DE10205444A1 - New bacterial lipase mutants, useful for enantioselective conversion, e.g. acylation of alcohols, have increased specific activity - Google Patents

New bacterial lipase mutants, useful for enantioselective conversion, e.g. acylation of alcohols, have increased specific activity

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DE10205444A1
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    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Abstract

Lipase variants (I) prepared by performing at least one amino acid substitution in a starting lipase (II), of lipase homology families I.1 or I.2 are new. The amino acid substitution is at a position corresponding to positions 17, 29, 30, 52, 86, 117, 122, 160, 163, 167, 265, 266, 286 or 289 of a 319 residue prototype lipase sequence (S1), given in the specification. Independent claims are also included for the following: (1) nucleic acid (II) that encodes (I); (2) nucleic acid constructs that contain (II); (3) host organisms transformed with the constructs of (2); (4) preparing (I) by culturing the organisms of (3); (5) lipase formulations containing at least one (I); (6) enzyme-catalyzed or enantioselective conversion of substrates using (I); and (7) preparing optically active compounds by enantioselective reaction of a stereoisomeric mixture or racemate of a lipase-sensitive substrate, using (I), then separation of the reaction mixture.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Lipase-Varianten mit verbesserten Eigenschaften, Verfahren zur Herstellung dieser Lipase- Varianten, sowie die Verwendung dieser Lipase-Varianten als Katalysatoren in chemischen Reaktionen, insbesondere zur Herstellung von optisch aktiven Verbindungen. The present invention relates to new lipase variants improved properties, process for producing this lipase Variants, as well as the use of these lipase variants as Catalysts in chemical reactions, especially for manufacturing of optically active connections.

Der Einsatz der natürlich vorkommenden Biokatalysatoren in chemischen Reaktionen wird durch zahlreiche Faktoren limitiert wie beispielsweise mangelnde Aktivität, Stabilität und Enantioselekitivität. Daher ist es wünschenswert, neue Biokatalysatoren zur Verfügung zu haben, die hinsichtlich dieser Eigenschaften optimiert worden sind. The use of naturally occurring biocatalysts in chemical reactions are limited by numerous factors such as for example lack of activity, stability and Enantioselekitivität. It is therefore desirable to use new biocatalysts To have available regarding these properties have been optimized.

Eine industriell bedeutende Anwendung von Lipasen liegt in der Herstellung von optisch aktiven Aminen, Alkoholen, Carbonsäuren und Carbonsäureestern. An industrially important application of lipases lies in Production of optically active amines, alcohols, carboxylic acids and carboxylic acid esters.

Aus EP 0 548 228 sind optimierte Lipase-Varianten für den Einsatz als Waschmitteladditive bekannt. Optimized lipase variants for use are known from EP 0 548 228 known as detergent additives.

Der Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, neue Lipase-Varianten mit verbesserten Eigenschaften, z. B. erhöhter spezifischer Aktivität zur Verfügung zu stellen. The object of the invention was to develop new lipase variants with improved properties, e.g. B. increased specific To provide activity.

Gefunden wurden Lipase-Varianten, herstellbar indem man an der Aminosäuresequenz einer Ausgangslipase, ausgewählt aus der Lipase-Homologiefamilie I.1 oder I.2, mindestens eine Aminosäuresubstitution an solchen Positionen durchführt, die den Positionen 17, 29, 30, 52, 86, 117, 122, 160, 163, 167, 265, 266, 286, 289 in der Sequenz der enzymatisch aktiven Prototyp-Lipase SEQ ID NO: 1 entsprechen. Lipase variants were found that can be produced by using the Amino acid sequence of a starting lipase selected from the Lipase homology family I.1 or I.2, at least one Performs amino acid substitution at those positions that correspond to the positions 17, 29, 30, 52, 86, 117, 122, 160, 163, 167, 265, 266, 286, 289 in the sequence of the enzymatically active prototype lipase SEQ ID NO: 1.

Die Lipase mit der Aminosäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 wird im folgenden als Prototyp-Lipase-Sequenz bezeichnet. Es handelt sich dabei um die Lipase des Stammes Pseudomonas spec. DSM 8246. The lipase with the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 1 is in hereinafter referred to as the prototype lipase sequence. These are to the lipase of the strain Pseudomonas spec. DSM 8246.

Dieser Stamm Pseudomonas spec. DSM 8246 wird auch als Burkholderia plantarii bezeichnet. Die Lipasen aus Burkholderia plantarii und Pseudomonas glumae weisen die gleiche Sequenz auf (Frenken et al., Cloning of the Pseudomonas glumae lipase gene and determination of the active site residues, Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, 3787-3791). This strain Pseudomonas spec. DSM 8246 is also called Burkholderia plantarii. The lipases from Burkholderia plantarii and Pseudomonas glumae have the same sequence (Frenken et al., Cloning of the Pseudomonas glumae lipase gene and determination of the active site residues, Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, 3787-3791).

Unter Ausgangslipasen der Lipasen-Homologiefamilien I.1 und I.2 werden erfindungsgemäß die Lipasen verstanden, die sich in die von Arpigny und Jäger in Biochem. J. 199, 343, 177 beschriebenen Homologieklassen (Tabelle 1) einordnen lassen. Auf diese Klassifizierung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Bevorzugt als Ausgangslipasen sind die Lipasen aus Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Pseudomonas fragi, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomorias vulgaris, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Pseudomonas spec. DSM 8246, Burkholderia plantarii, Chromobacterium viscosum und Pseudomonas luteola. Under starting lipases of the lipase homology families I.1 and I.2 are understood according to the invention the lipases which are in the by Arpigny and Jäger in Biochem. J. 199, 343, 177 Allocate homology classes (Table 1). To this Classification is hereby expressly referred to. Preferred as The starting lipases are the lipases from Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Pseudomonas fragi, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomorias vulgaris, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Pseudomonas spec. DSM 8246, Burkholderia plantarii, Chromobacterium viscosum and Pseudomonas luteola.

Besonders bevorzugt als Ausgangslipase ist die Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246, deren Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 wiedergegeben ist. The lipase is particularly preferred as the starting lipase Pseudomonas spec. DSM 8246, whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 is reproduced.

Die Aminosäuresequenzen dieser bevorzugten Lipasen sind in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, Seite 31223 beschrieben. The amino acid sequences of these preferred lipases are in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, page 31223 described.

Es können jedoch auch noch andere Lipasen als Ausgangslipasen der Lipasen-Homologiefamilien I.1 und I.2 verwendet werden, solange sie den Klassifikationskriterien von Arpigny und Jäger genügen. However, other lipases can also be used as starting lipases Lipase homology families I.1 and I.2 are used as long as they meet the classification criteria of Arpigny and Jäger.

Unter Lipasen und Lipase-Varianten werden erfindungsgemäß Lipasen verstanden, d. h. Enzyme die die enzymatische Aktivität einer Lipase aufweisen. In der Regel werden solche Lipase-Varianten durch gezielte gentechnische Veränderung von Ausgangs-Lipasen hergestellt. Eine weitere Möglichkeit, die erfindungsgemäßen Lipase-Varianten herzustellen sind sogenannte evolutive Verfahren, bei denen ein Ausgangsmolekül durch ungerichtete Mutation und Selektion optimiert wird. Lipases and lipase variants include lipases according to the invention understood, d. H. Enzymes which indicate the enzymatic activity of a Have lipase. As a rule, such lipase variants through targeted genetic engineering of parent lipases manufactured. Another possibility, the invention To produce lipase variants are so-called evolutionary Methods in which a parent molecule is caused by undirected mutation and selection is optimized.

Unter Aminosäuresubstitution wird erfindungsgemäß der Austausch einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz der Ausgangslipase durch eine andere Aminosäure, bevorzugt natürliche Aminosäure verstanden. Unter natürlichen Aminosäuren werden Ala, Asp, Asn, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp und Tyr verstanden. According to the invention, the exchange is carried out under amino acid substitution an amino acid in the amino acid sequence of the parent lipase by another amino acid, preferably natural amino acid Roger that. Ala, Asp, Asn, Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Understand Thr, Val, Trp and Tyr.

Da die Aminosäuresequenzen der Ausgangslipasen in der Regel nicht die gleiche Länge wie die Prototyp-Lipase-Sequenz besitzen, können die Positionen der Prototyp-Lipase-Sequenz nicht direkt auf die Ausgangslipase übertragen werden, sondern es müssen die entsprechenden homologen Positionen identifiziert werden. Um diese Positionen zu ermitteln führt man ein Sequenz-Alignment mit der Prototyp Lipase Sequenz durch, wie es in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, Seite 31223 (Fig. 3) beschrieben ist. Auf dieses Dokument sowie die darin aufgeführten weiteren Dokumente wird hiermit hinsichtlich des Sequenz Alignments und der homologen Positionen ausdrücklich Bezug genommen. Since the amino acid sequences of the starting lipases generally do not have the same length as the prototype lipase sequence, the positions of the prototype lipase sequence cannot be transferred directly to the starting lipase, but the corresponding homologous positions must be identified. To determine these positions, a sequence alignment is carried out using the prototype lipase sequence, as described in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, page 31223 ( FIG. 3). Reference is hereby expressly made to this document and the other documents listed therein with regard to the sequence alignment and the homologous positions.

Wie man beispielsweise dem Homologie-Vergleich in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, Seite 31223 entnimmt, entspricht der Position Met16 der Lipase aus Pseudomonas aeruginosa in der Lipase aus Vibrio cholerae die Position Leu44; in der Lipase aus Pseudomonas fragi die Position Leu17; in der Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus die Position Leu49; in der Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis die Position Val37; in der Lipase aus Pseudomonas fluorescens die Position Met17; in der Lipase aus Pseudomonas vulgaris die Position Leu16; in der Lipase aus Burkholderia cepacia die Position Leu17; in der Lipase aus Burkholderia glumae (identisch mit SEQ ID NO: 1) die Position Leu17; in der Lipase aus Chromobacterium viscosum, die Position Leu17 und in der Lipase aus Pseudomonas luteola die Position Leu57. As can be seen, for example, from the homology comparison in Nardini et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, page 31223, the position Met 16 of the lipase from Pseudomonas aeruginosa in the lipase from Vibrio cholerae corresponds to the position Leu 44 ; in the Pseudomonas fragi lipase, position Leu 17 ; in the lipase from Acinetobacter calcoaceticus the position Leu 49 ; in the Pseudomonas wisconsinensis lipase the position Val 37 ; the position Met 17 in the lipase from Pseudomonas fluorescens; the position Leu 16 in the lipase from Pseudomonas vulgaris; the position Leu 17 in the lipase from Burkholderia cepacia; the position Leu 17 in the lipase from Burkholderia glumae (identical to SEQ ID NO: 1); in the lipase from Chromobacterium viscosum, the position Leu 17 and in the lipase from Pseudomonas luteola, the position Leu 57 .

