DE10150183A1

DE10150183A1 - Use of the orphan receptor TR4 and related compounds, for diagnosis and treatment of tumors and blood diseases, especially leukemia, and for drug screening

Info

Publication number: DE10150183A1
Application number: DE10150183A
Authority: DE
Inventors: Martin Zenke; Petr Bartunek; Jaime Madruga; Nicolas P Koritschoner
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 2001-10-12
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2003-04-24
Also published as: WO2003033529A3; WO2003033529A2; AU2002362891A1

Abstract

Use of TR4 (an orphan receptor), its activators, inhibitors and/or associated molecules (collectively (A)) for diagnosis, prophylaxis, monitoring, and/or (follow-up) treatment of tumors and/or diseases of the blood; proliferation, differentiation and/or expansion of hematopoietic cells, blood cells, pluripotent or committed stem cells; preparation of myeloid precursor cells or screening for pharmaceuticals. An Independent claim is also included for the use of TR4 and/or associated molecules for identification and/or isolation of TR (ant)agonists.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Behandlung von leukämischen Erkrankungen auf der Basis der Aktivität eines Rezeptors. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die pharmazeutische Industrie und die Medizin. The invention relates to an agent for the treatment of leukemic diseases on the Basis of the activity of a receptor. Areas of application of the invention are pharmaceutical industry and medicine.

Nukleare Rezeptoren sind Schlüsselregulatoren der Zellproliferation, der Zelldifferenzierung und der verschiedenen Entwicklungsprozesse der Zelle. In vielen Fällen üben diese Rezeptoren ihre Funktion über die Bindung an bekannte Liganden wie Retinoide, Steroide, Thyroidhormon, Eicosanoide und Vitamin D aus. Weiterhin gibt es eine sogar noch größere Anzahl von nuklearen Rezeptoren, die keine Liganden haben bzw. deren Liganden noch nicht identifiziert wurden. Diese nuklearen Rezeptoren werden auch als Orphan-Rezeptoren bezeichnet (Mangelsdörfund Evans, Cell 83 (1995) 841-850). Zahlreiche Untersuchungen zeigten, dass nukleare Rezeptoren einen starken Einfluss auf die Entwicklung von hämatopoetischen Zellen haben. So regulieren zum Beispiel der Retinoide X-Rezeptor und der Thyroide Hormonrezeptor das Erytrozytenwachstum und die Erytrozytendifferenzierung (Bartunek et al., Mol. Endocrinol., 12 (1998) 1269-1279). In anderen Zellsystemen bewirkt die Aktivierung von RARa durch Retinsäure eine Hemmung des Zellwachstums und unterstützt die Differenzierung zu Neutriphilen (Collins et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 2154-2163). TR4 ist ein Orphan-Rezeptor, der mit dem TR2 Rezeptor eng verwandt ist. Beide Rezeptoren definieren eine Unterfamilie innerhalb der Steroid-/Thyroidrezeptorfamilie (Hirose et al., Mol. Endocriol., 8 (1994) 1667-1680). Nuclear receptors are key regulators of cell proliferation, cell differentiation and the different development processes of the cell. In many cases, they practice Receptors function by binding to known ligands such as retinoids, steroids, Thyroid hormone, eicosanoids and vitamin D. There is also an even larger one Number of nuclear receptors that have no ligands or whose ligands are not yet were identified. These nuclear receptors are also called orphan receptors referred to (Mangelsdörf and Evans, Cell 83 (1995) 841-850). Numerous investigations showed that nuclear receptors have a strong influence on the development of have hematopoietic cells. For example, the retinoids regulate the X receptor and the thyroid hormone receptor the erytrocyte growth and erytrocyte differentiation (Bartunek et al., Mol. Endocrinol., 12 (1998) 1269-1279). In other cell systems the activation of RARa by retinoic acid inhibits cell growth and supports differentiation to neutriphiles (Collins et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 2154-2163). TR4 is an orphan receptor that is closely related to the TR2 receptor. Both Receptors define a subfamily within the steroid / thyroid receptor family (Hirose et al., Mol. Endocriol., 8 (1994) 1667-1680).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, auf der Basis der physiologischen Rolle des Orphan-Rezeptors TR4 ein pharmazeutisches Mittel zu entwickeln, mit dem leukämische Erkrankungen behandelt werden können. The invention is based, based on the physiological role of the task Orphan receptor TR4 to develop a pharmaceutical agent with the leukemic Diseases can be treated.

Die Erfindung wird gemäß dem Anspruch 1 realisiert. Die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. The invention is implemented according to claim 1. The subclaims are Preferred versions.

Es wurde gefunden, dass der Orphan-Rezeptor TR4 in hämatopoetischen Zellen und Geweben überraschend stark exprimiert wird und einen starken Einfluss auf diese Zellen ausübt. Ferner wurde gefunden, dass im Knochenmark mittels eines Retrovirusvektors ektopisch exprimiertes TR4 die Proliferation von myeloiden Progenitorzellen fördert. Ein weiterer Befund ist, dass die Aktivität von TR4 nicht ausschließlich von seiner Assoziation mit DNA abhängt, weil die Expression einer mutierten Version von TR4 ohne DNA- Bindungsmöglichkeit zum selben proliferativen Potential führt wie bei Wildtyp-TR4. It was found that the orphan receptor TR4 is found in hematopoietic cells and tissues is surprisingly strongly expressed and has a strong influence on these cells. Further was found to be ectopic in the bone marrow using a retrovirus vector expressed TR4 promotes the proliferation of myeloid progenitor cells. Another The finding is that the activity of TR4 is not solely due to its association with DNA depends on the expression of a mutant version of TR4 without DNA The possibility of binding leads to the same proliferative potential as with wild-type TR4.

Aus diesen Untersuchungen ergibt sich insgesamt, dass der Orphan-Rezeptor TR4 ein wichtiger Regulator der Proliferation und der Entwicklung myeloider Progenitorzellen ist. Overall, from these investigations it emerges that the orphan receptor TR4 is an important regulator of the proliferation and development of myeloid progenitor cells.

Ausgehend von dieser Erkenntnis wurde das erfindungsgemäße Mittel entwickelt, welches Substanzen enthält, die die Aktivität von TR4 beeinflussen. Bevorzugt sind dies Inhibitoren wie zum Beispiel Agonisten oder Aktivatoren wie zum Beispiel Antagonisten. Based on this knowledge, the agent according to the invention was developed, which Contains substances that affect the activity of TR4. These are preferably inhibitors such as agonists or activators such as antagonists.

Durch den Einsatz des Mittels wird eine neue Möglichkeit eröffnet, leukämische Erkrankungen, insbesondere der Myeloid-Leukämie zu behandeln. The use of the agent opens up a new possibility, leukaemic Treat diseases, especially myeloid leukemia.

Der nukleare Orphan-Rezeptor TR4 ist besonders stark in hämatopoetischen Geweben und Zelltypen ausgeprägt. The nuclear orphan receptor TR4 is particularly strong in hematopoietic tissues and Pronounced cell types.

Um das Expressionsprofil von nuklearen Rezeptoren in hämatopoetischen Zellen zu bestimmen, wurde eine auf RT-PCR gestützte Strategie angewandt, die sich degenerierter Primer mit der in einem hohen Maße erhaltenen DNS-Bindedomäne der nuklearen Rezeptoren bediente. Es wurde festgestellt, dass mehrere Mitglieder der nuklearen Rezeptor- Genfamilie in verschiedenen aus Hühnerknochenmark gewonnenen Progenitortypen vorkommen. Interessanterweise entsprach einer der den Untersuchungen zur Erfindung am meisten vorhandenen cDNA-Klone dem Hühnerhomolog des nuklearen Orphanrezeptors TR4. Um das Expressionsmuster von TR4 näher zu untersuchen, wurden Human- und Hühner-TR4-cDNA als Sonden in Northern-Blots eingesetzt, die ein RNA-Feld aus hämatopoetischen und nicht hämatopoetischen Geweben und Zelltypen enthielten (Abb. 1A, B und C). In order to determine the expression profile of nuclear receptors in hematopoietic cells, a strategy based on RT-PCR was used which made use of degenerate primers with the DNA binding domain of the nuclear receptors which was preserved to a high degree. It was found that several members of the nuclear receptor gene family occur in different types of progenitor derived from chicken bone marrow. Interestingly, one of the cDNA clones most present in the studies on the invention corresponded to the chicken homologue of the nuclear orphan receptor TR4. In order to investigate the expression pattern of TR4 in more detail, human and chicken TR4 cDNA were used as probes in Northern blots which contained an RNA field from hematopoietic and non-hematopoietic tissues and cell types ( FIGS. 1A, B and C).

