DE10151292A1

DE10151292A1 - New bacterial lipase mutants, useful for enantioselective conversion, e.g. acylation of alcohols, have increased specific activity

Info

Publication number: DE10151292A1
Application number: DE2001151292
Authority: DE
Inventors: Markus Matuschek; Rainer Stuermer; Bernhard Hauer; Gerhard Klebe; Marco Bocola
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-10-22
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2003-04-30

Abstract

Lipase variants (I) prepared by performing at least one amino acid substitution in a starting lipase (II), of lipase homology families I.1 or I.2 are new. The amino acid substitution is at a position corresponding to positions 17, 29, 30, 52, 86, 117, 122, 160, 163, 167, 265, 266, 286 or 289 of a 319 residue prototype lipase sequence (S1), given in the specification. Independent claims are also included for the following: (1) nucleic acid (II) that encodes (I); (2) nucleic acid constructs that contain (II); (3) host organisms transformed with the constructs of (2); (4) preparing (I) by culturing the organisms of (3); (5) lipase formulations containing at least one (I); (6) enzyme-catalyzed or enantioselective conversion of substrates using (I); and (7) preparing optically active compounds by enantioselective reaction of a stereoisomeric mixture or racemate of a lipase-sensitive substrate, using (I), then separation of the reaction mixture.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Lipase-Varianten mit erhöhter spezifischer Aktivität, Verfahren zur Herstellung dieser Lipase- Varianten, sowie die Verwendung dieser Lipase-Varianten als Katalysatoren in chemischen Reaktionen, insbesondere zur Herstellung von optisch aktiven Verbindungen. The present invention relates to lipase variants with increased specific activity, process for producing this lipase Variants, as well as the use of these lipase variants as Catalysts in chemical reactions, especially for manufacturing of optically active connections.

Enzyme werden in zunehmendem Maße in chemischen Reaktionen als Katalysatoren zur Herstellung von Chemikalien insbesondere zur Herstellung von enantiomerenreinen Verbindungen eingesetzt (Nature 2001, 409, 225-268). Enzymes are increasingly being used in chemical reactions Catalysts for the production of chemicals, in particular for Production of enantiomerically pure compounds used (Nature 2001, 409, 225-268).

Eine industriell bedeutende Anwendung von Lipasen liegt in der Herstellung von optisch aktiven Ammen, Alkoholen, Carbonsäuren und Carbonsäureestern. An industrially important application of lipases lies in Production of optically active nurses, alcohols, carboxylic acids and carboxylic acid esters.

Der Einsatz der natürlich vorkommenden Biokatalysatoren in chemischen Reaktionen wird durch zahlreiche Faktoren limitiert wie beispielsweise mangelnde Aktivität, Stabilität und Enantioselektivität. Daher wird an der Optimierung der Eigenschaften vorhandener Enzyme und am Screening nach neuen Enzymen gearbeitet. The use of naturally occurring biocatalysts in chemical reactions are limited by numerous factors such as for example lack of activity, stability and Enantioselectivity. Therefore, the optimization of the properties existing enzymes and worked on the screening for new enzymes.

Aus EP 0 548 228 sind optimierte Lipase-Varianten für den Einsatz als Waschmitteladditive bekannt. Optimized lipase variants for use are known from EP 0 548 228 known as detergent additives.

Desweiteren ist aus Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36, 2830-2832, Science Progress 2000, 83, 157-172, Chemistry & Biology 2000, 7, 709-718 sowie aus DE 197 31 990 A1 bekannt, durch evolutive Zufallsmutation Lipase-Varianten mit verbesserter Enantioselektivität herzustellen. Furthermore, from Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36, 2830-2832, Science Progress 2000, 83, 157-172, Chemistry & Biology 2000, 7, 709-718 and known from DE 197 31 990 A1, by evolutionary random mutation lipase variants with improved Establish enantioselectivity.

Lipase-Varianten mit einer erhöhten spezifischen Aktivität sind bisher nicht bekannt. Are lipase variants with an increased specific activity not yet known.

Aus Pleiss et al., J. Mol. Catalysis B 2000, 10, 491-508 ist bekannt, daß das GX-Motiv im Oxyanion-Loch innnerhalb eine Superfamilie von Lipasen hoch konserviert ist, wobei X für die hydrophoben Aminosäuren Leu, Val, Met und Phe steht. From Pleiss et al., J. Mol. Catalysis B 2000, 10, 491-508 known that the GX motif in the oxyanion hole within one Superfamily of lipases is highly conserved, with X for the hydrophobic amino acids Leu, Val, Met and Phe.

Der Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, neue Lipase-Varianten zur Verfügung zu stellen, die eine erhöhte spezifische Aktivität aufweisen. The object of the invention was to develop new lipase variants to provide an increased specific activity exhibit.

Dementsprechend wurden Lipase-Varianten gefunden, die im Vergleich zur Lipase der SEQ. ID. NO. 1 eine erhöhte spezifische Aktivität bei der Umsetzung von Methoxycyclohexanol mit Vinyllaurat aufweisen. Accordingly, lipase variants were found that are in the Comparison to the lipase of the SEQ. ID. NO. 1 an increased specific Activity in the reaction of methoxycyclohexanol with vinyl laurate exhibit.

Die Lipase der SEQ. ID. NO. 1 als Referenzlipase stellt die Lipase des Stammes Pseudomonas spec. DSM 8246 dar. Die Lipasen aus Pseudomonas glumae oder Burkholderia plantarü weisen die gleiche Sequenz auf (Frenken et al., Cloning of the Pseudomonas glumae lipase gene and determination of the active site residues, Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, 3787-3791). The lipase of the SEQ. ID. NO. 1 as the reference lipase represents the lipase of the Pseudomonas spec. DSM 8246. The lipases from Pseudomonas glumae or Burkholderia plantarü show the same Sequence on (Frenken et al., Cloning of the Pseudomonas glumae lipase gene and determination of the active site residues, Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, 3787-3791).

Unter Lipasen und Lipase-Varianten werden erfindungsgemäß Lipasen verstanden, d. h. Enzyme die die enzymatische Aktivität einer Lipase aufweisen. In der Regel werden Lipase-Varianten durch Veränderung von Ausgangs-Lipase hergestellt, es kann sich bei Lipase- Varianten aber auch um natürliche Lipasen handeln, die Mutationen enthalten. Lipases and lipase variants include lipases according to the invention understood, d. H. Enzymes which indicate the enzymatic activity of a Have lipase. As a rule, lipase variants are used Modification of starting lipase produced, it can Variants but also natural lipases are the mutations contain.

Unter "spezifischer Aktivität" wird erfindungsgemäß die enzymatische Aktivität der Lipase bei der Umwandlung eines Substrats, bezogen auf die Menge Lipase verstanden. According to the invention, "specific activity" is used enzymatic activity of the lipase during the conversion of a substrate, understood based on the amount of lipase.

Die Bestimmung der spezifischen Aktivität einer Lipase-Variante und der Referenz-Lipase erfolgt erfindungsgemäß in einer Referenz-Reaktion, der durch die Lipase oder Lipase-Variante katalysierten Umsetzung von raeemischen trans-Methoxycyclohexanol mit Vinyllaurat zu Laurinsäure-1R,2R-2-Methoxycyclohexylester und 1S,2S-Methoxycyclohexanol. Determination of the specific activity of a lipase variant and the reference lipase takes place according to the invention in one Reference reaction by the lipase or lipase variant catalyzed implementation of Roman trans-methoxycyclohexanol with Vinyl laurate to 1R lauric acid, 2R-2-methoxycyclohexyl ester and 1S, 2S methoxycyclohexanol.

Die Bestimmung der spezifischen Aktivität erfolgt in der Referenzreaktion unter folgenden Bedingungen: The specific activity is determined in the Reference reaction under the following conditions:

Die Referenzrektionreaktion wird in Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Mikrotiterplatte enthält pro Well
A das Lipase-haltige Lyophyllisat von 150 µl Rulturüberstand von Kulturen natürlicher oder rekombinanter Organismen, die eine Lipase exprimieren oder
B die entsprechende, fest vorgegebene Menge isolierte Lipase. The reference reaction is carried out in microtiter plates. The microtiter plate contains per well
A the lipase-containing lyophyllisate of 150 ul culture supernatant from cultures of natural or recombinant organisms that express a lipase or
B the corresponding, fixed amount of isolated lipase.

Für die Racemattrennung werden racemisches trans-Methoxycyclohexanol und Vinyllaurat im molaren Verhältnis 1 : 0,65 eingesetzt [d. h. pro Platte 10 g Methoxycyclohexanol und 11,3 g Vinyllaurat]. In jedes Well werden 200 µl dieses Gemisches pipettiert. For the racemate separation racemic trans-methoxycyclohexanol and vinyl laurate in a molar ratio of 1: 0.65 [D. H. 10 g methoxycyclohexanol and 11.3 g per plate Laurate]. 200 µl of this mixture are pipetted into each well.

Jede Platte wird mit "plate sealer" versiegelt, mit Deckel verschlossen und 96 h bei Raumtemperatur im Rundschüttler bei 150 U/min inkubiert. Anschließend werden jeweils 100 µl pro Kavität abgenommen mit Essigsäureethylester versetzt und gaschromatographisch analysiert. Each plate is sealed with a "plate sealer", with a lid sealed and 96 h at room temperature in a rotary shaker at 150 rpm incubated. Then 100 µl per cavity removed with ethyl acetate and analyzed by gas chromatography.

Gemessen wird die Menge gebildetes Methoxycyclohexanyllaurat bezogen auf die Menge der eingesetzten Lipase (Fall B) oder bezogen auf die optische Dichte der Zellsuspensionen in den Kavitäten der Mikrotitterplatten (Fall A). The amount of methoxycyclohexanyl laurate formed is measured based on the amount of lipase used (case B) or based on the optical density of the cell suspensions in the cavities of the Microplate (case A).

Im Fall A muß gewährleistet sein, daß alle weiteren Meßparameter und sonstigen Parameter, wie beispielsweise induzierte und konstitutive Expression, bei den Organismen, die die jeweilige Lipase exprimieren, identisch sind. In case A it must be ensured that all other measurement parameters and other parameters such as induced and constitutive expression, in the organisms that make up the particular Express lipase are identical.

Eine nach dieser Methode gemessene, größere Menge Methoxycyclohexanyllaurat pro Menge Lipase bedeutet eine höhere spezifische Aktivität. A larger amount measured using this method Methoxycyclohexanyl laurate per amount of lipase means a higher specific Activity.

Unter einer Lipase-Variante, die im Vergleich zur Lipase der SEQ. ID. NO.1 eine erhöhte spezifische Aktivität bei der Umsetzung von Methoxycyclohexanol mit Vinyllaurat aufweist, wird dementsprechend eine Lipase-Variante verstanden, die bei vorstehender Referenz-Reaktion eine höhere, vorzugsweise eine um 10% höhere, bevorzugter eine um 50% höhere, bevorzugter eine um 100% höhere, bevorzugter eine um 200% höhere, bevorzugter eine um 300% höhere, bevorzugter eine um 400% höhere, besonders bevorzugter eine um 500% höhere spezifische Aktivität aufweist als die Lipase der SEQ. ID. NO.1 (Lipase aus Pseodomonas spec. DSM 8246). Under a lipase variant, which compared to the lipase of the SEQ. ID. NO.1 an increased specific activity during implementation of methoxycyclohexanol with vinyl laurate accordingly understood a lipase variant that in the above Reference reaction a higher, preferably a 10% higher, more preferably 50% higher, more preferably 100% higher, more preferably 200% higher, more preferably 300% higher, more preferably 400% higher, more preferably one around 500% higher specific activity than the lipase SEQ. ID. NO.1 (Lipase from Pseodomonas spec. DSM 8246).