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sind Lipase-Varianten, die herstellbar sind aus Ausgangslipasen, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
A Lipase aus Pseudomonas aeruginosa,
B Lipase aus Vibrio cholerae,
C Lipase aus Pseudomonas fragi,
D Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus,
E Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis,
F Lipase aus Pseudomonas fluorescens,
G Lipase aus Pseudomonas vulgaris,
H Lipase aus Burkholderia cepacia,
I Lipase aus Burkholderia glumae,
J Lipase aus Burkholderia plantarii,
K Lipase aus Chromobacterium viscosum,
L Lipase aus Pseudomonas luteola,
M Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246 A preferred embodiment of the invention are lipase variants which can be prepared from starting lipases which are selected from the following group:
A lipase from Pseudomonas aeruginosa,
B Lipase from Vibrio cholerae,
C lipase from Pseudomonas fragi,
D lipase from Acinetobacter calcoaceticus,
E Paseomonas wisconsinensis lipase,
F lipase from Pseudomonas fluorescens,
G lipase from Pseudomonas vulgaris,
H lipase from Burkholderia cepacia,
I lipase from Burkholderia glumae,
J lipase from Burkholderia plantarii,
K lipase from Chromobacterium viscosum,
L lipase from Pseudomonas luteola,
M lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246

Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind solche Lipase-Varianten, die gegenüber der Ausgangslipase an folgenden Positionen mutiert sind:
A Lipase aus Pseudomonas aeruginosa, mutiert in Position Met16,
B Lipase aus Vibrio cholerae, mutiert in Position Leu44,
C Lipase aus Pseudomonas fragi, mutiert in Position Leu17,
D Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus, mutiert in Position Leu49,
E Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis, mutiert in Position Val37,
F Lipase aus Pseudomonas fluorescens, mutiert in Position Met17,
G Lipase aus Pseudomonas vulgaris, mutiert in Position Leu16
H Lipase aus Burkholderia cepacia, mutiert in Position Leu17,
I Lipase aus Burkholderia glumae, mutiert in Position Leu17,
J Lipase aus Burkholderia plantarii, mutiert in Position Leu17,
K Lipase aus Chromobakterium viscosum, mutiert in Position Leu17,
L Lipase aus Pseudomonas luteola, mutiert in Position Leu57.
M Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246, mutiert in Position Leu17. Further preferred embodiments are those lipase variants which are mutated in relation to the starting lipase at the following positions:
A lipase from Pseudomonas aeruginosa, mutated in position Met 16 ,
B Lipase from Vibrio cholerae, mutated in position Leu 44 ,
C lipase from Pseudomonas fragi, mutated in position Leu 17 ,
D lipase from Acinetobacter calcoaceticus, mutated in position Leu 49 ,
E lipase from Pseudomonas wisconsinensis, mutated in position Val 37 ,
F lipase from Pseudomonas fluorescens, mutated in position Met 17 ,
G lipase from Pseudomonas vulgaris, mutated in position Leu 16
H lipase from Burkholderia cepacia, mutated in position Leu 17 ,
I lipase from Burkholderia glumae, mutated in position Leu 17 ,
J lipase from Burkholderia plantarii, mutated in position Leu 17 ,
K lipase from Chromobacterium viscosum, mutated in position Leu 17 ,
L Pseudomonas luteola lipase mutated in position Leu 57 .
M lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246, mutated into position Leu 17 .

Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind solche Lipase-Varianten, die gegenüber der Ausgangslipase folgende Substitutionen tragen:
A Lipase aus Pseudomonas aeruginosa, wobei Met16 durch Ala16, Thr16 oder Phe16 ersetzt ist,
B Lipase aus Vibrio cholerae, wobei Leu44 durch Ala44, Thr44 oder Phe44 ersetzt ist,
C Lipase aus Pseudomonas fragi, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
D Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus, wobei Leu49 durch Ala49, Thr49 oder Phe49 ersetzt ist,
E Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis, wobei Val37 durch Ala37, Thr37 oder Phe37 ersetzt ist,
F Lipase aus Pseudomonas fluorescens, wobei Met17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
G Lipase aus Pseudomonas vulgaris, wobei Leu16 durch Ala16, Thr16 oder Phe16 ersetzt ist,
H Lipase aus Burkholderia cepacia, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
I Lipase aus Burkholderia glumae, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
J Lipase aus Burkholderia plantarii, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
K Lipase aus Chromobakterium viscosum, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
L Lipase aus Pseudomonas luteola, wobei Leu57 durch Ala57, Thr57 oder Phe57 ersetzt ist,
M Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist. Further preferred embodiments are those lipase variants which have the following substitutions compared to the starting lipase:
A lipase from Pseudomonas aeruginosa, where Met 16 is replaced by Ala 16 , Thr 16 or Phe 16 ,
B Lipase from Vibrio cholerae, Leu 44 being replaced by Ala 44 , Thr 44 or Phe 44 ,
C lipase from Pseudomonas fragi, where Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
D Lipase from Acinetobacter calcoaceticus, where Leu 49 is replaced by Ala 49 , Thr 49 or Phe 49 ,
E lipase from Pseudomonas wisconsinensis, Val 37 being replaced by Ala 37 , Thr 37 or Phe 37 ,
F lipase from Pseudomonas fluorescens, where Met 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
G lipase from Pseudomonas vulgaris, where Leu 16 is replaced by Ala 16 , Thr 16 or Phe 16 ,
H lipase from Burkholderia cepacia, where Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
I Burkholderia glumae lipase, Leu 17 being replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
J lipase from Burkholderia plantarii, where Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
K lipase from Chromobacterium viscosum, where Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
L lipase from Pseudomonas luteola, Leu 57 being replaced by Ala 57 , Thr 57 or Phe 57 ,
M lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246, whereby Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 .

Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind solche Lipase- Varianten, die gegenüber der Ausgangslipase aus Pseudomonas spec DSM 8246 mindestens eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen tragen:
Leu17 ersetzt durch Ala17, Thr17 oder Phe17, Met17
Tyr29 ersetzt durch Ser29, Thr29, Phe29, Glu29
Trp30 ersetzt durch His30, Phe30
Phe52 ersetzt durch Ser52, Thr52 oder Tyr52, Leu52
His86 ersetzt durch Trp86, Thr86, Ser86
Ser117 ersetzt durch Ala117, Thr117, Met117
Phe122 ersetzt durch Leu122
Ala160 ersetzt durch Phe160, Leu160, Ile160
Ala163 ersetzt durch Phe163, Leu163, Ile163
Leu167 ersetzt durch Ala167, Val167, Ser167, Thr167
Leu265 ersetzt durch Ala265, Val267 oder Met265, Ser265, Thr265
Val266 ersetzt durch Ala266, Leu266, Met266, Ser266, Lys266
Leu286 ersetzt durch Ala286, Met286, Val286 oder Ile286, Ser286
Ile289 ersetzt durch Ala289, Val289 oder Leu289, Further preferred embodiments are those lipase variants which carry at least one of the following amino acid substitutions compared to the starting lipase from Pseudomonas spec DSM 8246:
Leu 17 replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 , Met 17
Tyr 29 replaced by Ser 29 , Thr 29 , Phe 29 , Glu 29
Trp 30 replaced by His 30 , Phe 30
Phe 52 replaced by Ser 52 , Thr 52 or Tyr 52 , Leu 52
His 86 replaced by Trp 86 , Thr 86 , Ser 86
Ser 117 replaced by Ala 117 , Thr 117 , Met 117
Phe 122 replaced by Leu 122
Ala 160 replaced by Phe 160 , Leu 160 , Ile 160
Ala 163 replaced by Phe 163 , Leu 163 , Ile 163
Leu 167 replaced by Ala 167 , Val 167 , Ser 167 , Thr 167
Leu 265 replaced by Ala 265 , Val 267 or Met 265 , Ser 265 , Thr 265
Val 266 replaced by Ala 266 , Leu 266 , Met 266 , Ser 266 , Lys 266
Leu 286 replaced by Ala 286 , Met 286 , Val 286 or Ile 286 , Ser 286
Ile 289 replaced by Ala 289 , Val 289 or Leu 289 ,

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist eine Lipase- Variante, die gegenüber der Ausgangslipase aus Pseudomonas spec DSM 8246 zwei der folgenden Aminosäuresubstitutionen trägt:
Leu17 ersetzt durch Ala17, Thr17, Phe17, Met17
Phe52 ersetzt durch Leu52, Ser52, Thr52 oder Tyr52. A particularly preferred embodiment is a lipase variant which carries two of the following amino acid substitutions compared to the starting lipase from Pseudomonas spec DSM 8246:
Leu 17 replaced by Ala 17 , Thr 17 , Phe 17 , Met 17
Phe 52 replaced by Leu 52 , Ser 52 , Thr 52 or Tyr 52 .

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäuresequenzen, die die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Lipase-Varianten kodieren. Geeignete Nukleinsäuresequenzen sind durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhältlich. The invention further relates to nucleic acid sequences, the invention described above Encode lipase variants. Suitable nucleic acid sequences are by Retranslation of the polypeptide sequence according to the genetic code available.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Organismus spezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln. Those codons are preferably used for this which correspond accordingly the organism-specific codon usage can be used frequently. The codon usage can be based on computer evaluations easily identify other known genes of the organism in question.

Soll die Lipase-Variante beispielsweise in einem Bakterium exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage des Bakteriums bei der Rückübersetzung zu verwenden. For example, if the lipase variant is in a bacterium are expressed, it is often advantageous to determine the codon usage of the Bacterium to use in the back translation.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Nukleinsäurekonstrukte, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten. Diese Nukleinsäurekonstrukte tragen bevorzugt neben den Nukleinsäuresequenzen noch regulatorische Sequenzen die beispielsweise für die Expression, die Replikation oder die Rekombination vorteilhaft sind. Another object of the invention are Nucleic acid constructs that the nucleic acid sequences according to the invention contain. These nucleic acid constructs preferably carry in addition to Nucleic acid sequences still regulatory sequences for example for expression, replication or Recombination are beneficial.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Wirtsorganismen, die mit diesen Nukleinsäurekonstrukten transformiert werden können. Als Wirtsorganismen geeignet sind Ein- oder Mehrzeller, wobei Mikroorganismen als Wirtsorganismen bevorzugt sind. Another object of the invention are host organisms that can be transformed with these nucleic acid constructs. One or more cells are suitable as host organisms, whereby Microorganisms are preferred as host organisms.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von Lipase-Varianten, indem man Wirtsorganismen, die mit einer für die Lipase-Varianten codierendenden Nukleinsäuresequenz transformiert wurden, unter solchen Bedingungen kultiviert, die die Produktion der Lipase-Varianten in diesen Wirtsorganismen erlauben. Anschließend, wenn die Konzentration der Lipase- Variante in dem Kulturmedium die gewünschte Größe erreicht hat, kann die Lipase-Variante aus dem Kulturmedium isoliert werden. Je nach gewünschtem Einsatzzweck der Lipase kann diese noch mit üblichen Verfahren der Proteinchemie wie Fällung und Chromatographie aufgereinigt werden. Für manche Einsatzzwecke kann jedoch auch der gesamte Wirtsorganismus ggf. nach vorheriger Abtötung verwendet werden. The invention further relates to methods for Production of lipase variants by comparing host organisms with a nucleic acid sequence coding for the lipase variants were transformed, cultivated under such conditions that the production of lipase variants in these host organisms allow. Then when the concentration of lipase Variant in the culture medium has reached the desired size, the lipase variant can be isolated from the culture medium. ever Depending on the intended use of the lipase, it can also be used usual methods of protein chemistry such as precipitation and Chromatography to be purified. For some uses, however also the entire host organism, if necessary after prior killing be used.

