DE10143606A1

DE10143606A1 - Conservation of animal or human tissue for transplantation, e.g. kidney, heart, pancreas or liver, involves extracorporeal treatment with solution containing microbial hyaluronate-lyase or enzymatically active fragment

Info

Publication number: DE10143606A1
Application number: DE2001143606
Authority: DE
Inventors: Peter-Juergen Mueller; Albert Haertl; Joerg-Hermann Ozegowski; Norbert Presselt
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Priority date: 2001-09-06
Filing date: 2001-09-06
Publication date: 2003-03-27
Also published as: WO2003022047A1

Abstract

Conservation of animal and human tissue intended for transplantation comprises extracorporeal treatment with solution containing microbial hyaluronate-lyase (I) or an enzymatically active fragment (IA) of (I).

Description

Das Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung ist die Transplantationsmedizin und präventive Maßnahmen bzw. Präkonditionierung, durch die Pathomechanismen eingeschränkt werden, welche die Funktionsfähigkeit der transplantierten Organe verringern The field of application of the present invention is transplantation medicine and preventive measures or preconditioning, through the pathomechanisms be restricted, which affects the functionality of the transplanted organs reduce

Die Erfindung betrifft eine spezielle Konservierung der für eine Transplantation vorgesehenen Gewebe, insbesondere Organe wie Herz, Leber, Lunge und Bauchspeicheldrüse. The invention relates to a special preservation for a transplant provided tissues, especially organs such as the heart, liver, lungs and Pancreas.

Die Häufigkeit von primärem Organversagen (5-15%) bzw. Organdysfunktion (ca. 30%) wie auch anderer klinisch relevanter Komplikationen nach Transplantation ist überwiegend durch die sogenannten Ischämie-Reperfusionsschäden (IRS) bedingt. Diese gefährden den Erfolg chirurgischer und internistischer Eingriffe. Trotz etablierter Konservierungsverfahren zeigen die für die Transplantation vorgesehenen Organe und Gewebe häufig einen hohen interstitiellen Druck, der seinerseits nach erfolgreicher Transplantation zu Zirkulationsstörung des Transplantates führen kann. Diese Zirkulationsstörungen können sekundär zu Zellnekrosen und letzten Endes auch zur Organabstoßung führen. Hinzu kommen weitere Ursachen, die die Akzeptanz des Transplantates beeinflussen, insbesondere auch die immunologische Fragestellung. In der Praxis werden die Transplantate nach Entnahme aus dem entweder gekühlt aufbewahrt oder mit speziellen Konservierungslösungen perfundiert. Die gekühlte Aufbewahrung der Transplantate ist aber generell ungünstiger als die Perfusion. Der Apparateaufwand und die Perfusionslösungen sind jedoch kostenintensiv. Handelsübliche Perfusionslösungen sind das glucosefreie Eurocollin, die relativ viskose UW (University of Wisconsin solution)- Lösung, welche sehr häufig für Leber-, Nieren- und Pankreastransplantationen eingesetzt wird. HTK und Celsior werden für für die Konservierung von Herzen eingesetzt (Muhlbacher F, Langer F, Mittermayer C. Preservation solutions for transplantation. Transpl. Int. 1996, 442-446). The frequency of primary organ failure (5-15%) or organ dysfunction (approx. 30%) as well as other clinically relevant complications after transplantation is prevalent due to the so-called ischemia-reperfusion damage (IRS). These endanger the Success of surgical and internal interventions. Despite established Preservation procedures show the organs and organs intended for transplantation Tissue often has high interstitial pressure, which in turn is more successful Transplantation can lead to graft circulation disorder. This Circulatory disorders can be secondary to cell necrosis and ultimately Lead organ rejection. There are also other causes that affect the acceptance of the Transplant affect, especially the immunological question. In the In practice, the grafts are either kept refrigerated after removal from the or perfused with special preservation solutions. The refrigerated storage of the However, grafts are generally less favorable than perfusion. The expenditure on equipment and the However, perfusion solutions are costly. Commercially available perfusion solutions are the glucose-free Eurocollin, the relatively viscous UW (University of Wisconsin solution) - Solution which is used very often for liver, kidney and pancreas transplants becomes. HTK and Celsior are used for heart preservation (Muhlbacher F, Langer F, Mittermayer C. Preservation solutions for transplantation. Transpl. Int. 1996, 442-446).

Bekannt ist, daß die Perfusion von Wirtstieren nach der Transplantation mit dem Enzym Hyaluronidase den interstitiellen Druck erniedrigt. (Johnsson, et al. 1999. Hyaluronidase ameliorates rejection-induced edema. Transplant Int. 1999; 12, 235, Johnsson et al. 2000, Monitoring of intragraft pressure of rejecting organs. Transplantation 70, 1575-1580, Johnsson C, Hallgren R, Lindbom LO, Tufveson G. Edema treatment during cardiac allograft rejection. J Heart Lung Transplant 1999 18, 1238-1242) It is known that the perfusion of host animals after the transplantation with the enzyme Hyaluronidase lowers interstitial pressure. (Johnsson, et al. 1999. Hyaluronidase ameliorates rejection-induced edema. Transplant int. 1999; 12, 235, Johnsson et al. 2000 Monitoring of intragraft pressure of rejecting organs. Transplantation 70, 1575-1580, Johnsson C, Hallgren R, Lindbom LO, Tufveson G. Edema treatment during cardiac allograft rejection. J Heart Lung Transplant 1999 18, 1238-1242)

Auch die Behandlung der isolierten Organe mit Hyaluronidase unter Verwendung handelsüblicher Konservierungslösungen (Rao et al. 1996, Hyaluronate level in donor organ washout effluents: a simple and predictive parameter of graft viability. Liver 16, 48-54 und Fischer JH, Jeschkeit S. Minimal amounts of hyaluronidase in HTK or UW solution substantially improve the recovery of preserved hearts. Transpl Int. 1996; 9 Suppl 1: S442-6) ergaben, dass die Transplantate nach der Behandlung mit Hyaluronidase eine signifikant bessere Einwachstendenz aufweisen. Also using hyaluronidase to treat the isolated organs commercially available preservation solutions (Rao et al. 1996, Hyaluronate level in donor organ washout effluents: a simple and predictive parameter of graft viability. Liver 16, 48-54 and Fischer JH, Jeschkeit S. Minimal amounts of hyaluronidase in HTK or UW solution substantially improve the recovery of preserved hearts. Transpl Int. 1996; 9 Suppl 1: S442-6) showed that the grafts after treatment with hyaluronidase a have significantly better growth tendencies.