Diese Lipase-Varianten lassen sich durch verschiedene Methoden herstellen. These lipase variants can be made by different methods produce.

Bevorzugt sind Lipase-Varianten, die im Vergleich zur Ausgangs- Lipase eine Mutation im Oxyanion-Loch aufweisen. Dementsprechend betrifft die Erfindung neben diesen Lipase-Varianten auch ein Verfahren zur Herstellung von Lipase-Varianten, in dem man in Ausgangs-Lipasen eine Mutation im Oxyanion-Loch einführt. Lipase variants are preferred which, compared to the starting Lipase have a mutation in the oxyanion hole. Accordingly In addition to these lipase variants, the invention also relates to a Process for the preparation of lipase variants, in which one in Starting lipases introduces a mutation in the oxyanion hole.

Als Ausgangs-Lipase können alle Enzyme verwendet werden, die die enzymatische Eigenschaft einer Lipase aufweisen. Dabei kann es sich um natürliche Lipasen oder um bereits abgewandelte Lipase- Varianten handeln. All enzymes which produce the exhibit enzymatic property of a lipase. It can natural lipases or already modified lipase Act variants.

Unter Mutation wird erfindungsgemäß insbesondere der Austausch einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz der Lipase oder Lipase- Variante durch eine andere natürliche Aminosäure verstanden. Unter natürlichen Aminosäuren werden vorzugsweise Ala, Asp, Asn, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp und Tyr verstanden. According to the invention, mutation means in particular the exchange an amino acid in the amino acid sequence of lipase or lipase Variant understood by another natural amino acid. Ala, Asp, Asn, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Understand Thr, Val, Trp and Tyr.

Das Oxyanion-Loch ist ein dem Fachmann bekanntes hochkonserviertes Strukturelement in Lipasen. Der Fachmann kann dieses Strukturelement in einer Lipase-Variante aus der Tertärstruktur durch räumlichen Vergleich der Lipase-Variante mit der Tertiärstruktur einer bekannten Lipase, beispielsweise der Röntgenstruktur von Pseudomonas aeruginosa Lipase entnehmen, bei der Met¹⁶, den "Boden" des Oxyanion-Lochs darstellt (Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 31219-31225). The oxyanion hole is a highly conserved structural element in lipases known to the person skilled in the art. The person skilled in the art can see this structural element in a lipase variant from the tertiary structure by spatial comparison of the lipase variant with the tertiary structure of a known lipase, for example the X-ray structure of Pseudomonas aeruginosa lipase, in which Met ^{16 represents} the “bottom” of the oxyanion hole (Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 31219-31225).

Besonders bevorzugt verwendet man als Ausgangs-Lipase eine bakterielle Lipase der Homologiefamilien I.1 und I.2 oder von diesen Lipasen durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgewandelte Lipasen, deren Sequenz mit der Sequenz einer der bakteriellen Lipasen eine Identität von mindestens 30% auf Aminosäurebene, und die die enzymatische Eigenschaft einer Lipase aufweisen. A starting lipase is particularly preferably used bacterial lipase of the homology families I.1 and I.2 or of these Lipases by substitution, insertion or deletion of Amino acids modified lipases, the sequence of which with the sequence one of the bacterial lipases have an identity of at least 30% Amino acid level, and the enzymatic property of a lipase exhibit.

Unter bakteriellen Lipasen der Homologiefamilien I.1 und I.2 werden erfindungsgemäß die Lipasen verstanden, die sich in die von von Arpigny und Jäger in Biochem. J. 199, 343, 177 beschriebenen Homologieklassen einordnen lassen. Insbesondere sind dies die Lipasen aus Pseudomonas aeruginosa, vibrio cholerae, Pseudomonas Fragi, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas vulgaris, Burkholderia cepacia, Eurkholderia glumae, Pseudomonas spec. DSM 8246, Burkholderia plantarii, Chromobakterium viscosum und Pseudomonas luteola. Die Aminosäuresequenzen dieser Lipasen sind in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, Seite 31223 beschrieben. Under bacterial lipases of the homology families I.1 and I.2 are understood according to the invention the lipases, which are in the by Arpigny and Jäger in Biochem. J. 199, 343, 177 Classify homology classes. In particular, these are the Lipases from Pseudomonas aeruginosa, vibrio cholerae, Pseudomonas Fragi, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas vulgaris, Burkholderia cepacia, Eurkholderia glumae, Pseudomonas spec. DSM 8246, Burkholderia plantarii, Chromobacterium viscosum and Pseudomonas luteola. The amino acid sequences of these lipases are in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, page 31223.

Wie vorstehend beschrieben, kann man in dieser bevorzugten Ausführungsform auch Lipasen als Ausgangslipasen verwenden, die sich von den vorstehend beschriebenen bakteriellen Lipasen, bevorzugt von der bakteriellen Lipase aus Burkholderia plantarii (SEQ. ID. NO. 1) durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren ableiten lassen und deren Sequenz mit der Sequenz einer der bakteriellen Lipasen, bevorzugt mit der bakteriellen Lipase aus Burkholderia plantarii (SEQ. ID. NO. 1) eine Identität von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 40%, bevorzugter mindestens 50%, bevorzugter mindestens 60%, bevorzugter mindestens 70%, bevorzugter mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% auf Aminosäurebene und die enzymatische Eigenschaft einer Lipase aufweisen. As described above, this can be preferred Embodiment also use lipases as starting lipases, which are preferred from the bacterial lipases described above from the bacterial lipase from Burkholderia plantarii (SEQ. ID. NO. 1) by substitution, insertion or deletion of Let amino acids be derived and their sequence with the sequence of one of the bacterial lipases, preferably with the bacterial lipase Burkholderia plantarii (SEQ. ID. NO. 1) an identity of at least 30%, preferably at least 40%, more preferably at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% at the amino acid level and the enzymatic property of a lipase exhibit.

Unter dem Begriff "Substitution" ist in der Beschreibung der Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevorzugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr. Under the term "substitution" is in the description of the Exchange of one or more amino acids by one or more Understand amino acids. So-called conservatives are preferred Exchanges carried out in which the replaced amino acid is a has similar properties to the original amino acid, for example exchange of Glu by Asp, Gln by Asn, Val by Ile, Leu through Ile, Ser through Thr.

Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen. Deletion is the replacement of an amino acid with a direct one Binding. Preferred positions for deletions are the termini of the polypeptide and the links between each Protein domains.

Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptidkette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird. Insertions are insertions of amino acids in the Polypeptide chain, being formally a direct bond through one or more Amino acids is replaced.

Unter Identität zwischen zwei Lipasen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene Software der Firma DNASTAR, inc. Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5S(2):151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Multiple alignment parameter: Gap penalty 10 Gap length penalty 10 Pairwise alignment parameter: K-tuple 1 Gap penalty 3 Window 5 Diagonals saved 5 Identity between two lipases is understood to mean the identity of the amino acids over the respective total protein length, in particular the identity which is obtained by comparison using the laser gene software from DNASTAR, inc. Madison, Wisconsin (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5S (2): 151-1) using the following parameters becomes:
Multiple alignment parameters: Gap penalty 10 Gap length penalty 10 Pairwise alignment parameters: K-tuple 1 Gap penalty 3 window 5 Diagonals saved 5

Unter einer Ausgangs-Lipase, die eine Identität von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist, wird dementsprechend eine Ausgangs-Lipase verstanden, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1, insbesondere nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 30% aufweist. Taking a starting lipase that has an identity of at least 30% at the amino acid level with the sequence SEQ. ID. NO. 1 is accordingly understood to mean a starting lipase which when comparing its sequence with the sequence SEQ. ID. NO. 1, in particular according to the above program algorithm with the above Parameter set has an identity of at least 30%.

Bevorzugt sind Lipase-Varianten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man die Seitenkette des Aminoacylrestes mutiert und damit substituiert, der C-terminal dem ersten konservierten Glycinrest, zwischen der Helix α1 und dem vorhergehenden β-Faltblatt, direkt benachbart ist, mit der Maßgabe, daß die Leserichtung vom N-Terminus zum C-Terminus erfolgt. Preferred are lipase variants which are characterized in that that one mutates the side chain of the aminoacyl residue and thus substituted, the C-terminal of the first conserved glycine residue, between the helix α1 and the previous β sheet, directly is adjacent, with the proviso that the reading direction from N-terminus to C-terminus.

Unter dem Begriff "vorhergehendes β-Faltblatt" wird das β-Faltblatt verstanden, daß bei Leserichtung vom N-Terminus zum C-Terminus direkt vor der Helix α1 liegt. Je nach Länge der Lipase-Sequenz wird dieses β-Faltblatt Faltblatt β1, wie beispielsweise bei der Lipase aus Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas Fragi, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas vulgaris, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Pseudomonas spec. DSM 8246, Burkholderia plantaril und Chromobakterium viscosum oder Faltblatt β3, wie beispielsweise bei der Lipase aus Pseudomonas luteola bezeichnet. Under the term "previous β-sheet" that β-sheet understood that when reading from the N-terminus to C-terminus is directly in front of the helix α1. Depending on the length of the Lipase sequence, this β-sheet is β1 sheet, such as in the lipase from Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas Fragi, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas vulgaris, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Pseudomonas spec. DSM 8246, Burkholderia plantaril and Chromobacterium viscosum or leaflet β3, such as referred to, for example, in the lipase from Pseudomonas luteola.

Entsprechend bevorzugt ist auch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Lipase-Variantenen indem man die Seitenkette des Aminoacylrestes substituiert, der C-terminal dem ersten konservierten Glycinrest, zwischen der Helix α1 und dem vorhergehenden β-Faltblatt, direkt benachbart ist, mit der Maßgabe, daß die Leserichtung vom N-Terminus zum C-Terminus erfolgt. The method according to the invention is correspondingly preferred for the production of lipase variants by using the side chain of the aminoacyl radical, the C-terminal of the first conserved glycine residue, between the helix α1 and the previous β-sheet, is directly adjacent, with the proviso that the Reading direction from N-terminus to C-terminus.

Bei den bevorzugten Ausgangs-Lipasen entnimmt der Fachmann diese bevorzugte Mutations-Position des Strukturelements "Oxyanion- Lochs" direkt der Primär- und Sekundärstruktur der Ausgangs-Lipase. The person skilled in the art takes these from the preferred starting lipases preferred mutation position of the structural element "oxyanion Lochs "directly the primary and secondary structure of the Output lipase.

Diese bevorzugte Position der Mutation kann der Fachmann bei einer Ausgangslipase einem direkten Homologie-Vergleich der Aminosäuresequenz dieser Ausgangslipase mit der einer bakteriellen Lipase der Homolgiefamilien I.1 und I.2., vorzugsweise mit der SEQ. ID. No.1 direkt entnehmen. The person skilled in the art can determine this preferred position of the mutation an initial lipase a direct homology comparison of the Amino acid sequence of this starting lipase with that of a bacterial one Lipase of the homology families I.1 and I.2., Preferably with the SEQ. ID. Take No.1 directly.