Die Erfindung betrifft weiterhin Lipasen-Formulierungen, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten. The invention further relates to lipase formulations, containing at least one of the lipase variants according to the invention.

Die Lipasen-Varianten können in diesen Formulierung in isolierter Form, auf einem festen Trägermaterial immobilisiert oder in Zellen verwendet werden. Solche Lipase Formulierungen können neben der Lipase-Variante auch noch Stabilisatoren, Detergentien sowie Enzymsubstrate enthalten. The lipase variants can be isolated in this formulation Form, immobilized on a solid support or in Cells are used. Such lipase formulations can besides the lipase variant also stabilizers, detergents and Enzyme substrates included.

Methoden zur Immobilisierung von Lipasen sind beispielsweise in WO 00/05354, EP 1069183 beschrieben. Methods for immobilizing lipases are described, for example, in WO 00/05354, EP 1069183.

Bevorzugt werden die Lipase-Varianten in immobilisierter Form verwendet. The lipase variants in immobilized form are preferred used.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur enzymkatalytischen Umwandlung oder enantioselektiven Umwandlung von Substraten, indem man die Substrate in Gegenwart der erfindungsgemäßen Lipase umsetzt. The invention further relates to a method for enzyme catalytic conversion or enantioselective conversion of Substrates by making the substrates in the presence of the invention Lipase.

Die erfindungsgemäßen Lipase-Varianten können demgemäß als Katalysatoren in chemischen Reaktionen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Lipase-Varianten sind in einer Vielzahl von chemischen Raktionen einsetzbar. The lipase variants according to the invention can accordingly as Catalysts are used in chemical reactions. The Lipase variants according to the invention are in a variety of chemical reactions can be used.

Die Messung der Katalytischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten erfolgt mit Referenzreaktionen. Damit lassen sich auch gut höhere spezifische Aktivitäten gegenüber den Ausgangslipasen ermitteln:
Die Bestimmung der spezifischen Aktivität einer Lipase-Variante erfolgt erfindungsgemäß beispielsweise in folgender Referenz- Reaktion, in der die Lipase oder Lipase-Variante die Umsetzung von racemischen trans-Methoxycyclohexanol mit Vinyllaurat zu Laurinsäure-1R, 2R-2-Methoxycyclohexylester und 1S,2S-Methoxycyclohexanol katalysiert. The catalytic properties of the lipase variants according to the invention are measured using reference reactions. It can also be used to determine higher specific activities compared to the starting lipases:
The specific activity of a lipase variant is determined according to the invention, for example, in the following reference reaction, in which the lipase or lipase variant converts racemic trans-methoxycyclohexanol with vinyl laurate to 1R, 2R-2-methoxycyclohexyl ester and 1S, 2S- Catalyzed by methoxycyclohexanol.

Die Bestimmung der spezifischen Aktivität erfolgt in dieser Referenzreaktion unter folgenden Bedingungen:
Die Referenzrektionreaktion wird in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten durchgeführt. Die Mikrotiterplatte enthält pro Kavität

  • 1. A das Lipase-haltige Lyophyllisat von 150 µl Kulturüberstand von Kulturen natürlicher oder rekombinanter Organismen, die eine Lipase exprimieren oder
  • 2. B die entsprechende, fest vorgegebene Menge isolierte Lipase.
The specific activity is determined in this reference reaction under the following conditions:
The reference reaction is carried out in 96-well microtiter plates. The microtiter plate contains per cavity
  • 1. A the lipase-containing lyophyllisate of 150 ul culture supernatant from cultures of natural or recombinant organisms that express a lipase or
  • 2. B the corresponding, fixed amount of isolated lipase.

Für die Racemattrennung werden racemisches trans-Methoxycyclohexanol und Vinyllaurat im molaren Verhältnis 1 : 0,65 eingesetzt [d. h. pro Platte 10 g Methoxycyclohexanol und 11,3 g Vinyllaurat]. In jedes Well werden 200 µl dieses Gemisches pipettiert. For the racemate separation racemic trans-methoxycyclohexanol and vinyl laurate in a molar ratio of 1: 0.65 [D. H. 10 g methoxycyclohexanol and 11.3 g per plate Laurate]. 200 µl of this mixture are pipetted into each well.

Jede Platte wird mit "plate sealer" versiegelt, mit Deckel verschlossen und 96 h bei Raumtemperatur im Rundschüttler bei 150 U/min inkubiert. Anschließend werden jeweils 100 µl pro Kavität abgenommen mit Essigsäureethylester versetzt und gaschromatographisch analysiert. Each plate is sealed with a "plate sealer", with a lid sealed and 96 h at room temperature in a rotary shaker Incubated 150 rpm. Then 100 µl each Removed cavity with ethyl acetate and analyzed by gas chromatography.

Gemessen wird die Menge gebildetes Methoxycyclohexanyllaurat bezogen auf die Menge der eingesetzten Lipase (Fall B) oder bezogen auf die optische Dichte der Zellsuspensionen in den Kavitäten der Mikrotitterplatten (Fall A). The amount of methoxycyclohexanyl laurate formed is measured based on the amount of lipase used (case B) or based on the optical density of the cell suspensions in the cavities of the Microplate (case A).

Im Fall A muß gewährleistet sein, daß alle weiteren Meßparameter und sonstigen Parameter, wie beispielsweise induzierte und konstitutive Expression, bei den Organismen, die die jeweilige Lipase exprimieren, identisch sind. In case A it must be ensured that all other measurement parameters and other parameters such as induced and constitutive expression, in the organisms that make up the particular Express lipase are identical.

Eine nach dieser Methode gemessene, größere Menge Methoxycyclohexanyllaurat pro Menge Lipase bedeutet eine höhere spezifische Aktivität. A larger amount measured using this method Methoxycyclohexanyl laurate per amount of lipase means a higher specific Activity.

Als enzymkatalytische Umwandlungen werden chemische Reaktionen von Substraten verstanden, die Lipasen katalysieren können. Beispielhaft seien folgende Reaktionen erwähnt:
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Alkoholen,
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Aminen,
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Aminoestern, wie beispielsweise Aminosäureester,
Verseifung (Hydrolyse) oder enantioselektive Verseifung (Hydrolyse) von Carbonsäureestern,
Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Cyanhydrinen,
Verseifung oder enantioselektive Verseifung von Cyanhydrinestern,
Asymmetrisierung von Meso-diolen oder
Asymmetrisierung von Meso-diestern durch Verseifung. Enzyme catalytic conversions are understood to mean chemical reactions of substrates that can catalyze lipases. The following reactions are mentioned as examples:
Acylation or enantioselective acylation of alcohols,
Acylation or enantioselective acylation of amines,
Acylation or enantioselective acylation of amino esters, such as amino acid esters,
Saponification (hydrolysis) or enantioselective saponification (hydrolysis) of carboxylic acid esters,
Acylation or enantioselective acylation of cyanohydrins,
Saponification or enantioselective saponification of cyanohydrin esters,
Asymmetrization of mesodiols or
Asymmetrization of meso-diesters by saponification.

Bevorzugte Verfahren sind Verfahren zur Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Alkoholen, Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Aminen, Acylierung oder enantioselektive Acylierung von Aminoestern, wie beispielsweise Aminosäureester oder ein Verfahren zur Verseifung (Hydrolyse) oder enantioselektiven Verseifung (Hydrolyse) von Carbonsäureestern. Preferred methods are methods for Acylation or enantioselective acylation of alcohols, Acylation or enantioselective acylation of amines, Acylation or enantioselective acylation of amino esters, such as for example amino acid esters or a process for Saponification (hydrolysis) or enantioselective saponification (Hydrolysis) of carboxylic acid esters.

Das Verfahren zur enzymkatalytischen Umwandlung oder enantioselektiven Umwandlung von Substraten ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Substrate in Gegenwart der erfindungsgemäßen Lipase- Varianten umsetzt. The process for enzyme catalytic conversion or enantioselective conversion of substrates is characterized by that the substrates in the presence of the lipase according to the invention Implement variants.

Je nachdem ob es der Reaktionstyp erfordert, werden dabei vorzugsweise weitere Reagenzien zugegeben. So erfordert beispielsweise eine Acylierung die Zugabe eines Acylierungsmittels, während beispielsweise die Verseifung keine Zugabe weiterer Reagenzien benötigt. Depending on whether the reaction type requires it, it will be preferably further reagents added. So requires for example an acylation, the addition of an acylating agent, while for example the saponification does not add any more Reagents needed.

Unter Substrat wird eine chemische Verbindung verstanden, die von Lipasen enzymkatalytisch umgesetzt, d. h. chemisch verändert werden kann. Bei enantioselektiven Umwandlungen sind Stereoisomerengemische, von denen nur ein Stereoisomeres umgesetzt wird, ebenfalls Substrate. A substrate is understood to mean a chemical compound that is produced by Lipases enzyme-catalyzed, d. H. chemically changed can be. With enantioselective conversions Mixtures of stereoisomers, of which only one stereoisomer is converted, also substrates.

Beispielhaft seien Alkohole, Amine, Aminoester, Amide, Carbonsäureester, Thioester, Thiole, Cyanhydrine, Cyanhydrinester und Meso-diole und deren stereoisomerengemische als Substrate erwähnt. Bevorzugte Substrate sind Alkohole, Amine, Aminoester und Carbonsäureester bzw. racemische Alkohole, Amine, Aminoester und Carbonsäureester. Examples include alcohols, amines, amino esters, amides, Carboxylic acid esters, thioesters, thiols, cyanohydrins, cyanohydrin esters and Mesodiols and their stereoisomeric mixtures as substrates mentioned. Preferred substrates are alcohols, amines, amino esters and Carboxylic acid esters or racemic alcohols, amines, amino esters and Carbonsäureester.

Das Verfahren wird vorzugsweise in Lösung, bei flüssigen Substraten mit oder ohne Lösungsmittel durchgeführt. Als Lösungsmittel können beispielsweise Wasser, organische Lösungsmittel oder auch wäßrig/organische Zweiphasengemische verwendet werden. The process is preferably in solution, with liquid Carried out substrates with or without solvent. As a solvent can, for example, water, organic solvents or aqueous / organic two-phase mixtures can be used.

Vorzugsweise werden als organische Lösungsmittel Dioxan, THF, Diethylether, Methyl-t-butylether (MTBE), Toluol oder Heptan verwendet. Als wäßrig/organisches Zweiphasengemisch wird vorzugsweise ein Wasser/MTBE-Gemisch in beliebigem Verhältnis eingesetzt. Dioxane, THF, Diethyl ether, methyl t-butyl ether (MTBE), toluene or heptane used. As an aqueous / organic two-phase mixture preferably a water / MTBE mixture in any ratio used.

Bei Verfahrensdurchführung in Lösung ist die Substratkonzentration nicht kritisch, liegt aber vorzugsweise zwischen 0.5 Gew.% und 50 Gew.% bezogen auf die Lösung, besonders bevorzugt sind 20 bis 30 Gew.%. Die Temperatur bei der Durchführung des Verfahrens ist ebenfalls nicht kritisch, ist aber nach oben durch die Temperaturstabilität des Enzyms beschränkt. Vorzugsweise wird das Verfahren bei 0°C bis 60°C durchgeführt, besonders bevorzugt sind 15°C bis 40°C. When the procedure is carried out in solution, the Substrate concentration is not critical, but is preferably between 0.5% by weight and 50% by weight, based on the solution, with 20 being particularly preferred up to 30% by weight. The temperature when performing the procedure is also not critical, but is up through the Temperature stability of the enzyme limited. Preferably that is Process carried out at 0 ° C to 60 ° C, are particularly preferred 15 ° C to 40 ° C.

