DE1017330B

DE1017330B - Process for the production of Actidion

Info

Publication number: DE1017330B
Application number: DEU4334A
Authority: DE
Inventors: Bruce Wenzel Churchill
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1956-01-26
Filing date: 1957-01-23
Publication date: 1957-10-10

Description

Verfahren zur Herstellung von Actidion Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Actidion, das auch unter der Bezeichnung Cycloheximid bekannt ist.Method of Making Actidion The invention relates to to an improved process for the production of Actidion, which is also available under the Name cycloheximide is known.

Actidion ist ein Antibiotikum, das von dem Streptomyces griseus erzeugt wird, der auch das Antibiotikum Streptomycin erzeugt. Geeignete Verfahren für die Herstellung und Gewinnung von Actidion sind in den USA.-Patentschriften 2574519 und 2 612 502 beschrieben.Actidion is an antibiotic made by the Streptomyces griseus, which also makes the antibiotic streptomycin. Suitable processes for the production and recovery of Actidion are described in U.S. Patents 2574519 and 2,612,502.

Da bei der Kultivierung von Streptomyces griseus sowohl Actidion als auch Streptomycin erzeugt wird, ist es schwierig, die beiden Antibiotika allein für sich herzustellen und zu gewinnen. Das Hauptziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Kultivierung von Streptomyces griseus, wobei die Erzeugung von Actidion im Verhältnis zu Streptomycin gesteigert und dadurch die Herstellung und Gewinnung von Actidion aus dem Gärmedium verbessert wird.Since both Actidion and Streptomycin is also produced, making it difficult to use the two antibiotics alone to make and win for yourself. The main object of the invention is therefore a Method for the cultivation of Streptomyces griseus, whereby the production of Actidion increased in relation to streptomycin and thereby the production and extraction is improved by Actidion from the fermentation medium.

Das erwähnte Hauptziel sowie andere Ziele werden erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß man den Streptomyces griseus in einem Medium züchtet, das zwischen 0,15 und 0,25 g/1 primäres Kaliumphosphat, mindestens 14 g/1 Sojamehl und etwa 4 Teile Glucose je Teil Sojamehl enthält. Falls nicht anders angegeben, bedeuten die angegebenen Teile Gewichtsteile.The aforementioned main object as well as other objects are thereby achieved in accordance with the present invention achieves that one cultivates the Streptomyces griseus in a medium that is between 0.15 and 0.25 g / 1 primary potassium phosphate, at least 14 g / 1 soy flour and about 4 Contains parts glucose per part soy flour. Unless otherwise stated, the mean specified parts by weight.

Es wurde gefunden, daß in Anwesenheit einer großen Menge Sojamehl, mindestens 14 g/1 und eines hohen Mengenverhältnisses von Glucose zu Sojamehl, d. h. etwa 4 : 1, die für die Herstellung von Actidion optimale Menge primäres Kaliumphosphat etwa 20 bis 60 (vorzugsweise 40) Teile p. M. zugesetzter Phosphor beträgt, und daß Konzentrationen über 60 T. p. M. und unter 20 T. p. M. die Ausbeute beträchtlich herabsetzen. Es wurde ferner gefunden, daß unter gleichen Bedingungen die optimale Konzentration an Phosphor für die Herstellung von Streptoinycin etwa das Zweifache (80 T. p. M.) der für Actidion gefundenen Menge ausmacht. Durch Aufrechterhaltung einer großen Menge Sojamehl, mindestens 14 g/1, und eines hohen Mengenverhältnisses von Glucose zu Sojamehl, d. h. von etwa 4 Teilen Glucose zu 1 Teil Sojamehl, sowie Einstellung der Phosphormenge innerhalb der obengenannten kritischen Grenzen, d. h. zwischen etwa 0,15 und etwa 0,25 g/1 (20 bis 60 T. p. M. zugesetzter Phosphor), wird die Erzeugung von Actidion bedeutend begünstigt und seine Gewinnung erleichtert.It has been found that in the presence of a large amount of soy flour, at least 14 g / 1 and a high ratio of glucose to soy flour, d. H. about 4: 1, the optimal amount of primary potassium phosphate for making Actidion about 20 to 60 (preferably 40) parts p. M. is added phosphorus, and that Concentrations above 60 T. p. M. and under 20 T. p. M. the yield is considerable reduce. It was also found that under the same conditions the optimal Concentration of phosphorus for the production of streptoinycin about twice as much (80 p.m.) of the amount found for Actidion. By maintaining a large amount of soy flour, at least 14 g / 1, and a high proportion from glucose to soy flour, d. H. from about 4 parts glucose to 1 part soy flour, as well Adjustment of the amount of phosphorus within the above-mentioned critical limits, d. H. between about 0.15 and about 0.25 g / l (20 to 60 parts per million of added phosphorus), the production of Actidion is significantly favored and its extraction is facilitated.