Die Seitenkette des Aminoacylrestes der C-terminal dem ersten konservierten Glycinrest, zwischen der Helix α1 und dem vorhergehenden β-Faltblatt, direkt benachbart ist, mit der Maßgabe, daß die Leserichtung vom N-Terminus zum C-Terminus erfolgt, stellt in der SEQ. ID. NO.1 Leu¹⁷ dar. The side chain of the aminoacyl residue of the C-terminal is directly adjacent to the first conserved glycine residue, between the helix α1 and the previous β sheet, with the proviso that the reading direction takes place from the N-terminus to the C-terminus, in the SEQ. ID. NO.1 Leu ¹⁷ .

Wie man beispielsweise dem Homologie-Vergleich in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, Seite 31223 entnimmt, entspricht diese Position in der Lipase aus Pseudomonas aeruginosa, die Position Met¹⁷, in der Lipase aus Vibrio cholerae, die Position Leu⁴⁴, in der Lipase aus Pseudomonas Fragi, die Position Leu¹⁷, in der Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus, die Position Leu⁴⁹, in der Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis, die Position Val³⁷, in der Lipase aus Pseudomonas fluorescens, die Position Met¹⁷, in der Lipase aus Pseudomonas vulgaris, die Position Leu¹⁶, in der Lipase aus Burkholderia cepacia, die Position Leu¹⁷, in der Lipase aus Burkholderia glumae, die Position Leu¹⁷, in der Lipase aus Chromobakterium viscosum, die Position Leu¹⁷ und in der Lipase aus Pseudomonas Iuteola, die Position Leu⁵⁷. As can be seen, for example, from the homology comparison in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, page 31223, this position in the lipase from Pseudomonas aeruginosa corresponds to the position Met ¹⁷ in the lipase from Vibrio cholerae , the position Leu ⁴⁴ , in the lipase from Pseudomonas Fragi, the position Leu ¹⁷ , in the lipase from Acinetobacter calcoaceticus, the position Leu ⁴⁹ , in the lipase from Pseudomonas wisconsinensis, the position Val ³⁷ , in the lipase from Pseudomonas fluorescens, the Position Met ¹⁷ , in the lipase from Pseudomonas vulgaris, position Leu ¹⁶ , in the lipase from Burkholderia cepacia, position Leu ¹⁷ , in the lipase from Burkholderia glumae, position Leu ¹⁷ , in the lipase from Chromobacterium viscosum, the position Leu ¹⁷ and in the lipase from Pseudomonas Iuteola, position Leu ⁵⁷ .

Dementsprechend betrifft die Erfindung in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Lipase-Varianten, ausgewählt aus der Gruppe der Lipasen A bis L
A Lipase aus Pseudomonas aeruginosa, mutiert in Position Met¹⁷,
B Lipase aus Vibrio cholerae, mutiert in Position Leu⁴⁴,
C Lipase aus Pseudomonas Fragi, mutiert in Position Leu¹⁷,
D Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus, mutiert in Position Leu⁴⁹,
E Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis, mutiert in Position Val³⁷,
F Lipase aus Pseudomonas fluorescens, mutiert in Position Mat¹⁷,
G Lipase aus Pseudomonas vulgaris, mutiert in Position Leu¹⁶,
H Lipase aus Burkholderia cepacia, mutiert in Position Leu¹⁷,
I Lipase aus Burkholderia glumae, mutiert in Position Leu¹⁷,
I Lipase aus Burkholderia plantarü, mutiert in Position Leu¹⁷,
J Lipase aus Chromobakterium viscosum, mutiert in Position Leu¹⁷,
K Lipase aus Pseudomonas luteola, mutiert in Position Leu⁵⁷,
L Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246, mutiert in Position Leu¹⁷. Accordingly, in a particularly preferred embodiment, the invention relates to lipase variants selected from the group of lipases A to L
A lipase from Pseudomonas aeruginosa, mutated in position Met ¹⁷ ,
B Lipase from Vibrio cholerae, mutated in position Leu ⁴⁴ ,
C lipase from Pseudomonas Fragi, mutated in position Leu ¹⁷ ,
D lipase from Acinetobacter calcoaceticus, mutated in position Leu ⁴⁹ ,
E lipase from Pseudomonas wisconsinensis, mutated in position Val ³⁷ ,
F lipase from Pseudomonas fluorescens, mutated in position Mat ¹⁷ ,
G lipase from Pseudomonas vulgaris, mutated in position Leu ¹⁶ ,
H lipase from Burkholderia cepacia, mutated in position Leu ¹⁷ ,
I lipase from Burkholderia glumae, mutated in position Leu ¹⁷ ,
I Burkholderia plantarü lipase mutated in position Leu ¹⁷ ,
J lipase from Chromobacterium viscosum, mutated in position Leu ¹⁷ ,
K lipase from Pseudomonas luteola, mutated in position Leu ⁵⁷ ,
L lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246, mutated into position Leu ¹⁷ .

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt als Mutation der Austausch der Ausgangs-Aminosäure an der Position der Muation durch Alanin, Threonin oder Phenylalanin. In a particularly preferred embodiment, as Mutation of the exchange of the starting amino acid at the position of the Muation by alanine, threonine or phenylalanine.

Dementsprechend betrifft die Erfindung in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Lipase-Varianten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Aminosäuresequenz der Lipase-Variante an der Position, die C-terminal dem ersten konservierten Glycinrest, zwischen der Helix α1 und dem vorhergehenden β-Faltblatt, direkt benachbart ist, Alanin, Threonin oder Phenylalanin enthält, mit der Maßgabe, daß die Leserichtung vom N-Terminus zum C-Terminus erfolgt. Accordingly, the invention relates in particular to one preferred embodiment lipase variants thereby are characterized in that the amino acid sequence of the lipase variant on the Position, the C-terminal of the first conserved glycine residue, between the helix α1 and the previous β sheet, directly is adjacent, containing alanine, threonine or phenylalanine provided that the reading direction from the N-terminus to the C-terminus he follows.

Ganz besonders bevorzugt sind daher Lipase-Varianten, ausgewählt aus der Gruppe der Lipasen-Varianten A bis L
A Lipase aus Pseudomonas aeruginosa, wobei Met¹⁷ durch Ala¹⁷, Thr¹⁷ oder Phe¹⁷ ersetzt ist,
B Lipase aus Vibrio cholerae, wobei Leu⁴⁴ durch Ala⁴⁴, Thr⁴⁴ oder Phe⁴⁴ ersetzt ist,
C Lipase aus Pseudomonas Fragi, wobei Leu¹⁷ durch Ala¹⁷, Thr¹⁷ oder Phe¹⁷ ersetzt ist,
D Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus, wobei Leu₄₉ durch Ala⁴⁹, Thr⁴⁹ oder Phe⁴⁹ ersetzt ist,
E Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis, wobei Val³⁷ durch Ala³⁷, Thr³⁷ oder Phe³⁷ ersetzt ist,
F Lipase aus Pseudomonas fluorescens, wobei Met¹⁷ durch Ala¹⁷, Thr¹⁷ oder Phe¹⁷ ersetzt ist,
G Lipase aus Pseudomonas vulgaris, wobei Leu¹⁶ durch Ala¹⁶, Thr¹⁶ oder Phe¹⁶ ersetzt ist,
H Lipase aus Burkholderia cepacia, wobei Leu¹⁷ durch Ala¹⁷, Thr¹⁷ oder Phe¹⁷ ersetzt ist,
I Lipase aus Burkholderia glumae, wobei Leu¹⁷ durch Ala¹⁷, Thr¹⁷ oder Phe¹⁷ ersetzt ist,
I Lipase aus Burkholderia plantarii, wobei Leu¹⁷ durch Ala¹⁷, Thr¹⁷ oder Phe¹⁷ ersetzt ist,
J Lipase aus Chromobakterium Viscosum, wobei Leu¹⁷ durch Ala¹⁷, Thr¹⁷ oder Phe¹⁷ ersetzt ist,
K Lipase aus Pseudomonas Iuteola, wobei Leu⁵⁷ durch Ala⁵⁷, Thr⁵⁷ oder Phe⁵⁷ ersetzt ist,
L Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246, wobei Leu¹⁷ durch Ala¹⁷, Thr¹⁷ oder Phe¹⁷ ersetzt ist. Lipase variants selected from the group of lipase variants A to L are therefore particularly preferred
A lipase from Pseudomonas aeruginosa, where Met ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
B Lipase from Vibrio cholerae, Leu ^{44 being} replaced by Ala ⁴⁴ , Thr ⁴⁴ or Phe ⁴⁴ ,
C lipase from Pseudomonas Fragi, where Leu ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
D Lipase from Acinetobacter calcoaceticus, where Leu _{49 is} replaced by Ala ⁴⁹ , Thr ⁴⁹ or Phe ⁴⁹ ,
E lipase from Pseudomonas wisconsinensis, Val ^{37 being} replaced by Ala ³⁷ , Thr ³⁷ or Phe ³⁷ ,
F lipase from Pseudomonas fluorescens, where Met ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
G lipase from Pseudomonas vulgaris, where Leu ^{16 is} replaced by Ala ¹⁶ , Thr ¹⁶ or Phe ¹⁶ ,
H lipase from Burkholderia cepacia, where Leu ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
I Burkholderia glumae lipase, Leu ^{17 being} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
I lipase from Burkholderia plantarii, where Leu ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
J lipase from Chromobacterium Viscosum, where Leu ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
K lipase from Pseudomonas Iuteola, where Leu ^{57 is} replaced by Ala ⁵⁷ , Thr ⁵⁷ or Phe ⁵⁷ ,
L lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246, whereby Leu ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ .

Ganz besonders bevorzugt ist eine Lipase-Variante, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO.2. Diese Sequenz unterscheidet sich von SEQ. ID. NO.1 durch Austausch von Leu¹⁷ gegen Ala¹⁷. A lipase variant containing the amino acid sequence SEQ is very particularly preferred. ID. NO.2. This sequence differs from SEQ. ID. NO.1 by exchanging Leu ¹⁷ for Ala ¹⁷ .

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuren, die die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Lipase-Varianten kodieren. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich. Another object of the invention are nucleic acids that the lipase variants according to the invention described above encode. Suitable nucleic acid sequences are by Retranslation of the polypeptide sequence available according to the genetic code.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Organismus spezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln. Those codons are preferably used for this which correspond accordingly the organism-specific codon usage can be used frequently. The codon usage can be based on computer evaluations easily identify other known genes of the organism in question.

Soll die Lipase-Variante beispielsweise in einem Bakterium exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage des Bakteriums bei der Rückübersetzung zu verwenden. For example, if the lipase variant is in a bacterium are expressed, it is often advantageous to determine the codon usage of the Bacterium to use in the back translation.

Die Erfindung betrifft weiterhin Lipasen-Formulierungen, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten. The invention further relates to lipase formulations, containing at least one of the lipase variants according to the invention.