Das Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Für die kontinuierliche Verfahrensdurchführung leitet man beispielsweise in an sich bekannter Weise in einem Reaktor durch eine Schüttschicht aus immobilisierter Lipase-Variante eine flüssige mobile Phase. Die mobile Phase kann entweder eine Lösung von Substrat (und Reagenzien) bzw. die flüssigen Substrate (und Reagenzien) ohne Lösungsmittel sein. Die Durchflußrate ist nicht kritisch und richtet sich nach verfahrenstechnischen Gesichtspunkten wie Höhe, Durchmesser und Korngröße der Schüttschicht sowie nach der Ausgestaltung des Reaktors. The process can be continuous or discontinuous be performed. For continuous process execution one leads, for example, in a manner known per se in one Reactor through a bed of immobilized lipase variant a fluid mobile phase. The mobile phase can either be a Solution of substrate (and reagents) or the liquid substrates (and reagents) without solvents. The flow rate is not critical and depends on process engineering Aspects such as height, diameter and grain size of the Fill layer and according to the design of the reactor.

Als Reaktoren für das kontinuierliche Verfahren verwendet man vorzugsweise die für kontinuierliche, heterogenkatalytische Prozesse (Fluid/Feststoff-Reaktionen) üblichen Reaktoren (J. Hagen, Chemische Reaktionstechnik, VCH, Weinheim 1992, S. 165-169). Beispielhaft seien Wirbelschichtreaktoren und Festbettreaktoren, wie Rohrreaktor, Säulenreaktor, Vollraumreaktor, Hordenreaktor, Rohrbündelreaktor und Flachbett-Kontaktofen genannt. Reactors for the continuous process are used preferably that for continuous, heterogeneous catalytic Processes (fluid / solid reactions) of conventional reactors (J. Hagen, Chemical reaction technology, VCH, Weinheim 1992, pp. 165-169). Examples are fluidized bed reactors and fixed bed reactors, such as Tubular reactor, column reactor, full-space reactor, tray reactor, Tube reactor and flat bed contact furnace called.

In der diskontinuierlichen Verfahrensdurchführung werden die immobilisierten Lipase-Varianten in an sich bekannter Weise in einem Reaktor in einer Lösung von Substrat (und Reagenzien) bzw. in flüssigen Substraten (und Reagenzien) mit oder ohne Lösungsmittel suspendiert und die Suspension durchmischt. Als Reaktoren für das diskontinuierliche Verfahren verwendet man vorzugsweise die für diskontinuierliche, heterogenkatalytische Prozesse (Fluid/Feststoff-Reaktionen) üblichen Reaktoren mit Schüttel-, Misch- oder Rührvorrichtung. Beispielhaft sei der Rührkessel und sich davon ableitende Ausgestaltungen sowie Reaktionsgefäße mit Schüttelvorrichtung erwähnt. In the discontinuous procedure, the immobilized lipase variants in a manner known per se in a reactor in a solution of substrate (and reagents) or in liquid substrates (and reagents) with or without Suspended solvent and mixed the suspension. As reactors is preferably used for the batch process for discontinuous, heterogeneous catalytic processes (Fluid / solid reactions) conventional reactors with shaking, Mixing or stirring device. The stirred kettle and derived designs and reaction vessels with Shaker mentioned.

Nach Beendigung der Reaktion (Erreichung des thermodynamischen Gleichgewichts) wird die immobilisierte Lipase-Variante, beispielsweise durch Dekantieren, Abzentrifugieren oder Abfiltrieren und Waschen isoliert und in weiteren Reaktionen verwendet. After completion of the reaction (reaching the thermodynamic Equilibrium) the immobilized lipase variant, for example by decanting, centrifuging or filtering and washing isolated and used in further reactions.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden Substrate, die acylierbare funktionelle Gruppen wie z. B. Hydroxyl- oder Aminogruppen enthalten, wie Alkohole, Amine oder Aminosäureester in Gegenwart der immobilisierten Lipase als Katalysator und eines Acylierungsmittels acyliert oder enantioselektiv acyliert. In a preferred embodiment of the method Substrates that acylatable functional groups such. B. hydroxyl or contain amino groups, such as alcohols, amines or Amino acid esters in the presence of the immobilized lipase as a catalyst and an acylating agent acylated or enantioselective acylated.

Diese enzymkatalytische Umwandlung wird bevorzugt in einem organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Dioxan, THF, Diethylether, Methyl-t-butylether (MTBE), Toluol oder Heptan durchgeführt. This enzyme catalytic conversion is preferred in one organic solvents such as dioxane, THF, Diethyl ether, methyl t-butyl ether (MTBE), toluene or heptane carried out.

Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Acylierung oder enantioselektiven Acylierung von Alkoholen, Aminen oder Aminosäureester oder racemischen Alkoholen, Aminen oder Aminosäureester in Gegenwart eines Acylierungsmittels und der Lipase-Variante der SEQ. ID. NO. 1. A process for acylation or is particularly preferred enantioselective acylation of alcohols, amines or Amino acid esters or racemic alcohols, amines or amino acid esters in Presence of an acylating agent and the lipase variant of SEQ. ID. NO. 1.

Hinsichtlich der Alkohole, Amine und Aminosäureester gibt es praktisch keine Beschränkung. So können ein- und mehrwertige Alkohole, wie beispielsweise
1-Phenylethanol,
gegebenenfalls substituiertes 2-Chlor-1-phenylethanol, Pent-3-in-2-ol,
1-Butin-3-ol,
2-Hydroxy-4-phenylbuttersäureester,
a-Methyl-(1,3)-benzodioxol-5-ethanol,
2-propanol-1-(1,3-benzodioxol-4-yl),
trans-2-Methoxy-cyclohexanol,
2-Methoxy-2-phenylethanol,
cis-2-Methyl-4-hydroxy-pyran oder
trans-2-Methyl-4-hydroxy-pyran
oder deren Stereoisomerengemische,
ein und mehrwertige Amine oder deren Stereoisomerengemische oder
α, β oder γ-Aminosäureester wie beispielsweise die gegebenenfalls mit Halogen substituierten C1-C4-Alkyl-, Alkylaryl-, Aryl-, C2-C6-Alkenyl- oder C2-C6-Alkinyl-Ester der natürlichen Aminosäuren oder deren Stereoisomerengemische
verwendet werden. There is practically no limit to the alcohols, amines and amino acid esters. So monohydric and polyhydric alcohols, such as
1-phenylethanol,
optionally substituted 2-chloro-1-phenylethanol, pent-3-yn-2-ol,
1-butyne-3-ol,
2-hydroxy-4-phenylbutanoic acid ester,
a-methyl- (1,3) -benzodioxol-5-ethanol,
2-propanol-1- (1,3-benzodioxol-4-yl),
trans-2-methoxy-cyclohexanol,
2-methoxy-2-phenylethanol,
cis-2-methyl-4-hydroxy-pyran or
trans-2-methyl-4-hydroxy-pyran
or their stereoisomer mixtures,
mono- and polyvalent amines or their stereoisomer mixtures or
α, β or γ-amino acid esters such as the C 1 -C 4 alkyl, alkylaryl, aryl, C 2 -C 6 alkenyl or C 2 -C 6 alkynyl esters of natural amino acids which are optionally substituted with halogen or their stereoisomer mixtures
be used.

Unter gegebenenfalls substituiertem 2-Chlor-1-phenylethanol wird insbesondere 2-Chlor-1-phenylethanol und substituiertes 2-Chlor-1-phenylethanol verstanden. Bevorzugte substituierte 2-Chlor-1-phenylethanole sind Alkohole der Formel III


wobei
n bis 3 und
R unabhängig voneinander Halogen, insbesondere F oder Cl, C1-C4-Alkoxy, insbesondere Methoxy und NO2 bedeuten. Optionally substituted 2-chloro-1-phenylethanol means in particular 2-chloro-1-phenylethanol and substituted 2-chloro-1-phenylethanol. Preferred substituted 2-chloro-1-phenylethanols are alcohols of the formula III


in which
n to 3 and
R independently of one another are halogen, in particular F or Cl, C 1 -C 4 alkoxy, in particular methoxy and NO 2 .

Ein besonders bevorzugtes substituiertes 2-Chlor-1-phenylethanol ist 2-Chlor-1-(m-chlorphenyl)-ethanol. A particularly preferred substituted 2-chloro-1-phenylethanol is 2-chloro-1- (m-chlorophenyl) ethanol.

Vorzugsweise verwendet man als Substrat racemisches trans-2-Methoxy-cyclohexanol. Racemic is preferably used as the substrate trans-2-methoxy-cyclohexanol.

Als Acylierungsmittel werden organische Verbindungen verstanden, die in Gegenwart von Lipasen in Lösung als Acylüberträger fungieren können. Beispielhaft seien erwähnt:
Aliphatische, araliphatische oder aromatische Carbonsäuren die gegebenenfalls mit Halogen, wie Cl, Br, I, F substituiert sind (Acylierung), wie
C1-C6-Alkancarbonsäuren, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder
wie araliphatische oder aromatische Carbonsäuren z. B. Benzoesäure, 3-Phenylpropionsäure oder
die entsprechenden Carbonsäureester (Umesterung) wie beispielsweise
3-Phenylpropionsäureester oder Essigsäurealkylester, wie z. B. Essigsäureethylester. Acylating agents are understood to be organic compounds which can act as acyl transfer agents in the presence of lipases in solution. Examples include:
Aliphatic, araliphatic or aromatic carboxylic acids which are optionally substituted with halogen, such as Cl, Br, I, F (acylation), such as
C 1 -C 6 alkane carboxylic acids, e.g. B. formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid or
such as araliphatic or aromatic carboxylic acids such. As benzoic acid, 3-phenylpropionic acid or
the corresponding carboxylic acid esters (transesterification) such as
3-phenylpropionic acid ester or alkyl acetate, such as. B. ethyl acetate.

Bevorzugte Carbonsäureester als Acylierungsmittel sind Vinylester der Formel I


in der
R1 Wasserstoff oder eine C1-C4-Alkyl-, vorzugsweise Methylgruppe und
R2 Wasserstoff, C1-C18-Alkyl, welches gegebenenfalls mit Halogen substituiert ist, Phenyl oder (C1-C3-)Alkoxy-(C1-C4)-Alkyl bedeutet. Preferred carboxylic acid esters as acylating agents are vinyl esters of the formula I.


in the
R 1 is hydrogen or a C 1 -C 4 alkyl, preferably methyl group and
R 2 is hydrogen, C 1 -C 18 -alkyl, which is optionally substituted by halogen, phenyl or (C 1 -C 3 -) alkoxy- (C 1 -C 4 ) -alkyl.

Bevorzugte Vinylester der Formel I sind Vinylformiat, Vinylacetat, Vinylpropionat, Vinylbutyrat oder Vinyllaurat. Preferred vinyl esters of the formula I are vinyl formate, Vinyl acetate, vinyl propionate, vinyl butyrate or vinyl laurate.

