DE102004022632A1

DE102004022632A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Analyse von Ausgleichsvorgängen

Info

Publication number: DE102004022632A1
Application number: DE200410022632
Authority: DE
Inventors: Frank Olschewski
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2004-05-07
Filing date: 2004-05-07
Publication date: 2005-12-15

Abstract

In einer Vorrichtung zur Analyse von Ausgleichsvorgängen insbesondere in einem Mikroskop (10), wird ein Objekt (15) mit einer Beleuchtungseinrichtung (1) bestrahlt. Die von dem Objekt (15) emittierte Strahlung (17) wird als Funktion der Zeit erfasst. Eine Signalauswerteeinrichtung (30) zum Auswerten des Messsignals (31) ist so ausgestaltet, dass aus dem Messsignal (31) Schaltzeitpunkte und Signaländerungen numerisch ermittelt werden.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse von Ausgleichsvorgängen insbesondere in einem Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs eins sowie ein Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 10.

Bei der Untersuchung von Objekten mit Hilfe eines Mikroskops besteht oftmals das Bedürfnis, die dreidimensionale Struktur des Objektes zu rekonstruieren. Hierzu kann beispielsweise die konfokale Scanmikroskopie eingesetzt werden. Dabei wird eine Probe mit dem Fokus eines Lichtstrahls punktweise in einer Ebene abgetastet, sodass ein Bild, allerdings mit geringer Tiefenschärfe, dieser Ebene erhalten wird. Durch die Aufnahme einer Mehrzahl von verschiedenen Ebenen und durch eine entsprechende Bildverarbeitung kann das Objekt dann dreidimensional dargestellt werden. Ein derartiges konfokales Scanmikroskopieverfahren ist beispielsweise aus der US 6,128,077 bekannt.

Bei der mikroskopischen Untersuchung von Objekten ist es oftmals erforderlich, bestimmte Teile oder Eigenschaften des Objektes durch Färbung zu kennzeichnen. Damit kann beispielsweise die Struktur in Zellen und Geweben differenziert und kontrastreich sichtbar gemacht werden. Wie aus der US 6,055,097 bekannt ist, können hierzu in eine Probe Farbstoffe eingebracht werden, die unter geeigneten Beleuchtungsbedingungen fluoreszieren, sodass mit der Bestrahlung die Lokalisierung der Farbstoffe in der Probe möglich wird. Zur Erzeugung eines räumlichen Bildes kann dann eine Anzahl von Bildern in unterschiedlichen Fokusebenen aufgenommen werden. Jedes dieser Bilder enthält Bildinformationen, die unmittelbar aus der Fokusebene stammen, ebenso wie solche Bildinformationen, die aus Raumabschnitten des Objektes stammen, die außerhalb der Fokusebene liegen. Zur Ermittlung eines scharfen Bildes ist es erforderlich, die nicht aus der Fokusebene stammenden Bildanteile zu eliminieren, was mit konfokaler Mikroskoptechnik gelingt.

Bei der Untersuchung lebender Objekte, wie etwa lebender Zellen, können bei geeigneter Einfärbung des Objektes bzw. dem Einbringen von Farbstoffen in das Objekt auch dadurch Informationen über die Struktur und Funktion des Objektes gewonnen werden, dass die in dem Objekt auftretenden Ausgleichsvorgänge untersucht werden. Grundsätzlich wird bei dieser Art von Untersuchung ein Objekt oder Teile des Objekts für eine bestimmte Zeit bestrahlt. Die Bestrahlung verursacht eine Mischung aus irreversiblen und reversiblen Veränderungen in dem Objekt die durch weitere Analyse Aufschluss über die internen Funktionsparameter Aussagen erlauben. Nach dem Abschalten der Bestrahlung wird dann das Objekt mit dem Ziel beobachtet, festzustellen, ob sich der durch die Bestrahlung erreichte Zustand ändert. Aus den Mustern, die diese Änderung beschreiben, kann dann darauf geschlossen werden, welche molekularen Zusammenhänge in dem Objekt vorliegen. So kann beispielsweise auf die Diffusionskonstante geschlossen werden, welche bestimmt mit welchen Zeitkonstanten Reversionsprozesse ablaufen, oder ob an bestimmten Stellen Bindungen vorliegen, welche den Ablauf der Reversionsprozesse „abbremsen", oder welcher Anteil irreversibel und welcher reversibel gestört wurde. Den Änderungsprozess kann man in diesem Zusammenhang als Ausgleichsvorgang bezeichnen.