Eine auffällige TR4-Expression wurde in Humanmyeloid-Zelllinien (U937, HL60) und Primärmonozyten sowie dendritischen Zellen festgestellt (Abb. 1A). Ähnlich stark war TR4 in Rattenmyeloidzellen ausgeprägt (Abb. 1B). Im T-Zellen fand sich mäßig, in B-Zellen nur wenig TR4. Zusätzlich ließ sich TR4 sofort in Erythroid-Zelllinien des Menschen, der Maus und des Huhns (K562, E31 bzw. HD3) sowie in den Primärprogenitoren der roten Blutkörperchen feststellen (Abb. 1A, B und C). Wie zu erwarten war, fand sich eine hohe TR4-Expression im Hirn. Im Thymus war der TR4-Spiegel ebenfalls hoch, in Bursa und Milz etwas geringer (Abb. 1 C). Entsprechend wurden TR4-Transkripte in B-, T- und dendritischen Zellen von Hühnern gefunden. Folglich liegt TR4 in einer ganzen Reihe verschiedener Zelltypen des hämatopoetischen Systems vor. A striking TR4 expression was found in human myeloid cell lines (U937, HL60) and primary monocytes as well as dendritic cells ( Fig. 1A). TR4 was similarly pronounced in rat myeloid cells ( Fig. 1B). Moderate was found in T cells and only little TR4 in B cells. In addition, TR4 was immediately detectable in human, mouse and chicken erythroid cell lines (K562, E31 and HD3) and in the primary progenitors of red blood cells ( Figs. 1A, B and C). As expected, there was a high level of TR4 expression in the brain. The TR4 level was also high in the thymus and somewhat lower in bursa and spleen ( Fig. 1 C). Accordingly, TR4 transcripts were found in chicken B, T and dendritic cells. As a result, TR4 is present in a number of different cell types in the hematopoietic system.

TR4 induziert wirksam die Proliferation von Myeloid-Progenitorzellen. TR4 effectively induces the proliferation of myeloid progenitor cells.

Während frühere Studien die Bedeutung von TR4 für die Unterdrückung verschiedener NR- Pfade aufgezeigt haben, wurde der Einfluss von TR4 auf Primärzellen insbesondere des hämatopoetischen Systems bisher noch nicht untersucht. Folglich wurde, um einen Einblick in die potenzielle Rolle von TR4 für die hämatopoetischen Zellen zu gewinnen, TR4 ektopisch in Knochenmarkzellen von Hühnern exprimiert und die Wirkungen des Rezeptors auf die Proliferation bzw. Entwicklung dieser Zellen untersucht. Zu diesem Zweck wurden ein TR4- cDNA tragender retroviraler Vektor konstruiert und in die Hühnerembryo-Fibroblasten transfiziert sowie die Neomyzin-resistenten Zellen selektiert. Die Zellen wiesen ganz augenscheinlich das TR4-Protein auf (Abb. 3) und wurden als Quelle zur Infektion der Knochenmarkzellen mit dem Virus eingesetzt. Mit Pilot-Experimenten, bei denen unterschiedliche Kulturbedingungen mit verschiedenen Kombinationen aus Wachstumsfaktoren, Hormonen, Seren und konditionierten Medien eingesetzt wurden, gelang es, das Wachstum der mit TR4 infizierten Progenitorzellen zu optimieren. Die auffälligste Beobachtung bestand darin, dass TR4 innerhalb von 4 bis 5 Tagen einen Auswuchs der Zellen verursachte, was bei den mit einem leeren Vektor infizierten Vergleichskulturen nicht festgestellt werden konnte (Abb. 2A). Die Zellen wuchsen in großen Aggregaten, die aus mehreren Hunderten von Zellen bestanden (Abb. 2B, links). Nach 14 bis 16 Tagen hörte diese Proliferation auf. While previous studies have shown the importance of TR4 for the suppression of various NR pathways, the influence of TR4 on primary cells, particularly in the hematopoietic system, has not yet been investigated. Consequently, in order to gain insight into the potential role of TR4 for hematopoietic cells, TR4 was expressed ectopically in chicken bone marrow cells and the effects of the receptor on the proliferation or development of these cells were examined. For this purpose, a retroviral vector carrying TR4 cDNA was constructed and transfected into the chicken embryo fibroblasts and the neomycin-resistant cells were selected. The cells clearly showed the TR4 protein ( Fig. 3) and were used as a source for the infection of the bone marrow cells with the virus. Pilot experiments, in which different culture conditions with different combinations of growth factors, hormones, sera and conditioned media were used, succeeded in optimizing the growth of the progenitor cells infected with TR4. The most striking observation was that TR4 caused a cell outgrowth within 4 to 5 days, which could not be found in the reference cultures infected with an empty vector ( Fig. 2A). The cells grew in large aggregates consisting of several hundreds of cells ( Fig. 2B, left). This proliferation stopped after 14 to 16 days.

Die histologische Untersuchung der TR4-Zellen ergab eine Ähnlichkeit mit Myeloid- Progenitoren (Abb. 2B, rechts). Die Zellen wiesen einen Durchmesser von durchschnittlich 9 µm auf und wurden des Weiteren per Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Paneels monoklonaler Antikörper hinsichtlich des Auftretens von Zelloberflächenmarkern charakterisiert (Abb. 2C). Dabei wurde in den TR4-Zellen eine hohe Expression der Myeloidmarker MC47-83, MC51-2 und MC22-3 sowie MHC Klasse II festgestellt. Die Prüfung auf K1, einen Makrophagenmarker, verlief negativ. Unter Verwendung des Antikörpers JS8 wurde wie (seitdem sich die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase befanden) erwartet ein Transferrinrezeptor gefunden. Die TR4-Zellen wiesen jedoch weder die T-Zell-spezifischen Marker (CD3, CD4 und CD8) noch den erythroidspezifischen Marker (JS4) oder den eosinophilen Marker (EOS47; Abb. 2C) auf. Ebenso fand sich kein HEMCAM, ein Adhäsionsmolekül früher hämatopoetischer Progenitoren, wogegen CD44, ein weiteres, in Form verschiedener hämatopoetischer Zelltypen auftretendes Adhäsionsmolekül, nachgewiesen werden konnte. Des Weiteren fand sich in den TR4-Zellen MEP17/a2/ßl Integrin, während das in starkem Maße auf Ihrombozyten und multipotenten Myeloid- Progenitoren, Ihrombozyt- sowie Erythroidzellen vorkommende MEP21/Thrombomucin fehlte. Histological examination of the TR4 cells showed a similarity to myeloid progenitors ( Fig. 2B, right). The cells had an average diameter of 9 µm and were further characterized by flow cytometry using a panel of monoclonal antibodies with regard to the appearance of cell surface markers ( Fig. 2C). High expression of the myeloid markers MC47-83, MC51-2 and MC22-3 and MHC class II was found in the TR4 cells. The test for K1, a macrophage marker, was negative. Using the antibody JS8, a transferrin receptor was found as expected (since the cells were in the exponential growth phase). However, the TR4 cells had neither the T cell-specific marker (CD3, CD4 and CD8) nor the erythroid-specific marker (JS4) or the eosinophilic marker (EOS47; Fig. 2C). There was also no HEMCAM, an adhesion molecule from earlier hematopoietic progenitors, whereas CD44, another adhesion molecule in the form of different hematopoietic cell types, could be detected. Furthermore, MEP17 / a2 / ßl integrin was found in the TR4 cells, while the MEP21 / thrombomucin, which occurs to a large extent on your plombocytes and multipotent myeloid progenitors, your plombocyte and erythroid cells, was missing.

Es kann geschlussfolgert werden, dass TR4-Zellen auf Grund ihrer morphologischen Eigenschaften und des Profils ihrer Zelloberflächenmarker Myeloid-Progenitoren sind. It can be concluded that TR4 cells are based on their morphological Properties and profile of their cell surface markers are myeloid progenitors.

Die wachstumsfördernde Aktivität von TR4 wird bei der Deletion seiner DNA-Bindedomäne beeinträchtigt, jedoch nicht beseitigt. The growth-enhancing activity of TR4 is evident in the deletion of its DNA binding domain impaired but not eliminated.

