14, wobei an diese feste Phase Nukleinsäureketten über einen Linker fixiert sind.
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung von Nukleinsäureketten an die feste Phase
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung einer Linker-Schicht an die feste Phase 3. Kopplung von Nukleinsäureketten an die Linker-Schicht
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Zyklische Synthese von Nukleinsäureketten an der festen Phase
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung einer Linker-Schicht an die feste Phase 3. Zyklische Synthese von Nukleinsäureketten an der festen Phase
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung von Nukleinsäureketten an die feste Phase 3. Kopplung weiterer Substanzen
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung einer Linker-Schicht an die feste Phase 3. Kopplung von Nukleinsäureketten an die Linker-Schicht 4. Kopplung weiterer Substanzen
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Zyklische Synthese von Nukleinsäureketten an der festen Phase 3. Kopplung weiterer Substanzen
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 16, wobei die Herstellung folgende Schritte einschließt: 1. Entfernung der Außenschicht der festen Phase 2. Kopplung einer Linker-Schicht an die feste Phase 3. Zyklische Synthese von Nukleinsäureketten an der festen Phase 4. Kopplung weiterer Substanzen
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 24, wobei die Außenschicht nur partiell abgetragen wird.
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 25, wobei die Entfernung der Außenschicht durch chemische Reaktion erfolgt
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Anspruch 26, wobei die chemische Reaktion in Anwesenheit von HF erfolgt
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Anspruch 26, wobei die chemische Reaktion in Anwesenheit von NaOH erfolgt
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 1 nm und 10 nm liegt.
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 10 nm und 100 nm liegt.
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 100 nm und 1 μm liegt.
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 1 μm und 10μm liegt.
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 28, wobei die Dicke der entfernten Außenschicht zwischen 10 μm und 100 μm liegt.
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 28, wobei nach der Entfernung der Außenschicht der festen Phase keine Trocknungsschritte erfolgen und weitere Schritte in der flüssigen Phase stattfinden.
Methode zur Herstellung der festen Phase nach Ansprüchen 21 bis 24, wobei weitere Substanzen folgende Substanzen einschließen: Monomere (Phosphat-, Sulfat-, Carboxy-Gruppen), Polymere (polyethylenglycol, polyacrylate, polyacrylamide, polyphosphate)
Feste Phase für Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln, die nach Methoden in Ansprüchen 17 bis 35 hergestellt wird.
Feste Phase für Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln, die nach Methoden in Ansprüchen 17 bis 35 hergestellt wird, wobei an der Oberfläche Nukleinsäureketten fixiert sind.
Feste Phase nach Ansprüchen 1 bis 37 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei fixierte Nukleinsäureketten eine einheitliche Population darstellen
Feste Phase nach Ansprüchen 1 bis 37 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei fixierte Nukleinsäureketten mehrere unterschiedliche Populationen darstellen
Feste Phase nach Ansprüchen 1 bis 39 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei Nukleinsäureketten eine Länge zwischen 5 und 50 Nukleotiden haben
Feste Phase nach Ansprüchen 1 bis 39 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei Nukleinsäureketten eine Länge zwischen 20 und 200 Nukleotiden haben
Feste Phase nach Ansprüchen 1 bis 39 mit fixierten Nukleinsäureketten, wobei Nukleinsäureketten eine Länge zwischen 50 und 500 Nukleotiden haben
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 42, wobei die Fixierung von Nukleinsäureketten kovalent ist.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 42, wobei die Fixierung affin ist.
Feste Phase nach Ansprüchen 16, 18, 20, 22, 24, wobei der Linker eine Länge von 1 bis 50 nm hat
Feste Phase nach Ansprüchen 16, 18, 20, 22, 24, 45, wobei der Linker ein nicht verzweigtes Polymer ist
Feste Phase nach Ansprüchen 16, 18, 20, 22, 24, 45 wobei der Linker ein verzweigtes Polymer ist
Feste Phase nach Ansprüchen 16, 18, 20, 22, 24, wobei Streptavidin oder Avidin als Linker auftritt.
Feste Phase nach Ansprüchen 16, 18, 20, 22, 24, wobei Nukleinsäureketten als Linker auftreten.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 1/100 μm² und 10/100 μm² liegt.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 10/100 μm² und 100/100 μm² liegt.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 100/100 μm² und 1000/100 μm² liegt.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 1000/100 μm² und 10.000/100 μm² liegt.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 49, wobei die Dichte der fixierten Nukleinsäureketten zwischen 10.000/100 μm² und 1.000.000/100 μm² liegt.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 54, wobei an der festen Phase ein mit optischen Mitteln erkennbares Muster fixiert ist
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 55, wobei die feste Phase ein Teil einer Vorrichtung zum Austausch von Flüssigkeiten darstellt.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 56, wobei die feste Phase für elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen im Bereich zwischen 200 nm bis 400 nm durchlässig ist.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 56, wobei die feste Phase für elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen im Bereich zwischen 200 nm bis 2000 nm durchlässig ist.