Die große Schwierigkeit bei der Durchführung dieser Untersuchung besteht nun darin zu ermitteln, mit welchen Parametern die Untersuchung durchzuführen ist, also etwa mit welcher Zeit und mit welcher Energie das Objekt bestrahlt werden muss, um tatsächlich aus dem Ausgleichsvorgang verlässliche Rückschlüsse auf die Eigenschaften des Objekts ziehen zu können. Diese Problematik macht mitunter langwieriges Experimentieren mit den Aufnahmeparametern notwendig, welches bei Benutzern nachteilig wahrgenommen wird.

Konkret kann periodisch eine Beleuchtungsstrahlung auf einen Punkt eines Objekts gerichtet werden. Das zeitliche Antwortverhalten der Probe wird dann als Messkurve erfasst. Durch periodische Aufnahme ganzer Bilder oder Volumen lässt sich so das Verhalten in vielen Bereichen der Probe systematisch erfassen. Im Anschluss daran wird mit einem Laserpuls bevorzugt entweder Material zerstört (Bleichen beim FRAP) oder aktiviert (Freisetzung von Farbstoff etwa beim Uncaging). In beiden Fällen wird ein Ausgleichsvorgang initiiert, der als Basis für die weitere Untersuchung des Objektes dient. Durch weiteres periodisches Aufnehmen ganzer Bilder oder Volumen lässt sich so das Verhalten in vielen Bereichen der Probe systematisch erfassen. Denn mit dem Erfassen der von dem Objekt emittierten Strahlung dieser Vorgehensweise erhält man eine Messkurve, die zum einen den Beleuchtungsimpuls als Bezugspunkt und darauf folgend einen Ausgleichsvorgang als Intensitätssignal in Abhängigkeit von der Zeit zeigt. Der Ausgleichsvorgang macht sich innerhalb und außerhalb der beleuchteten Region entweder aufsteigend oder absteigend bemerkbar. Somit kann dem Ausgleichsvorgang mathematisch eine Gleichung zugrunde gelegt werden, die den Verlauf der Intensität in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt. Eine derartige Funktion kann in allgemeiner Form beispielsweise dadurch wiedergegeben werden, dass für die Intensität in Abhängigkeit von der Zeit l(t) die Gleichung

angesetzt wird. Über die experimentelle Bestimmung des Parameters τ können dann Aussagen über das Objekt getroffen werden, da der Parameter τ Aufschlüsse über die chemischen Verhältnisse innerhalb der Probe liefert. Eine Möglichkeit besteht darin, durch eine geeignete Anpassung einer Kurve, einem sogenannten FIT, den Parameter τ zu ermitteln. Voraussetzung hierbei ist allerdings, dass ein hinreichend großes ΔI erzeugt werden kann. In den meisten Fällen ist dies allerdings nicht möglich. Gegenwärtig wird daher häufig darauf zurückgegriffen, interaktiv oder mit Hilfe eines Trial-and-Error- Verfahrens mehrfach zu bleichen bzw. den Farbstoff zu aktivieren, bis man eine geeignete Konfiguration von System und Experimentparametern gefunden hat die für das Experiment geeignet ist.

Nimmt man die Intensität in dieser Zeit kontinuierlich auf, dann ergibt sich mit

eine Messung der Form

Diese liefert zwischen den Schaltzeitpunkten t_i den gleichen Exponentialausgleich nur mit unterschiedlichen Stufen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren vorzuschlagen, mit dem es möglich ist, die erhaltene Messkurve so auszuwerten, dass die Auswertung von den an sich willkürlich gesetzten Beleuchtungspunkten unabhängig wird.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 sowie durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 10 gelöst.

Während der Messung liegen die Messdaten in der Form I_n = I(nT) vor. Um in der Signalauswerteeinrichtung die Schaltzeitpunkte und die Signaländerungen numerisch ermitteln zu können wird daher zunächst die Folge Ln = log In – log In-1 gebildet, die als eine Art der logarithmischen Differentialbildung angesehen werden kann. Denn bei Betrachtung des Logarithmus der Folge erhält man konstante lineare Steigungen in den Intervallen zwischen den Schaltpunkten und auf den Schaltpunkten davon unterschiedliche Werte. Nach Differentiation wird daraus eine Funktion gewonnen, die zwischen den Schaltpunkten konstant ist und auf den Schaltpunkten fast infinitesimal wird.