Die Lipasen-Varianten können anaolg zu Lipasen in dieser Formulierung in freier Form, auf einem festen Trägermaterial immobilisiert oder in Zellen verwendet werden. The lipase variants can be analogous to lipases in this Formulation in free form, on a solid carrier material immobilized or used in cells.

Methoden zur Immobilisierung von Lipasen sind beispielsweise in WO 00/05354, EP 1069183 beschrieben. Methods for immobilizing lipases are described, for example, in WO 00/05354, EP 1069183.

Bevorzugt werden die Lipase-Varianten in izumobilisierter Form verwendet. The lipase variants in izumobilized form are preferred used.

Die erfindungsgemäßen Lipase-Varianten sind vorzugsweise durch Expression entsprechender Nukleinsäuren, die die entsprechenden Mutationen enthalten in Organismen, vorzugsweise in Bakterien herstellbar. Beispiel für eine solche Nukleinsäure ist das Lipase-Gen aus Burkholderia plantarii (ACC. Nr.: X70354), in das die entsprechende Mutation eingeführt wurde. The lipase variants according to the invention are preferably through Expression of appropriate nucleic acids that correspond to the Mutations exist in organisms, preferably in bacteria produced. This is an example of such a nucleic acid Lipase gene from Burkholderia plantarii (ACC. No .: X70354), in which the corresponding mutation was introduced.

Die Mutationen in den Nukleinsäuren werden beispielsweise, in an sich bekannter Weise, wie in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, Seite 177 bis 183 beschrieben hergestellt und können durch an sich bekannte Methoden in den Expressionsorganismus eingeführt werden. The mutations in the nucleic acids are, for example, in known way, as in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, pages 177 to 183 described and can be prepared by methods known per se are introduced into the expression organism.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur enzymkatalytischen Umwandlung oder enantioselektiven Umwandlung von Substraten, indem man die Substrate in Gegenwart der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipasen-Formulierungen umsetzt. The invention further relates to a method for enzyme catalytic conversion or enantioselective conversion of Substrates by making the substrates in the presence of the invention Implement lipase variants or lipase formulations.

Die erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipasen-Formulierungen können demgemäß als Katalysatoren in chemischen Reaktionen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipasen-Formulierungen sind in einer Vielzahl von chemischen Raktionen einsetzbar. The lipase variants according to the invention or Lipase formulations can accordingly be used as catalysts in chemical reactions be used. The lipase variants according to the invention or Lipase formulations come in a variety of chemical Actions can be used.

Die erfindungsgemäßen Lipase-Varianten weisen nicht nur in der vorstehend erwähnten Referenzreaktion, sondern auch in weiteren Reaktionen eine erhöhte spezifische Aktivität auf. The lipase variants according to the invention not only show in the reference reaction mentioned above, but also in others Reactions to increased specific activity.

Als enzymkatalytische Umwandlungen werden chemische Reaktionen von Substraten verstanden, die Lipasen katalysieren können. Beispielhaft seien folgende Reaktionen erwähnt:
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Alkoholen,
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Aminen,
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Aminoestern, wie beispielsweise Aminosäureester,
Verseifung (Hydrolyse) oder enantioselektive Verseifung (Hydrolyse) von Carbonsäureestern,
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Cyanhydrinen,
Verseifung oder enantioselektive Verseifung von Cyanhydrinestern,
Asymmetrisierung von Meso-diolen oder
Asymmetrisierung von Meso-diestern durch Verseifung. Enzyme catalytic conversions are understood to mean chemical reactions of substrates that can catalyze lipases. The following reactions are mentioned as examples:
Acylation or enantioselective acylation of alcohols,
Acylation or enantioselective acylation of amines,
Acylation or enantioselective acylation of amino esters, such as amino acid esters,
Saponification (hydrolysis) or enantioselective saponification (hydrolysis) of carboxylic acid esters,
Acylation or enantioselective acylation of cyanohydrins,
Saponification or enantioselective saponification of cyanohydrin esters,
Asymmetrization of mesodiols or
Asymmetrization of meso-diesters by saponification.

Bevorzugte Verfahren sind Verfahren zur
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Alkoholen,
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Aminen,
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Aminoestern, wie beispielsweise Aminosäureester oder ein Verfahren zur Verseifung (Hydrolyse) oder enantioselektiven Verseifung (Hydrolyse) von Carbonsäureestern. Preferred methods are methods for
Acylation or enantioselective acylation of alcohols,
Acylation or enantioselective acylation of amines,
Acylation or enantioselective acylation of amino esters, such as amino acid esters or a process for the saponification (hydrolysis) or enantioselective saponification (hydrolysis) of carboxylic acid esters.

Besonders bevorzugt wird bei diesen Verfahren die Lipase-Variante der SEQ. ID. NO.2 verwendet. The lipase variant is particularly preferred in these processes the SEQ. ID. NO.2 used.

Das Verfahren zur enzymkatalytischen Umwandlung oder enantioselektiven Umwandlung von Substraten ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Substrate in Gegenwart der erfindungsgemäßen Lipase- Varianten oder Lipasen-Formulierungen umsetzt. The process for enzyme catalytic conversion or enantioselective conversion of substrates is characterized by that the substrates in the presence of the lipase according to the invention Implement variants or lipase formulations.

Je nachdem ob es der Reaktionstyp erfordert, werden dabei vorzugsweise weitere Reagenzien zugegeben. So erfordert beispielsweise eine Acylierung die Zugabe eines Acylierungsmittels, während beispielsweise die Verseifung keine Zugabe weiterer Reagenzien benötigt. Depending on whether the reaction type requires it, it will be preferably further reagents added. So requires for example an acylation, the addition of an acylating agent, while for example the saponification does not add any more Reagents needed.

Unter Substrat wird eine chemische Verbindung verstanden, die von Lipasen enzymkatalytisch umgesetzt, d. h. chemisch verändert werden kann. Bei enantioselektiven Umwandlungen sind Stereoisomerengemische, von denen nur ein Stereoisomeres umgesetzt wird, ebenfalls Substrate. A substrate is understood to mean a chemical compound that is produced by Lipases enzyme-catalyzed, d. H. chemically changed can be. With enantioselective conversions Mixtures of stereoisomers, of which only one stereoisomer is converted, also substrates.

Beispielhaft seien Alkohole, Amine, Aminoester, Amide, Carbonsäureester, Thioester, Thiole, Cyanhydrine, Cyanhydrinester und Meso-diole und deren stereoisomerengemische als Substrate erwähnt. Bevorzugte Substrate sind Alkohole, Amine, Aminoester und Carbonsäureester bzw. racemische Alkohole, Amine, Aminoester und Carbonsäureester. Examples include alcohols, amines, amino esters, amides, Carboxylic acid esters, thioesters, thiols, cyanohydrins, cyanohydrin esters and Mesodiols and their stereoisomeric mixtures mentioned as substrates. Preferred substrates are alcohols, amines, amino esters and Carboxylic acid esters or racemic alcohols, amines, amino esters and Carbonsäureester.

Das Verfahren wird vorzugsweise in Lösung, bei flüssigen Substraten mit oder ohne Lösungsmittel durchgeführt. Als Lösungsmittel können beispielsweise Wasser, organische Lösungsmittel oder auch wäßrig/organische Zweiphasengemische verwendet werden. The process is preferably in solution, with liquid Carried out substrates with or without solvent. As a solvent can, for example, water, organic solvents or aqueous / organic two-phase mixtures can be used.

Vorzugsweise werden als organische Lösungsmittel Dioxan, THF, Diethylether, Methyl-t-butylether (MTBE), Toluol oder Heptan verwendet. Als wäßrig/organisches Zweiphasengemisch wird vorzugsweise ein Wasser/MTBE-Gemisch in beliebigem Verhältnis einge - setzt. Dioxane, THF, Diethyl ether, methyl t-butyl ether (MTBE), toluene or heptane used. As an aqueous / organic two-phase mixture preferably a water / MTBE mixture is used in any ratio - puts.

Bei Verfahrensdurchführung in Lösung ist die Substratkonzentration nicht kritisch, liegt aber vorzugsweise zwischen 0.5 Gew.-% und 50 Gew.-% bezogen auf die Lösung, besonders bevorzugt sind 20 bis 30 Gew.-%. Die Temperatur bei der Durchführung des Verfahrens ist ebenfalls nicht kritisch, ist aber nach oben durch die Temperaturstabilität des Enzyms beschränkt. Vorzugsweise wird das Verfahren bei 0°C bis 60°C durchgeführt, besonders bevorzugt sind 15°C bis 40°C. When the procedure is carried out in solution, the Substrate concentration not critical, but is preferably between 0.5% by weight and 50% by weight, based on the solution, with 20 being particularly preferred up to 30% by weight. The temperature when performing the procedure is also not critical, but is up through the Temperature stability of the enzyme limited. Preferably that is Process carried out at 0 ° C to 60 ° C, are particularly preferred 15 ° C to 40 ° C.

Das Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Für die kontinuierliche Verfahrensdurchführung leitet man beispielsweise in an sich bekannter Weise in einem Reaktor durch eine Schüttschicht aus immobilisierter Lipase-Variante eine flüssige mobile Phase. Die mobile Phase kann entweder eine Lösung von Substrat (und Reagenzien) bzw. die flüssigen Substrate (und Reagenzien) ohne Lösungsmittel sein. Die Durchflußrate ist nicht kritisch und richtet sich nach verfahrenstechnischen Gesichtspunkten wie Höhe, Durchmesser und Korngröße der Schüttschicht sowie nach der Ausgestaltung das Reaktors. The process can be continuous or discontinuous be performed. For continuous process execution one leads, for example, in a manner known per se in one Reactor immobilized by a fill layer Lipase variant a liquid mobile phase. The mobile phase can either a solution of substrate (and reagents) or the liquid Substrates (and reagents) without solvents. The Flow rate is not critical and depends on procedural aspects such as height, diameter and grain size the packed bed and, according to the design, the reactor.

Als Reaktoren für das kontinuierliche Verfahren verwendet man vorzugsweise die für kontinuierliche, heterogenkatalytische Prozesse (Fluid/Feststoff-Reaktionen) üblichen Reaktoren (J. Hagen, Chemische Reaktionstechnik, VCH, Weinheim 1992, S. 165-169). Beispielhaft seien Wirbelschichtreaktoren und Festbettreaktoren, wie Rohrreaktor, Säulenreaktor, Vollraumreaktor, Hordenreaktor, Rohrbündelreaktor und Flachbett-Kontaktofen genannt. Reactors for the continuous process are used preferably that for continuous, heterogeneous catalytic Processes (fluid / solid reactions) of conventional reactors (J. Hagen, Chemical reaction technology, VCH, Weinheim 1992, pp. 165-169). Examples are fluidized bed reactors and fixed bed reactors, such as Tubular reactor, column reactor, full-space reactor, tray reactor, Tube reactor and flat bed contact furnace called.