Das dabei eingesetzte Enzym Hyaluronidase wird aus tierischem Gewebe, beispielsweise aus Rinder- oder Schafshoden gewonnen. Es besitzt glukosaminoglykanspaltende Aktivität und ist vor allem durch die Eigenschaft charakterisiert, Hyaluronsäure zu hydrolysieren. Zu den Glukosaminoglykanen gehören neben der Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Heparansulfat, diese kommen im Gewebe aller Vertebraten vor. Hyaluronsäure hat die Eigenschaft, Wasser unter Bildung viskoser, hydrokolloider Lösungen zu binden oder mit basischen Proteinen schwerlösliche Polyelektrolytkomplexe zu bilden. Sie besteht aus Glukuronsäure und azetyliertem Glukosamin, die durch β-(1-3)-glycosidische Bindungen verbunden sind. Diese Disaccharideinheiten sind wiederum miteinander durch glycosidische β-(1-4)-Bindungen verbunden. The enzyme hyaluronidase used is derived from animal tissue, for example obtained from cattle or sheep testicles. It has glucosaminoglycan-cleaving activity and is mainly characterized by the property of hydrolyzing hyaluronic acid. In addition to hyaluronic acid, chondroitin sulfate, glucosaminoglycans include Dermatan sulfate and heparan sulfate, these occur in the tissue of all vertebrates. Hyaluronic acid has the property of forming water with a viscous, hydrocolloid Bind solutions or poorly soluble with basic proteins To form polyelectrolyte complexes. It consists of glucuronic acid and acetylated Glucosamine linked by β- (1-3) glycosidic bonds. This Disaccharide units are in turn linked to one another by glycosidic β- (1-4) bonds connected.

Der Begriff Hyaluronidasen beschreibt nicht korrekt drei unterschiedlich wirkende Typen hyaluronsäurespaltender Enzyme (Ludowieg J: The mechanisms of hyaluronidases. J. Biol. Chem. 236, S. 333-339, 1961). Es sind einmal die Endohydrolasen, die die β-(1-4)- Bindungen hydrolytisch spalten. Zu ihnen gehören die Mehrzahl der Hyaluronidasen aus höheren Organismen, beispielsweise die Hyaluronidase aus Rinderhoden. Diese Hyaluronat-Glycanhydrolasen (Hyaluronoglucosaminidasen/E. C. 3.2.1.35) spalten neben den Bindungen der Hyaluronsäure in einem begrenzten Maße auch andere Glukosaminoglykane. The term hyaluronidases does not correctly describe three different types hyaluronic acid-splitting enzymes (Ludowieg J: The mechanisms of hyaluronidases. J. Biol. Chem. 236, pp. 333-339, 1961). It is the endohydrolases that produce the β- (1-4) - Splitting bonds hydrolytically. The majority of hyaluronidases belong to them higher organisms, for example hyaluronidase from bovine testicles. This Hyaluronate glycan hydrolases (hyaluronoglucosaminidases / E.C. 3.2.1.35) split alongside the hyaluronic acid bonds to a limited extent also others Glycosaminoglycans.

Die Perfusion von Transplantaten mit einer Lösung, welche mit diesem Enzymtyp hergestellte niedermolekulare Abbauprodukte der Hyaluronsäure enthielt, zeigte einen für das Überleben von experimentell transplantierter Leber und Niere fördernden Effekt (Knoflach et. al., 1999. Immunomodulatory functions of hyaluronate in the Lew-to-F344 model of chronic cardiac allograft rejection. Transplantation 1999, 67, 909). Perfusion of grafts with a solution containing this type of enzyme produced low molecular weight degradation products of hyaluronic acid showed one for the survival of experimentally transplanted liver and kidney promoting effect (Knoflach et. Al., 1999. Immunomodulatory functions of hyaluronate in the Lew-to-F344 model of chronic cardiac allograft rejection. Transplantation 1999, 67, 909).

Einen weiteren Typ stellt die Endo-β-Hyaluronoglucuronidase (E. C. 3.2.1.36) aus dem Blutegel dar, welche die β-(1-3)-Bindung hochspezifisch spaltet. Der dritte Enzymtyp, die Hyaluronatlyase (E. C. 4.2.2.1.), spaltet Hyaluronsäure in der β-(1-4)-Bindung nach einem Eliminierungsmechanismus unter Bildung einer Doppelbindung in (4-5)-Stellung an der Glukuronsäure. Es enstehen die sogenannten Hyaluronsäureuronide. Hyaluronatlyasen sind häufig mikrobieller Herkunft. Sie werden beispielsweise in Streptomyceten und in anderen Bakterien gefunden. Ihr gemeinsames Merkmal ist ihre hohe Spezifität gegenüber Hyaluronsäure. Andere Glukosaminoglykane werden in der Regel in einem vernachlässigbaren Ausmaß gespalten (Ozegowski JH, Günther E, Reichardt W: Purification and characterization of hyaluronidase from Streptococcus agalactiae. Zbl Bakt 280, S. 497-506, 1994/Ohya T, Kaneko Y: Novel hyaluronidase from Streptomyces. Biochim Biophys Acta 198, S. 607-609, 1970/Gase K, Ozegowski JH, Malke H: The Streptococcus agalactiae hylB gene encoding hyaluronate lyase - completion of the sequence and expression analysis. Biochim Biophys Acta 1398(1), S. 86-98, 1998). Another type is the endo-β-hyaluronoglucuronidase (E.C. 3.2.1.36) from the Leeches, which cleaves the β- (1-3) -binding highly specifically. The third type of enzyme, the Hyaluronate lyase (E.C. 4.2.2.1.), Cleaves hyaluronic acid in the β- (1-4) bond after one Elimination mechanism to form a double bond in the (4-5) position at the Glucuronic. The so-called hyaluronic acid uronides are formed. Are hyaluronate lyases often of microbial origin. They are found, for example, in Streptomycetes and others Bacteria found. Their common characteristic is their high specificity towards Hyaluronic acid. Other glucosaminoglycans are usually in one negligible extent split (Ozegowski JH, Günther E, Reichardt W: Purification and characterization of hyaluronidase from Streptococcus agalactiae. Zbl Bakt 280, pp. 497-506, 1994 / Ohya T, Kaneko Y: Novel hyaluronidase from Streptomyces. Biochim Biophys Acta 198, pp. 607-609, 1970 / Gase K, Ozegowski JH, Malke H: The Streptococcus agalactiae hylB gene encoding hyaluronate lyase - completion of the sequence and expression analysis. Biochim Biophys Acta 1398 (1), pp. 86-98, 1998).