Die Wirkungen, die durch Veränderungen der Mengen innerhalb und außerhalb der Grenzen der Erfindung verursacht werden, sind in den folgenden Talellen angegeben. Die in diesen Tabellen aufgeführten Daten wurden auf folgende Weise erhalten: Ein Agarschrägnährboden einer Kultur von Actidion erzeugendem Streptomyces griseus wurde zur Impfung eines 500 ccm fassenden Erlenmeyerkolbens verwendet, der für eine verstärkte Rührwirkung gezähnte Prallwände besaß und 100-ccm des zu untersuchenden Mediums enthielt. Die Impfung erfolgte mit 1 ccin Sporensuspension, die durch Zusatz von 10 ccm sterilem destilliertem Wasser zum Agarschrägnährboden und Ablösen der Sporen mit einer sterilen Drahtöse hergestellt worden war. Dieser Kolben wurde 5 Tage bei 24' und 300 Umdrehungen je Minute auf einer Drehschüttelvorrichtung inkubiert und dann unter Verwendung des Testorganismus Saccharomyces pastorianus mit dem Papierscheibenverfahren untersucht. Auf jeder Platte wurde eine reine Probe Actidion untersucht. Das Grundmedium enthielt in jedem Falle 8 g/1 Calciumcarbonat, 5 g/1 Ammoniumsulfat, 2,5 g/1 Brauereihefe und 4,0 g/1 Natriumchlorid einschließlich der in denTabellen aufgeführten Bestandteile. Tabelle I Wirkung von Konzentrationen, die unter der optimalen Konzentration von Sojamehl liegen Höchst- Medium Sojamehl Glucose K H2 P 04 menge Actidion Nr. g/1 g/1 g/l ;,/ccm 1 ... .. ......... 7 25 0.4 360 2 .............. 7 35 0,2 415 3 ... .. .. ....... 7 45 0,4 280 Kontroll- versuch A ... 14 - 60 @4 0,4J- 860 Kontroll- versuch B ... 14 60 0.2 1100 Im Kontrollversuch A ist die Menge primäres Kaliumphosphat nicht optimal. Dieser Versuch dient zum Vergleich mit den Medien 1 und 3.The effects caused by changes in the amounts within and outside the limits of the invention are given in the following tables. The data listed in these tables were obtained in the following manner: A slanted agar medium from a culture of Actidion-producing Streptomyces griseus was used to inoculate a 500 cc Erlenmeyer flask which had toothed baffles for increased stirring and contained 100 cc of the medium to be examined. The inoculation was carried out with 1 cc of spore suspension, which had been prepared by adding 10 cc of sterile distilled water to the agar slant and loosening the spores with a sterile wire loop. This flask was incubated for 5 days at 24 'and 300 revolutions per minute on a rotary shaker and then examined by the paper disk method using the test organism Saccharomyces pastorianus. A pure sample of Actidion was tested on each plate. The basic medium contained in each case 8 g / 1 calcium carbonate, 5 g / 1 ammonium sulfate, 2.5 g / 1 brewer's yeast and 4.0 g / 1 sodium chloride including the components listed in the tables. Table I. Effect of concentrations that are below the optimal Concentration of soy seeds is n maximum Medium soy flour glucose K H2 P 04 amount Actidion No. g / 1 g / 1 g / l;, / ccm 1 ... .. ......... 7 25 0.4 360 2 .............. 7 35 0.2 415 3 ... .. .. ....... 7 45 0.4 280 Control attempt A ... 14 - 60 @ 4 0,4J- 860 Control experiment B ... 14 60 0.2 1100 In control experiment A, the amount of primary potassium phosphate is not optimal. This experiment is used to compare with media 1 and 3.