In der diskontinuierlichen Verfahrensdurchführung werden die immobilisierten Lipase-Varianten in an sich bekannter Weise in einem Reaktor in einer Lösung von Substrat (und Reagenzien) bzw. in flüssigen Substraten (und Reagenzien) mit oder ohne Lösungsmittel suspendiert und die Suspension durchmischt. Als Reaktoren für das diskontinuierliche Verfahren verwendet man vorzugsweise die für diskontinuierliche, heterogenkatalytische Prozesse (Fluid/Feststoff-Reaktionen) üblichen Reaktoren mit Schüttel-, Misch- oder Rührvorrichtung. Beispielhaft sei der Rührkessel und sich davon ableitende Ausgestaltungen sowie Reaktionsgefäße mit Schüttelvorrichtung erwähnt. In the discontinuous procedure, the immobilized lipase variants in a manner known per se in a reactor in a solution of substrate (and reagents) or in liquid substrates (and reagents) with or without Suspended solvent and mixed the suspension. As reactors is preferably used for the batch process for discontinuous, heterogeneous catalytic processes (Fluid / solid reactions) conventional reactors with shaking, Mixing or stirring device. The stirred kettle and derived designs and reaction vessels with Shaker mentioned.

Nach Beendigung der Reaktion (Erreichung des thermodynamischen Gleichgewichts) wird die immobilisierte Lipase-Variante, beispielsweise durch Dekantieren, Abzentrifugieren oder Abfiltrieren und Waschen isoliert und in weiteren Reaktionen verwendet. After completion of the reaction (reaching the thermodynamic Equilibrium) the immobilized lipase variant, for example by decanting, centrifuging or filtering and washing isolated and used in further reactions.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden Substrate, die acylierbare funktionelle Gruppen wie z. B. Hydroxyl- oder Aminogruppen enthalten, wie Alkohole, Amine oder Aminosäureester in Gegenwart der immobilisierten Lipase als Katalysator und eines Acylierungsmittels acyliert oder enantioselektiv acyliert. In a preferred embodiment of the method Substrates that acylatable functional groups such. B. Contain hydroxyl or amino groups, such as alcohols, amines or Amino acid esters in the presence of the immobilized lipase Acylated catalyst and an acylating agent or enantioselectively acylated.

Diese enzymkatalytische Umwandlung wird bevorzugt in einem organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Dioxan, THF, Diethylether, Methyl-t-butylether (MTBE), Toluol oder Heptan durchgeführt. This enzyme catalytic conversion is preferred in one organic solvents such as dioxane, THF, Diethyl ether, methyl t-butyl ether (MTBE), toluene or heptane carried out.

Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Acylierung oder enantioselektiven Acylierung von Alkoholen, Aminen oder Aminosäureester oder racemischen Alkoholen, Aminen oder Aminosäureester in Gegenwart eines Acylierungsmittels und der Lipase-Variante der SEQ. ID. NO.1. A process for acylation or is particularly preferred enantioselective acylation of alcohols, amines or Amino acid esters or racemic alcohols, amines or amino acid esters in the presence of an acylating agent and the lipase variant of SEQ. ID. NO.1.

Hinsichtlich der Alkohole, Amine und Aminosäureester gibt es praktisch keine Beschränkung. So können ein- und mehrwertige Alkohole, wie beispielsweise
1-Phenylethanol,
gegebenenfalls substituiertes 2-Chlor-1-phenylethanol,
Pent-3-in-2-ol,
1-Butin-3-ol,
2-Hydroxy-4-phenylbuttersäureester,
a-Methyl-(1,3)-benzodioxol-5-ethanol,
2-propanol-1-(1,3-benzodioxol-4-yl),
trans-2-Methoxy-cyclohexanol,
2-Methoxy-2-phenylethanol,
cis -2-Methyl-4-hydroxy-pyran oder
trans-2-Methyl-4-hydroxy-pyran
oder deren Stereoisomerengemische,
ein und mehrwertige Amine oder deren Stereoisomerengemische oder
α, β oder y-Aminosäureester wie beispielsweise die gegebenfalls mit Halogen substituierten C₁-C₄-Alkyl-, Alkylaryl-, Aryl-, C₂-C₆- Alkenyl- oder C₂-C₆-Alkinyl-Ester der natürlichen Aminosäuren oder deren Stereoisomerengemische
verwendet werden. There is practically no limit to the alcohols, amines and amino acid esters. So monohydric and polyhydric alcohols, such as
1-phenylethanol,
optionally substituted 2-chloro-1-phenylethanol,
Pent-3-yn-2-ol,
1-butyne-3-ol,
2-hydroxy-4-phenylbutanoic acid ester,
a-methyl- (1,3) -benzodioxol-5-ethanol,
2-propanol-1- (1,3-benzodioxol-4-yl),
trans-2-methoxy-cyclohexanol,
2-methoxy-2-phenylethanol,
cis -2-methyl-4-hydroxy-pyran or
trans-2-methyl-4-hydroxy-pyran
or their stereoisomer mixtures,
mono- and polyvalent amines or their stereoisomer mixtures or
α, β or y-amino acid esters such as the C ₁ -C ₄ alkyl, alkylaryl, aryl, C ₂ -C ₆ alkenyl or C ₂ -C ₆ alkynyl esters of natural amino acids which are optionally substituted with halogen or their stereoisomer mixtures
be used.

Unter gegebenenfalls substituiertem 2-Chlor-1-phenylethanol wird insbesondere 2-Chlor-1-phenylethanol und substituiertes 2-Chlor-1-phenylethanol verstanden. Bevorzugte substituierte 2-Chlor-1-phenylethanole sind Alkhole der Formel III

wobei
n lbis 3 und
R unabhängig voneinander Halogen, insbesondere F oder Cl, C₁-C₄- Alkoxy, insbesondere Methoxy und NO₂ bedeuten. Optionally substituted 2-chloro-1-phenylethanol means in particular 2-chloro-1-phenylethanol and substituted 2-chloro-1-phenylethanol. Preferred substituted 2-chloro-1-phenylethanols are alcohols of the formula III

in which
n 1 to 3 and
R independently of one another are halogen, in particular F or Cl, C ₁ -C ₄ -alkoxy, in particular methoxy and NO ₂ .

Ein besonders bevorzugtes substituiertes 2-Chlor-1-phenylethanol ist 2-Chlor-1-(m-chlorphenyl)-ethanol. A particularly preferred substituted 2-chloro-1-phenylethanol is 2-chloro-1- (m-chlorophenyl) ethanol.

Vorzugsweise verwendet man als Substrat racemisches trans-2-Methoxy-cyclohexanol. Racemic is preferably used as the substrate trans-2-methoxy-cyclohexanol.

Als Acylierungsmittel werden organische Verbindungen verstanden, die in Gegenwart von Lipasen in Lösung als Acylüberträger fungieren können. Beispielhaft seien erwähnt:
Aliphatische, araliphatische oder aromatische Carbonsäuren die gegebenenfalls mit Halogen, wie Cl, Br, I, F substituiert sind (Acylierung), wie
C₁-C₆-Alkancarbonsäuren, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder
wie araliphatische oder aromatische Carbonsäuren z. B. Benzoesäure, 3-Phenylpropionsäure oder
die entsprechenden Carbonsäureester (Umesterung) wie beispielsweise
3-Phenylpropionsäureester oder Essigsäurealkylester, wie z. B. Essigsäureethylester. Acylating agents are understood to be organic compounds which can act as acyl transfer agents in the presence of lipases in solution. Examples include:
Aliphatic, araliphatic or aromatic carboxylic acids which are optionally substituted with halogen, such as Cl, Br, I, F (acylation), such as
C ₁ -C ₆ alkane carboxylic acids, e.g. B. formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid or
such as araliphatic or aromatic carboxylic acids such. As benzoic acid, 3-phenylpropionic acid or
the corresponding carboxylic acid esters (transesterification) such as
3-phenylpropionic acid ester or alkyl acetate, such as. B. ethyl acetate.

Bevorzugte Carbonsäureester als Acylierungsmittel sind Vinylester der Formel I

in der
R¹ Wasserstoff oder eine C₁-C₄-Alkyl-, vorzugsweise Methylgruppe und
R² Wasserstoff, C₁-C₁₈-Alkyl, welches gegebenenfalls mit Halogen substituiert ist, Phenyl oder (C₁-C₃-)Alkoxy-(C₁-C₄)-Alkyl bedeutet, wie Vinylformiat, Vinylacetat, Vinylpropionat, Vinylbutyrat oder Vinyllaurat. Preferred carboxylic acid esters as acylating agents are vinyl esters of the formula I.

in the
R ^{1 is} hydrogen or a C ₁ -C ₄ alkyl, preferably methyl group and
R ^{2 is} hydrogen, C ₁ -C ₁₈ alkyl, which is optionally substituted by halogen, phenyl or (C ₁ -C ₃ -) alkoxy (C ₁ -C ₄ ) alkyl, such as vinyl formate, vinyl acetate, vinyl propionate, vinyl butyrate or vinyl laurate.

Acylierungsmittel sind weiterhin aliphatische, cycloaliphatische, araliphatische oder aromatische Carbonsäureanhydride und gemischte Carbonsäureanhydride (Acylierung) wie Essigsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid (BSA), Buttersäureanhydrid, 2-Ethylhexansäureanhydrid oder Methyl-Bernsteinsäureanhydrid. Im Falle der Verwendung von Bernsteinsäureanhydrid (BSA) oder anderer schlecht löslicher Anhydride als Acylierungsmittel kann Propylencarbonat besonders vorteilhaft zugemischt werden, um das BSA in Lösung zu bringen. Dies ist vor allem im Hinblick auf ein kontinuierliches Verfahren von Bedeutung. Acylating agents are furthermore aliphatic, cycloaliphatic, araliphatic or aromatic carboxylic acid anhydrides and mixed carboxylic anhydrides (acylation) such as acetic anhydride, Succinic anhydride (BSA), butyric anhydride, 2-ethylhexanoic anhydride or methyl succinic anhydride. In case of Use of succinic anhydride (BSA) or other bad Soluble anhydrides as acylating agents can be propylene carbonate be mixed particularly advantageously to the BSA in solution bring. This is especially with a view to continuous Procedures of importance.

Ein besonders bevorzugtes Acylierungsmittel ist Vinyl-Laurat. A particularly preferred acylating agent is vinyl laurate.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden Carbonsäureester in Gegenwart der erfindungsgemäßen Lipase- Varianten oder Lipase-Formulierungen verseift oder enantioselektiv verseift. In a further preferred embodiment of the method carboxylic acid esters in the presence of the lipase according to the invention Variants or lipase formulations saponified or saponified enantioselectively.

In diesem Fall müssen keine weiteren Reagenzien zugegeben werden, dennoch ist die Anwesenheit von Wasser nötig. Bevorzugt wir die Verseifung von Carbonsäureester durch Zusatz von Wasser unter Verwendung eines vorzugsweise zweiphasigen Systems wie z. B. Wasser/MTBE in Gegenwart der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipase-Formulierungen durchgeführt. In this case, no further reagents need to be added, however, the presence of water is necessary. We prefer that Saponification of carboxylic acid ester by adding water under Use of a preferably two-phase system such. B. Water / MTBE in the presence of the lipase variants according to the invention or lipase formulations.