Um nun die Schaltpunkte entfernen zu können müssen alle nicht konstanten Varianten aus der Funktion entfernt werden, wobei insbesondere ein Threshold-Verfahen angewendet werden kann. Anschließend kann die Folge in einzelne Segmente unterteilt werden, wobei jedes Segment den Abschnitt zwischen den Schaltpunkten repräsentiert.

Auf die einzelnen Segmente kann dann eine Histogrammbildung angewendet werden, sodass daran anschließend eine Normalverteilung auf das Histogramm angepasst insbesondere gefittet werden kann. Für jedes Intervall ergibt sich daraus ein Mittelwert für die inverse Zeitkonstante 1/τ und eine Varianz, aus dem sich die Zeitkonstante τ und die zugehörige Varianz berechnen lässt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann in der Signalauswerteeinrichtung zur Ermittlung der Schaltzeitpunkte eine Folge der Form L_n = log I_n – log I_n-1 gebildet werden, wobei I_n = I(nT) die jeweils gemessene Intensität des Messsignals (31) zur Zeit T ist. Aus der Folge können dann auch die Schaltzeitpunkte durch ein geeignetes Verfahren entfernt werden, wobei insbesondere ein sogenanntes Threshold-Verfahren angewendet werden kann. Dabei werden die im wesentlichen nicht konstanten Werte der Folge entfernt.

In der Signalauswerteeinrichtung können dann aus Folge L_n anschließend Segmente gebildet werden. Diese dienen in der Folge dazu, Histogramme zu bilden. Anschließend kann eine Normalverteilung auf die Histogramme angepasst werden.

Nach dem Bilden von Segmenten ist es weiterhin möglich, in der Signalauswerteeinrichtung aus den Segmenten weitere Untersegmente zu bilden und aus den Untersegmenten wiederum Histogramme zu erzeugen und auf die Histogramme eine Normalverteilung anzupassen.

Für die Gesamtfolge kann man auch testen, ob es sich um einen reinen Prozess mit einem einzigen Wert für τ oder um einen Mischprozess mit zwei oder mehreren τ's handelt, da man die Segmente weiter unterteilen kann und lokal dann dieselbe Analyse durchführt. Durch statistische Tests kann dann entscheiden werden, ob die Unterschiede signifikant sind. Danach lässt sich feststellen, ob ein Modell mit einem τ oder eins mit zwei oder mehreren τ's auszuwählen ist, diese kann man dann an die Segmente von I anfitten.

Da man die Gesamtfolge I und deren zeitliche Reihenfolge kennt, kann man aus den nun vorliegenden Informationen und der Suche von Anfangs- und Endwerten innerhalb der Gesamtfolge ein Gesamtmodell mit allen Sprüngen bilden. Über einen Fit kann daraufhin eine genauere Ermittlung der Zeitkonstanten erfolgen, da dann das gesamte Datenmaterial der Messung ausgewertet wird.

Im Hinblick auf das Verfahren besteht die erfindungsgemäße Lösung in einem Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen wobei ein Objekt mit einer Beleuchtungsquelle, insbesondere einem Laser beleuchtet und die von dem Objekt ausgehende Strahlung von einer Erfassungseinheit als Messsignal erfasst wird mit den Merkmalen gemäß Anspruch 10.

Mit dem Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, das gesamte vorliegende Datenmaterial der Messkurve zur Auswertung zu nutzen und somit wesentlich genauere Ergebnisse zu erhalten.

Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der nachfolgenden Figuren sowie deren Beschreibungen, bei deren Darstellung zugunsten der Übersichtlichkeit auf eine maßstabsgetreue Wiedergabe verzichtet wurde.