Allgemein ist bekannt, dass Hyaluronidasen tierischer Herkunft, speziell die bovine testikuläre Hyaluronidase, den Schaden reduzieren, der durch einen Herzinfarkt entsteht (Repa I, Garnic JD, Hollenberg NK: Myocardial infarction treated with two lymphagogues, calcium dobesilate (CLS 2210) and hyaluronidase - a coded, placebo-controlled animal study. J Cardiovasc Pharmacol 16, S. 286-291, 1990). Hyaluronidase aus Rinderhoden hat einen förderlichen Effekt auf den kollateralen Blutfluß in das ischämische Gewebe (Askenazi J, Hillis LD, Diaz PE et al.: The effects of hyaluronidase on coronary blood flow following coronary artery occlusion in the dog. Circ Res 40, S. 566-571, 1977/Premaratne S, Watanabe BI, LaPenna WF, et al.: Effects of hyaluronidase on reducing myocardial infarct size in a baboon model of ischemia-reperfusion injury. J Surg Res 58, S. 205-210, 1995). It is generally known that hyaluronidases of animal origin, especially the bovine testicular hyaluronidase, reduce the damage caused by a heart attack (Repa I, Garnic JD, Hollenberg NK: Myocardial infarction treated with two lymphagogues, calcium dobesilate (CLS 2210) and hyaluronidase - a coded, placebo-controlled animal study. J Cardiovasc Pharmacol 16, pp. 286-291, 1990). Bovine testicular hyaluronidase a beneficial effect on the collateral blood flow into the ischemic tissue (Askenazi J, Hillis LD, Diaz PE et al .: The effects of hyaluronidase on coronary blood flow following coronary artery occlusion in the dog. Circ Res 40, pp. 566-571, 1977 / Premaratne S, Watanabe BI, LaPenna WF, et al .: Effects of hyaluronidase on reducing myocardial infarct size in a baboon model of ischemia-reperfusion injury. J Surg Res 58, pp. 205-210, 1995).

Es wird vermutet, daß eine Behandlung mit Hyaluronidase tierischer Herkunft die postischämische Genesung der Herzfunktion durch eine Vergrößerung des Herz-Lymph- Volumens verbessert (Yotsumoto G, Moriyama Y, Yamaoka A et al.: Experimental study of cardiac lymph dynamics and edema formation in ischemia/reperfusion injury-with reference to the effect of hyaluronidase. Angiology 49, S. 299-305, 1998). Treatment with hyaluronidase of animal origin is believed to affect the post-ischemic recovery of cardiac function by enlarging the cardiac lymphatic Volume improved (Yotsumoto G, Moriyama Y, Yamaoka A et al .: Experimental study of cardiac lymph dynamics and edema formation in ischemia / reperfusion injury-with reference to the effect of hyaluronidase. Angiology 49, pp. 299-305, 1998).

Durch die Fähigkeit der Hyaluronsäure, Wasser zu binden, trägt ihre interstitielle Akkumulation zum interstitiellen Ödem im infarzierten Herzmuskelgewebe bei. Due to the ability of hyaluronic acid to bind water, its interstitial contributes Accumulation to interstitial edema in infarcted myocardial tissue.

Interstitielle Ödeme beeinflussen wahrscheinlich auch die Funktionen der Transplantate. So werden elektromechanische Charakteristiken des Myokards aufgrund des Kontaktverlustes zwischen Muskelzellen (Reentry-Phänomene) gestört und es entstehen Tachykardien bis hin zum Kammerflimmern. Desweiteren verursachen Ödeme erhöhten extrazellulären Druck und stören die Mikrozirkulation des Myokards durch eine veränderte Herzwand-Compliance. Interstitial edema is likely to affect the functions of the Transplants. This is how electromechanical characteristics of the myocardium are based on the Loss of contact between muscle cells (reentry phenomena) disturbed and arise Tachycardia to ventricular fibrillation. Furthermore, edema causes increased extracellular pressure and disrupt the microcirculation of the myocardium due to an altered Heart wall compliance.

Durch Abbau der Hyaluronsäure begrenzt bovine testikuläre Hyaluronidase den zellulären Schaden während der myokardialen Ischämie (Waldenstrom A, Martinussen HJ, Gerdin B et al.: Accumulation of hyaluronan and tissue edema in experimental myocardial infarction. J Clin Invest 88, S. 1622-1628, 1991). By breaking down the hyaluronic acid, bovine testicular hyaluronidase limits the cellular Damage during myocardial ischemia (Waldenstrom A, Martinussen HJ, Gerdin B et al .: Accumulation of hyaluronan and tissue edema in experimental myocardial infarction. J Clin Invest 88, pp. 1622-1628, 1991).