Feste Phase mit fixierten Nukleinsäureketten nach Ansprüchen 1 bis 56, wobei die feste Phase für elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen im Bereich zwischen 400 nm bis 800 nm durchlässig ist.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 1, wobei die feste Phase nach Ansprüchen 2 bis 59 verwendet wird.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 60, wobei markierte Komponenten verwendet werden.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 61, wobei die Markierung von den markierten Komponenten durch Abspaltung entfernt werden kann.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 61 und 62, wobei markierte Komponenten markierte Ribonukleosidtriphosphate oder Deoxyribonucleosidtriphosphate oder Dideoxyribonukleosidtriphosphate einschließen.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 61 bis 63, wobei markierte Komponenten reversibel markierte Ribonukleosidtriphosphate oder Deoxyribonucleosidtriphosphate oder Dideoxyribonukleosidtriphosphate einschließen.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 61 und 62, wobei markierte Komponenten markierte Nukleinsäuren einschließen.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 65, wobei markierte Komponenten reversibel markierte Nukleinsäuren einschließen.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 66, wobei parallel 100 bis 10.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 66, wobei parallel 1000 bis 100.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 66, wobei parallel 10.000 bis 1.000.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 66, wobei parallel 100.000 bis 10.000.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 66, wobei parallel 1.000.000 bis 100.000.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 66, wobei parallel 100.000.000 bis 10.000.000.000 Nukleinsäureketten analysiert werden
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 72, wobei Ereignisse an einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen optisch detektiert werden
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 0,3 μm ermöglichen
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 0,5 μm ermöglichen
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 0,8 μm ermöglichen
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 1 μm ermöglichen
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 1,2 μm ermöglichen
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 1,5 μm ermöglichen
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 73, wobei optische Mittel eine Auflösung bis zu 2 μm ermöglichen
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 80, wobei die Analyse durch zyklische Sequenzierung verläuft.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 81, wobei die Analyse durch zyklische Sequenzierung verläuft und folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer festen Phase nach Ansprüchen 1 bis 59 2. Bindung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen an diese feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexen, 3. Durchführung einer zyklischen Reaktion mit den auf der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten, die folgende Schritte einschließt: 3.1 Inkubation einer Lösung mit einer oder mehreren Polymerase und einem oder mehreren markierten Nukleotiden (Polymerase-Nukleotid-Gemisch) mit der festen Phase unter Bedingungen, die eine Einbaureaktion an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen zulassen, 3.2 Entfernung des Polymerase-Nukleotid-Gemischs und Waschen der festen Phase 3.3 Detektion der Signale von eingebauten markierten Nukleotiden, wobei relative Koordinaten einzelne Signale identifiziert werden 3.4 Entfernung der Signale von eingebauten Nukleotiden, 3.5 gegebenenfalls Waschen der festen Phase 3.6 gegebenenfalls Wiederholung der Schritte 3.1 bis 3.5 4. Rekonstruktion der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäuremolekülen aus den unter Schritt 3.3 erhaltenen Signalen
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 81, wobei die Analyse durch zyklische Sequenzierung verläuft und folgende Schritte einschließt: 1. Bereitstellung einer festen Phase nach Ansprüchen 2 bis 59 2. Bindung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen an diese feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexen, 3. Durchführung einer zyklischen Reaktion mit den auf der festen Phase fixierten Nukleinsäureketten, die folgende Schritte einschließt: 3.1a Inkubation einer Lösung mit einer oder mehreren Polymerase mit der festen Phase unter Bedingungen, die ihre Bindung an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen zulassen, 3.1b Entfernung des Polymerase-Gemischs und Waschen der festen Phase 3.1c Inkubation einer Lösung mit einer oder mehreren Arten von Nukleotiden mit der festen Phase unter Bedingungen, die den Einbau von Nukleotiden an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen zulassen, 3.2 Entfernung der Lösung mit Nukleotiden und Waschen der festen Phase 3.3 Detektion der Signale von eingebauten markierten Nukleotiden, wobei relative Koordinaten einzelne Signale identifiziert werden 3.4 Entfernung der Signale von eingebauten Nukleotiden, 3.5 gegebenenfalls Waschen der festen Phase 3.6 gegebenenfalls Wiederholung der Schritte 3.1 bis 3.5 4. Rekonstruktion der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäuremolekülen aus den unter Schritt 3.3 erhaltenen Signalen