Es zeigen im Einzelnen:
1. eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mikroskops
2 ein typisches Beispiel für eine Messkurve
3 ein Ablaufdiagramm
1 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes konfokales Scanmikroskop 10. Ein von einem Beleuchtungssystem 1 kommender Lichtstrahl 3 wird von einem Strahlteiler 5 zur Strahlablenkeinrichtung 7 reflektiert, die von einer Steuer- und Erfassungseinheit 23 über eine Leitung 29 gesteuert wird und die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 9 beinhaltet, der den Strahl durch eine Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw. in das Innere des Objektes 15 führt. Der Lichtstrahl 3 wird bei nicht transparenten Objekten 15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Objekten 15 (Präparaten) oder transparenten Objekten kann der Lichtstrahl 3 auch durch die Oberfläche des Objektes 15 hindurch geführt werden. Bei diesem Verfahren ist es möglich, dass verschiedene Fokusebenen des Objekts nacheinander durch den Lichtstrahl 3 abgetastet werden. Da biologische Objekte zur Kennzeichnung bestimmter Objektbereiche mit Farbstoffen versehen werden können, lässt sich für jeden Rasterpunkt aus der Anregung der Farbstoffe und dem damit emittierten Fluoreszenzlicht ein dreidimensionales Bild des Objekts 15 erzeugen. Der vom Beleuchtungssystem 1 kommende Lichtstrahl 3 ist als durchgezogene Linie dargestellt. Das vom Objekt 15 ausgehende Fluoreszenzlicht 17 gelangt durch die Mikroskopoptik 13 und über die Strahlablenkeinrichtung 7 zum Strahlteiler 5, passiert diesen und trifft auf den Detektor 19, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Das vom Objekt 15 ausgehende Fluoreszenzlicht 17 ist in der Abbildung als gestrichelte Linie dargestellt.
Im Detektor 19 werden elektrische, zur Leistung des vom Objekt ausgehenden Lichtes 17 proportionale Detektionssignale 21 erzeugt und an die Steuer- und Erfassungseinheit 23 weitergegeben. Die in der Strahlablenkeinrichtung 7 mit Hilfe eines induktiv oder kapazitiv arbeitenden Positionssensors 11 erfassten Positionssignale 25 können ebenfalls an die Steuer- und Erfassungseinheit 23 übergeben werden. Die eingehenden, Analogsignale werden in der Steuer- und Erfassungseinheit 23 zunächst digitalisiert. Die Positions- und Detektionssignale können werden in der Steuer- und Erfassungseinheit 23 einander zugeordnet und an eine Recheneinheit 33, insbesondere einen PC weitergegeben werden. Hier kann eine Signalauswerteeinheit 30 vorgesehen sein, in der die Messwerte erfasst und gegebenenfalls aufbereitet werden können. Ein Abbild 35 des Objektes 15 oder eines Objektbereichs kann dann auf dem Display 27 angezeigt werden.
Werden nun Informationen über das Objekt 15 über das zeitliche Abklingverhalten eines Strahlungsimpulses ermittelt, so wird hierzu, bevorzugt periodisch, die Beleuchtungsstrahlung 3 in Form von Pulsen auf einen Punkt des Objekts 15 gerichtet. Das zeitliche Antwortverhalten des Objekts 15 wird dann in der Steuer- und Erfassungseinheit 23 zugeführt und als Messkurve 31 (2) erfasst. Mit dem Laserpuls wird bevorzugt periodisch entweder Material im Objekt zerstört (Bleichen beim FRAP) oder aktiviert, wobei Farbstoffe freigesetzt werden können. Dabei wird ein Ausgleichsvorgang initiiert, der als Basis für die weitere Untersuchung des Objekts 15dient. Der Ausgleichsvorgang macht sich innerhalb und außerhalb der beleuchteten Region entweder aufsteigend oder absteigend bemerkbar. Somit kann dem Ausgleichsvorgang mathematisch eine Gleichung zugrunde gelegt werden, dien den Verlauf der Intensität in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt.