Presselt et al. (WO 00/39290) schlagen die Behandlung atheromatöser Gefäßkrankheiten von Mensch und Tier mit Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft vor. Injektionspräparate für intravenöse und intraarterielle Applikationen werden für die Behandlung von Herzrhythmusstörungen, Atherosklerose, zerebralen Infarkten, zerebralen Thrombosen, Koronarthrombosen und kardialen Infarkten eingesetzt. Das Enzym wirkt der Entstehung atheromatöser Plaques entgegen bzw. löst diese auf. Presselt et al. (WO 00/39290) suggest the treatment of atheromatous vascular diseases of humans and animals with hyaluronate lyase of microbial origin. injectables for intravenous and intraarterial applications are used for the treatment of Irregular heartbeat, atherosclerosis, cerebral infarction, cerebral thrombosis, Coronary thrombosis and cardiac infarction are used. The enzyme works counteracts or dissolves atheromatous plaques.

Gottlieb (US 3,708,575) schlägt vor, Gefäßkrankheiten des Menschen wie Herzarrhythmien, Thrombosen, kardiale und zerebrale Infarkte mit Hyaluronidase aus Tierhoden (Molmasse 120.000 D) in hohen Dosierungen von 20.000 bis 1.000.000 IU pro Injektion zu behandeln. Eine isotonische sterile Lösung mit beispielsweise 10.000 IU/ml wird intravenös, intraarteriell oder intrathekal injiziert. Das Enzym wurde aus Rinderhoden gewonnen. Irrtümlicherweise wird die bovine testikuläre Hyaluronidase als Glucuronoglycosaminoglycan-Hyaluronatlyase geführt, obwohl aus der Erfindungsbeschreibung eindeutig hervorgeht, daß es sich um ein Enzym aus Rinderhoden handelt. Eine Hyaluronidase mit der Spaltungsspezifität einer Lyase ist jedoch in Tierhoden nicht nachweisbar. Aus der Erfindungsbeschreibung geht hervor, daß es sich bei dem Enzym eindeutig um die Anwendung einer Hyaluronidase aus Tierhoden handelt. Gottlieb (US 3,708,575) suggests how to treat vascular diseases in humans Cardiac arrhythmias, thromboses, cardiac and cerebral infarcts with hyaluronidase Animal testicles (molar mass 120,000 D) in high doses of 20,000 to 1,000,000 IU per Treat injection. An isotonic sterile solution, for example 10,000 IU / ml is injected intravenously, intraarterially or intrathecally. The enzyme was made from bovine testicles won. The bovine testicular hyaluronidase is mistakenly called Glucuronoglycosaminoglycan hyaluronate lyase resulted, although from the Description of the invention clearly shows that it is an enzyme from bovine testicles is. A hyaluronidase with the cleavage specificity of a lyase is however in Animal testicles undetectable. From the description of the invention it appears that it is the enzyme is clearly the application of a hyaluronidase from animal testicles.

Eine dem Enzym zugeschriebene Esteraseaktivität deutet ebenfalls auf eine Hyaluronidase und nicht auf eine Hyaluronatlyase hin. Auch bezieht sich die angewendete Methode zur Messung der spezifischen Aktivität auf eine Vorschrift zur Bestimmung von Hyaluronidasen. Esterase activity attributed to the enzyme also indicates hyaluronidase and not for a hyaluronic acid lyase. The method used also relates to Measurement of the specific activity on a regulation for the determination of Hyaluronidases.

Der Einsatz testikulärer Hyaluronidasen ist aus Gründen der relativ geringen und bei mehrfacher Anwendung sehr schnell nachlassenden Wirkung sowie aufgrund der zunehmenden Gefahr der Übertragung von infektiösem Material eingeschränkt. Darüber hinaus erfordert die Reinigung der Hyaluronidasen aus Gewebemazeraten mit einem naturgemäß hohen Anteil an Fremdproteinen und lipoiden Verbindungen einen hohen Reinigungsaufwand. Es gibt außerdem Hinweise, daß die relativ geringe Wirkung der Hyaluronidase aus Rindertestes auf die ausgeprägte Inhibition des Enzyms durch sulfatierte Glukosaminoglykane, wie Heparin oder heparinähnliche Glukosaminoglykane, die in der extrazellulären Matrix von Säugern vorhanden sind, zurückzuführen ist. The use of testicular hyaluronidases is for reasons of the relatively small and multiple use very quickly diminishing effect and due to the increasing risk of transferring infectious material. About that furthermore, the purification of the hyaluronidases from tissue macerates requires using a naturally a high proportion of foreign proteins and lipoid compounds Cleaning effort. There are also indications that the relatively low effect of Hyaluronidase from cattle tests for the pronounced inhibition of the enzyme by sulfated glucosaminoglycans, such as heparin or heparin-like glucosaminoglycans, that are present in the extracellular matrix of mammals.