Hinsichtlich der Carbonsäureester gibt es praktisch keine Beschränkung. So können beispielsweise
Verbindungen der Formel II oder deren Stereoisomerengemische

wobei
R³, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff,
Halogen, wie beispielsweise F, Cl, Br oder I,
einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten
C₁-C₈-Alkylrest wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1, 1-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1-Methylpentyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 1,1-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl 1-Ethyl-2-methylpropyl, Heptyl oder Octyl,
C₂-C₆-Alkenylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes 2-Propenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-entenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl- 3-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl- 3-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 1-Ethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1- methyl-2-propenyl oder 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyl,
C₃-C₆-Alkinylrest wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes 2-Propinyl, 2-Butinyl, 3-Butinyl, 1-Methyl-2-propinyl, 2-Pentinyl, 3-Pentinyl, 4-Pentinyl, 1-Methyl-3-butinyl, 2-Methyl-3-butinyl, 1-Methyl-2-butinyl, 1,1-Dimethyl-2-propinyl, 1-Ethyl-2-propinyl, 2-Hexinyl, 3-Hexinyl, 4-Hexinyl, 5-Hexinyl, 1-Methyl-2-pentinyl, 1-Methyl-2-pentinyl, 1-Methyl-3-pentinyl, 1-Methyl-4-pentinyl, 2-Methyl-3-pentinyl, 2-Methyl-4-pentinyl, 3-Methyl-4-pentinyl, 4-Methyl-2-pentinyl, 1,1-Dimethyl-2- butinyl, 1,1-Dimethyl-3-butinyl, 1,2-Dimethyl-3-butinyl, 2,2-Dimethyl-3-butinyl, 1-Ethyl-2-butinyl, 1-Ethyl-3-butinyl, 2-Ethyl-3-butinyl oder 1-Ethyl-1-methyl-2-propinyl
oder C₃-C₈-Cycloalkylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl, Cyclooctyl,
einen gegebenenfalls substituierten
Arylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes Phenyl, 1-Naphtyl oder 2-Naphtyl,
Arylalkylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes Benzyl,
Heteroarylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, 2-Furyl, 3-Furyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 2-Thienyl, 3-Thienyl, 2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl, 5-Thiazolyl, 2-Oxazolyl, 4-Oxazolyl, 5-Oxazolyl, 2-Pyrimidyl, 4-Pyrimidyl, 5-Pyrimidyl, 6-Pyrimidyl, 3-Pyrazolyl, 4-Pyrazolyl, 5-Pyrazolyl, 3-Isothiazolyl, 4-Isothiazolyl, 5-Isothiazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, 5-Imidazolyl, 3-Pyridazinyl, 4-Pyridazinyl, 5-Pyridazinyl oder 6-Pyridazinyl, vorzugsweise 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, 2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thienyl, 3-Thienyl, 2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl oder 5-Thiazolyl,
oder Heterocycloalkyl- oder -alkenylrest bedeuten. There is practically no restriction on the carboxylic acid esters. For example
Compounds of formula II or their stereoisomer mixtures

in which
R ³ , R ⁴ and R ⁵ independently of one another are hydrogen,
Halogen, such as F, Cl, Br or I,
a branched or unbranched, optionally substituted
C ₁ -C ₈ alkyl such as optionally substituted methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1,2 -Dimethylpropyl, 1, 1-dimethylpropyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, 1-methylpentyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 2 , 2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1-ethyl-2-methylpropyl, heptyl or octyl,
C ₂ -C ₆ alkenyl, such as optionally substituted 2-propenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1-methyl-2-propenyl, 2-methyl-2-propenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4- Pentenyl, 1-methyl-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, 3-methyl-2-butenyl, 1-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, 1,1-dimethyl-2-propenyl, 1,2-dimethyl-2-propenyl, 1-ethyl-2-propenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyl, 1-methyl-2- pentenyl, 2-methyl-2-pentenyl, 3-methyl-2-pentenyl, 4-methyl-2-pentenyl, 3-methyl-3-pentenyl, 4-methyl-3-pentenyl, 1-methyl-4-pentenyl, 2-methyl-4-pentenyl, 3-methyl-4-entenyl, 4-methyl-4-pentenyl, 1,1-dimethyl-2-butenyl, 1,1-dimethyl-3-butenyl, 1,2-dimethyl 2-butenyl, 1,2-dimethyl-3-butenyl, 1,3-dimethyl-2-butenyl, 1,3-dimethyl-3-butenyl, 2,2-dimethyl-3-butenyl, 2,3-dimethyl 2-butenyl, 2,3-dimethyl-3-butenyl, 1-ethyl-2-butenyl, 1-ethyl-3-butenyl, 2-ethyl-2-butenyl, 2-ethyl-3-butenyl, 1,1, 2-trimethyl-2-propenyl, 1-ethyl-1-methyl-2-propenyl or 1-ethyl-2-methyl- 2-propenyl,
C ₃ -C ₆ alkynyl such as optionally substituted 2-propynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 1-methyl-2-propynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-pentynyl, 1-methyl-3-butynyl , 2-methyl-3-butynyl, 1-methyl-2-butynyl, 1,1-dimethyl-2-propynyl, 1-ethyl-2-propynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl, 4-hexynyl, 5-hexynyl , 1-methyl-2-pentynyl, 1-methyl-2-pentynyl, 1-methyl-3-pentynyl, 1-methyl-4-pentynyl, 2-methyl-3-pentynyl, 2-methyl-4-pentynyl, 3rd -Methyl-4-pentynyl, 4-methyl-2-pentynyl, 1,1-dimethyl-2-butynyl, 1,1-dimethyl-3-butynyl, 1,2-dimethyl-3-butynyl, 2,2-dimethyl -3-butynyl, 1-ethyl-2-butynyl, 1-ethyl-3-butynyl, 2-ethyl-3-butynyl or 1-ethyl-1-methyl-2-propynyl
or C ₃ -C ₈ cycloalkyl, such as optionally substituted cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl, cyclooctyl,
an optionally substituted one
Aryl radical, such as optionally substituted phenyl, 1-naphthyl or 2-naphthyl,
Arylalkyl radical, such as optionally substituted benzyl,
Heteroaryl radical, such as optionally substituted 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-furyl, 3-furyl, 2-pyrrolyl, 3-pyrrolyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-thiazolyl, 4-thiazolyl, 5-thiazolyl, 2-oxazolyl, 4-oxazolyl, 5-oxazolyl, 2-pyrimidyl, 4-pyrimidyl, 5-pyrimidyl, 6-pyrimidyl, 3-pyrazolyl, 4-pyrazolyl, 5-pyrazolyl, 3-isothiazolyl, 4- Isothiazolyl, 5-isothiazolyl, 2-imidazolyl, 4-imidazolyl, 5-imidazolyl, 3-pyridazinyl, 4-pyridazinyl, 5-pyridazinyl or 6-pyridazinyl, preferably 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-furyl , 3-furyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-thiazolyl, 4-thiazolyl or 5-thiazolyl,
or heterocycloalkyl or alkenyl radical.

Als ein bis dreifache Substituenten der C₁-C₈-Alkyl-, C₂-C₆ -Alkenyl-, C₂-C₆-Alkinyl-, C₃-C₈-Cycloalkyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Heteroaryl-, Heterocycloalkyl- oder -alkenylreste kommen beispielsweise Halogen-, Nitro-, Amino-, Hydroxy- oder Cyanogruppen, C₁-C₄-Alkyl-, C₁-C₄-Halogenalkyl-, C₁-C₄-Alkoxy-, C₁-C₄ -Halogenalkoxy-, C₁-C₄-Alkylthio-, Hetaryl-, Arylreste oder der Rest -O- CO-C₁-C₄-Alkyl in Frage. As one to triple substituents of the C ₁ -C ₈ alkyl, C ₂ -C ₆ alkenyl, C ₂ -C ₆ alkynyl, C ₃ -C ₈ cycloalkyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl Heterocycloalkyl or alkenyl radicals come, for example, halogen, nitro, amino, hydroxy or cyano groups, C ₁ -C ₄ alkyl, C ₁ -C ₄ haloalkyl, C ₁ -C ₄ alkoxy, C ₁ -C ₄ haloalkoxy, C ₁ -C ₄ alkylthio, hetaryl, aryl radicals or the radical -O- CO-C ₁ -C ₄ alkyl in question.

Bevorzugte Carbonsäureester sind beispielsweise
1-Butin-3-ol-acetat,
1-Butin-3-ol-butyrat,
Essigsäure-1-phenyl-ethylester oder
2-Acetoxy-4-phenylbuttersäureester. Preferred carboxylic acid esters are, for example
1-butyne-3-ol acetate,
1-butyne-3-ol-butyrate,
1-phenyl-ethyl acetate or
2-acetoxy-4-phenylbutanoic acid ester.

Das Verfahren zur enantioselektiven enzymkatalytischen Umwandlung von Substraten mit den erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipase-Formulierungen kann zur Abtrennung von Stereoisomeren und insbesondere zur Abtrennung von Enantiomeren oder Diastereomeren aus einem Stereoisomerengemisch des Substrats dienen. Besonders bevorzugt dient es zur Abtrennung von Enantiomeren oder Diastereomeren aus racemischen Substraten und damit zur Herstellung von optisch aktiven Verbindungen aus den jeweiligen racemischen Gemischen. The process for enantioselective enzyme catalytic conversion of substrates with the lipase variants according to the invention or Lipase formulations can be used to separate stereoisomers and especially for the separation of enantiomers or diastereomers serve from a mixture of stereoisomers of the substrate. Especially it is preferably used to separate enantiomers or Diastereomers from racemic substrates and thus for the production of optically active compounds from the respective racemic Mixtures.

Durch die enantioselektive Substratspezifität der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipase-Formulierungen, wird beispielsweise nur ein Enantiomeres des racemischen Substrats umgewandelt, das andere Enantiomere reagiert nicht. Die entstehenden Produkte lassen sich durch chemische, physikalische und mechanische Trennmethoden in an sich bekannter Weise leicht trennen. Beispielhaft seien Kristallisation, Fällung, Extraktion in zweiphasigen Lösungsmittelsystemen, chromatographische Trennverfahren, wie HPLC, GC oder Säulenchromatographie über Kieselgel oder thermische Trennungsverfahren wie Destillation genannt. Due to the enantioselective substrate specificity of the lipase variants or lipase formulations according to the invention for example only one enantiomer of the racemic substrate is converted, the other enantiomer does not react. The resulting products can be by chemical, physical and mechanical Easily separate separation methods in a manner known per se. exemplary be crystallization, precipitation, extraction in two-phase Solvent systems, chromatographic separation processes such as HPLC, GC or column chromatography on silica gel or thermal Separation processes called distillation.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man Stereoisomerengemische oder Racemate von Subtraten, die sich enzymkatalytisch von Lipasen umsetzen lassen, enantioselektiv in Gegenwart der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten umsetzt und anschließend die Gemische auftrennt. Accordingly, the present invention further relates to a Process for the production of optically active compounds, thereby characterized in that mixtures of stereoisomers or racemates of Substrates that can be enzymatically converted by lipases, enantioselectively in the presence of the invention Implement lipase variants and then separate the mixtures.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorzugsweise die optisch aktiven Verbindungen herstellen, die als Stereoisomerengemisch als Substrate von Lipasen umgesetzt werden können, bzw. von deren Stereoisomerengemisch mindestens ein Stereoisomer als Substrat von Lipasen umgesetzt werden kann. With the method according to the invention, the Establish optically active connections as Stereoisomer mixture can be implemented as substrates of lipases, or of their stereoisomer mixture at least one stereoisomer as Substrate can be implemented by lipases.