Im Kontrollversuch B ist die Stoffzusammensetzung erfindungsgemäß und optimal. Dieser Versuch dient zum Vergleich mit dem Medium 2.In control experiment B, the composition of matter is according to the invention and optimal. This experiment is used to compare with medium 2.

Die erhaltenen Daten zeigen deutlich die nachteilige Wirkung von geringeren Konzentrationen an Sojamehl und ferner, daß sich diese nachteilige Wirkung nicht durch Steigerung der Glucosemenge oder Änderung der Menge an primärem Kaliumphosphat beseitigen läßt. Tabelle II Wirkung von Verhältnissen, die unter dem optimalen Mengenverhältnis von Glucose zu Sojamehl liegen Höchst- Medium Sojamehl Glucose KH2P04 menge Actidion Nr. g/1 g/1 g/1 ;./ccm 4 ............ 14 25 0,4 300 5 ............ 14 45 0,4 680 6 ............ 14 50 0.4 770 12 ............ 21 25 0,4 260 13 ............ 21 50 0,4 665 14 ............ 21 60 0,2 800 15 ............ 21 70 0,2 850 Kontroll- versuch A ... 14 60 0,4 860 Kontroll- versuch B ... 14 60 0,2 1100 Kontroll- versuch C ... 21 90 0,2 1040 Aus den Daten von Tabelle II geht hervor, daß ungenügende Mengen Glucose die Ausbeute an Actidion wesentlich herabsetzen und daß nicht die Glucosemenge, sondern das Mengenverhältnis von Glucose zu Sojamehl wichtig ist. Tabelle III Wirkung nicht optimaler Konzentrationen von primärem Kaliumphosphat Höchst- Medium Sojamehl Glucose KH2P04 menge Actidion Nr. g/1 g/1 g/1 ;/ccm 29 ............ 14 I 60 0,0 365 28 ............ 14 60 0,15 1040 9 ............ 14 60 0,2 1100 (Kontroll- versuch B) 27 ............ 14 60 0,25 1110 8 ....... . .... 14 60 0,4 860 (Kontroll- versuch A) 21 ... .. .. ..... I 14 60 ( 1,4 225 Diese Daten zeigen. daß Ausbeuten von etwa 1000 y oder mehr je ccm nur dann erhalten werden, wenn die Konzentration des primären Kaliumphosphats zwischen etwa 0,15 und etwa 0,25 gil beträgt. Tabelle IV Wirkung optimaler Mengen Höchst- Medium Sojamehl Glucose KH2P04 menge Acddion Nr. g,!1 g!1 gll y/ccm 7 ............ 14 55 0,2 1000 9 ......,..... 14 60 0,2 1100 (Kontroll- versuch B) 1.0 ............ 14 65 0.2 1030 16 ............ 21 90 0,2 1040 1.9 ..... . ...... 28 120 0.2 1040 27 ... .. .. .. ... 14 60 0,25 1110 28 ,.........,. 14 60 0,15 1040 Diese Daten zeigen, daß innerhalb eines weiten Konzentrationsbereiches für Sojamehl durchweg hohe Ausbeuten erhalten werden, wenn das Mengenverhältnis von Glucose zu Sojamehl etwa 4 : 1 beträgt und die Konzentration des primären Kaliumphosphats zwischen etwa 0,15 und etwa 0,25 gjl liegt. Die obere Grenze für die geeignete Sojamehlmenge wird durch die Viskosität bestimmt und ist gewöhnlich nicht größer als etwa 30 gll.The data obtained clearly show the adverse effect of lower concentrations of soy flour and also that this adverse effect cannot be eliminated by increasing the amount of glucose or changing the amount of primary potassium phosphate. Table II Effect of ratios that are below the optimal Quantity ratio of glucose to soy flour lie maximum Medium soy flour glucose KH2P04 amount Actidion No. g / 1 g / 1 g / 1; ./ cc m 4 ............ 14 25 0.4 300 5 ............ 14 45 0.4 680 6 ............ 14 50 0.4 770 12 ............ 21 25 0.4 260 13 ............ 21 50 0.4 665 14 ............ 21 60 0.2 800 15 ............ 21 70 0.2 850 Control attempt A ... 14 60 0.4 860 Control experiment B ... 14 60 0.2 1100 Control attempt C ... 21 90 0.2 1040 The data in Table II show that insufficient amounts of glucose significantly reduce the yield of Actidion and that it is not the amount of glucose but the ratio of glucose to soy flour that is important. Table III Effect of suboptimal concentrations of primary potassium phosphate maximum Medium soy flour glucose KH2P04 amount Actidion No. g / 1 g / 1 g / 1; / ccm 29 ............ 14 I 60 0.0 365 28 ............ 14 60 0.15 1040 9 ............ 14 60 0.2 1100 (Control attempt B) 27 ............ 14 60 0.25 1110 8 ........ .... 14 60 0.4 860 (Control attempt A) 21 ... .. .. ..... I 14 60 (1.4 225 These data show. that yields of about 1000 y or more per cc are only obtained when the concentration of the primary potassium phosphate is between about 0.15 and about 0.25 gil. Table IV Effect of optimal amounts maximum Medium soy flour glucose KH2P04 amount Acddion No. g,! 1 g! 1 gll y / ccm 7 ............ 14 55 0.2 1000 9 ......, ..... 14 60 0.2 1100 (Control attempt B) 1.0 ............ 14 65 0.2 1030 16 ............ 21 90 0.2 1040 1.9 ...... ...... 28 120 0.2 1040 27 ... .. .. .. ... 14 60 0.25 1110 28, .........,. 14 60 0.15 1040 These data show that consistently high yields are obtained over a wide range of concentrations for soy flour when the ratio of glucose to soy flour is about 4: 1 and the concentration of primary potassium phosphate is between about 0.15 and about 0.25 g / l. The upper limit for the appropriate amount of soy flour is determined by the viscosity and is usually no greater than about 30 gll.