Die Erfindung hat zum Ziel, eine spezielle extrakorporale Behandlung von Transplantaten nach der Entnahme bzw. vor der Transplantation (isoliertes Transplantat) zu finden, durch welche eine komplikationsarme bzw. erfolgreiche Transplantation gefördert wird. Diese Maßnahme soll zusätzlich oder zusammen mit den herkömmlichen Konservierungsmaßnahmen angewendet werden. The aim of the invention is a special extracorporeal treatment of grafts after removal or before the transplant (isolated graft) which promotes a low-complication or successful transplant. This Measure should be in addition to or together with the conventional Preservation measures are applied.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, einen Wirkstoff für die Konservierung aufzufinden, der die angeführten Nachteile der testikulären Hyaluronidase bzw. von Hyaluronidasen tierischer Herkunft nicht aufweist und darüber hinaus auf einfachem Weg in ausreichenden Mengen herstellbar ist. Es soll bei Anwendung des Wirkstoffs auf Grund seiner nicht-tierischen Herkunft keine Gefährdung durch eventuelle Infektionen entstehen. The invention is based on the object of an active ingredient for preservation to find out the disadvantages of testicular hyaluronidase or Does not have hyaluronidases of animal origin and moreover in a simple way can be produced in sufficient quantities. It is said to apply when using the active ingredient its non-animal origin does not pose any risk from possible infections.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass mikrobielle Hyaluronatlyasen bzw. ihre enzymatisch aktiven Fragmente, die nach ihrem Spaltmechanismus als Lyasen der Enzymklassifikationsnummer E. C. 4.2.2.1 zugerechnet werden, insbesondere die durch den Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, bevorzugt der Arten Streptococcus agalactiae und besonders aus Streptococcus equisimilis, bei Fermentation in die Kulturflüssigkeit exkretierte Hyaluronatlyasen, unter anderem zu einer intensiven Reduktion des interstitiellen Druckes und einer schnellen Wiederherstellung der Funktion des Transplantates nach durchgeführter Transplantation führen. Die erfindungsgemäße Konservierung der isolierten Transplantate vor der Transplantation mit mikrobieller Hyaluronatlyase mit der Zielstellung, eine komplikationsfreies Einwachsen und schnellen Funktionsaufnahme des Transplantates bei möglichst geringer Schädigung zu erreichen, wurde bisher noch nicht beschrieben. Die extrakorporale Anwendung von Hyaluronatlyase am isoliertem Transplantat unterscheidet sich dadurch von allen anderen Anwendungen der Hyaluronatlyase, die zur Prophylaxe oder Therapie an lebenden Menschen und Tieren bisher vorgeschlagen wurde. Sie führt zu einem wesentlich verbesserten Transplationsergebnis. According to the invention it was found that microbial hyaluronate lyases or their enzymatically active fragments, which according to their cleavage mechanism as lyases Enzyme classification number E.C. 4.2.2.1 are attributed, in particular those by the microorganism of the genus Streptococcus, preferably the species Streptococcus agalactiae and especially from Streptococcus equisimilis, during fermentation in the Culture fluid excreted hyaluronate lyases, including an intense one Reduction of interstitial pressure and quick restoration of function of the graft after the transplant has been carried out. The invention Preservation of the isolated grafts before the transplantation with microbial Hyaluronate lyase with the goal of complication-free waxing and rapid To achieve functional start of the transplant with as little damage as possible, has not been described yet. The extracorporeal use of hyaluronate lyase on the isolated graft differs from all other applications of the Hyaluronate lyase, used for prophylaxis or therapy in living humans and animals has been proposed so far. It leads to a much improved Transplationsergebnis.

Die Erfindung betrifft dementsprechend ein Verfahren zur Konservierung von zur Transplantation vorgesehenen tierischen und menschlichen Geweben, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass besagte Gewebe extrakorporal mit Lösungen enthaltend mikrobielle Hyaluronatlyase oder ein enzymatisch aktives Fragment davon behandelt werden. The invention accordingly relates to a method for the preservation of Transplantation provided animal and human tissues, which thereby is characterized in that said tissue containing extracorporeal with solutions treated microbial hyaluronate lyase or an enzymatically active fragment thereof become.

Der enzymatische Wirkstoff spaltet, anders als testikuläre Hyaluronidasen bzw. andere Hyaluronidasen tierischer Herkunft, Hyaluronsäure nach einem Eliminierungsmechanismus unter Bildung von ungesättigten Spaltprodukten, den Hyaluronsäure-Uroniden. Im Gegensatz dazu spalten Hyaluronidasen tierischer Herkunft (E. C. 3.2.1.35/36) die Hyaluronsäure hydrolytisch bei Anlagerung von Wasser unter Bildung gesättigter Spaltprodukte. Die Hyaluronatlyasen unterscheiden sich von tierischen Hyaluronidasen weiterhin durch die Aminosäuresequenzen sowie die Isoelektrischen Punkte (IP). The enzymatic active ingredient cleaves, unlike testicular hyaluronidases or others Hyaluronidases of animal origin, hyaluronic acid after one Elimination mechanism with formation of unsaturated cleavage products, the Hyaluronic acid Uroniden. In contrast, hyaluronidases of animal origin split (E.C. 3.2.1.35/36) the hyaluronic acid hydrolytically when water is added under Formation of saturated fission products. The hyaluronate lyases differ from animal ones Hyaluronidases continue through the amino acid sequences as well as the isoelectric Points (IP).

Zum fördernden Effekt der erfindungsgemäßen Konservierung kann vermutet werden, dass sie durch eine Kombination von spezifischen Wirkungen der Hyaluronatlyase hervorgerufen werden. Möglicherweise führt der verbesserte Lymphabfluß als auch ein verbesserter Immunstatus der transplantierten Organe oder Gewebe zu einer Reduktion interstitieller Ödeme und Verhinderung der Okklusion bzw. den Kollaps der Lymphgefäße. Der Lymphfluß im ischämischen Gewebe wird aufrechterhalten und so die Entwicklung von Nekrosen und Narbenbildung gehemmt. Der Abbau von dickeren Schichten von gequollener Hyaluronsäure fördert das Zusammenwachsen der Organ- bzw. Gewebegrenzflächen. With regard to the promoting effect of the preservation according to the invention, it can be assumed that it through a combination of specific effects of hyaluronate lyase are caused. Possibly the improved lymphatic drain introduces as well improved immune status of the transplanted organs or tissues to a reduction interstitial edema and prevention of occlusion or collapse of the lymphatic vessels. The lymph flow in the ischemic tissue is maintained and so the development inhibited by necrosis and scarring. Mining thicker layers of swollen hyaluronic acid promotes the coalescence of the organ or Tissue interfaces.

Möglicherweise beeinflußt die Hyaluratlyase über ihre spezifischen Spaltprodukte, den ungesättigten Hyaluronsäure-Uroniden, auch die Bindungsaktivität der Rezeptoren CD44 und Rhamm der Blut-, Lymph- und besonders der Immunzellen, so dass möglicherweise die Gefahr der Abstoßung verringert wird. The hyalurate lyase may influence the specific cleavage products, the unsaturated hyaluronic acid uronides, also the binding activity of the CD44 receptors and ramming of the blood, lymph and especially immune cells, so possibly the risk of rejection is reduced.

Die unter ihrer Einwirkung der Hyaluronatlyase gebildeten Spaltprodukte der Hyaluronsäure, die ungesättigten Hyaluronsäueuroniden, besitzen außerdem eine intensive angiogene und radikalfangende Wirkung. The cleavage products of the. Formed under the influence of the hyaluronate lyase Hyaluronic acid, the unsaturated hyaluronic acid neurons, also have an intense angiogenic and radical-catching effect.