Ein Verfahren zur enantioselektiven Acylierung von Alkoholen, Aminen oder Aminosäureester dient vorzugsweise zur Trennung von racemischen Alkoholen, Aminen bzw. Aminosäureester und damit zur Herstellung von otisch aktiven Alkoholen, Aminen bzw. Aminosäureester. A process for the enantioselective acylation of alcohols, Amines or amino acid esters are preferably used to separate racemic alcohols, amines or amino acid esters and thus for Production of otically active alcohols, amines or Aminosäureester.

Ein Verfahren zur enantioselektiven Hydrolyse oder Verseifung von Carbonsäureestern dient vorzugsweise zur Trennung von racemischen Carbonsäureestern und damit zur Herstellung von otisch aktiven Carbonsäureestern. A process for the enantioselective hydrolysis or saponification of Carboxylic esters are preferably used to separate racemic Carboxylic acid esters and thus for the production of otically active Carbonsäureestern.

Die erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipase-Formulierungen weisen den Vorteil auf, daß sie bei gleichbleibender Enantioselektivität eine erhöhte spezifische Aktivität aufweisen. The lipase variants or lipase formulations according to the invention have the advantage that they remain the same Enantioselectivity have an increased specific activity.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung: The following examples illustrate the invention:

General experimental conditions

In allen Fällen, in denen keine detaillierte Beschreibung der Experimente erfolgt, wurden molekularbiologische Methoden angewandt, die bekannt sind und z. B. in Current Protocols of Molecular Biology, 1999, John Wiley & Sons beschrieben sind. Verwendete Bakterienstämme Escherichia coli XL1-Blue (Fa. Stratagene)
Escherichia coli XJS5037 (pRK₂₀13) (Proc. Natl. Acad. Sci., 1979, 1648-1652)
Pseudomonas spec. DSM 8246 Verwendete Plasmide pBluescriptIIKS (Fa. Stratagene),
pBP1500: Abkömmling von pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) mit dem 2,6 kBp Lipase-Operon aus Pseudomonas spec. DSM 8246 in pBP1500 codiert für eine enzymatisch inaktive Lipase (lipA-),
pBP1520: Abkömmling von pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) mit dem 2,6 kBp Lipase-Operon aus Pseudomonas spec. DSM 8246 in pBP1520 codiert für eine enzymatisch aktive Lipase (lipA),
pBP2112: Abkömmling von pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) mit dem 2,6 kBp Lipase-Operon aus Pseudomonas spec. DSM 8246, das die Mutation zur Produktion der Lipasevariante LipA L17A enthält. In all cases in which the experiments are not described in detail, molecular biological methods were used which are known and e.g. B. in Current Protocols of Molecular Biology, 1999, John Wiley & Sons. Bacterial strains used Escherichia coli XL1-Blue (from Stratagene)
Escherichia coli XJS5037 (pRK ₂₀ 13) (Proc. Natl. Acad. Sci., 1979, 1648-1652)
Pseudomonas spec. DSM 8246 plasmids pBluescriptIIKS (from Stratagene) used,
pBP1500: descendant of pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) with the 2.6 kbp lipase operon from Pseudomonas spec. DSM 8246 in pBP1500 encodes an enzymatically inactive lipase (lipA-),
pBP1520: descendant of pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) with the 2.6 kbp lipase operon from Pseudomonas spec. DSM 8246 in pBP1520 encodes an enzymatically active lipase (lipA),
pBP2112: descendant of pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) with the 2.6 kbp lipase operon from Pseudomonas spec. DSM 8246, which contains the mutation for the production of the lipase variant LipA L17A.

example 1 Production of a lipase variant with increased specific enzyme activity A) Cultivation of the bacteria

Escherichia coli wurde in LB-Medium 16 h im Rundschüttler mit 200 Upm bei 37°C inkubiert. Pseudomonas spec. DSM 8246 wurde in FP- Medium 24 h im Rundschüttler mit 200 Upm bei 30°C inkubiert. Als Inkubationsgefäße wurden Kulturröhrchen oder Mikrotiterplatten verwendet. Escherichia coli was incubated in LB medium for 16 h in a rotary shaker with 200 Rpm incubated at 37 ° C. Pseudomonas spec. DSM 8246 was developed in FP Medium incubated in a rotary shaker at 200 rpm at 30 ° C. for 24 h. As Incubation tubes were culture tubes or microtiter plates used.

Folgende Antibiotika (Selektion) wurden verwendet: Tetracyclin 10 µg/ml (XL1-Blue), Ampicillin 100 µg/ml (pBluescriptIIKS), Gentamycin 10 µg/ml (pBP-Plasmide in E. coli), Gentamycin 45 µg/ml (pBP-Plasmide in Pseudomonas spec. DSM 8246), Chloramphenicol 20 µg/ml (Pseudvmonas spec. DSM 8246), Kanamycin 25 µg/ml (Escherichia coli XJS5037 (pRK2013) oder Pseudomonas spec. DSM 8246) The following antibiotics (selection) were used: tetracycline 10 µg / ml (XL1-Blue), ampicillin 100 µg / ml (pBluescriptIIKS), Gentamycin 10 µg / ml (pBP plasmids in E. coli), gentamycin 45 µg / ml (pBP plasmids in Pseudomonas spec. DSM 8246), chloramphenicol 20 µg / ml (Pseudvmonas spec. DSM 8246), Kanamycin 25 µg / ml (Escherichia coli XJS5037 (pRK2013) or Pseudomonas spec. DSM 8246)

B) Mutagenesis

Durch ortsgerichtete Mutagenese mit der Methode Overlap-Extension-PCR (Recombinant PCR, 1990, 177-183, Academic Press, San Diego) wurde die Mutante L17A von lipA aus Pseudomonas spec. DSM 8246 erzeugt. By site-directed mutagenesis with the method Overlap Extension PCR (Recombinant PCR, 1990, 177-183, Academic Press, San Diego) the mutant L17A of lipA from Pseudomonas spec. DSM 8246 generated.

Chromosomale DNA von Pseudomonas spec. DSM 8246 diente als Matrizen-DNA. Als Primer wurden eingesetzt:

MAT16 5'-GATCGACGTAAGCTTTAACGATGGAGAT-3' (SEQ. ID. NO.6)
MAT109 5'-CGGTGCCCGCGGCGCCGTGGACGAGGATCACCG-3' (SEQ. ID. NO.3)
MAT108 5'-CGTCCACGGCGCCGCGGGCACCGACAAGTTCGC-3' (SEQ. ID. NO.4)
MAT19 5'-CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3' (SEQ. ID. NO.5)
Chromosomal DNA from Pseudomonas spec. DSM 8246 served as template DNA. The following were used as primers:

MAT16 5'-GATCGACGTAAGCTTTAACGATGGAGAT-3 '(SEQ. ID. NO.6)
MAT109 5'-CGGTGCCCGCGGCGCCGTGGACGAGGATCACCG-3 '(SEQ. ID. NO.3)
MAT108 5'-CGTCCACGGCGCCGCGGGCACCGACAAGTTCGC-3 '(SEQ. ID. NO.4)
MAT19 5'-CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3 '(SEQ. ID. NO.5)

Im ersten PCR-Schritt wurde mit MAT16 und MAT109 ein Teilfragment von lipA und mit MAT108 und MAT19 ein weiteres Teilfragment von lipA erzeugt. Die Teilfragmente wurden im Agarosegel aufgetrennt und mit dem GFX Kit (Fa. Pharmacia) gereinigt. Aus den gereinigten Fragmenten wurde im zweiten PCR-Schritt mit MAT16 und MAT19 das Fragment lipA* erzeugt, das für die Lipasevariante L17A codiert. In the first PCR step, a partial fragment was created with MAT16 and MAT109 from lipA and with MAT108 and MAT19 another partial fragment from lipA generates. The partial fragments were separated in the agarose gel and cleaned with the GFX Kit (Pharmacia). From the purified fragments were in the second PCR step with MAT16 and MAT19 generates the fragment lipA *, which is required for the lipase variant L17A coded.

Die PCR wurde nach der Vorschrift des Herstellers mit dem GC-Rich Kit (Fa. Pharmacia) mit dem folgenden Temperaturprofil durchgeführt: (1) 95°C - 3 min. (2) 95°C - 30 s, (3) 40°C - 30 s, (4) 72 - 30 s, (5) 95°C - 30 s, (6) 60°C - 30 s, (7) 72°C - 30 s, (8) 72°C - 10 min. Schritte (2) - (4) mit 5 Zyklen; dann Schritte (5) - (7) 15 Zyklen. The PCR was carried out according to the manufacturer's instructions with the GC-Rich Kit (Pharmacia) with the following temperature profile carried out: (1) 95 ° C - 3 min. (2) 95 ° C - 30 s, (3) 40 ° C - 30 s, (4) 72 - 30 s, (5) 95 ° C - 30 s, (6) 60 ° C - 30 s, (7) 72 ° C - 30 s, (8) 72 ° C - 10 min. Steps (2) - (4) with 5 cycles; then steps (5) - (7) 15 cycles.

Das Fragment lipA* und der Vektor pBluescriptIIKS wurden mit HindIII und SacI gespalten, im Agarosegel getrennt, mit dem GFX Kit gereinigt und ligiert. Anschließend wurde der Ansatz in E. coli transformiert. Das rekombinante Plasmid wurde gereinigt und sequenziert, um die Mutation nachzuweisen. Bis auf die Mutation L17A wurden keine weiteren Mutationen in der DNA nachgewiesen. The fragment lipA * and the vector pBluescriptIIKS were included Split HindIII and SacI, separated in agarose gel, with the GFX Kit cleaned and ligated. The approach was then carried out in E. coli transformed. The recombinant plasmid was purified and sequenced to detect the mutation. Except for the mutation L17A no further mutations were detected in the DNA.

C) cloning

Der Vektor pBP1500 und das rekombinante pBluescript-Derivat mit lipA* wurde mit HindIII und Sacl gespalten und ligiert. Das entstandene rekombinante Plasmid wurde als pBP2112 bezeichnet. pBP2112 wurde in E. coli XL1-Blue transformiert. Anschließend wurde pBP2112 durch Konjugation von E. coli XL1-BLue mit Hilfe des Helferstammes E. coli XJS5037 (pRK2013) nach Pseudomonas spec. DSM 8246 übertragen. Der rekombinante Stamm wurde als Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP2112) bezeichnet. The vector pBP1500 and the recombinant pBluescript derivative with lipA * was cleaved and ligated with HindIII and Sacl. The The resulting recombinant plasmid was named pBP2112. pBP2112 was transformed into E. coli XL1-Blue. Subsequently was made using pBP2112 by conjugation of E. coli XL1-BLue of the helper strain E. coli XJS5037 (pRK2013) according to Pseudomonas spec. DSM 8246 transmitted. The recombinant strain was called Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP2112).