Acylierungsmittel sind weiterhin aliphatische, cycloaliphatische, araliphatische oder aromatische Carbonsäureanhydride und gemischte Carbonsäureanhydride (Acylierung) wie Essigsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid (BSA), Buttersäureanhydrid, 2-Ethylhexansäureanhydrid oder Methyl-Bernsteinsäureanhydrid. Im Falle der Verwendung von Bernsteinsäureanhydrid (BSA) oder anderer schlecht löslicher Anhydride als Acylierungsmittel kann Propylencarbonat besonders vorteilhaft zugemischt werden, um das BSA in Lösung zu bringen. Dies ist vor allem im Hinblick auf ein kontinuierliches Verfahren von Bedeutung. Acylating agents are furthermore aliphatic, cycloaliphatic, araliphatic or aromatic carboxylic acid anhydrides and mixed carboxylic anhydrides (acylation) such as acetic anhydride, Succinic anhydride (BSA), butyric anhydride, 2-ethylhexanoic anhydride or methyl succinic anhydride. In case of Use of succinic anhydride (BSA) or other bad Soluble anhydrides as acylating agents can be propylene carbonate be mixed particularly advantageously to the BSA in solution bring. This is especially with a view to continuous Procedures of importance.

Ein besonders bevorzugtes Acylierungsmittel ist Vinyllaurat. A particularly preferred acylating agent is vinyl laurate.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden Carbonsäureester in Gegenwart der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipase-Formulierungen verseift oder enantioselektiv verseift. In a further preferred embodiment of the method are carboxylic acid esters in the presence of the invention Lipase variants or lipase formulations saponified or saponified enantioselectively.

In diesem Fall müssen keine weiteren Reagenzien zugegeben werden, dennoch ist die Anwesenheit von Wasser nötig. Bevorzugt wir die Verseifung von Carbonsäureester durch Zusatz von Wasser unter Verwendung eines vorzugsweise zweiphasigen Systems wie z. B. Wasser/MTBE in Gegenwart der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipase-Formulierungen durchgeführt. In this case, no further reagents need to be added, however, the presence of water is necessary. We prefer that Saponification of carboxylic acid ester by adding water under Use of a preferably two-phase system such. B. Water / MTBE in the presence of the lipase variants according to the invention or lipase formulations.

Hinsichtlich der Carbonsäureester gibt es praktisch keine Beschränkung. So können beispielsweise Verbindungen der Formel II oder deren Stereoisomerengemische


wobei
R3, R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff,
Halogen, wie beispielsweise F, Cl, Br oder I,
einen verzweigten oder unverzweigten, gegebenenfalls substituierten
C1-C8-Alkylrest wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1,1-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1-Methylpentyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 1,1-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl 1-Ethyl-2-methylpropyl, Heptyl oder Octyl,
C2-C6-Alkenylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes 2-Propenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-entenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl- 3-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl- 3-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 1-Ethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1- methyl-2-propenyl oder 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyl,
C3-C6-Alkinylrest wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes 2-Propinyl, 2-Butinyl, 3-Butinyl, 1-Methyl-2-propinyl, 2-Pentinyl, 3-Pentinyl, 4-Pentinyl, 1-Methyl-3-butinyl, 2-Methyl-3-butinyl, 1-Methyl-2-butinyl, 1,1-Dimethyl-2-propinyl, 1-Ethyl-2-propinyl, 2-Hexinyl, 3-Hexinyl, 4-Hexinyl, 5-Hexinyl, 1-Methyl-2-pentinyl, 1-Methyl-2-pentinyl, 1-Methyl-3-pentinyl, 1-Methyl-4-pentinyl, 2-Methyl-3-pentinyl, 2-Methyl-4-pentinyl, 3-Methyl-4-pentinyl, 4-Methyl-2-pentinyl, 1,1-Dimethyl-2- butinyl, 1,1-Dimethyl-3-butinyl, 1,2-Dimethyl-3-butinyl, 2,2-Dimethyl-3-butinyl, 1-Ethyl-2-butinyl, 1-Ethyl-3-butinyl, 2-Ethyl-3-butinyl oder 1-Ethyl-1-methyl-2-propinyl
oder C3-C8-Cycloalkylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl, Cyclooctyl,
einen gegebenenfalls substituierten
Arylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes Phenyl, 1-Naphtyl oder 2-Naphtyl,
Arylalkylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes Benzyl,
Heteroarylrest, wie beispielsweise gegebenenfalls substituiertes 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, 2-Furyl, 3-Furyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 2-Thienyl, 3-Thienyl, 2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl, 5-Thiazolyl, 2-Oxazolyl, 4-Oxazolyl, 5-Oxazolyl, 2-Pyrimidyl, 4-Pyrimidyl, 5-Pyrimidyl, 6-Pyrimidyl, 3-Pyrazolyl, 4-Pyrazolyl, 5-Pyrazolyl, 3-Isothiazolyl, 4-Isothiazolyl, 5-Isothiazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, 5-Imidazolyl, 3-Pyridazinyl, 4-Pyridazinyl, 5-Pyridazinyl oder 6-Pyridazinyl, vorzugsweise 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, 2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thienyl, 3-Thienyl, 2-Thiazolyl, 4-Thiazolyl oder 5-Thiazolyl,
oder Heterocycloalkyl- oder -alkenylrest bedeuten. There is practically no restriction on the carboxylic acid esters. For example, compounds of the formula II or their stereoisomer mixtures


in which
R 3 , R 4 and R 5 independently of one another are hydrogen,
Halogen, such as F, Cl, Br or I,
a branched or unbranched, optionally substituted
C 1 -C 8 alkyl such as optionally substituted methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1,2 -Dimethylpropyl, 1,1-dimethylpropyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, 1-methylpentyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 2 , 2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1-ethyl-2-methylpropyl, heptyl or octyl,
C 2 -C 6 alkenyl, such as optionally substituted 2-propenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1-methyl-2-propenyl, 2-methyl-2-propenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4- Pentenyl, 1-methyl-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, 3-methyl-2-butenyl, 1-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, 1,1-dimethyl-2-propenyl, 1,2-dimethyl-2-propenyl, 1-ethyl-2-propenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyl, 1-methyl-2- pentenyl, 2-methyl-2-pentenyl, 3-methyl-2-pentenyl, 4-methyl-2-pentenyl, 3-methyl-3-pentenyl, 4-methyl-3-pentenyl, 1-methyl-4-pentenyl, 2-methyl-4-pentenyl, 3-methyl-4-entenyl, 4-methyl-4-pentenyl, 1,1-dimethyl-2-butenyl, 1,1-dimethyl-3-butenyl, 1,2-dimethyl 2-butenyl, 1,2-dimethyl-3-butenyl, 1,3-dimethyl-2-butenyl, 1,3-dimethyl-3-butenyl, 2,2-dimethyl-3-butenyl, 2,3-dimethyl 2-butenyl, 2,3-dimethyl-3-butenyl, 1-ethyl-2-butenyl, 1-ethyl-3-butenyl, 2-ethyl-2-butenyl, 2-ethyl-3-butenyl, 1,1, 2-trimethyl-2-propenyl, 1-ethyl-1-methyl-2-propenyl or 1-ethyl-2-methyl- 2-propenyl,
C 3 -C 6 alkynyl such as optionally substituted 2-propynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 1-methyl-2-propynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-pentynyl, 1-methyl-3-butynyl , 2-methyl-3-butynyl, 1-methyl-2-butynyl, 1,1-dimethyl-2-propynyl, 1-ethyl-2-propynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl, 4-hexynyl, 5-hexynyl , 1-methyl-2-pentynyl, 1-methyl-2-pentynyl, 1-methyl-3-pentynyl, 1-methyl-4-pentynyl, 2-methyl-3-pentynyl, 2-methyl-4-pentynyl, 3rd -Methyl-4-pentynyl, 4-methyl-2-pentynyl, 1,1-dimethyl-2-butynyl, 1,1-dimethyl-3-butynyl, 1,2-dimethyl-3-butynyl, 2,2-dimethyl -3-butynyl, 1-ethyl-2-butynyl, 1-ethyl-3-butynyl, 2-ethyl-3-butynyl or 1-ethyl-1-methyl-2-propynyl
or C 3 -C 8 cycloalkyl, such as optionally substituted cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl, cyclooctyl,
an optionally substituted one
Aryl radical, such as optionally substituted phenyl, 1-naphthyl or 2-naphthyl,
Arylalkyl radical, such as optionally substituted benzyl,
Heteroaryl radical, such as optionally substituted 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-furyl, 3-furyl, 2-pyrrolyl, 3-pyrrolyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-thiazolyl, 4-thiazolyl, 5-thiazolyl, 2-oxazolyl, 4-oxazolyl, 5-oxazolyl, 2-pyrimidyl, 4-pyrimidyl, 5-pyrimidyl, 6-pyrimidyl, 3-pyrazolyl, 4-pyrazolyl, 5-pyrazolyl, 3-isothiazolyl, 4- Isothiazolyl, 5-isothiazolyl, 2-imidazolyl, 4-imidazolyl, 5-imidazolyl, 3-pyridazinyl, 4-pyridazinyl, 5-pyridazinyl or 6-pyridazinyl, preferably 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-furyl , 3-furyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-thiazolyl, 4-thiazolyl or 5-thiazolyl,
or heterocycloalkyl or alkenyl radical.

Als ein bis dreifache Substituenten der C1-C8-Alkyl-, C2-C6 -Alkenyl-, C2-C6-Alkinyl-, C3-C8-Cycloalkyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Heteroaryl-, Heterocycloalkyl- oder -alkenylreste kommen beispielsweise Halogen-, Nitro-, Amino-, Hydroxy- oder Cyanogruppen, C1-C4-Alkyl-, C1-C4-Halogenalkyl-, C1-C4-Alkoxy-, C1-C4-Halogenalkoxy-, C1-C4-Alkylthio-, Hetaryl-, Arylreste oder der Rest -O-CO-C1-C4-Alkyl
in Frage. As one to triple substituents of the C 1 -C 8 alkyl, C 2 -C 6 alkenyl, C 2 -C 6 alkynyl, C 3 -C 8 cycloalkyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl Heterocycloalkyl or alkenyl radicals are, for example, halogen, nitro, amino, hydroxyl or cyano groups, C 1 -C 4 alkyl, C 1 -C 4 haloalkyl, C 1 -C 4 alkoxy, C 1 -C 4 haloalkoxy, C 1 -C 4 alkylthio, hetaryl, aryl radicals or the radical -O-CO-C 1 -C 4 alkyl
in question.

Bevorzugte Carbonsäureester sind beispielsweise
1-Butin-3-ol-acetat,
1-Butin-3-ol-butyrat,
Essigsäure-1-phenyl-ethylester oder
2-Acetoxy-4-phenylbuttersäureester. Preferred carboxylic acid esters are, for example
1-butyne-3-ol acetate,
1-butyne-3-ol-butyrate,
1-phenyl-ethyl acetate or
2-acetoxy-4-phenylbutanoic acid ester.