Ein typisches Beispiel für eine derartige Messkurve ist in 2 dargestellt. 2a zeigt den typischen Ablauf eines FRAP Experiments. Im Zeitintervall T_B bleicht der Benutzer, wobei es zu einem Signalabfall kommt. Anschließend setzt der Ausgleichsvorgang ein, der sich in einem Anstieg des Signals 31, dem sogenannten Recovery, ausdrückt. Mit zunehmender Zeit nähert sich dieses Signal dann einem Wert I_R unterhalb dem Startwert I_S. Sollte der Signalabfall zu klein oder der resultierende Ausgleichseffekt im gemessenen Signal zu klein sein muss der Benutzer das Experiment neu durchführen.
2b. zeigt den typischen Ablauf eines FRAP Experiments mit der vorgeschlagenen Erfindung. Der Benutzer bleicht in den Zeitintervallen T_B1, T_B2 und T_B3 und es kommt jeweils zu einem Signalabfall und anschließender Recovery in den Zeitintervallen T_R1, T_R2, und T_R3. Die Anzahl der durchgeführten Bleichvorgänge und damit die Anzahl der durchgeführten Messungen hängt davon ab, welche Ergebnisse der Benutzer erzielen konnte und wie zufrieden er mit diesen Ergebnissen war. In dem in 2b gezeigtem Beispiel wird das Bleichen und die darauf folgende Recovery in Summe dreimal wiederholt.
Mit dem so spezifizierten Verfahren kann dann die Datenmenge identifiziert werden, die durch Bleichen charakterisiert ist. Diese Daten können aus der Messkurve 31 ausgeschnitten werden. Die so die identifizierten Zeitläufe, in denen nur Ausgleichsvorgänge stattfinden, können dann der Gesamtanalyse zu. Bei Uncaging Experimenten verlaufen die Signale gespiegelt, sind jedoch ansonsten phänomenologisch gleich.
Ein typisches Ablaufdiagramm eines derartigen computergestützten Experiments ist in 3 dargestellt. Der Benutzer startet eine kontinuierliche Datenaufnahme. Während diese Abläuft werden interaktive Bleichbefehle gegeben die vom Konfokalmikroskop umgesetzt werden und auf dem am System angebrachten Bildschirm angezeigt werden. Nach Ablauf des Experiments gibt der Benutzer – in der Regel oder optional – eine Bereichsdefinition 41 ab, in der er z. B. durch Überlagerung einer grafischen Figur auf dem Bildschirm den Bereich markiert, insbesondere einkreist. Mit den Schritten Logarithmieren 43 und Differenzieren 44 werden dann die so aufgenommenen Daten bearbeitet und – wie bereits oben ausführlich erläutert – die Schaltzeitpunkte identifiziert. Die Identifikation 45 erfolgt – wie oben beschrieben – bevorzugt durch Schwellwertbildung. Im Anschluss erfolgt das Segmentieren 46 durch das System, wobei die Zeitläufe der einzelnen Ausgleichsvorgänge zwischen den Schaltzeitpunkten gefittet werden. Für jedes Segment erfolgt der Fit 47 der jeweils charakteristischen Information. Aus diesen Einzelfits wird dann das Gesamtergebnis 48 gebildet. Sollten in den einzelnen Segmenten unterschiedliche Ergebnisse vorliegen, dann können diese separat dargestellt werden, sollten Sie innerhalb nicht signifikanter Abweichungen gleich sein, kann das Gesamtergebnis 48 auch als FIT über sämtliche Segmente ohne die Schaltzeitpunkte ausgeprägt sein. Das Gesamtergebnis 48 kann dann für den Benutzter sichtbar gemacht, insbesondere auf einen Monitor ausgegeben werden.