D) Enzyme production and processing

Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP2112) wurde in 96-Kavitäten-Mikrotiterplatten mit je 250 µl Medium pro Kavität auf dem Rundschüttler mit 150 Upm bei 30°C für 24 h inkubiert. Als Kontrolle wurde Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP1520) angezogen. Dieser Stamm trägt plasmidcodiert das lipA-Gen von Pseudomonas spec. DSM 8246 (Vergleichsbeispiel). Für die Anzucht der Bakterien wurde folgendes Medium eingesetzt: (NH₄)₂SO₄ 6 g/l, CaCl₂ 0,02 g/l, MgSO₄ × 7 H₂O 1 g/l, KH₂PO₄ 3,5 g/l, K₂HPO₄ 3,5 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, Glucose 5 g/l, Spurensalzlösung 10 ml/11 Kanamycin 25 µg/ml, Gentamycin 45 µg/ml. Nach der Anzucht wurden die Mikrotiterplatten zentrifugiert. Die Kulturüberstände wurden anschließend in eine Polypropylen-Mikrotiterplatte übertragen und 48 h gefriergetrocknet. Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP2112) was incubated in 96-well microtiter plates with 250 µl medium per cavity on the rotary shaker at 150 rpm at 30 ° C for 24 h. Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP1520) tightened. This strain carries the lipA gene from Pseudomonas spec. DSM 8246 (comparative example). The following medium was used to grow the bacteria: (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 6 g / l, CaCl ₂ 0.02 g / l, MgSO ₄ × 7 H ₂ O 1 g / l, KH ₂ PO ₄ 3.5 g / l, K ₂ HPO ₄ 3.5 g / l, yeast extract 5 g / l, glucose 5 g / l, trace salt solution 10 ml / 11 kanamycin 25 µg / ml, gentamycin 45 µg / ml. After growth, the microtiter plates were centrifuged. The culture supernatants were then transferred to a polypropylene microtiter plate and freeze-dried for 48 hours.

Unter den Kultivierungsbedingungen wird die chromosomale Lipase nicht exprimiert. Daher trägt auch das Vergleichsbeispiel die natürliche Lipase plasmidcodiert. Under the cultivation conditions, the chromosomal lipase not expressed. Therefore, the comparative example also carries the natural lipase plasmid-encoded.

E) Resolution and analysis

In den Mikrotiterplatten mit den gefriergetrockneten überständen wurde die Racematspaltung von rac-trans-2-Methoxycyclohexanol durchgeführt. Für die Racemattrennung wurden Methoxycyclohexanol und Vinyllaurat im molaren Verhältnis 1 : 0,65 eingesetzt [d. h. pro Platte 10 g Methoxycyclohexanol und 11,3 g Vinyllaurat]. In jedes Well wurden 200 µl dieses Gemisches pipettiert. Jede Platte wurden mit "plate sealer" versiegelt, mit Deckel verschlossen und 96 h bei Raumtemperatur im Rundschüttler bei 150 V/min inkubiert. Anschließend wurden jeweils 100 µl pro Kavität abgenommen mit Essigsäureethylester versetzt und gaschromatographisch analysiert. In the microtiter plates with the freeze-dried supernatants was the racemate resolution of rac-trans-2-methoxycyclohexanol carried out. For the racemate separation methoxycyclohexanol and vinyl laurate in a molar ratio of 1: 0.65 [d. H. 10 g methoxycyclohexanol and 11.3 g vinyl laurate per plate]. In 200 μl of this mixture were pipetted into each well. Every plate were sealed with a "plate sealer", closed with a lid and Incubated for 96 h at room temperature in a rotary shaker at 150 V / min. Then 100 µl per cavity were removed Ethyl acetate added and analyzed by gas chromatography.

Tabelle 1 enthält die gemessene Menge gebildetes Methoxycyclohexanyllaurat in Gew.-%. Tabelle 1

Table 1 contains the measured amount of methoxycyclohexanyl laurate formed in% by weight. Table 1

Die Lipasevariante LipA L17A zeigte im Vergleich zum natürlichen Enzym eine um den Faktor 8,4 höhere Aktivität in der Racematspaltung von Methoxycyclohexanol. The lipase variant LipA L17A showed in comparison to the natural Enzyme in the enzyme is 8.4 times higher Racemate resolution of methoxycyclohexanol.

Die spezifische Enzymaktivität ist in diesem Fall definiert als Menge gebildetes Methoxycyclohexanyllaurat in [Gew.-%] geteilt durch Optische Dichte der Bakteriensuspension bei OD₆₆₀ nm. Die gebildete Menge aktives Enzym koreliert linear mit der OD_{660 nm} im Bereich 0,0 bis 0,7 +/- 0,2. The specific enzyme activity is defined in this case as the amount of methoxycyclohexanyl laurate formed in [% by weight] divided by the optical density of the bacterial suspension at OD ₆₆₀ nm. The amount of active enzyme formed correlates linearly with the OD _{660 nm} in the range 0.0 to 0. 7 +/- 0.2.

Dabei ergaben sich für die spezifische Aktivität folgende Werte: Tabelle 2

The results for the specific activity were as follows: Table 2

Die Lipasevariante LipA L17A zeigte im Vergleich zum natürlichen Enzym eine um den Faktor 7,3 höhere spezifische Enzymaktivität in der Racematspaltung von Methoxycyclohexanol. SEQUENCE LISTING

The lipase variant LipA L17A showed a 7.3 times higher specific enzyme activity in the resolution of methoxycyclohexanol compared to the natural enzyme. SEQUENCE LISTING

Claims

1. Lipase variant, which compared to the lipase of the SEQ. ID. NO.1 an increased specific activity in the implementation of Has racemic trans-methoxycyclohexanol with vinyl laurate.

2. Lipase variant according to claim 1, characterized in that Compared to the parent lipase, a mutation in Has oxyanion hole.

3. Lipase variant according to claim 1 or 2, characterized characterized in that a bacterial lipase as the starting lipase Homology families I.1 and I.2 used or by them Lipases by substitution, insertion or deletion of Amino acids modified lipases, the sequence of which follows the sequence of a bacterial lipases have an identity of at least 30% at the amino acid level, and which has the enzymatic property have a lipase.

4. Lipase variant according to claim 3, characterized in that the side chain of the aminoacyl radical is substituted, the C- terminally the first conserved glycine residue, between the Helix α1 and the previous β sheet, directly is adjacent, with the proviso that the reading direction from N-terminus to C-terminus.

5. lipase variant according to claim 4, characterized in that the amino acid sequence of the lipase variant at the position, the C-terminal of the first conserved glycine residue, between the helix α1 and the previous β-sheet, directly is adjacent, containing alanine, threonine or phenylalanine provided that the reading direction from the N-terminus to C terminus occurs.

6. Lipase variant, selected from the group of lipases A to L
A lipase from Pseudomonas aeruginosa, mutated in position Met ¹⁷ ,
H Lipase from Vibrio cholerae, mutated in position Leu ⁴⁴ ,
C lipase from Pseudomonas asks mutated in position Leu ¹⁷ ,
D lipase from Acinetobacter calcoaceticus, mutated in position Leu ⁴⁹ ,
E lipase from Pseudomonas wisconsinensis, mutated in position Val ³⁷ ,
F lipase from Pseudomonas fluorescens, mutated in position Met ¹⁷ ,
G lipase from Pseudomonas vulgaris, mutated in position Leu ¹⁶ ,
H lipase from Burkholderia cepacia, mutated in position Leu ¹⁷ ,
I lipase from Burkholderia glumae, mutated in position Leu ¹⁷ ,
I lipase from Burkholderia plantarii, mutated in position Leu ¹⁷ ,
J lipase from Chromobacterium viscosum, mutated in position Leu ¹⁷ ,
K lipase from Pseudomonas luteoia mutated in position Leu ⁵⁷ .
L lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246, mutated into position Leu ¹⁷ .

7. Lipase variant, selected from the group of lipase variants A to L
A lipase from Pseudomonas aeruginosa, where Met ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
H Lipase from Vibrio cholerae, where Leu ^{44 is} replaced by Ala ⁴⁴ , Thr ⁴⁴ or Phe ⁴⁴ ,
C lipase from Pseudomonas Fragi, where Leu ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
D Lipase from Acinetobacter calcoaceticus, where Leu ^{49 is} replaced by Ala ⁴⁹ , Thr ⁴⁹ or Phe ⁴⁹ ,
E lipase from Pseudomonas wisconsinensis, Val ^{37 being} replaced by Ala ³⁷ , Thr ³⁷ or Phe ³⁷ ,
F lipase from Pseudomonas fluorescens, where Met ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
G lipase from Pseudomonas vulgaris, where Leu ^{16 is} replaced by Ala ¹⁶ , Thr ¹⁶ or Phe ¹⁶ ,
H lipase from Burkholderia cepacia, where Leu ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
I Burkholderia glumae lipase, Leu ^{17 being} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
I Burkhoideria piantarii lipase, Leu ^{17 being} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
J lipase from Chromobacterium viscosum, where Leu ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ ,
K lipase from Pseudomonas luteola, Leu ^{57 being} replaced by Ala ⁵⁷ , Thr ⁵⁷ or Phe ⁵⁷ ,
L lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246, whereby Leu ^{17 is} replaced by Ala ¹⁷ , Thr ¹⁷ or Phe ¹⁷ .

8. Lipase variant containing the amino acid sequence SEQ. ID. NO.2.

9. nucleic acids encoding a lipase variant according to one of the Claims 1 to 8.

10. Process for the preparation of lipase variants, in which one in Starting lipases introduces a mutation in the oxyanion hole.

11. The method according to claim 10, characterized in that bacterial lipases as the starting lipases Homology families I.1 and I.2 used or by these lipases Substitution, insertion or deletion of amino acids modified lipases, the sequence of which matches the sequence of one of the bacterial lipases have an identity of at least 30% Amino acid level, and the enzymatic property of a lipase exhibit.

12. The method according to claim 11, characterized in that one substituted the side chain of the aminoacyl radical, the C-terminal the first conserved glycine residue, between the helix α1 and the previous β sheet, is directly adjacent, with the proviso that the reading direction from the N-terminus to the C- Terminus occurs.

13. Lipase formulation containing at least one of the lipase Variants according to one of claims 1 to 8.

14. Lipase formulation according to claim 13, characterized characterized in that the lipase variants according to one of the claims 1 to 8 in free form, on a solid support immobilized or used in cells.

15. Process for enzyme catalytic conversion or enantioselective conversion of substrates, characterized in that according to the substrates in the presence of the lipase variants one of claims 1 to 8 or the lipase formulations implemented according to claim 13 or 14.

16. The method according to claim 15, characterized in that as substrates alcohols, amines or amino acid esters used and this in the presence of an acylating agent acylated or enantioselectively acylated.

17. The method according to claim 15, characterized in that one uses carboxylic acid esters as substrates and these saponified or saponified enantioselectively.

18. Process for the production of optically active compounds, characterized in that mixtures of stereoisomers or Racemate of substrates that are enzymatically catalyzed by Have lipases converted, enantioselectively in the presence of Lipase variants according to one of claims 1 to 8 or the lipase Formulations according to claim 13 or 14 and then separates the mixtures.

19. The method according to claim 18, characterized in that as substrates alcohols, amines or aminate used and this in the presence of an acylating agent enantioselectively acylated.

20. The method according to claim 18, characterized in that one uses carboxylic acid esters as substrates and these saponified enantioselectively.

21. Use of the lipase variants according to one of claims 1 to 8 or the lipase formulations according to claim 13 or 14 as a catalyst in chemical reactions.