Die gleiche ungewöhnlich hohe Ausbeute an Actidion, die nach der obigen Beschreibung in der Schüttelflasche erzielt wurde, wurde auch in 378 1 fassenden Gärbottichen erhalten. Es wurden die Medien 1, 8 (Kontrollversuch A) und 9 (Kontrollversuch B (s. Tabelle I) untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Tabelle V Actidion-Ausbeuten in 378 1 fassenden Gärbottichen mit drei Medien in 4 und 5 Tagen Actidion-Ausbeuten in y/ccm in drei Medien bei drei Versuchsreihen Medium Nr. 1 Medium Nr. 8 Medium Nr. 9 (Kontrollversuch A) (Kontrollversuch B) 4 Tage 5 Tage 4 Tage 5 Tage 4 Tage I 5 Tage 425 680 840 740 880 510 370 720 900 720 1020 5.55 800 700 1100 400 410 940 1110 930 1160 940 1080 605 1020 Diese Daten zeigen, daß das erfindungsgemäße Medium ('Medium 9) in 378 1 fassenden Gärbottichen die gleiche Ausbeute wie in der Schüttelflasche ergibt und daß die durchschnittliche Ausbeute um etwa 200% höher ist als beim Medium 1 in einem parallelen Gärversuch. Aus diesen Daten geht ferner hervor, daß der Organismus in den erfindungsgemäßen Medien längere Zeit fortgesetzt Actidion erzeugt, was zum Teil die erzielten ungewöhnlich hohen Ausbeuten erklären kann. Außerdem zeigen diese Daten, daß eine zu hohe Konzentration an primärem Kaliumphosphat die Erzeugung von Actidion hemmt. Die gleichen hohen Ausbeuten an Actidion mit den erfindungsgemäßen Medien wurden auch in 189 hl fassenden und größeren Gärbottichen erzielt.The same unusually high yield of Actidion that was achieved in the shake flask as described above was also obtained in 378 l fermentation vats. The media 1, 8 (control experiment A) and 9 (control experiment B (see Table I)) were examined. The results obtained are shown in the following table. Table V Actidion yields in 378 l fermentation vats with three media in 4 and 5 days Actidion yields in y / ccm in three media with three test series Medium # 1 Medium # 8 Medium # 9 (Control experiment A) (control experiment B) 4 days 5 days 4 days 5 T ag e 4 days I 5 days 425 680 840 740 880 510 370 720 900 720 1020 5.55 800 700 1100 400 410 940 1110 930 1160 940 1080 605 1020 These data show that the medium according to the invention ('Medium 9) gives the same yield in 378 l fermentation vats as in the shake flask and that the average yield is about 200% higher than with medium 1 in a parallel fermentation test. These data also show that the organism continues to produce actidion in the media according to the invention for a long time, which can partly explain the unusually high yields achieved. In addition, these data show that too high a concentration of primary potassium phosphate inhibits the production of Actidion. The same high yields of Actidion with the media according to the invention were also achieved in 189-liter and larger fermentation vats.