Das Verfahren zur enantioselektiven enzymkatalytischen Umwandlung von Substraten mit den erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipase-Formulierungen kann zur Abtrennung von Stereoisomeren und insbesondere zur Abtrennung von Enantiomeren oder Diastereomeren aus einem Stereoisomerengemisch des Substrats dienen. Besonders bevorzugt dient es zur Abtrennung von Enantiomeren oder Diastereomeren aus racemischen Substraten und damit zur Herstellung von optisch aktiven Verbindungen aus den jeweiligen racemischen Gemischen. The process for enantioselective enzyme catalytic conversion of substrates with the lipase variants according to the invention or Lipase formulations can be used to separate stereoisomers and especially for the separation of enantiomers or diastereomers serve from a mixture of stereoisomers of the substrate. Especially it is preferably used to separate enantiomers or Diastereomers from racemic substrates and thus for the production of optically active compounds from the respective racemic Mixtures.

Durch die enantioselektive Substratspezifität der erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipase-Formulierungen, wird beispielsweise nur ein Enantiomeres des racemischen Substrats umgewandelt, das andere Enantiomere reagiert nicht. Die entstehenden Produkte lassen sich durch chemische, physikalische und mechanische Trennmethoden in an sich bekannter Weise leicht trennen. Beispielhaft seien Kristallisation, Fällung, Extraktion in zweiphasigen Lösungsmittelsystemen, chromatographische Trennverfahren, wie HPLC, GC oder Säulenchromatographie über Kieselgel oder thermische Trennungsverfahren wie Destillation genannt. Due to the enantioselective substrate specificity of the lipase variants or lipase formulations according to the invention for example only one enantiomer of the racemic substrate is converted, the other enantiomer does not react. The resulting products can be by chemical, physical and mechanical Easily separate separation methods in a manner known per se. exemplary be crystallization, precipitation, extraction in two-phase Solvent systems, chromatographic separation processes, such as HPLC, GC or column chromatography on silica gel or called thermal separation processes such as distillation.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man Stereoisomerengemische oder Racemate von Subtraten, die sich enzymkatalytisch von Lipasen umsetzen lassen, enantioselektiv in Gegenwart der erfindungsgenmäßen Lipase- Varianten umsetzt und anschließend die Gemische auftrennt. Accordingly, the present invention further relates to a Process for the production of optically active compounds, thereby characterized in that mixtures of stereoisomers or racemates of Substrates that can be enzymatically converted by lipases, enantioselective in the presence of the lipase Implement variants and then separate the mixtures.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vorzugsweise die optisch aktiven Verbindungen herstellen, die als Stereoisomerengemisch als Substrate von Lipasen umgesetzt werden können, bzw. von deren Stereoisomerengemisch mindestens ein Stereoisomer als Substrat von Lipasen umgesetzt werden kann. With the method according to the invention, the Establish optically active connections as Stereoisomer mixture can be implemented as substrates of lipases, or of their stereoisomer mixture at least one stereoisomer as Substrate can be implemented by lipases.

Ein Verfahren zur enantioselektiven Acylierung von Alkoholen, Aminen oder Aminosäureester dient vorzugsweise zur Trennung von racemischen Alkoholen, Aminen bzw. Aminosäureester und damit zur Herstellung von optisch aktiven Alkoholen, Aminen bzw. Aminosäureester. A process for the enantioselective acylation of alcohols, Amines or amino acid esters are preferably used to separate racemic alcohols, amines or amino acid esters and thus for Production of optically active alcohols, amines or Aminosäureester.

Ein Verfahren zur enantioselektiven Hydrolyse oder Verseifung von Carbonsäureestern dient vorzugsweise zur Trennung von racemischen Carbonsäureestern und damit zur Herstellung von optisch aktiven Carbonsäureestern. A process for the enantioselective hydrolysis or saponification of Carboxylic esters are preferably used to separate racemic Carboxylic acid esters and thus for the production of optically active Carbonsäureestern.

Die erfindungsgemäßen Lipase-Varianten oder Lipase-Formulierungen weisen den Vorteil auf, daß sie bei gleichbleibender Enantioselektivität eine erhöhte spezifische Aktivität aufweisen. The lipase variants or lipase formulations according to the invention have the advantage that they remain the same Enantioselectivity have an increased specific activity.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung: The following examples illustrate the invention:

Allgemeine experimentelle BedingungenGeneral experimental conditions

In allen Fällen, in denen keine detaillierte Beschreibung der Experimente erfolgt, wurden molekularbiologische Methoden angewandt, die bekannt sind und z. B. in Current Protocols of Molecular Biology, 1999, John Wiley & Sons beschrieben sind. Verwendete Bakterienstämme Escherichia coli XL1-Blue (Fa. Stratagene)
Escherichia coli XJS5037 (pRK2013) (Proc. Natl. Acad. Sci., 1979, 1648-1652)
Pseudomonas spec. DSM 8246 Verwendete Plasmide pBluescriptIIKS (Fa. Stratagene),
pBP1500: Abkömmling von pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) mit einem 2,6 kBp-DNA-Fragment, welches das Lipase-Operon aus Pseudomonas spec. DSM 8246 enthält. pBP1500 codiert für eine enzymatisch inaktive Lipase (lipA-),
pBP1520: Abkömmling von pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) mit einem 2,6 kBp-DNA-Fragment, welches das Lipase-Operon aus Pseudomonas spec. DSM 8246 enthält. pBP1520 codiert für eine enzymatisch aktive Lipase (lipA),
pBP2112: Abkömmling von pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) mit einem 2,6 kBp-DNA-Fragment, elches das Lipase-Operon aus Pseudomonas spec. DSM 8246 enthält und das die Mutation zur Produktion der Lipasevariante LipA L17A enthält. In all cases in which the experiments are not described in detail, molecular biological methods were used which are known and e.g. B. in Current Protocols of Molecular Biology, 1999, John Wiley & Sons. Bacterial strains used Escherichia coli XL1-Blue (from Stratagene)
Escherichia coli XJS5037 (pRK2013) (Proc. Natl. Acad. Sci., 1979, 1648-1652)
Pseudomonas spec. DSM 8246 plasmids pBluescriptIIKS (from Stratagene) used,
pBP1500: descendant of pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) with a 2.6 kBp DNA fragment which contains the lipase operon from Pseudomonas spec. DSM 8246 contains. pBP1500 codes for an enzymatically inactive lipase (lipA - ),
pBP1520: descendant of pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) with a 2.6 kBp DNA fragment which contains the lipase operon from Pseudomonas spec. DSM 8246 contains. pBP1520 codes for an enzymatically active lipase (lipA),
pBP2112: descendant of pML131 (Gene, 1990, 89: 37-46) with a 2.6 kBp DNA fragment, the lipase operon from Pseudomonas spec. DSM 8246 contains and which contains the mutation for the production of the lipase variant LipA L17A.

Beispiel 1example 1 Herstellung einer Lipase-Variante mit gesteigerter spezifischer EnzymaktivitätProduction of a lipase variant with increased specific enzyme activity A) Kultivierung der BakterienA) Cultivation of the bacteria

Die rekombinanten Stämme von Escherichia coli wurden entweder auf festem LB-Agar kultiviert oder in LB-Medium 16 h im Rundschüttler mit 200 Upm bei 37°C. Das Medium enthielt die zur Elektion erforderlichen Antibiotika Pseudomonas spec. DSM 8246 und die rekombinanten Abkömmlinge dieses Stammes wurden entweder auf festem FG-Agar oder in FP-Medium 24 h im Rundschüttler mit 200 Upm bei 30°C oder in (NH4)2SO4 6 g/l, CaCl2 0,02 g/l, MgSO4 × 7 H2I 1 g/l, KH2PO4 3,5 g/l, K2HPO4 3,5 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, Glucose 5 g/l, Spurensalzlösung 10 ml/l 24 h im Rundschüttler bei 150 Upm bei 30°C inkubiert. Das Medium erhielt die zur Selektion erforderlichen Antibiotika. Als Inkubationsgefäße wurden Petrischlan, Kulturröhrchen oder Mikrotiterplatten verwendet. The recombinant strains of Escherichia coli were either cultivated on solid LB agar or in LB medium for 16 hours in a rotary shaker at 200 rpm at 37 ° C. The medium contained the antibiotics Pseudomonas spec. DSM 8246 and the recombinant descendants of this strain were either on solid FG agar or in FP medium for 24 hours in a rotary shaker at 200 rpm at 30 ° C. or in (NH 4 ) 2 SO 4 6 g / l, CaCl 2 0.02 g / l, MgSO 4 × 7 H 2 I 1 g / l, KH 2 PO 4 3.5 g / l, K 2 HPO 4 3.5 g / l, yeast extract 5 g / l, glucose 5 g / l, Trace salt solution 10 ml / l incubated for 24 h in a rotary shaker at 150 rpm at 30 ° C. The medium received the antibiotics required for selection. Petri lantern, culture tubes or microtiter plates were used as incubation vessels.

Folgende Antibiotika (Selektion) wurden verwendet: Tetracyclin 10 µg/ml (XL1-Blue), Ampicillin 100 µg/ml (pBluescriptIIKS), Gentamycin 10 µg/ml (pBP-Plasmide in E. coli), Gentamycin 45 µg/ml (pBP-Plasmide in Pseudomonas spec. DSM 8246), Chloramphenicol 20 µg/ml (Pseudomonas spec. DSM 8246), Kanamycin 25 µg/ml (Escherichia coli XJS5037 (pRK2013) oder Pseudomonas spec. DSM 8246) The following antibiotics (selection) were used: tetracycline 10 µg / ml (XL1-Blue), ampicillin 100 µg / ml (pBluescriptIIKS), Gentamycin 10 µg / ml (pBP plasmids in E. coli), gentamycin 45 µg / ml (pBP plasmids in Pseudomonas spec. DSM 8246), chloramphenicol 20 µg / ml (Pseudomonas spec. DSM 8246), Kanamycin 25 µg / ml (Escherichia coli XJS5037 (pRK2013) or Pseudomonas spec. DSM 8246)

B) MutageneseB) Mutagenesis

Durch ortsgerichtete Mutagenese mit der Methode Overlap-Extension-PCR (Recombinant PCR, 1990, 177-183, Academic Press, San Diego) wurde die Mutante L17A von lipA aus Pseudomonas spec. DSM 8246 erzeugt. By site-directed mutagenesis with the method Overlap Extension PCR (Recombinant PCR, 1990, 177-183, Academic Press, San Diego) the mutant L17A of lipA from Pseudomonas spec. DSM 8246 generated.