1: Beleuchtungssystem
3: Lichtstrahl
5: Strahlteiler
7: Strahlablenkeinrichtung
9: Scanspiegel
10: Scanmikroskop
11: Positionssensor
13: Mikroskopoptik
15: Objekt
17: vom Objekt 15 ausgehendes Licht
19: Detektor, Photomultiplier
21: Detektionssignale
23: Steuer- und Erfassungseinheit
25: Positionssignale
27: Display
29: Leitung
30: Signalauswerteeinrichtung
31: Messsignal (Messkurve)
33: Recheneinheit
35: Abbild
37: Leitung
38: Datenaufnahme
39: Markieren
40: Bleichen
41: Bereichsauswahl
43: Logarithmieren
44: Differenzieren
45: Identifizieren
46: Segmentieren
47: Fitten
48: Gesamtergebnis Ausgabe

Claims

Vorrichtung insbesondere Mikroskop (10) zur Analyse von Ausgleichsvorgängen mit einer Objektbeleuchtungseinrichtung (1) zum Beleuchten eines Objekts (15) und einer Erfassungseinheit (23) zum Erfassen von Signalen, die von dem Objekt (15) emittiert werden, wobei die von dem Objekt (15) emittierten Signale als Messsignal (31) erfasst werden dadurch gekennzeichnet, dass eine Signalauswerteeinrichtung (30) zum Auswerten des Messsignals (31) vorgesehen ist, die so ausgestaltet ist, dass aus dem Messsignal (31) Schaltzeitpunkte und Signaländerungen numerisch ermittelt werden und an die modelltypische Recoverygleichungen gefittet werden, und dem Benutzer präsentiert werden.
Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die modelltypischen Recoverygleichungen von einem Benutzer vorgebbar oder wählbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass in der Signalauswerteeinrichtung (30) zur Ermittlung der Schaltzeitpunkte eine Folge der Form L_n = log I_n – log I_n-1 gebildet wird, wobei I_n = I(nT) die jeweils gemessene Intensität des Messsignals (31) zur Zeit T ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass in der Signalauswerteeinrichtung (30) aus der Folge L_n die Schaltzeitpunkte entfernt werden.
Vorrichtung nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass in der Signalauswerteeinrichtung (30) aus der Folge L_n die Schaltzeitpunkte durch ein Threshold-Verfahren, insbesondere durch das Entfernen von im wesentlichen nicht Konstanten Werten erfolgt.
Vorrichtung nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass in der Signalauswerteeinrichtung (30) aus Folge L_n anschließend Segmente gebildet werden.
Vorrichtung nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass in der Signalauswerteeinrichtung (30) aus Segmenten Histogramme gebildet und auf die Histogramme eine Normalverteilung angepasst insbesondere gefittet wird.
Vorrichtung nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass in der Signalauswerteeinrichtung (30) aus den Segmenten weitere Untersegmente gebildet werden, und aus den Untersegmenten Histogramme gebildet und auf die Histogramme eine Normalverteilung angepasst insbesondere gefittet wird.
Vorrichtung nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass in der Signalauswerteeinrichtung (30) durch statistische Tests ermittelt wird, ob ein Ausgleichsvorgang vorliegt, dem eine oder mehrere Zeitkonstanten τ zugrunde liegen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-9 dadurch gekennzeichnet, dass in der Signalauswerteeinrichtung (30) das gesamte Datenmaterial der Messkurve zur Ermittlung der Zeitkonstanten τ verwendet wird.
Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen wobei ein Objekt mit einer Beleuchtungsquelle (1), insbesondere einem Laser beleuchtet und die von dem Objekt (15) ausgehende Strahlung (17) von einer Erfassungseinheit (23) als Messsignal (31) erfasst wird dadurch gekennzeichnet, dass mit einer Signalauswerteeinrichtung (30) zum Auswerten des Messsignals (31) aus dem Messsignal (31) Schaltzeitpunkte und Signaländerungen numerisch ermittelt und an modelltypische Recoverygleichungen gefittet werden.
Verfahren nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass die modelltypischen Recoverygleichungen von einem Benutzer vorgegeben oder ausgewählt werden.
Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen nach Anspruch 11 oder 12 dadurch gekennzeichnet, dass zur Ermittlung der Schaltzeitpunkte eine Folge der Form L_n = log I_n – log I_n-1, gebildet wird, wobei I_n = I(nT) die jeweils gemessene Intensität des Messsignals (31) zur Zeit T ist.
Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen nach einem der Ansprüche 10 bis 13 dadurch gekennzeichnet, dass in der Signalauswerteeinrichtung (30) aus der Folge L_n die Schaltzeitpunkte insbesondere durch ein Threshold-Verfahren entfernt werden.
Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen nach Anspruch 14 dadurch gekennzeichnet, dass anschließend aus Folge L_n Segmente gebildet werden.
Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, dass aus den Segmenten Histogramme gebildet und auf die Histogramme eine Normalverteilung angepasst insbesondere gefittet und eine Zeitkonstante τ für den Ausgleichsvorgang ermittelt wird.
Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, dass aus den Segmenten weitere Untersegmente gebildet werden, und aus den Untersegmenten Histogramme gebildet und auf die Histogramme eine Normalverteilung angepasst insbesondere gefittet wird.
Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, dass durch statistische Tests ermittelt wird, ob ein Ausgleichsvorgang vorliegt, dem eine oder mehrere Zeitkonstanten τ zugrunde liegen.
Verfahren zur Analyse von Ausgleichsvorgängen nach einem der Ansprüche 16 bis 18 dadurch gekennzeichnet, dass das gesamte Datenmaterial der Messkurve (31) zur Ermittlung der Zeitkonstanten τ verwendet wird.