Die anderen Bestandteile des Mediums sind zwar als Hilfsmittel erwünscht, können jedoch auch weggelassen werden, ohne daß die durch Verwendung von Sojamehl, Glucose und primärem Kaliumphosphat im angegebenen Mengenverhältnis erzielte relative Steigerung der Ausbeute beeinträchtigt wird. Das Calciumcarbonat wird vorteilhaft zur Einstellung des pH-Wertes verwendet, und seine Menge kann zu diesem Zweck zwischen etwa 5 und 10 g/1 betragen. Es können auch größere Mengen angewendet werden, wegen der Unlöslichkeit des Calciumcarbonats ist dies jedoch nicht erwünscht. Das Ammoniumsulfat wird vorteilhaft als ionogene Stickstoffquelle verwendet, und seine Menge kann zu diesem Zwecke zwischen etwa 2,5 und etwa 7,5 g/1 betragen. Größere Mengen sind unerwünscht, da beim Ammoniakstoffwechsel übermäßige Mengen Schwefelsäure freigesetzt werden. Die Brauereihefe wird vorteilhaft wegen ihres Gehalts an Vitaminen und wachstumsfördernden Substanzen verwendet, und ihre Menge kann zu diesem Zwecke zwischen etwa 1 und 5 g/1 betragen, doch sind auch größere Mengen verwendbar. Das Natriumchlorid dient vorteilhaft zur Erhaltung des Ionengleichgewichts und kann hierfür in Mengen von etwa 2 bis etwa 6 g/1 verwendet werden. Größere Mengen sind unerwünscht.The other components of the medium are desirable as aids, can, however, also be omitted without the use of soy flour, Glucose and primary potassium phosphate in the specified proportions achieved relative Increase in the yield is impaired. The calcium carbonate becomes beneficial used to adjust the pH, and its amount can for this purpose between be about 5 and 10 g / l. Larger amounts can also be used because of However, this is not desirable because of the insolubility of the calcium carbonate. The ammonium sulfate is advantageously used as an ionic nitrogen source, and its amount can increase for this purpose between about 2.5 and about 7.5 g / l. Larger amounts are undesirable, because excessive amounts of sulfuric acid are released during ammonia metabolism. Brewer's yeast is beneficial because of its vitamin and growth-promoting content Substances used, and their amount for this purpose can be between about 1 and 5 g / 1, but larger amounts can also be used. The sodium chloride is used beneficial for maintaining the ion balance and can be used in amounts of about 2 to about 6 g / l can be used. Larger amounts are undesirable.

Die optimale Temperatur für das erfindungsgemäße Verfahren beträgt etwa 24°, kann jedoch zwischen etwa 22 und 26° schwanken, und weicht in dieser Hinsicht von der optimalen Temperatur von 30° (28 bis 32°) für die Erzeugung von Streptomycin ab.The optimum temperature for the process according to the invention is about 24 °, but can fluctuate between about 22 and 26 °, and deviates in this regard from the optimal temperature of 30 ° (28 to 32 °) for the production of streptomycin away.

Das Actidion kann aus den erfindungsgemäßen Gärmedien nach bekannten Verfahren, wie sie z. B. in der I?SA.-Patentschrift 2 574 519 und 2 612 502 beschrieben sind, gewonnen werden. Auf Grund der mit dein erfindungsgemäßen Verfahren erzielten ungeii'ohnlich hohen Ausbeuten an Actidion kann man jedoch für die Gewinnung des Actidions auch ein vereinfachtes Verfahren anwenden.The Actidion can be prepared from the fermentation media according to the invention according to known methods Process as they are e.g. For example, in I SA. Patents 2,574,519 and 2,612,502 are to be won. On the basis of the achieved with your method according to the invention Unbelievably high yields of actidion can, however, be used for the production of the Actidions also use a simplified procedure.