Chromosomale DNA von Pseudomonas spec. DSM 8246 diente als Matrizen-DNA. Als Primer wurden eingesetzt:
MAT16 5'-GATCGACGTAAGCTTTAACGATGGAGAT-3' (SEQ. ID. NO. 6)
MAT109 5'-CGGTGCCCGCGGCGCCGTGGACGAGGATCACCG-3' (SEQ. ID. NO. 3)
MAT108 5'-CGTCCACGGCGCCGCGGGCACCGACAAGTTCGC-3' (SEQ. ID. NO. 4)
MAT19 5'-CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3' (SEQ. ID. NO. 5) Chromosomal DNA from Pseudomonas spec. DSM 8246 served as template DNA. The following were used as primers:
MAT16 5'-GATCGACGTAAGCTTTAACGATGGAGAT-3 '(SEQ. ID. NO. 6)
MAT109 5'-CGGTGCCCGCGGCGCCGTGGACGAGGATCACCG-3 '(SEQ. ID. NO. 3)
MAT108 5'-CGTCCACGGCGCCGCGGGCACCGACAAGTTCGC-3 '(SEQ. ID. NO. 4)
MAT19 5'-CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3 '(SEQ. ID. NO. 5)

Im ersten PCR-Schritt wurde mit MAT16 und MAT109 ein Teilfragment von lipA und mit MAT108 und MAT19 ein weiteres Teilfragment von lipA erzeugt. Die Teilfragmente wurden im Agarosegel aufgetrennt und mit dem GFX Kit (Fa. Pharmacia) gereinigt. Aus den gereinigten Fragmenten wurde im zweiten PCR-Schritt mit MAT16 und MAT19 das Fragment lipA* erzeugt, das für die Lipasevariante L17A codiert. In the first PCR step, a partial fragment was created with MAT16 and MAT109 from lipA and with MAT108 and MAT19 another partial fragment from lipA generates. The partial fragments were separated in the agarose gel and cleaned with the GFX Kit (Pharmacia). From the purified fragments were in the second PCR step with MAT16 and MAT19 generates the fragment lipA *, which is required for the lipase variant L17A coded.

Die PCR wurde nach der Vorschrift des Herstellers mit dem GC-Rich Kit (Fa. Pharmacia) mit dem folgenden Temperaturprofil durchgeführt: (1) 95°C - 3 min, (2) 95°C - 30 s, (3) 40°C - 30 s, (4) 72-30 s, (5) 95°C - 30 s, (6) 60°C - 30 s, (7) 72°C - 30 s, (8) 72°C - 10 min; Schritte (2)-(4) mit 5 Zyklen; dann Schritte (5)-(7) 15 Zyklen. The PCR was carried out according to the manufacturer's instructions with the GC-Rich Kit (Pharmacia) with the following temperature profile carried out: (1) 95 ° C - 3 min, (2) 95 ° C - 30 s, (3) 40 ° C - 30 s, (4) 72-30 s, (5) 95 ° C - 30 s, (6) 60 ° C - 30 s, (7) 72 ° C - 30 s, (8) 72 ° C - 10 min; Steps (2) - (4) with 5 cycles; then steps (5) - (7) 15 cycles.

Das Fragment lipA* und der Vektor pBluescriptIIKS wurden mit HindIII und SacI gespalten, im Agarosegel getrennt, mit dem GFX Kit gereinigt und ligiert. Anschließend wurde der Ansatz in E. coli transformiert. Das rekombinante Plasmid wurde gereinigt und sequenziert, um die Mutation nachzuweisen. Bis auf die Mutation L17A wurden keine weiteren Mutationen in der DNA nachgewiesen. The fragment lipA * and the vector pBluescriptIIKS were included HindIII and SacI cleaved, separated in an agarose gel, with the GFX Kit cleaned and ligated. Then the approach in E. coli transformed. The recombinant plasmid was purified and sequenced to detect the mutation. Except for the Mutation L17A showed no further mutations in the DNA demonstrated.

C) KlonierungC) cloning

Der Vektor pBP1500 und das rekombinante pBluescript-Derivat mit lipA* wurde mit HindIII und SacI gespalten und ligiert. Das entstandene rekombinante Plasmid wurde als pBP2112 bezeichnet. pBP2112 wurde in E. coli XL1-Blue transformiert. Anschließend wurde pBP2112 durch Konjugation von E. coli XL1-BLue mit Hilfe des Helferstammes E. coli XJS5037 (pRK2013) nach Pseudomonas spec. DSM 8246 übertragen. Der rekombinante Stamm wurde als Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP2112) bezeichnet. The vector pBP1500 and the recombinant pBluescript derivative with lipA * was cleaved and ligated with HindIII and SacI. The The resulting recombinant plasmid was named pBP2112. pBP2112 was transformed into E. coli XL1-Blue. Subsequently was made using pBP2112 by conjugation of E. coli XL1-BLue of the helper strain E. coli XJS5037 (pRK2013) according to Pseudomonas spec. DSM 8246 transmitted. The recombinant strain was called Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP2112).

D) Enzymproduktion und AufarbeitungD) Enzyme production and processing

Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP2112) wurde in 96-Kavitäten-Mikrotiterplatten mit je 250 µl Medium pro Kavität auf dem Rundschüttler mit 150 Upm bei 30°C für 24 h inkubiert. Als Kontrolle wurde Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP1520) angezogen. Dieser Stamm trägt plasmidcodiert das lipA-Gen von Pseudomonas spec. DSM 8246 (Vergleichsbeispiel). Für die Anzucht der Bakterien wurde folgendes Medium eingesetzt: (NH4)2SO4 6 g/l, CaCl2 0,02 g/l, MgSO4 × 7 H2O 1 g/l, KH2PO4 3,5 g/l, K2HPO4 3,5 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, Glucose 5 g/l, Spurensalzlösung 10 ml/l, Kanamycin 25 µg/ml, Gentamycin 45 µg/ml. Nach der Anzucht wurden die Mikrotiterplatten zentrifugiert. Die Kulturüberstände wurden anschließend in eine Polypropylen-Mikrotiterplatte übertragen, 16 h bei -80°C gefroren und dann 48 h gefriergetrocknet. Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP2112) was incubated in 96-well microtiter plates with 250 µl medium per cavity on the rotary shaker at 150 rpm at 30 ° C for 24 h. Pseudomonas spec. DSM 8246 (pBP1520) tightened. This strain carries the lipA gene from Pseudomonas spec. DSM 8246 (comparative example). The following medium was used to grow the bacteria: (NH 4 ) 2 SO 4 6 g / l, CaCl 2 0.02 g / l, MgSO 4 × 7 H 2 O 1 g / l, KH 2 PO 4 3.5 g / l, K 2 HPO 4 3.5 g / l, yeast extract 5 g / l, glucose 5 g / l, trace salt solution 10 ml / l, kanamycin 25 µg / ml, gentamycin 45 µg / ml. After growth, the microtiter plates were centrifuged. The culture supernatants were then transferred to a polypropylene microtiter plate, frozen for 16 h at -80 ° C and then freeze-dried for 48 h.

Unter den Kultivierungsbedingungen wird die chromosomale Kopie des Lipasegens nicht exprimiert. Daher trägt auch das Vergleichsbeispiel die natürliche Lipase plasmidcodiert. Under the cultivation conditions, the chromosomal copy of the lipase gene was not expressed. Therefore, that also bears Comparative example the natural lipase plasmid-encoded.

E) Racematspaltung und AnalytikE) Resolution and analysis

In den Mikrotiterplatten mit den gefriergetrockneten Überständen wurde die Racematspaltung von rac-trans-2-Methoxycyclohexanol durchgeführt. Für die Racemattrennung wurden Methoxycyclohexanol und Vinyllaurat im molaren Verhältnis 1 : 0,65 eingesetzt [d. h. pro Platte 10 g Methoxycyclohexanol und 11,3 g Vinyllaurat]. In jede Kavität wurden 200 µl dieses Gemisches pipettiert. Jede Platte wurden mit "plate sealer" versiegelt, mit Deckel verschlossen und 96 h bei Raumtemperatur im Rundschüttler bei 150 U/min inkubiert. In the microtiter plates with the freeze-dried supernatants was the racemate resolution of rac-trans-2-methoxycyclohexanol carried out. For the racemate separation methoxycyclohexanol and vinyl laurate in a molar ratio of 1: 0.65 [d. H. 10 g methoxycyclohexanol and 11.3 g vinyl laurate per plate]. 200 µl of this mixture were pipetted into each cavity. Each plate was sealed with a "plate sealer", with a lid sealed and 96 h at room temperature in a rotary shaker Incubated 150 rpm.

Anschließend wurden jeweils 100 ?l pro Kavität abgenommen mit Essigsäureethylester versetzt und gaschromatographisch analysiert. Then 100? L were removed from each cavity mixed with ethyl acetate and gas chromatographically analyzed.

Tabelle 1 enthält die gemessene Menge gebildetes Methoxycyclohexanyllaurat in Gew.%. Tabelle 1

Table 1 contains the measured amount of methoxycyclohexanyl laurate formed in% by weight. Table 1

Die Lipasevariante LipA L17A zeigte im Vergleich zum natürlichen Enzym eine um den Faktor 8,5 höhere Aktivität in der Racematspaltung von Methoxycyclohexanol. The lipase variant LipA L17A showed in comparison to the natural Enzyme in the enzyme is 8.5 times higher Racemate resolution of methoxycyclohexanol.

Die spezifische Enzymaktivität ist in diesem Fall definiert als Menge gebildetes Methoxycyclohexanyllaurat in [Gew.%] geteilt durch Optische Dichte der Bakteriensuspension bei OD660nm. Die gebildete Menge aktives Enzym korreliert im Bereich einer optischen Dichte von OD660nm = 0,7 +/- 0,2 linear mit der Trübung der Bakteriensuspension. The specific enzyme activity is defined in this case as the amount of methoxycyclohexanyl laurate formed in [% by weight] divided by the optical density of the bacterial suspension at OD 660nm . The amount of active enzyme formed correlates linearly with the turbidity of the bacterial suspension in the range of an optical density of OD 660nm = 0.7 +/- 0.2.

Dabei ergaben sich für die spezifische Aktivität folgende Werte: Tabelle 2

The results for the specific activity were as follows: Table 2

Die Lipasevariante LipA L17A zeigte im Vergleich zum natürlichen Enzym eine um den Faktor 7,3 höhere spezifiche Enzymaktivität in der Racematspaltung von Methoxycyclohexanol. SEQUENZPROTOKOLL



The lipase variant LipA L17A showed a 7.3 times higher specific enzyme activity in the resolution of methoxycyclohexanol compared to the natural enzyme. SEQUENCE LISTING



Claims (18)