TR4 wurde als an der Unterdrückung und Aktivierung von Genexpressionen beteiligter Transkriptionsfaktor beschrieben. Diese doppelte Aktivität kann in erheblichem Maße von den TR4-DNA-Kontakten oder TR4-Kofaktor(en)-Bindungen oder beidem abhängig sein. Um zu untersuchen, welche Aktivität von TR4 an der hier beobachteten Wachstumsförderung von Knochenmarkzellen beteiligt sein könnte, wurden folglich Retroviren, die mit Hämagglutinin markierte TR4-Versionen mit vollständiger Stranglänge oder mutantes TR4 ohne dessen DNA-Bindung enthielten, konstruiert und analysiert (Abb. 3A). Per Western-Blot unter Verwendung eines Anti-Hämagglutinin-spezifischen Antikörpers wurde eine wirksame Expression der HA-TR4- und HA-ΔTR4-Proteine festgestellt (Abb. 3B). Zusätzlich wurde die subzelluläre Lokalisation der TR4-Proteine per indirekte Immunofluoreszenz ermittelt (Abb. 3C). In den Hühnerembryo-Fibroblasten war HA-TR4 deutlich auf den Zellkern beschränkt, während das HA-ΔTR4-Protein sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma auftrat. Die letztgenannte Beobachtung überrascht nicht, teilen sich doch TR4 und sein nächster "Verwandter" TR2 in ihrer DNA-Bindedomäne ein in höchstem Maße homologes Zellkernlokalisierungssignal und es ist ja eben dieses Motiv, das bei HA-ΔTR4 entfernt wurde. Erwartungsgemäß verlief das Anfärben von leere Vektoren enthaltenden Hühnerembryo-Fibroblasten mit Hämagglutinin-spezifischen Antikörpern negativ. TR4 has been described as a transcription factor involved in the suppression and activation of gene expression. This double activity can depend significantly on the TR4 DNA contacts or TR4 cofactor (s) linkages, or both. In order to investigate which activity of TR4 could be involved in the growth promotion of bone marrow cells observed here, retroviruses containing TR4 versions with full strand length labeled with hemagglutinin or mutant TR4 without its DNA binding were therefore constructed and analyzed ( Fig. 3A ). An effective expression of the HA-TR4 and HA-ΔTR4 proteins was determined by Western blot using an anti-hemagglutinin-specific antibody ( FIG. 3B). In addition, the subcellular localization of the TR4 proteins was determined by indirect immunofluorescence ( Fig. 3C). In the chicken embryo fibroblasts, HA-TR4 was clearly restricted to the cell nucleus, while the HA-ΔTR4 protein appeared both in the cell nucleus and in the cytoplasm. The latter observation is not surprising, since TR4 and its closest "relative" TR2 share a highly homologous nuclear localization signal in their DNA binding domain and it is precisely this motif that was removed in HA-ΔTR4. As expected, staining empty chicken embryo fibroblasts containing hemagglutinin-specific antibodies was negative.

Mit Hilfe von Banden-Shift-Assays wurde nachgewiesen, dass HA-TR4 sich wirksam an der in DR1-HRE (AGGTCAAAGGTCA) enthaltenen TR4-Bindungsstelle angegliedert hatte, HA-ΔTR4 dagegen nicht (Abb. 4A). Die HA-TR4 entsprechende Bande war geringfügig stärker verschoben als beim nicht markierten TR4. Die HA-TR4-Bindung war deutlich spezifisch, da sie von nicht markiertem DR1-HRE, jedoch nicht von einem mutierten Oligonukleotid wirksam kompetitiert wurde (Abb. 4A). Darüber hinaus war der Anti- Hämagglutinin-spezifische monoklonale Antikörper in der Lage, einen Supershift der TR4- HA-Bande zu bewirken, wogegen er auf das Muster des HA-ΔTR4 keinen Einfluss hatte. Diese Daten wurden des Weiteren durch Shift-Western-Experimente bestätigt, bei denen die Proteine in dem Shiftgel auf eine Membran übertragen und mit dem Anti-Hämagglutinin- Antikörper sondiert wurden. Erwartungsgemäß erkannte der Antikörper dabei HA-TR4, was der einem Shift unterzogenen Bande entsprach. Using band shift assays, it was demonstrated that HA-TR4 had effectively attached to the TR4 binding site contained in DR1-HRE (AGGTCAAAGGTCA), whereas HA-ΔTR4 had not ( Fig. 4A). The band corresponding to HA-TR4 was shifted slightly more than with the unmarked TR4. HA-TR4 binding was clearly specific because it was competed effectively by unlabeled DR1-HRE but not by a mutated oligonucleotide ( Fig. 4A). In addition, the anti-hemagglutinin-specific monoclonal antibody was able to cause a supershift of the TR4-HA band, whereas it had no influence on the pattern of the HA-ΔTR4. These data were further confirmed by shift western experiments in which the proteins in the shift gel were transferred to a membrane and probed with the anti-hemagglutinin antibody. As expected, the antibody recognized HA-TR4, which corresponded to the band subjected to a shift.

Es wurden transiente Transfektionsexperimente zur Analyse der transkriptionellen Aktivität von TR4-Konstrukten durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass HA-TR4 die RXR- und Thyroidhormonrezeptor-abhängige transkriptionelle Aktivierung unterdrückt, HA-ΔTR4 dagegen nicht (Abb. 4B). Ähnliche Ergebnisse wurden bei hämatopoetischen Zellen (HD3- Erythroblasten) gewonnen. Transient transfection experiments were carried out to analyze the transcriptional activity of TR4 constructs. It was found that HA-TR4 suppressed RXR- and thyroid hormone receptor-dependent transcriptional activation, HA-ΔTR4 did not ( Fig. 4B). Similar results were obtained from hematopoietic cells (HD3 erythroblasts).

Nach der Feststellung, dass HA-ΔTR4 weder die DNA bindet noch die Transkription unterdrückt, sollte im nächsten Schritt untersucht werden, ob für den beobachteten TR4- induzierten Phänotyp die DNA-Bindeaktivität von TR4 verantwortlich ist. Dazu wurden HA- TR4- und HA-ΔTR4-Retroviren eingesetzt, um wie oben beschrieben Knochenmarkzellen zu infizieren. HA-TR4 verhielt sich identisch wie nicht modifiziertes TR4, so dass problemlos wachsende Myeloidzellen erhalten wurden (Abb. 5). Überraschenderweise wurde auch bei HA-ΔTR4 ein Auswuchs an Myeloidzellen beobachtet, wenn auch die Gesamtzahl der Zellen etwas geringer als bei HA-TR4 ausfiel (Abb. 5). Erwartungsgemäß wiesen die mit einem Neovirus infizierten Kontrollzellen ein eingeschränktes Wachstumspotential auf und beendeten die Proliferation nach 4 bis 6 Tagen in der Kultur. Darüber hinaus zeigten die mit Retroviren umgewandelten Zellen deutlich Hämagglutinin-markierte TR4-Proteine, wie eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung des Anti-Hämagglutinin-spezifischen Antikörpers ergab (Abb. 5). Schließlich konnte festgestellt werden, dass TR4, HA-TR4 und HA-ΔTR4 sowohl hinsichtlich ihrer Morphologie als auch ihrer Zelloberflächenmarker-Expression identisch sind. After finding that HA-ΔTR4 neither binds the DNA nor suppresses the transcription, the next step should be to investigate whether the TR4-induced phenotype is responsible for the DNA binding activity of TR4. For this purpose, HATR4 and HA-ΔTR4 retroviruses were used to infect bone marrow cells as described above. HA-TR4 behaved identically to unmodified TR4, so that myeloid cells grew without problems ( Fig. 5). Surprisingly, growth of myeloid cells was also observed in HA-ΔTR4, although the total number of cells was somewhat lower than in HA-TR4 ( Fig. 5). As expected, the control cells infected with a neovirus had a limited growth potential and ended the proliferation after 4 to 6 days in the culture. In addition, the cells converted with retroviruses clearly showed hemagglutinin-labeled TR4 proteins, as was shown by a Western blot analysis using the anti-hemagglutinin-specific antibody ( FIG. 5). Finally, it was found that TR4, HA-TR4 and HA-ΔTR4 are identical in terms of both their morphology and their cell surface marker expression.

Zusammenfassend lässt sich schlussfolgern, dass TR4 und in einem geringeren Maße auch HA-ΔTR4 wirksam einen Auswuchs an Myeloidzellen aus Knochenmark unterstützten, was zeigt, dass die wachstumsfördernde Aktivität von TR4 durch die Deletion seiner DNA- Bindedomäne nicht verloren geht. In conclusion, it can be concluded that TR4 and to a lesser extent HA-ΔTR4 effectively supported an outgrowth of bone marrow myeloid cells shows that the growth-enhancing activity of TR4 by deleting its DNA Binding domain is not lost.