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 82, wobei die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle Nukleinsäureketten mit einer Länge zwischen 30 und 3000 Nukleotide darstellen.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 84, wobei die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle Deoxyribonukleinsäureketten oder Ribonukleinsäureketten darstellen.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 85, wobei die bereitgestellte feste Phase fixierte Nukleinsäuren trägt, die als Primer für die Sequenzierung dienen.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 86, wobei die bereitgestellte feste Phase fixierte Nukleinsäuren trägt, die als Primer für die Sequenzierung dienen und die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle direkt an diese Primer hybridisiert werden, wobei extensionsfähige Primer-Matrize-Komplexe gebildet werden.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 85, wobei die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle an die feste Phase fixiert werden und anschließend ein Primer an die zu analysierenden Nukleinsäureketten hybridisiert wird.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 82, wobei die Fixierung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen kovalent an die feste Phase erfolgt.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 82, wobei die Fixierung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen affin an die feste Phase erfolgt.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 und 90, wobei die bereitgestellte feste Phase fixierte Nukleinsäureketten trägt, die als Anker für affine Fixierung von zu analysierenden Nukleinsäuremolekülen dienen.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 und 90, wobei die Fixierung von zu analysierenden Nukleinsäureketten durch die Hybridisierung bzw. affine Bindung an den Anker an der festen Phase erfolgt.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 92, wobei die Dichte der fixierten extensionsfähigen Primer-Matrize-Komplexe auf der festen Phase zwischen 1 und 10 Komplexe pro 100 μm2 liegt.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 92, wobei die Dichte der fixierten extensionsfähigen Primer-Matrize-Komplexe auf der festen Phase zwischen 1 und 100 Komplexe pro 100 μm2 liegt.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 94, wobei die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle an die feste Phase in zufälliger Anordnung fixiert werden
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 60 bis 94, wobei die zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle an die feste Phase in vorbestimmter Anordnung fixiert werden
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 bis 96, wobei im Schritt 3.1 verwendete Nukleotide Ribonukleosidtriphosphate oder Deoxyribonucleosidtriphosphate oder Dideoxyribonukleosidtriphosphate einschließen.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 bis 97, wobei im Schritt 3.1 verwendete Nukleotide eine reversibel terminierende Gruppe tragen, so dass nur ein markiertes Nukleotid in einem Inkubationsschritt 3.1 eingebaut werden kann
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 98, wobei nach dem Detektionsschritt 3.3 ein weiterer Schritt zur Entfernung der reversibel terminierenden Gruppe im durchgeführt wird, so dass die Extensionsreaktion im weiteren Verlauf stattfinden kann
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 bis 99, wobei verwendete Nukleotide eine einheitliche Markierung tragen und im Inkubationsschritt 3.1 modifizierte Nukleotide gleicher Basenart zugegeben werden.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 bis 99, wobei verwendete Nukleotide eine basenspezifische Markierung tragen und im Inkubationsschritt 3.1 modifizierte Nukleotide unterschiedlicher Basenart zugegeben werden.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 bis 101, wobei im Schritt 3.3 relative Intensität eines jeden Signals bestimmt wird.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 bis 101, wobei die Zahl der Wiederholungen der Schritte 3.1 bis 3.5 zwischen 2 und 10 liegt.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 bis 101, wobei die Zahl der Wiederholungen der Schritte 3.1 bis 3.5 zwischen 10 und 25 liegt.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 bis 101, wobei die Zahl der Wiederholungen der Schritte 3.1 bis 3.5 zwischen 25 und 50 liegt.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Ansprüchen 82 bis 101, wobei die Zahl der Wiederholungen der Schritte 3.1 bis 3.5 zwischen 50 und 200 liegt.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 1, 60 bis 105, wobei als markierte Nukleotide konventionell modifizierte Nukleotide eingesetzt werden.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 1, 60 bis 105, wobei als markierte Nukleotide Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden.
Verfahren zur parallelen Analyse einer Vielzahl einzelner Nukleinsäuremoleküle mit optischen Mitteln nach Anspruch 60 bis 80, wobei die Analyse durch Hybridisierung komplementärer markierter Nukleinsäureketten verläuft.
Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten mit der festen Phase nach Ansprüchen 2 bis 59, wobei die zu analysierenden Nukleinsäureketten an der festen Phase fixiert sind und die Analyse durch die Hybridisierung von komplementären markierten Nukleinsäureketten erfolgt.
Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten mit der festen Phase nach Ansprüchen 2 bis 59, wobei an der festen Phase Nukleinsäurestränge in einer vordefinierten Anordnung fixiert sind und die zu analysierenden Nukleinsäureketten durch die Hybridisierung an die fixierten Nukleinsäurestränge analysiert werden.