1. Lipase-Variante, herstellbar indem man an der Aminosäuresequenz einer Ausgangslipase, ausgewählt aus der Lipase-Homologiefamilie I.1 oder I.2, mindestens eine Aminosäuresubstitution an solchen Positionen durchführt, die den Positionen 17, 29, 30, 52, 86, 117, 122, 160, 163, 167, 265, 266, 286, 289 bei der Prototyp-Lipase-Sequenz SEQ ID NO: 1 entsprechen. 1. Lipase variant, can be produced by using the Amino acid sequence of a starting lipase selected from the Lipase homology family I.1 or I.2, at least one Performs amino acid substitution at those positions that correspond to the positions 17, 29, 30, 52, 86, 117, 122, 160, 163, 167, 265, 266, 286, 289 for the prototype lipase sequence SEQ ID NO: 1. 2. Lipase-Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangslipase eine Lipase aus der Gruppe der Lipasen A bis M ausgewählt wird:
A Lipase aus Pseudomonas aeruginosa,
B Lipase aus Vibrio cholerae,
C Lipase aus Pseudomonas fragi,
D Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus,
E Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis,
F Lipase aus Pseudomonas fluorescens,
G Lipase aus Pseudomonas vulgaris,
H Lipase aus Burkholderia cepacia,
I Lipase aus Burkholderia glumae,
J Lipase aus Burkholderia plantarii,
K Lipase aus Chromobakterium viscosum,
L Lipase aus Pseudomonas luteola,
M Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246. 2. Lipase variant according to claim 1, characterized in that a lipase from the group of lipases A to M is selected as the starting lipase:
A lipase from Pseudomonas aeruginosa,
B Lipase from Vibrio cholerae,
C lipase from Pseudomonas fragi,
D lipase from Acinetobacter calcoaceticus,
E Paseomonas wisconsinensis lipase,
F lipase from Pseudomonas fluorescens,
G lipase from Pseudomonas vulgaris,
H lipase from Burkholderia cepacia,
I lipase from Burkholderia glumae,
J lipase from Burkholderia plantarii,
K lipase from Chromobacterium viscosum,
L lipase from Pseudomonas luteola,
M lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246. 3. Lipase-Variante nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäuresubstitution an folgenden Positionen der Lipasen A bis M durchführt:
A Lipase aus Pseudomonas aeruginosa, mutiert in Position Met16,
B Lipase aus Vibrio cholerae, mutiert in Position Leu44,
C Lipase aus Pseudomonas fragi, mutiert in Position Leu17,
D Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus, mutiert in Position Leu49,
E Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis, mutiert in Position Val37,
F Lipase aus Pseudomonas fluorescens, mutiert in Position Met17,
G Lipase aus Pseudomonas vulgaris, mutiert in Position Leu16,
H Lipase aus Burkholderia cepacia, mutiert in Position Leu17,
I Lipase aus Burkholderia glumae, mutiert in Position Leu17,
J Lipase aus Burkholderia plantarii, mutiert in Position Leu17,
K Lipase aus Chromobakterium viscosum, mutiert in Position Leu17,
L Lipase aus Pseudomonas luteola, mutiert in Position Leu57,
M Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246, mutiert in Position Leu17. 3. Lipase variant according to claim 2, characterized in that one carries out an amino acid substitution at the following positions of the lipases A to M:
A lipase from Pseudomonas aeruginosa, mutated in position Met 16 ,
B Lipase from Vibrio cholerae, mutated in position Leu 44 ,
C lipase from Pseudomonas fragi, mutated in position Leu 17 ,
D lipase from Acinetobacter calcoaceticus, mutated in position Leu 49 ,
E lipase from Pseudomonas wisconsinensis, mutated in position Val 37 ,
F lipase from Pseudomonas fluorescens, mutated in position Met 17 ,
G lipase from Pseudomonas vulgaris, mutated in position Leu 16 ,
H lipase from Burkholderia cepacia, mutated in position Leu 17 ,
I lipase from Burkholderia glumae, mutated in position Leu 17 ,
J lipase from Burkholderia plantarii, mutated in position Leu 17 ,
K lipase from Chromobacterium viscosum, mutated in position Leu 17 ,
L lipase from Pseudomonas luteola, mutated in position Leu 57 ,
M lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246, mutated into position Leu 17 . 4. Lipase-Variante nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Aminosäuresubstitutionen an den Lipasen A bis M durchgeführt werden:
A Lipase aus Pseudomonas aeruginosa, wobei Met16 durch Ala16, Thr16 oder Phe16 ersetzt ist,
B Lipase aus Vibrio cholerae, wobei Leu44 durch Ala44, Thr44 oder Phe44 ersetzt ist,
C Lipase aus Pseudomonas fragi, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
D Lipase aus Acinetobacter calcoaceticus, wobei Leu49 durch Ala49, Thr49 oder Phe49 ersetzt ist,
E Lipase aus Pseudomonas wisconsinensis, wobei Val37 durch Ala37, Thr37 oder Phe37 ersetzt ist,
F Lipase aus Pseudomonas fluorescens, wobei Met17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
G Lipase aus Pseudomonas vulgaris, wobei Leu16 durch Ala16, Thr16 oder Phe16 ersetzt ist,
H Lipase aus Burkholderia cepacia, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
I Lipase aus Burkholderia glumae, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
J Lipase aus Burkholderia plantarii, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
K Lipase aus Chromobakterium viscosum, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist,
L Lipase aus Pseudomonas luteola, wobei Leu57 durch Ala57, Thr57 oder Phe57 ersetzt ist,
M Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246, wobei Leu17 durch Ala17, Thr17 oder Phe17 ersetzt ist. 4. Lipase variant according to claim 3, characterized in that the following amino acid substitutions are carried out on the lipases A to M:
A lipase from Pseudomonas aeruginosa, where Met 16 is replaced by Ala 16 , Thr 16 or Phe 16 ,
B Lipase from Vibrio cholerae, Leu 44 being replaced by Ala 44 , Thr 44 or Phe 44 ,
C lipase from Pseudomonas fragi, where Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
D Lipase from Acinetobacter calcoaceticus, where Leu 49 is replaced by Ala 49 , Thr 49 or Phe 49 ,
E lipase from Pseudomonas wisconsinensis, Val 37 being replaced by Ala 37 , Thr 37 or Phe 37 ,
F lipase from Pseudomonas fluorescens, where Met 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
G lipase from Pseudomonas vulgaris, where Leu 16 is replaced by Ala 16 , Thr 16 or Phe 16 ,
H lipase from Burkholderia cepacia, where Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
I Burkholderia glumae lipase, Leu 17 being replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
J lipase from Burkholderia plantarii, where Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
K lipase from Chromobacterium viscosum, where Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 ,
L lipase from Pseudomonas luteola, Leu 57 being replaced by Ala 57 , Thr 57 or Phe 57 ,
M lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246, whereby Leu 17 is replaced by Ala 17 , Thr 17 or Phe 17 . 5. Lipase-Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Aminosäuresubstitutionen an zwei Positionen durchführt, die den Positionen 17 und 52 bei der Prototyp-Lipase-Sequenz SEQ ID NO: 1 entsprechen. 5. lipase variant according to claim 1, characterized in that one carries out amino acid substitutions at two positions, positions 17 and 52 in the prototype lipase sequence SEQ ID NO: 1. 6. Lipase-Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen bei Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 8246 durchführt:
Leu17 ersetzt durch Ala17, Thr17, Phe17 oder Met17
Tyr29 ersetzt durch Ser29, Thr29, Phe29, Glu29
Trp30 ersetzt durch His30 oder Phe30
Phe52 ersetzt durch Ser52, Thr52, Tyr52 oder Leu52
His86 ersetzt durch Trp86, Thr86 oder Ser86
Ser117 ersetzt durch Ala117, Thr117 oder Met117
Phe122 ersetzt durch Leu122
Ala160 ersetzt durch Phe160, Leu160 oder Ile160
Ala163 ersetzt durch Phe163, Leu163 oder Ile163
Leu167 ersetzt durch Ala167, Val167, Ser167 oder Thr167
Leu265 ersetzt durch Ala265, Val267, Met265, Ser265 oder Thr265
Val266 ersetzt durch Ala266, Leu266, Met266, Ser266 oder Lys266
Leu286 ersetzt durch Ala286, Met286, Val286, Ile286 oder Ser286
Ile289 ersetzt durch Ala289, Val289 oder Leu289. 6. Lipase variant according to claim 1, characterized in that at least one of the following amino acid substitutions in lipase from Pseudomonas spec. DSM 8246 carries out:
Leu 17 replaced by Ala 17 , Thr 17 , Phe 17 or Met 17
Tyr 29 replaced by Ser 29 , Thr 29 , Phe 29 , Glu 29
Trp 30 replaced by His 30 or Phe 30
Phe 52 replaced by Ser 52 , Thr 52 , Tyr 52 or Leu 52
His 86 replaced by Trp 86 , Thr 86 or Ser 86
Ser 117 replaced by Ala 117 , Thr 117 or Met 117
Phe 122 replaced by Leu 122
Ala 160 replaced by Phe 160 , Leu 160 or Ile 160
Ala 163 replaced by Phe 163 , Leu 163 or Ile 163
Leu 167 replaced by Ala 167 , Val 167 , Ser 167 or Thr 167
Leu 265 replaced by Ala 265 , Val 267 , Met 265 , Ser 265 or Thr 265
Val 266 replaced by Ala 266 , Leu 266 , Met 266 , Ser 266 or Lys 266
Leu 286 replaced by Ala 286 , Met 286 , Val 286 , Ile 286 or Ser 286
Ile 289 replaced by Ala 289 , Val 289 or Leu 289 . 7. Nukleinsäuresequenz, kodierend eine Lipase-Variante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6. 7. Nucleic acid sequence encoding a lipase variant according to one of claims 1 to 6. 8. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 7. 8. Nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence according to claim 7. 9. Wirtsorganismus der mit einem Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 8 transformiert worden ist. 9. Host organism with a nucleic acid construct according to Claim 8 has been transformed. 10. Verfahren zur Herstellung einer Lipase-Variante gemäß Anspruch 1-6, wobei ein Wirtsorganismus gemäß Anspruch 9 unter Bedingungen kultiviert wird, die die Produktion der Lipase-Variante erlauben und die Lipase-Variante anschließend aus dem Kulturmedium gewonnen wird. 10. The method for producing a lipase variant according to Claims 1-6, wherein a host organism according to claim 9 is cultivated under conditions that affect the production of the Allow lipase variant and then the lipase variant is obtained from the culture medium. 11. Lipasen-Formulierung, enthaltend mindestens eine der Lipase- Varianten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6. 11. Lipase formulation containing at least one of the lipase Variants according to one of claims 1 to 6. 12. Lipasen-Formulierung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipasen-Varianten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in isolierter Form, auf einem festen Trägermaterial immobilisiert oder in Zellen verwendet. 12. Lipase formulation according to claim 11, characterized characterized in that the lipase variants according to one of the Claims 1 to 6 in isolated form, on a solid Carrier material immobilized or used in cells. 13. Verfahren zur enzymkatalytischen Umwandlung oder enantioselektiven Umwandlung von Substraten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Substrate in Gegenwart der Lipase-Varianten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umsetzt. 13. Process for enzyme catalytic conversion or enantioselective conversion of substrates, characterized in that according to the substrates in the presence of the lipase variants implements one of claims 1 to 6. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrate Alkohole, Amine oder Aminosäureester verwendet und diese in Gegenwart eines Acylierungsmittels acyliert. 14. The method according to claim 13, characterized in that as substrates alcohols, amines or amino acid esters used and this in the presence of an acylating agent acylated. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrate Carbonsäureester verwendet und diese verseift. 15. The method according to claim 14, characterized in that one uses carboxylic acid esters as substrates and these saponified. 16. Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man Stereoisomerengemische oder Racemate von Substraten, die sich enzymkatalytisch von Lipasen umsetzen lassen, enantioselektiv in Gegenwart der Lipase-Varianten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umsetzt und anschließend die Gemische auftrennt. 16. Process for the production of optically active compounds, characterized in that mixtures of stereoisomers or racemates of substrates that are enzyme catalytic by lipases, enantioselective in the presence the lipase variants according to one of claims 1 to 6 reacted and then the mixtures separated. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrate Alkohole, Amine oder Aminosäureester verwendet und diese in Gegenwart eines Acylierungsmittels enantioselektiv acyliert. 17. The method according to claim 16, characterized in that as substrates alcohols, amines or amino acid esters used and this in the presence of an acylating agent enantioselectively acylated. 18. Verwendung der Lipase-Varianten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 als Katalysator. 18. Use of the lipase variants according to one of claims 1 to 6 as a catalyst.
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