RXR und seine DNA-bindungslose Variante ΔRXR rekapitulieren die TR4-Wirkungen auf Knochenmarkzellen nur unvollständig. RXR and its DNA-binding variant ΔRXR recapitulate the TR4 effects Bone marrow cells only incomplete.

Wie bereits oben beschrieben, wirkt TR4 auf RXR-vermittelte Transkriptionen stark repressiv. Daher wurde ein ΔRXR, der keine DNA-Bindedomäne mehr besitzt, über einen Retrovirus in Knochenmarkzellen eingeführt um zu prüfen, ob ein dominanter störender RXR einen ähnlichen Phänotyp wie TR4 ausbilden würde. In einer Kontrollkultur wurde ein RXR mit vollständiger Stranglänge verwendet. Während die ΔRXIR- und RXR-Proben zunächst einen Auswuchs zeigten, beendeten diese Zellen am 9. Tag in der Kultur die Proliferation und blieben von da an die Zellzahlen konstant bzw. begannen sich zu verringern (Abb. 5). All diese Daten weisen darauf hin, dass eine erweiterte Proliferation spezifisch nur von TR4 und TR4-Varianten erzielt wird, wogegen RXR das Wachstum von Myeloidzellen begünstigt. Darüber hinaus zeigte ΔRXR eine ähnliche Wirkung auf Knochenmarkzellen wie RXR mit vollständiger Stranglänge, was zeigt, dass, wie auch beim TR4, die DNS-Bindung von RXR für diese Aktivität durchaus entbehrlich ist. As already described above, TR4 has a strong repressive effect on RXR-mediated transcriptions. Therefore, a ΔRXR that no longer has a DNA binding domain was introduced into bone marrow cells via a retrovirus in order to check whether a dominant interfering RXR would develop a phenotype similar to TR4. A full-length RXR was used in a control culture. While the ΔRXIR and RXR samples initially showed an outgrowth, these cells stopped proliferation on the 9th day in the culture and from then on the cell numbers remained constant or began to decrease ( Fig. 5). All of these data indicate that extended proliferation is only achieved specifically by TR4 and TR4 variants, whereas RXR favors the growth of myeloid cells. In addition, ΔRXR had a similar effect on bone marrow cells as full-length RXR, which shows that, like TR4, RXR DNA binding is entirely unnecessary for this activity.

Zur Untersuchung des Differenzierungspotentials der TR4-Zellen wurden Myeloid- Differenzierungsinduktoren wie zum Beispiel 9-cis-Retinosäure oder TFA zugegeben und die Zellen anschließend auf morphologische Veränderungen und ihre Adhäsionseigenschaften hin untersucht (Abb. 6A und B). Zur Kontrolle wurden weitere Zellen mit dem Hühner- Myelomonozyten-Wachstumsfaktor (cMGF) behandelt, womit bei früheren Experimenten eine zwar wachstumsfördernde, jedoch keine differenzierende Aktivität nachgewiesen wurde. Von den mit 9cisRA behandelten HA-TR4- und HA-ΔTR4-Zellen wurden nur wenige adhärent, während die Mehrzahl der RXR- und ΔRXR-Zellen am Gefäß hafteten und zu Makrophagen differenzierten (Abb. 6A, B). To investigate the differentiation potential of the TR4 cells, myeloid differentiation inducers such as 9-cis-retinoic acid or TFA were added and the cells were then examined for morphological changes and their adhesive properties ( FIGS. 6A and B). As a control, further cells were treated with the chicken myelomonocyte growth factor (cMGF), with which a growth-promoting but no differentiating activity was detected in previous experiments. Only a few of the HA-TR4 and HA-ΔTR4 cells treated with 9cisRA became adherent, while the majority of the RXR and ΔRXR cells adhered to the vessel and differentiated into macrophages ( FIGS. 6A, B).

TPA leitete rasch eine Adhäsion der gesamten Zellpopulation ein, wobei keine offensichtlichen Unterschiede zwischen RXR-, ARXR-, TR4- und ΔTR4-Zellen beobachtet wurden (Abb. 6A und B). Den Zellen wurden unterschiedliche TPA-Konzentrationen zugesetzt und unter dem Mikroskop die sich vollziehenden morphologischen Veränderungen beobachtet. Nach längerer TPA-Behandlung (3 Tage) erwarben einige der Zellen eine Multizellkern-Morphologie. TPA rapidly initiated adhesion of the entire cell population, with no apparent differences observed between RXR, ARXR, TR4 and ΔTR4 cells ( Figs. 6A and B). Different concentrations of TPA were added to the cells and the morphological changes taking place were observed under the microscope. After prolonged TPA treatment (3 days), some of the cells acquired a multicellular nucleus morphology.

TR4- und ΔTR4-Zellen weisen hochgradig C/EBPβ und den Promyelozytmarker Mim-1 auf. TR4 and ΔTR4 cells have high levels of C / EBPβ and the promyelocyte marker Mim-1.

Im nächsten Schritt wurde die Proteinexpression der TR4-Zellen analysiert. In the next step, the protein expression of the TR4 cells was analyzed.

Interessanterweise wiesen sowohl HA-TR4- als auch HA-ΔTR4-Zellen in reichlichem Maße ein Protein mit einer Molekularmasse von 35 kDa auf (Abb. 7A). Diese Bande wurde auch in RXR- und ΔRXR-Zellen beobachtet, jedoch hier in einem wesentlich geringeren Maße als bei den TR4-Zellen. Danach wurde die Identität dieses Proteins ermittelt. Dazu wurde diese Bande aus einem Gel isoliert und eine Peptidsequenzierung durchgeführt. Durch die Analyse verschiedener Peptidsequenzen konnte das Protein als das myb-induzierte Myeloidprotein 1, Mim-1 genannt, identifiziert werden. Ein Western-Blot mit einem Anti-Mim-1-spezifischen Antikörper bestätigte zusätzlich die Identität dieses Proteins (Abb. 7B). Die in den Coomassie-Blau gefärbten Gels gefundene 18-kDA-Bande ist aller Wahrscheinlichkeit nach ein Mim-1-Abbauprodukt, da es sich ebenfalls mit Anti-Mim-1-Antikörper färben ließ. Mim- 1 kommt in Zytoplasmagranulat in Form normaler und verformter Promyelozyten vor. Interestingly, both HA-TR4 and HA-ΔTR4 cells abundantly showed a protein with a molecular mass of 35 kDa ( Fig. 7A). This band was also observed in RXR and ΔRXR cells, but to a much lesser extent than in the TR4 cells. The identity of this protein was then determined. For this purpose, this band was isolated from a gel and peptide sequencing was carried out. By analyzing various peptide sequences, the protein was identified as the myb-induced myeloid protein 1, called Mim-1. A Western blot with an anti-Mim-1-specific antibody additionally confirmed the identity of this protein ( FIG. 7B). The 18 kDA band found in the Coomassie blue-colored gels is most likely a Mim-1 degradation product because it could also be stained with anti-Mim-1 antibody. Mim-1 occurs in cytoplasmic granules in the form of normal and deformed promyelocytes.

Um die Analyse der TR4-Zellen weiter zu vertiefen, wurde das Vorhandensein von C/EBPß, einem weiteren, in hohem Maße in Myeloid-Progenitoren auftretenden und für eine wirksame Mim-1-Expression erforderlichen Protein, per Immunoblot geprüft. Dabei wurde festgestellt, dass TR4- und HA-ΔTR4-enthaltende Zellen hochgradig C/EBPβ aufwiesen (Abb. 7C). Auch in RXR- und ΔRXR-Zellen trat C/EBPβ auf, jedoch in einem geringeren Maße. In order to further deepen the analysis of the TR4 cells, the presence of C / EBPß, another protein which occurs to a large extent in myeloid progenitors and is required for effective Mim-1 expression, was checked by immunoblot. It was found that cells containing TR4 and HA-ΔTR4 were highly C / EBPβ ( Fig. 7C). C / EBPβ also occurred in RXR and ΔRXR cells, but to a lesser extent.

In der Summe bestätigen all diese Daten den Effekt, dass TR4 bei der Einleitung eines Auswuchses gebundener Granulozyt-Progenitoren bzw. bei der Verhinderung der terminalen Differenzierung dieser Zellen eine Rolle spielt. The sum of all these data confirms the effect that TR4 when initiating a Outgrowth of bound granulocyte progenitors or in the prevention of terminal ones Differentiation of these cells plays a role.