Es existieren im Gewebe bzw. Organen auch keine Inhibitoren, die die Aktivität der mikrobiellen Hyaluronatlyase hemmen könnten. Bekannt ist, dass im Gegensatz zur Aktivität der testikulären Hyaluronidase die Aktivität von Hyaluronatlyase aus Streptococcus equisimilis durch sulfatierte Glukosaminoglykane, wie beispielsweise der sulfatierten Hyaluronsäure oder Heparin, kaum inhibiert wird. There are also no inhibitors in the tissue or organs that inhibit the activity of could inhibit microbial hyaluronate lyase. It is known that, in contrast to the Activity of testicular hyaluronidase the activity of hyaluronate lyase Streptococcus equisimilis by sulfated glucosaminoglycans, such as that sulfated hyaluronic acid or heparin, is hardly inhibited.

Die mikrobiellen Hyaluronatlyasen werden für ihre erfinderische Verwendung in Form von galenischen Formulierungen eingesetzt. Sie enthalten als Injektionspräparat beispielsweise eine isotonische wässrige Lösung einer hochgereinigten mikrobiellen Hyaluronatlyase mit Konzentrationen zwischen 10 und 250.000 IU/ml und in Injektionspräparaten übliche Hilfsstoffe. Das Enzymprotein der Hyaluronatlyase wird vorteilhaft in Form eines lagerstabilen Feststoffes, der in der Regel stabilisierende Zusätze enthält, beispielsweise in Glasampullen abgefüllt, eingesetzt. Besonders vorteilhaft ist der Einsatz von gefriergetrocknetem Wirkstoff. Als stabilisierende Zusätze können beispielsweise Natriumchlorid, Glukose, Magnesiumsalze, Polyvinylpyrrolidin, Aminosäuren, Albumine und deren Hydrolysate oder Gelatine und deren Hydrolysate eingesetzt werden. The microbial hyaluronate lyases are in shape for their inventive use of galenic formulations. They contain as an injection for example an isotonic aqueous solution of a highly purified microbial Hyaluronate lyase with concentrations between 10 and 250,000 IU / ml and in Injection products are common excipients. The enzyme protein of hyaluronate lyase is advantageous in the form of a storage-stable solid, which generally contains stabilizing additives contains, for example filled in glass ampoules, used. The is particularly advantageous Use of freeze-dried active ingredient. Can be used as stabilizing additives for example sodium chloride, glucose, magnesium salts, polyvinylpyrrolidine, Amino acids, albumins and their hydrolyzates or gelatin and their hydrolyzates be used.

Die Enzymaktivtät einer Ampulle liegt nach Auffüllen mit physiologischer Kochsalzlösung zwischen 10 und 250.00 IU/ml. Injektionen werden bei kleineren Organen, die schwer einer Perfusion zugänglich sind, angewendet The enzyme activity of an ampoule is after filling it with physiological Saline between 10 and 250.00 IU / ml. Injections are made with smaller ones Organs that are difficult to achieve perfusion

Andere erfindungsgemäß verwendbare Formulierungen sind z. B. Perfusionslösungen. Sie enthalten in der Regel nur etwa 25% der Enzymaktivitäten des Injektionspräparats. In der Perfusionslösung sind in der Regel neben Glukose auch Salze wie Kochsalz, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natrium- und Kaliumphosphate Natriumbicarbonat, Magnesiumsalze, Glukose, Natriumpyruvat und komplexbildende Substanzen vorhanden. Die Perfusion kann durch die vorhandenen Gefäßanschlüsse oder bei größeren Organen mittels eines Katheters erfolgen. Die Perfusion wird bevorzugt bei größeren Organen, wie dem Herzen oder der Leber angewendet. Other formulations that can be used according to the invention are e.g. B. Perfusion solutions. she usually contain only about 25% of the enzyme activities of the injection preparation. In the In addition to glucose, perfusion solutions are usually salts such as table salt, Potassium chloride, calcium chloride, sodium and potassium phosphates, sodium bicarbonate, Magnesium salts, glucose, sodium pyruvate and complexing substances available. Perfusion can occur through the existing vascular connections or with larger organs by means of a catheter. Perfusion is preferred for larger organs, such as applied to the heart or liver.

Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Transplantate in einer Lösung, welche Hyaluronatlyaseaktivität aufweist, für wenige Minuten bis zu mehreren Stunden eingetaucht bzw. gespült. Die Spül- bzw. Tauchlösungen enthalten in der Regel die gleichen Bestandteile wie die Perfusionslösungen. Spülungen bzw. Tauchungen werden bei Geweben, z. B. Hauttransplantaten, angewendet oder bei kleineren Organen oftmals in Verbindung mit einer Injektion. In a further embodiment of the invention, the grafts are in one Solution having hyaluronate lyase activity for a few minutes to several Hours immersed or rinsed. The rinsing or immersion solutions usually contain the same components as the perfusion solutions. Rinses or dives are used in tissues, e.g. B. skin grafts, applied or for smaller organs often in connection with an injection.

Die Konservierung erfolgt bei Temperaturen des Transplantates zwischen etwa 1°C und der normalen Körpertemperatur. Bei erfindungsgemäßer als auch bei Kombination von herkömmlicher und erfindungsgemäßer Konservierung werden Temperaturen von ca. 4°C bevorzugt. Eine intensivere Wirkung wird jedoch bei höheren Temperaturen erreicht. Die Wirkung ist an der Abnahme der Gewebespannung deutlich wahrzunehmen. The preservation takes place at temperatures of the transplant between about 1 ° C and normal body temperature. With the invention as well as with a combination of Conventional and inventive preservation temperatures of about 4 ° C. prefers. However, a more intensive effect is achieved at higher temperatures. The The effect can be clearly seen from the decrease in tissue tension.