Nach diesem vereinfachten Verfahren wird der hl,-Wert der gesamten Gärlösung mit 60o/oiger Schwefelsäure auf 3,5 bis 5,5 gebracht und 10 Minuten auf etwa 60° erhitzt, auf 30° abgekühlt und in einer Filterpresse mit Hilfe von Diatomeenerde oder einem ähnlichen Filterhilfsmittel geklärt. Die geklärte Lösung wird dann in einem Podbielniakextraktor mit -llethylenchlorid unter Verwendung von 0,2 Volumteilen Methylenchlorid je Volumteil Gärlösung extrahiert. Die auf diese Weise erhaltene Methvlenchloridlösung wird in einem Zentrifugalabscheider geklärt und mit Entfärbungskohle entfärbt. Danach wird sie zwanzig- bis vierzigfach konzentriert und ein zweites Mal mit Entfärbungskohle entfärbt. Der so entfärbte Methylenchloridextrakt wird dann weiter auf einen Feststoffgehalt von etwa 400 bis 500 g/1 konzentriert, anschließend mit 3 1 Amylacetat je Kilogramm der Gesamtfeststoffe verdünnt und im Vakuum unter Entfernung des Methylenchlorids destilliert. Die Temperatur sollte unter etwa 70° gehalten werden. Das Actidion wird sodann aus der Amylacetatlösung kristallisiert, und die Kristalle werden mit technisch reinem Hexan gewaschen und - falls erwünscht - aus Amylacetat umkristallisiert. Durch dieses vereinfachte Verfahren erhält man Actidion mit folgenden Eigenschaften: a) Schmelzpunkt zwischen 105 und 120°, b) Gewichtsverlust beim Trocknen nicht über 0,31/o und c) Wirksamkeit mindestens 800 "/mg nach dem Plattenversuch mit Saccharomyces pastorianus.After this simplified procedure, the hl, value becomes the total Fermentation solution with 60% sulfuric acid brought to 3.5 to 5.5 and 10 minutes Heated about 60 °, cooled to 30 ° and put in a filter press with the help of diatomaceous earth or a similar filter aid clarified. The clarified solution is then in a Podbielniak extractor with methylene chloride using 0.2 parts by volume Methylene chloride extracted per part by volume of fermentation solution. The obtained in this way Methylene chloride solution is clarified in a centrifugal separator and treated with decolorizing charcoal discolored. Then it is concentrated twenty to forty times and a second Times decolorized with decolorizing charcoal. The methylene chloride extract decolorized in this way is then further concentrated to a solids content of about 400 to 500 g / l, then diluted with 3 l amyl acetate per kilogram of total solids and under vacuum Distilled removal of the methylene chloride. The temperature should be below about 70 ° being held. The Actidion is then crystallized from the amyl acetate solution, and the crystals are washed with technically pure hexane and - if desired - Recrystallized from amyl acetate. Through this simplified procedure, one obtains Actidion with the following properties: a) melting point between 105 and 120 °, b) Weight loss on drying not more than 0.31 / o and c) effectiveness at least 800 "/ mg after the plate test with Saccharomyces pastorianus.

Claims

PATENT APPROACH: 1 .. Process for the production of Actidion by Breeding of an Actidion-producing strain of Streptomyces griseus, characterized in that that one cultivates the Actidion producing Streptomyces griseus in a medium which at least 14g soy flour per liter, 0.15 to 0.25 g primary potassium phosphate per liter and about 4 parts of glucose each part contains soy flour, and optionally that on top of this Actidion produced in a manner that is obtained from the fermentation medium.

2. The method according to claim 1, characterized in that the Actidion-producing strain of Streptomyces griseus grows in the medium mentioned until the concentration of the actidion has reached at least about 1000 y / cc, and then the actidion from the fermentation medium wins.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the Actidion-producing strain of Streptomyces griseus in said medium for so long grows until the concentration of the actide ion reaches at least about 1000 / ccm has then acidified the fermentation medium to the p $ value 3.5 to 5.5, the fermentation medium clarifies, extracts the clarified medium with methylene chloride, the methylene chloride extract decolorized and concentrated twenty to forty times, the concentrate decolorized, the methylene chloride is replaced by amyl acetate and the actidion from the amyl acetate solution crystallized.