Für das Verständnis, wie sich die verschiedenen hämatopoetischen Abstammungslinien entwickeln, ist die Expression von Zellkernhormonrezeptoren von zentraler Bedeutung. Mit der Erfindung wird nachgewiesen, dass TR4 in hohem Maße in hämatopoetischen Zellen und Geweben von Wirbelorganismen und dabei besonders stark in Myeloidzellen auftreten. Des Weiteren wurde durch die ektopische Expression von TR4 in Knochenmarkzellen der potenzielle Einfluss von TR4 auf die Hämatopoese aufgedeckt. Es wurde festgestellt, dass TR4 zu einem wirksamen Auswuchs an Promyelozyten führt und so an der Proliferation und Differenzierung von Myeloid-Progenitorzellen beteiligt ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass TR4 sowie auch das von seiner DNA-Bindedomäne befreite ΔTR4 im Wesentlichen die gleichen biologischen Aktivitäten aufweisen. Offensichtlich ist die DNS-Bindeaktivität von TR4 für die Ausübung seiner Aktivitäten in hämatopoetischen Zellen nicht erforderlich. For understanding how the different hematopoietic lineages are development, the expression of nuclear hormone receptors is of central importance. With The invention demonstrates that TR4 is highly active in hematopoietic cells and Tissues from vertebrate organisms and particularly strongly occur in myeloid cells. Of Furthermore, the ectopic expression of TR4 in bone marrow cells led to the potential impact of TR4 on hematopoiesis revealed. It was found that TR4 leads to an effective outgrowth of promyelocytes and thus to proliferation and Differentiation of myeloid progenitor cells is involved. It was also shown that TR4 as well as the ΔTR4 freed from its DNA binding domain essentially the have the same biological activities. Obviously, the DNA binding activity of TR4 is not required for the exercise of its activities in hematopoietic cells.

Wie hier aufgezeigt wurde, kommt TR4 zwar in verschiedenen hämatopoetischen Abstammungslinien vor, doch wurde ein wirksamer Auswuchs nach einer ektopischen Expression in Knochenmarkzellen nur im Myeloidbereich beobachtet. Interessanterweise wurde, obwohl Erythroidzellen in allen analysierten Spezies eine auffällige TR4-Expression aufwiesen, kein Auswuchs an eiythroiden Progenitorzellen beobachtet. Des Weiteren wurde festgestellt, dass TR4 bei Einbau in vorhandene Erythroid-Progenitoren nur eine geringfügige wachstumsfördernde Aktivität besitzt. As shown here, TR4 comes in various hematopoietic Lineage before, but became an effective outgrowth after an ectopic Expression in bone marrow cells only observed in the myeloid area. Interestingly, was, although erythroid cells in all analyzed species show a striking TR4 expression showed no outgrowth on egg-thyroid progenitor cells. Furthermore, found that TR4 is only marginal when installed in existing erythroid progenitors has growth-promoting activity.

Gemäß der Erfindung wird die transkriptionelle Aktivität von TR4 als Repressor durch verschiedene Mechanismen, darunter auch die Zusammensetzung der Zielstelle, bedingt. Entsprechend erfordert eine TR4-vermittelte Repression an bestimmten DNS-Elementen eine intakte DNS-Bindedomäne, wie ebenfalls hier dargestellt wurde. Alternativ könnte die transkriptionelle Repression per Sequestrierung von Kofaktoren (Transrepression), die sich zum Beispiel mit AF-2 verbinden, vermittelt werden und die Transrepression folglich sowohl von TR4 als auch ΔTR4 durchgeführt werden. Interessanterweise zeigen TR4 und ΔTR4 in vivo ähnliche biologische Aktivitäten bei der Förderung der Promyelozytproliferation. Dies erlaubt die Schlußfolgerung, dass die Aktivität der ektopisch auftretenden TR4 in Myeloidzellen weitestgehend, wenn nicht sogar vollständig aus der Sequestrierung eines oder mehrerer Kofaktoren resultiert, die an der korrekten Myeloidentwicklung beteiligt sind. Dieser Gedanke wird des Weiteren durch in Experimenten mit anderen hämatopoetischen Zelltypen gewonnene Belege gestützt. So kann zum Beispiel der Östrogenrezeptor in erythroiden Zellen die Differenzierung über einen Mechanismus hemmen, der eine intakte AF-2-Domäne erfordert, jedoch von der AF-1- und DNS-Bindedomäne unabhängig ist. According to the invention, the transcriptional activity of TR4 is carried out as a repressor various mechanisms, including the composition of the target location. Accordingly, TR4-mediated repression on certain DNA elements requires one intact DNA binding domain, as also shown here. Alternatively, the transcriptional repression by sequestration of cofactors (transrepression), which for example, connect to AF-2, be mediated and consequently both transrepression of TR4 as well as ΔTR4. Interestingly, TR4 and ΔTR4 show in vivo-like biological activities in promoting promyelocyte proliferation. This allows the conclusion that the activity of the ectopic TR4 in Myeloid cells largely, if not completely, from the sequestration of one or results in several cofactors that are involved in the correct development of the myeloid. This idea is further evidenced by experiments with other hematopoietic Supported evidence obtained from cell types. For example, the estrogen receptor in erythroid cells inhibit differentiation through a mechanism that maintains an intact AF-2 domain required, but independent of the AF-1 and DNA binding domains.

Kürzlich wurde nachgewiesen, dass NR in der Lage sind, Zielgenexpressionen nicht nur als DNS-gebundene Faktoren, sondern auch durch Mechanismen, die keine direkten DNA- Interaktionen erfordern, zu modulieren. Solche DNS-unabhängigen Aktivitäten der NR werden in den meisten Fällen per Protein-Protein-Interaktionen durchgeführt. Die wahrscheinlichsten Kandidaten für eine solche Funktion sind Korepressoren und Koaktivatoren, die bekanntermaßen mit der AF-2-Domäne von NR interagieren. Einem solchen DNA-unabhängigen Mechanismus der TR4-Tätigkeit würden die gemachten Beobachtungen, die eine ähnliche Aktivität von TR4 und ΔTR4 bei der Promyelozyt- Proliferation nachweisen, entsprechen. Ein Kandidat für diese Funktion ist RIP-140, ein nachweislich mit TR4 interagierender Koaktivator. Des Weiteren besitzt die Transrepression auf Grund der RIP-140-Sequestrierung durchaus Priorität und wurde zum Beispiel bei der PPAR/RXR-gesteuerten Genexpression beobachtet. It has recently been demonstrated that NR are able to express target gene not only as DNA-linked factors, but also through mechanisms that do not have direct DNA Interactions require to modulate. Such DNS-independent activities of the NR are carried out in most cases via protein-protein interactions. The The most likely candidates for such a role are corporators and Coactivators known to interact with the AF-2 domain of NR. a such a DNA-independent mechanism of TR4 activity would be made Observations showing similar activity of TR4 and ΔTR4 in promyelocytic Prove proliferation, correspond. A candidate for this role is RIP-140, a proven to interact with TR4 coactivator. It also has transrepression due to the RIP-140 sequestration quite a priority and was, for example, at the PPAR / RXR-controlled gene expression was observed.

Die Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der TR4-Proteine ergab, dass TR4 im Zellkern, ΔTR4 dagegen zwar zum größten Teil im Zellkern, jedoch auch im Zytoplasma von TR4-transformierten Hühnerembryo-Fibroblasten und Myeloidzellen vorhanden ist. Ein Grund dafür könnte darin bestehen, dass das mutmaßliche Zellkernlokalisierungssignal von TR4 (wie das entsprechende Zellkernlokalisierungssignal in der DNA-Binderegion von TR2) in ΔTR4 entfernt ist. Folglich könnte die vernngerte Zellkernexpression von ΔTR4 durchaus das gegenüber TR4-Zellen etwas verringerte Proliferationspotential der ΔTR4-Zellen erklären. Examination of the subcellular localization of the TR4 proteins revealed that TR4 in the Cell nucleus, however, ΔTR4 for the most part in the cell nucleus, but also in the cytoplasm of TR4-transformed chicken embryo fibroblasts and myeloid cells are present. On The reason for this could be that the putative nuclear localization signal of TR4 (like the corresponding nuclear localization signal in the DNA binding region of TR2) is removed in ΔTR4. Consequently, the decreased nuclear expression of ΔTR4 may well be the slightly reduced proliferation potential of the ΔTR4 cells compared to TR4 cells to explain.