Ohne die Erfindung auf die Hyaluronatlyase oder ihres enzymatisch aktiven Fragmentes aus einen bestimmten Mikroorganismus festzulegen, wird der erfindungsgemäße Wirkstoff am Beispiel des Enzyms aus dem allgemein zugänglichen Streptococcus agalactiae, hergestellt durch biotechnische Fermentation, erläutert. Diese Hyaluronatlyase besitzt einen Isoelektrischen Punkt von etwa IP = 8,6 sowie eine Molmasse von etwa 116.000 D und wirkt als Endoglycanase. Durch nachfolgend aufgeführte Reinigungsverfahren wird die Hyaluronatlyase als ein hochgereinigtes Enzym für Injektionszwecke gewonnen oder die gereinigte Hyaluronatlyase mit einer spezifisch wirkenden Protease zu einem Fragment mit Hyaluronatlyase-Aktivität umgesetzt. Als spezifisch wirkende Protease kann, ohne die Erfindung einzuschränken, beispielsweise die saure Metalloprotease MO/2 eingesetzt werden, die aus dem Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus gewonnen werden kann (DD 270 924). Diese Protease besitzt eine Molmasse von etwa 14 kD und einen Isoelektrischen Punkt zwischen IP = 3,85 bis 4,0. Without the invention on the hyaluronate lyase or its enzymatically active fragment to determine from a certain microorganism, the active ingredient according to the invention using the example of the enzyme from the generally accessible Streptococcus agalactiae, produced by biotechnical fermentation, explained. This hyaluronate lyase has an isoelectric point of approximately IP = 8.6 and a molecular weight of approximately 116,000 D. and acts as an endoglycanase. The cleaning procedure listed below will the hyaluronate lyase is obtained as a highly purified enzyme for injection purposes or the purified hyaluronate lyase with a specific protease into a fragment implemented with hyaluronate lyase activity. As a specific protease, without the To limit the invention, for example the acidic metalloprotease MO / 2 used be obtained from the microorganism Streptomyces hygroscopicus can (DD 270 924). This protease has a molecular weight of approximately 14 kD and one Isoelectric point between IP = 3.85 to 4.0.

example 1

Männliche Weiße Neuseelandkaninchen werden durch zervikale Dislokation betäubt, durch Thorakotomie das Herz entnommen und mit der Aorta an einem Perfusionsapparat befestigt. Die Perfusion erfolgt retrograd nach der Langendorff-Methode mit modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) bei konstanter Temperatur (37°C), konstantem Druck (60 mmHg) und ständiger Carbogen-Begasung. Die Zusammensetzung der basalen Perfusionslösung ist: NaCl 118 mmol/l, KCl 4,7 mmol/l, CaCl₂ 2,5 mmol/l, NaHPO₄ 1,2 mmol/l, NaHCO₃ 24,9 mmol/l, MgSO₄ 1,6 mmol/l, Glukose 5,5 mmol/l, Na-Pyruvat 2,0 mmol/l und Na₂EDTA 0,5 mmol/l. Male New Zealand white rabbits are anesthetized by cervical dislocation, the heart is removed by thoracotomy and attached to a perfusion apparatus with the aorta. Perfusion is carried out retrograde according to the Langendorff method with modified Krebs-Henseleit buffer (pH 7.4) at constant temperature (37 ° C), constant pressure (60 mmHg) and constant fumigation with carbogen. The composition of the basal perfusion solution is: NaCl 118 mmol / l, KCl 4.7 mmol / l, CaCl ₂ 2.5 mmol / l, NaHPO ₄ 1.2 mmol / l, NaHCO ₃ 24.9 mmol / l, MgSO ₄ 1.6 mmol / l, glucose 5.5 mmol / l, Na pyruvate 2.0 mmol / l and Na ₂ EDTA 0.5 mmol / l.

Die verwendete Hyaluronatlyaselösung wird wie folgt hergestellt: Eine Ampulle Hyaluronatlyase entsprechend 200.000 IU wird in eiskaltem destillierten Wasser (1 ml) und Perfusionslösung (4 ml) gelöst und sofort in 1995 ml temperierte und begaste Perfusionslösung gegeben, so daß die Konzentration 100 IU/ml beträgt. Mit dieser Lösung wird das Herz entweder vor oder nach der globalen Ischämie perfundiert. The hyaluronate lyase solution used is prepared as follows: One ampoule Hyaluronate lyase corresponding to 200,000 IU is in ice cold distilled water (1 ml) and perfusion solution (4 ml) dissolved and immediately tempered and fumigated in 1995 ml Perfusion solution given so that the concentration is 100 IU / ml. With this solution the heart is perfused either before or after global ischemia.

Nach der Entnahme der Herzen werden diese in die Perfusionsapparatur eingespannt und für 15 min mit basaler Perfusionslösung bis zum Erreichen stabiler Aktionspotentiale perfundiert. Anschließend erfolgt die Retransplation. In gleicher Weise wird mit Herzen verfahren, die mit einer hyaluronatlyasefreie Perfusionslösung perfundiert wurden. Der interstitielle Druck wird mit einer Drucksonde gemessen. After the hearts have been removed, they are clamped in the perfusion apparatus and for 15 min with basal perfusion solution until stable action potentials are reached perfused. The retransplation then takes place. In the same way, with hearts procedures that have been perfused with a hyaluronate lyase-free perfusion solution. The interstitial pressure is measured with a pressure probe.

Example 2

Jeweils ein Rattenherz wird durch Aufbewahren für 18 Stunden bei Temperaturen von 0° bis 1°C für 24 Stunden in handelsüblicher UW-Lösung sowie in EuroFlush-Glutathione (EFG)-Lösung, in der 2000 IU/l Hyaluronatlyase gelöst sind, konserviert. Zum Vergleich wird ein Rattenherz in UW-Lösung und EFG-Lösung ohne Hyaluronatlyase in gleicher Weise konserviert. Nach Reperfusion mit dem Blut von Wirtsratten wird die Ödembildung in Gefrierschnitt mikroskopisch untersucht. In den Herzen, konserviert mit den Hyaluronatlyase enthaltenden Lösungen, ist die die Ödembildung während der Reperfusion stark reduziert. Der koronare Blutfluß und die Funktion des Implantats erreicht innerhalb von 5 Tagen annähernd Normalwerte. Each rat heart is kept for 18 hours at temperatures of 0 ° up to 1 ° C for 24 hours in a commercial UW solution as well as in EuroFlush glutathione (EFG) solution in which 2000 IU / l hyaluronate lyase are dissolved, preserved. For comparison becomes a rat heart in UW solution and EFG solution without hyaluronate lyase in the same Way preserved. After reperfusion with the blood of host rats, the edema formation microscopically examined in frozen section. In the heart, preserved with the Solutions containing hyaluronate lyase, which is the edema formation during reperfusion greatly reduced. The coronary blood flow and the function of the implant achieved within of 5 days approximately normal values.