Abschließend wird festgestellt, dass TR4 als Regulator der Myeloidentwicklung ein Ziel der pharmakologischen Forschung darstellt und somit neue Möglichkeiten für die Behandlung von Myeloid-Leukämie eröffnen wird. Dabei können insbesondere synthetische TR4- Agonisten bzw. -Antagonisten in Verbindung mit den bereits etablierten Behandlungsmethoden der Differenzierungstherapie wertvolle Wirkstoffe bieten. In conclusion, it is stated that TR4 as a regulator of myeloid development is a goal of represents pharmacological research and thus new treatment options of myeloid leukemia will open up. In particular, synthetic TR4- Agonists or antagonists in connection with the already established ones Treatment methods of differentiation therapy offer valuable active ingredients.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. The invention will be explained in more detail below by means of exemplary embodiments.

Cells and cell culture

Es wurden Hühnerknochenmarkzellen von 3 bis 10 Tage alten SPAFAS-Hühnern präpariert und die Zellen kultiviert. Dazu wurden die Knochenmarkzellen 2 bis 4 Stunden in Standard- Nährmedium, bestehend aus DMEM, 8% fötalem Kälberserum, 2% Hühnerserum, 20 mM HEPES (pH 7,3) sowie 100 Einheiten Penicillin/Streptomycin, Standard-Nährmedium gezüchtet. Anschließend wurden die nicht adhärenten Zellen aufbereitet und zur Infektion eingesetzt und die infizierten Zellen in DMEM, 8% FCS, 5% Hühnerserum, 0,128 mg/ml Hühnertransferrin (Conalbumin), 100 ng/ml rekombinantem Hühner-Stammzellenfaktor, 20 mM HEPES (pH 7,3) sowie 100 Einheiten Penicillin/Streptomycin bei einer Zelldichte von 2 bis 3 × 106 Zellen/ml kultiviert. Chicken marrow cells from 3 to 10 day old SPAFAS chickens were prepared and cultivated the cells. To do this, the bone marrow cells were held in standard Nutrient medium consisting of DMEM, 8% fetal calf serum, 2% chicken serum, 20 mM HEPES (pH 7.3) and 100 units penicillin / streptomycin, standard nutrient medium bred. The non-adherent cells were then processed and prepared for infection used and the infected cells in DMEM, 8% FCS, 5% chicken serum, 0.128 mg / ml Chicken transferrin (conalbumin), 100 ng / ml recombinant chicken stem cell factor, 20 mM HEPES (pH 7.3) and 100 units penicillin / streptomycin with a cell density of 2 cultivated up to 3 × 106 cells / ml.

Die Hühnerembryo-Fibroblasten wurden in dem Standard-Nährmedium gezüchtet. Die Herstellung der virusproduzierenden Hühnerembryo-Fibroblasten und die Infektion der Knochenmarkzellen erfolgte nach Standardmethoden. Dabei wurden die Infektionen in Anwesenheit von 1 µg/ml rekombinantem Humaninsulin und 100 ng/ml Stammzellenfaktor durchgeführt. The chicken embryo fibroblasts were grown in the standard nutrient medium. The Production of the virus-producing chicken embryo fibroblasts and infection of the Bone marrow cells were made using standard methods. The infections were in Presence of 1 µg / ml recombinant human insulin and 100 ng / ml stem cell factor carried out.

Construction of retroviral vectors

Es wurde ein retroviraler Vektor konstruiert, der die komplette Stranglänge der TR4-cDNA abwärts entlang des CMV-Promoters enthielt. Dazu wurde Wildtyp Human-TR4 an der EcoRI-Schnittstelle von pSFCV-LE eingebaut. Die mit Hämagglutinin markierten TR4- Versionen wurden zunächst in einen Trägervektor umgewandelt, der Kodiersequenzen für drei Hämagglutinin-Epitope aufwärts entlang der Klonstellen enthielt. In der HA-ΔTR4- Aminosäure wurden die Positionen 64 bis 232, die die gesamte DNA-Bindedomäne des Human-TR4 umfassen, entfernt. Anschließend wurden an den EcoRV-EcoRI-Stellen von pSFCV-LE HA-TR4 und HA-ΔTR4 eingebaut. Rekombinante retrovirale Vektoren, die RXR und von seiner DNA-Bindedomäne befreites -ΔRXR sind bereits Stand der Technik. cDNA-Synthese und PCR A retroviral vector was constructed that encompasses the entire strand length of the TR4 cDNA contained down the CMV promoter. Wild-type Human-TR4 was used on the EcoRI interface from pSFCV-LE installed. The TR4- labeled with hemagglutinin Versions were first converted to a carrier vector, the coding sequences for contained three hemagglutinin epitopes up along the clone sites. In the HA-ΔTR4- Amino acids were positions 64 to 232 that represent the entire DNA binding domain of the Human TR4 include removed. Then at the EcoRV-EcoRI sites of pSFCV-LE HA-TR4 and HA-ΔTR4 installed. Recombinant retroviral vectors, the RXR and -ΔRXR, freed from its DNA binding domain, are already state of the art. cDNA synthesis and PCR

Die RNA-Herstellung, cDNA-Synthese und PCR-Amplifikation erfolgt nach den Standardverfahren. Dazu wurde zunächst aus 2-5 µg Gesamt-RNA unter Verwendung von 100 U M-MLV-Revertase und Random-Hexamer-Primern in einer Gesamtmenge von 20 bis 50 µl Strang-cDNA synthetisiert. Für die PCR-Amplifikation wurde ein Satz degenerierter Primer für den die DNA-Bindedomäne der nuklearen Rezeptoren kodierenden Bereich entwickelt. Diese Primer wiesen die folgenden Sequenzen auf:

NHR1: 5'-GAYRARDCNWSNGGNTDYCAYT-3';
NHR2: 5'-GAYMGNDSNWSNGGNAARCAYT-3';
NHR3: 5'-CAYTTNYKNWRNCKRCANKMNKGRCA-3';
NHR4: 5'-TGYAARNNNTTYTTYMRNMG-3'.
RNA production, cDNA synthesis and PCR amplification are carried out according to the standard procedures. For this purpose, a total of 20 to 50 μl of strand cDNA was first synthesized from 2-5 μg of total RNA using 100 U M-MLV revertase and random hexamer primers. A set of degenerate primers for the region encoding the DNA binding domain of the nuclear receptors was developed for the PCR amplification. These primers had the following sequences:

NHR1: 5'-GAYRARDCNWSNGGNTDYCAYT-3 ';
NHR2: 5'-GAYMGNDSNWSNGGNAARCAYT-3 ';
NHR3: 5'-CAYTTNYKNWRNCKRCANKMNKGRCA-3 ';
NHR4: 5'-TGYAARNNNTTYTTYMRNMG-3 '.

Die Strang-cDNA wurde zunächst 40 Zyklen einer PCR-Amplifikation unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase und mit dem folgenden Zyklusprofil unterzogen: 30 Sekunden bei 94°C, 90 Sekunden bei 37°C sowie 20 Sekunden bei 72°C. Dabei wurden die folgenden Primerkombinationen eingesetzt: Bei der ersten Reaktion NHR1 bzw. NHR2 gemeinsam mit NHR3. Das Produkt dieser Reaktion wurde im Verhältnis 1 : 300 verdünnt und als Matrix für die Reaktion mit NHR3 und NHR4 eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden gelelektrophoretisch gereinigt und in den Vektor pCRII eingebaut. Die entstandenen Klone wurden sequenziert und anschließend die Sequenzen mit dem Tool BLAST zur Identifikation funktioneller Einheiten analysiert. Die Genbank-Zugangsnummer für die Hühner-TR4 ist AF 133054. The strand cDNA was first used for 40 cycles of PCR amplification of Taq DNA polymerase and subjected to the following cycle profile: 30 seconds at 94 ° C, 90 seconds at 37 ° C and 20 seconds at 72 ° C. The following were Primer combinations used: In the first reaction NHR1 or NHR2 together with NHR 3. The product of this reaction was diluted 1: 300 and used as a matrix for the reaction with NHR3 and NHR4 is used. The PCR products were purified by gel electrophoresis and incorporated into the vector pCRII. The resulting clones were sequenced and then the sequences with the BLAST tool for identification functional units analyzed. The Genbank accession number for the Chicken TR4 is AF 133054.

RNA analysis

Die RNA wurde mit Standardverfahren aus Gewebe und den folgenden Zellen isoliert:
Humanzellen: K562 (Erythroid); U937, HL60 (Myeloid); Namalwa, Raji (B-Lymphoid); CEM, Jurkat (T-Lymphoid) sowie HepG2 (Leber). Maus: MEL, E31 (Erythroid); WEHI-3, RAW (Myeloid); A20 (B-Lymphoid) sowie NIH3T3 (Fibroblast). Huhn: DT40 (B- Lymphoid); MSB-1 (T-Lymphoid) sowie v-reIER-umgewandelte Progenitoren und dendritische Zellen. Folgende Primärzellen wurden verwendet: Humanzellen: Erythroid- Progenitoren, periphere Blut-T-Zellen und Monozyten; Mauszellen: dendritische Zellen; Hühnerzellen: SCF- und STED-Erythroblasten. The RNA was isolated from tissue and the following cells using standard methods:
Human cells: K562 (erythroid); U937, HL60 (myeloid); Namalwa, Raji (B lymphoid); CEM, Jurkat (T-lymphoid) and HepG2 (liver). Mouse: MEL, E31 (erythroid); WEHI-3, RAW (myeloid); A20 (B lymphoid) and NIH3T3 (fibroblast). Chicken: DT40 (B lymphoid); MSB-1 (T-lymphoid) as well as v-REIER-converted progenitors and dendritic cells. The following primary cells were used: human cells: erythroid progenitors, peripheral blood T cells and monocytes; Mouse cells: dendritic cells; Chicken cells: SCF and STED erythroblasts.

Es wurden jeweils 15 µg RNA per Northem-Blot analysiert. Dazu wurden die Filter mit ³²P- markierten Human- oder Hühner-TR4-spezifischen Sonden hybridisiert, mäßig intensiv gewaschen und fotografiert. 15 µg RNA were analyzed by Northem blot. For this purpose, the filters were hybridized with ³² P-labeled human or chicken TR4-specific probes, washed moderately intensively and photographed.

Flow cytometry

Für die Durchflusszytometrie wurden Zellen gewonnen, mit PBS (1% BSA) gewaschen und mit Primär-Antikörpern (1 h) inkubiert. Dazu wurden die folgenden monoklonalen Antikörper eingesetzt: MC47-83, MCS1-2, MC₂₂-3; Kl, 2G11; JS8 und JS4, CD3, CD4 und CD8; MEP17, MEP21, MEP26 und EOS47; DM-GRASP (BEN1); HEM-CAM-Antikörper; CD44 (AV6). Anschließend wurden die Zellen eine Stunde mit FITCkonjugiertem Antimaus-IgG inkubiert, gewaschen und in PBS (1% BSA, 2 µg/ml Propidiumjodid) aufgeschlämmt, um die lebensfähigen Zellen austreten zu lassen. Diese Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Cells were obtained for flow cytometry, washed with PBS (1% BSA) and incubated with primary antibodies (1 h). The following monoclonal antibodies were used: MC47-83, MCS1-2, MC ₂₂ -3; Kl, 2G11; JS8 and JS4, CD3, CD4 and CD8; MEP17, MEP21, MEP26 and EOS47; DM-GRASP (BEN1); HEM-CAM antibody; CD44 (AV6). The cells were then incubated with FITC-conjugated anti-mouse IgG for one hour, washed and slurried in PBS (1% BSA, 2 µg / ml propidium iodide) to allow the viable cells to emerge. These cells were analyzed using flow cytometry.

Western blot

Die gesamten Zellextrakte wurden auf einem 10-prozentigen SDS-PAGE-Gel aufbereitet und auf Nitrozellulose-Membranen geblottet. Es wurden dabei die folgenden Antikörper eingesetzt: Anti-Hämagglutinin 12CA5, Anti-CEBPβ, Anti-Mim-I. Anschließend wurden die Blots gewaschen und mit dem entsprechenden Sekundär-Antikörper 45 min lang in PBS (5% fettfreies Milchpulver) bei Raumtemperatur inkubiert, entwickelt und fotografiert. The entire cell extracts were prepared on a 10 percent SDS-PAGE gel and blotted on nitrocellulose membranes. The following antibodies were found used: anti-hemagglutinin 12CA5, anti-CEBPβ, anti-Mim-I. Then the Blots washed and with the appropriate secondary antibody in PBS (5% fat-free milk powder) incubated at room temperature, developed and photographed.

immunofluorescence

Die, die TR4-Versionen enthaltenden Hühnerembryo-Fibroblasten wurden wie oben kultiviert und mit Trypsin versetzt. Anschließend wurde ihnen die Möglichkeit gegeben, sich an Glasträgern anzuhaften (1 h, 37°C). Die Zellen wurden gewaschen und mit PBS (3,7% Paraformaldehyd) für 15 Minuten fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen mit PBS (0,5% NP-40) durchlässig gemacht (1 S min), mit 0,5-prozentigem thermisch inaktiviertem FCS in PBS für 30 Minuten inkubiert, um mögliche unspezifische Bindungen zu blockieren, und 1 h lang einer Reaktion mit Anti-Hämagglutinin 12CA5, gefolgt von einer Reaktion mit FITCkonjugiertem Antimaus-IgG (I h) unterzogen. Des Weiteren wurden die Proben mit TRITCmarkiertem Phalloidin auf Actin angefärbt. Zum Färben der Zellkerne wurde DAPI (0,5 mg/ml) verwendet. Die Proben wurden mit PBS gewaschen und in Mowiol 4.88 mit einem Gehalt von 50 mg/ml DABCO als Bleichschutzmittel fixiert. Sämtliche Inkubationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. The chicken embryo fibroblasts containing the TR4 versions were cultured as above and mixed with trypsin. Then they were given the opportunity to join Adhere to glass slides (1 h, 37 ° C). The cells were washed and washed with PBS (3.7% Paraformaldehyde) fixed for 15 minutes. After fixation, the cells were washed with PBS (0.5% NP-40) made permeable (1 S min), with 0.5 percent thermally inactivated FCS in PBS incubated for 30 minutes to block possible nonspecific bindings and 1 h a reaction with anti-hemagglutinin 12CA5 followed by a reaction with Subjected to FITC-conjugated anti-mouse IgG (I h). Furthermore, the samples were included TRITC-labeled phalloidin stained for actin. DAPI (0.5 mg / ml) was used to stain the cell nuclei. used. The samples were washed with PBS and in Mowiol 4.88 with a Content of 50 mg / ml DABCO fixed as bleach protection. All incubations were made performed at room temperature.

Protein purification and sequencing

Es wurden die mit Coomassie-Blau gefärbten Proteinbanden entfernt und im Gel mit Trypsin aufgeschlossen. Mit Hilfe der reversed phase HPLC (µRPC C2/ C18 SC 2.1/10-Säule) wurden Trypsinpeptidkarten erstellt. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 100 µl/min bei 25°C unter Anwendung eines linearen Acetonitril-Gradienten in 0,1% Trifluoressigsäure. Die interessierenden Peptide wurden auf eine mit Biobrene beschichtete Glasfilterfaser eines Procise-Sequenators aufgetragen. Die anschließende Sequenzierung erfolgte mit Hilfe von Standardprotokollen. The protein bands stained with Coomassie blue were removed and in the gel with trypsin open minded. Using the reversed phase HPLC (µRPC C2 / C18 SC 2.1 / 10 column) trypsin peptide maps were created. The flow rate was 100 µl / min at 25 ° C using a linear acetonitrile gradient in 0.1% trifluoroacetic acid. The Peptides of interest were placed on a glass filter fiber coated with Biobrene Procise sequencers applied. The subsequent sequencing was carried out with the help of Standard protocols.

Gangs shift assays

Die Hühnerembryo-Fibroblasten wurden in einer Pufferlösung aus 20 mM Tris pH 7,5, 2 mM DTT, 20% Glyzerol sowie 400 mM KCl (1 h auf Eis) aufgelöst. Die vollständigen Zellextrakte (5-10 µg) wurden 15 Minuten auf Eis mit einem ³²P-markierten Oligonukleotid inkubiert, das die DR1-HRE-Bindungsstelle
5'-GGGGATCCGGCAGAGGTCAAAGGTCAAACGT-3'
enthielt. Als nicht spezifisches Konkurrenzreagens wurde Poly-dI-dC (1 µg pro Reaktion) zugegeben. Für Konkurrenzexperimente wurde eine mutierte Version der DR1-HRE-Stelle
5'-GGGGATCCGGCAGTGGACAATGGACAAACGT-3'
eingesetzt. Die Bindungsreaktionen wurden auf 5-prozentigem Polyacrylamidgel in 0,25x TBE separiert. The chicken embryo fibroblasts were dissolved in a buffer solution of 20 mM Tris pH 7.5, 2 mM DTT, 20% glycerol and 400 mM KCl (1 h on ice). The complete cell extracts (5-10 µg) were incubated for 15 minutes on ice with a ³² P-labeled oligonucleotide that contains the DR1-HRE binding site
5'-GGGGATCCGGCAGAGGTCAAAGGTCAAACGT-3 '
contained. Poly-dI-dC (1 µg per reaction) was added as a non-specific competitor. A mutated version of the DR1-HRE site was used for competition experiments
5'-GGGGATCCGGCAGTGGACAATGGACAAACGT-3 '
used. The binding reactions were separated on 5 percent polyacrylamide gel in 0.25x TBE.