Example 3

Entnommene Rattennieren werden 5 Stunden nach Abkühlung ohne weitere Manipulation zwischen 0-4 Grad gelagert oder mittels einer Pumpe konstant bei 4-10 Grad mit WU- Lösung perfundiert. Die UW-Lösung enthält 10.000 IU/l Hyaluronatlyase. Removed rat kidneys are 5 hours after cooling without further manipulation stored between 0-4 degrees or with a pump constant at 4-10 degrees with WU- Solution perfused. The UW solution contains 10,000 IU / l hyaluronate lyase.

Nach Transplantation nehmen die mit Hyaluronatlyase perfundierten Nieren die frühzeitige Organfunktion auf, während das kalt gelagerten Organ und das ohne Hyaluronatlyase perfundierte Organ auch nach mehreren Tagen nach der Reperfusion schlechte Funktionswerte aufweisen. After transplantation, the kidneys perfused with hyaluronate lyase take the early one Organ function while the organ is cold and without hyaluronate lyase organ perfused poor even after several days after reperfusion Have functional values.

Example 4

Zwei Rattenleber wird entnommen, wobei Pfortader und Leberarterie abgeklemmt werde. Durch Tauchen in UW-Lösung bei Temperaturen zwischen 4 und 8°C, welche in einem Fall 4000 IU/l Hyaluronatlyase enthält, werden die Organe 5 Stunden behandelt und anschließend an den Blutkreislauf von Wirtstieren übertragen. Das mit Hyaluronatlyase perfundierte Organ nimmt nach Transplantation seine Funktion im Verlauf von zwei Tagen vollständig auf, während das Tier, welchem das nicht mit Hyaluronatlyase perfundierte Organ implantiert wurde, nicht überlebte. Two rat liver are removed, with the portal vein and hepatic artery being pinched off. By diving in UW solution at temperatures between 4 and 8 ° C, which in one If 4000 IU / l contains hyaluronate lyase, the organs are treated for 5 hours and subsequently transferred to the bloodstream of host animals. That with hyaluronate lyase perfused organ takes its function over two days after transplantation completely while the animal which was not perfused with hyaluronate lyase Organ was implanted, did not survive.

Example 5

Jeweils ein Rattenherz wird durch Aufbewahren für 8 Stunden bei Temperaturen von 0° bis 1°C für 24 Stunden in handelsüblicher UW-Lösung konserviert. In ein Rattenherz wird an drei verschiedenen Stellen jeweils 0,2 ml einer Lösung injiziert, welche 100 IU/ml Hyaluronatlyase enthält. Nach Reperfusion mit dem Blut von Wirtsratten wird die Ödembildung in Gefrierschnitt mikroskopisch untersucht. Mit den Hyaluronatlyase behandelten Herz ist die Ödembildung während der Reperfusion stark reduziert. Each rat heart is stored for 8 hours at temperatures of 0 ° Preserved up to 1 ° C for 24 hours in a commercial UW solution. Into a rat heart 0.2 ml of a solution, which is 100 IU / ml Contains hyaluronate lyase. After reperfusion with the blood of host rats, the Edema formation in frozen sections examined microscopically. With the hyaluronate lyase Treated heart, edema formation during reperfusion is greatly reduced.

Claims

1. A method for the preservation of animal and human tissues intended for transplantation, characterized in that said tissues are treated extracorporeally with solutions containing microbial hyaluronate lyase or an enzymatically active fragment thereof.

2. The method according to claim 1, characterized in that the treatment at Temperatures between 1 ° C and 37 ° C, preferably at temperatures of approx. 4 ° C is carried out.

3. The method according to claim 1, characterized in that the enzyme-containing Solutions are injected into said tissue

4. The method according to claim 1, characterized in that the enzyme-containing Solutions are introduced into said tissue by perfusion

5. The method according to claim 1, characterized in that said tissue in the enzyme-containing solutions are immersed.

6. The method according to claim 1, characterized in that it is said Tissue is about kidneys and the preservation times by perfusion or Diving can be up to 48 hours

7. The method according to claim 1, characterized in that it is said Tissue is about heart or lungs and the preservation times through Perfusion or diving can take up to eight hours.

8. The method according to claim 1, characterized in that it is said Tissue is about pancreas or liver and the preservation times through Perfusion and / or diving up to 24 hours.

9. The method according to claim 1, characterized in that it is in the Hyaluronate lyase is an enzyme from a microorganism of the genus Streptococcus, preferably of the species Streptococcus agalactiae and especially from Streptococcus equisimilis.

10. The method according to claim 1, characterized in that an enzymatically active Fragment of a microbial hyaluronate lyase, available from the latter Reaction with a specific protease, preferably with the acidic Metalloprotease MO / 2.

11. The method according to claim 3, characterized in that for injection isotonic aqueous solution of a highly purified microbial hyaluronate lyase or an enzymatically active fragment thereof with concentrations between 10 and 250,000 IU / ml with the addition of those customary in injection preparations Auxiliary materials are used.

12. The method according to any one of claims 4 and 5, characterized in that the Perfusion solution or immersion solution up to 70,000 IU / ml of a highly purified microbial hyaluronate lyase or an enzymatically active fragment thereof contains auxiliary substances.

13. The method according to claim 1, characterized in that the preservation by injection in addition to perfusion or dipping.