Transient transfections

Mittels Kalziumphosphatfällung wurden die Hühnerembryo-Fibroblasten vorübergehend mit retroviralen Expressionsvektoren, die TR4, HA-TR4 bzw. HA-ΔTR4 enthielten, in Kombination mit eukaryotischen Expressionsvektoren, die RXR in pSG5 trugen, sowie einem Luziferasereporter mit Ratten-CRBPII-RXRE transfiziert. Um die Transfektionseffektivität zu normalisieren, wurden weiterhin RS V-β-Galactose bzw. pCH I 10-Plasmide kotransfziert. Die transfizierten Zellen wurden in einem Standard-Nährmedium gezüchtet, das weitestgehend aus Retinoiden entzogenes FCS und Hühnerserum enthielt. Es wurde 9cRA (10^-6 M) hinzugefügt. Achtundvierzig Stunden später wurden die Zellextrakte präpariert und hinsichtlich ihrer Luziferase- sowie β-Galactosidase-Aktivität analysiert. Zur Untersuchung der β-Galactosidase-Aktivität wurden die Luziferasewerte normalisiert. The chicken embryo fibroblasts were transiently transfected by means of calcium phosphate precipitation with retroviral expression vectors which contained TR4, HA-TR4 and HA-ΔTR4, in combination with eukaryotic expression vectors which carried RXR in pSG5, and a luciferase reporter with rat CRBPII-RXRE. In order to normalize the transfection effectiveness, RS V-β-galactose and pCH I 10 plasmids were also cotransfected. The transfected cells were grown in a standard nutrient medium containing FCS and chicken serum largely extracted from retinoids. 9cRA (10 ^-6 M) was added. Forty-eight hours later, the cell extracts were prepared and analyzed for their luciferase and β-galactosidase activity. Luciferase levels were normalized to study beta-galactosidase activity.

Es zeigen die Abbildungen: The illustrations show:

Fig. 1. Hematopoietic cells and tissues have TR4

Die Gesamt-RNA verschiedener Zelltypen und Gewebe von Menschen (A), Mäusen (B) und Hühnern (C) wurde per Northern-Blot auf TR4-Expression analysiert. TR4-spezifische Transkripte sind gekennzeichnet (Pfeilspitze und Stern). Zum Nachweis der RNA-Belastung ist mit Methylenblau gefärbte 28S-Ribosomen-RNA dargestellt. Erbls: Erythroblasten, DC: dendritische Zellen (Dendritic Cells), DCprog.: DC-Progenitoren (DC Progenitors), SCF und STED: SCF- bzw. SCF/TGFa-abhängige Erythroblasten. The total RNA of different cell types and tissues from humans (A), mice (B) and Chickens (C) were analyzed for TR4 expression by Northern blot. TR4-specific Transcripts are marked (arrowhead and star). To detect the RNA load is shown with 28S ribosome RNA stained with methylene blue. Erbls: erythroblasts, DC: dendritic cells (Dendritic Cells), DCprog .: DC progenitors (DC Progenitors), SCF and STED: SCF- or SCF / TGFa-dependent erythroblasts.

Fig. 2. TR4 promotes the proliferation of bone marrow cells in vitro

Wachstumskurven von mit HA-TR4, HA-ΔTR4, RXR und ΔRXR infizierten Knochenmarkzellen wie angegeben. Kontrollzellen mit leerem Neovirus. Die Zellen wurden in einem Medium aus 100 ng/ml SCR gezüchtet. Dabei wurde täglich die Gesamtzellenzahl ermittelt. Kleines Bild: HA-TR4- und HA-ΔTR4-Zellen weisen gemäß Nachweis per Western-Blot und Anti-Hämagglutinin-spezifischem Antikörper wirksam TR4-Proteine auf. Growth curves of those infected with HA-TR4, HA-ΔTR4, RXR and ΔRXR Bone marrow cells as indicated. Control cells with empty neovirus. The cells were grown in a medium of 100 ng / ml SCR. The total number of cells was daily determined. Small picture: HA-TR4 and HA-ΔTR4 cells have been identified by Western blot and anti-hemagglutinin-specific antibodies are effective on TR4 proteins.

Fig. 3. DNA binding activity and transcriptional activity of HA-TR4 and HA-ΔTR4

A) The DNA binding activity of TR4 proteins was analyzed by band shift assays using complete cell extracts from the stably transfected chicken embryo fibroblasts shown in Fig. 3B. A 32P-labeled oligonucleotide containing a DR1 motif was used for this. The chicken embryo fibroblasts (control) and neoresistant chicken embryo fibroblasts with empty vectors (neoR) showed some endogenous binding activity (lanes 2 and 3, respectively). The HA-TR4 extracts showed a predominant band (arrowhead in the left field, lanes 4 and 6), which was missing in the HA-ΔTR4 samples (lane 7). TR4 favored a slightly faster complex migration compared to HA-TR4 (lanes 8 and 11). When anti-HA-specific antibody (α-HA) was added, the HA-TR4 band was supershifted (indicated by an asterisk), whereas HA-ΔTR4 and TR4 remained unchanged. Lane 1: no extract (none). Lane 5: Competition with a 100-fold excess of unlabeled oligonucleotides. Open arrowheads: background bands.
B) HA-TR4 and HA-ΔTR4 were analyzed for their transcriptional activity by means of transient co-transfection experiments in chicken embryo fibroblasts. The luciferase reporter construct contains rat CRBPII-RXRE. In the transfection reactions, 500 ng of both reporter and pSGS-RXR plasmids (all samples) and increasing amounts (5, 10, 50, 100 and 500 ng) of retrovirus vectors with HA-TR4 and HA-ΔTR4 were used as indicated , Luciferase activity was normalized by cotransfection of a β-galactosidase reporter plasmid. As indicated, 9cRA was added to the solution at a final concentration of 10 -6 M (+).

Fig. 4. Differentiation of TR4 and RXR cells in response to different ones stimuli

Die Differenzierung der HA-TR4-, HA-ΔTR4-, RXR- und ΔRXR-Zellen am 12. Tag in der Kultur wurde mit 9cRA (1 × 10^-6 M) oder per TPA-Behandlung (1 µg/ml) über 48 h ausgelöst. Die differenzierten adhärenten Zellen wurden anschließend mit einem histologischen Farbstoff (DiffQuik) gefärbt. Zur Kontrolle wurde Hühner-Myelomonozyten- Wachstumsfaktor (40 ng/ml) zugegeben. Da mit leeren Neoviren infizierte Knochenmarkzellen keinen Auswuchs aufwiesen (Abb. 5), konnten die mit leeren Vektoren infizierten Zellen nicht in die Kontrolle eingeschlossen werden. Die Dichte der adhärenten Zellen wurde per NIH-Bildsoftware ermittelt. Dabei wurden die Werte der mit TPA aufbereiteten Zellen willkürlich mit 100 festgelegt. Differentiation of the HA-TR4, HA-ΔTR4, RXR and ΔRXR cells on the 12th day in the culture was carried out with 9cRA (1 × 10 ^-6 M) or by TPA treatment (1 μg / ml) over 48 h triggered. The differentiated adherent cells were then stained with a histological dye (DiffQuik). Chicken myelomonocyte growth factor (40ng / ml) was added as a control. Since bone marrow cells infected with empty neoviruses had no outgrowth ( Fig. 5), the cells infected with empty vectors could not be included in the control. The density of the adherent cells was determined using NIH imaging software. The values of the cells prepared with TPA were arbitrarily set to 100.

Claims

1. Agent for the treatment of leukemic diseases, containing substances that the Affect the activity of the orphan receptor TR4.

2. Composition according to claim 1, containing activators of TR4.

3. Composition according to claim 1 and 2, containing synthetic TR4 agonists.

4. Composition according to claim 1, containing inhibitors of TR4.

5. Composition according to claim 1 and 4, containing synthetic T4 antagonists.

6. Use of the agent according to claims 1-5 for the treatment of myeloid leukemia.

7. Means for therapy of myeloid leukemia, characterized in that it is called TR4 Contains regulator of myeloid development.