DE10138303A1

DE10138303A1 - New extracts of fly larvae, useful as medicaments for promoting wound healing, obtained by homogenizing fly larvae under cooling and removing non-dissolved components

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Publication number: DE10138303A1
Application number: DE10138303A
Authority: DE
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2001-08-10
Filing date: 2001-08-10
Publication date: 2003-03-06

Abstract

New extracts of fly larvae (I) are obtained by cooling the fly larvae, homogenizing (preferably in presence of an extraction medium) and removing the non-dissolved components.

Description

Die Erfindung betrifft die topische Applikation von Enzymen oder Enzymisolaten aus Fliegenlarven verschiedener Arten der Gattung Lucilia zur Behandlung von oberflächlichen oder tiefen chronischen und akuten Wunden jeglicher Genese. The invention relates to the topical application of enzymes or enzyme isolates Fly larvae of various species of the genus Lucilia for the treatment of superficial or deep chronic and acute wounds of any origin.

Die Wundheilung ist ein komplexes Geschehen, bei dem multiple Zielzellen und Zielstrukturen in einer geordneten Abfolge von Prozessen ineinander greifen müssen. Unabhängig von der Wundart (chronisch/akut) laufen diese Prozesse ab, während die Zeitdauer einzelner Phasen variabel ist. Es lassen sich generell drei Hauptphasen unterscheiden, die exsudative Phase, die proliferative Phase und die Epithelisierung- bzw. Reparationsphase. Wound healing is a complex process involving multiple target cells and Target structures must interlock in an orderly sequence of processes. Regardless of the type of wound (chronic / acute), these processes take place during the The duration of individual phases is variable. There are generally three main phases distinguish the exudative phase, the proliferative phase and the epithelialization or repair phase.

In der exsudativen Phase stehen die akute Traumatisierung der hämostaseologischen und vasokonstriktorischen Reaktionen im Vordergrund. Klinisch imponiert ein Wundödem und der Wundschmerz. Der entstandene Gefäßdefekt wird unter dem Einfluß der Thrombozyten verschlossen. Diese setzen chemotaktisch wirkende Thrombozyten frei. Es kommt zu einer Einwanderung von Makrophagen, Neutrophilen und Lymphozyten. Dadurch wird ein Phagozytosesystem aufgebaut, das hochwirksam für das Gewebedebridement verantwortlich ist. In the exudative phase are the acute traumatization of the hemostaseological and vasoconstrictive reactions in the foreground. Clinically impressive Wound edema and wound pain. The resulting vascular defect is under the Platelet influence blocked. These set chemotactically acting Platelets free. There is an immigration of macrophages, neutrophils and lymphocytes. This creates a phagocytic system that is highly effective responsible for tissue engineering.

Nach Beseitigung von Zelltrümmern beginnt durch die Migration von Fibroblasten und Gefäßendothelzellen die proliferative Phase. Der Zellgehalt nimmt durch die eingewanderten Fibroblasten und Endothelzellen massiv zu. Gleichzeitig werden vermehrt Zytokine und Wachstumsfaktoren freigesetzt, die ihrerseits die Gefäßneubildung und Zellproliferation stimulieren. Zusätzlich findet in dieser Phase ein Matrixumbau statt. Dies erfolgt durch die Bildung und den Umbau von Kollagen Typ III in Kollagen Typ 1. Dadurch entsteht ein gut kapillarisiertes, Makrophagen-, Fibroblasten- und Mastzellreiches Granulationsgewebe. After removing cell debris begins by migrating fibroblasts and Vascular endothelial cells the proliferative phase. The cell content decreases by that immigrant fibroblasts and endothelial cells. Be at the same time increasingly released cytokines and growth factors, which in turn the Stimulate neovascularization and cell proliferation. Additionally takes place in this phase Matrix conversion instead. This is done through the formation and remodeling of collagen type III in Collagen type 1. This creates a well capillaryized, macrophage, fibroblast and granulation tissue rich in mast cells.

An diese proliferative Phase schließt sich die Epithelisierungs- und Reparationsphase an. In dieser abschließenden Phase kommt es zur Wundkontraktion und zur Migration randständiger Keratinozyten in die Wunde. Die Neoangiogenese und die Kapillardichte nimmt ab. Der Kollagengehalt hingegen nimmt zu. Dieser Prozeß ist für die mechanische Festigkeit des entstehenden Narbengewebes relevant. The epithelization and repair phase follows this proliferative phase on. In this final phase, wound contraction and migration occur marginal keratinocytes into the wound. Neoangiogenesis and capillary density decreases. The collagen content, however, increases. This process is for the mechanical strength of the resulting scar tissue relevant.

Bei Störungen dieser komplexen Wechselwirkungen können Verzögerungen der Wundheilung auftreten. In Abhängigkeit von der Genese der beeinträchtigten Prozesse spricht man nach einer 6-8 Wochen lang bestehenden Wunde von chronischen Wundheilungsstörungen. Diese treten bei einer Vielzahl von immunologisch bedingten Erkrankungen, der Varikose, der arteriellen Verschlusserkrankung, nach Infektionen und beispielsweise beim Diabetes mellitus auf. Maßnahmen zur Förderung der Wundheilung dienen der beschleunigten oder regelrechten Abfolge der zuvor beschriebenen Prozesse. Hierbei sind in erster Linie wundreinigende, neben granulationsfördernen Verfahren anzuführen. Durch moderne "Wunddressings" kann aber auch die Epithelisierung gefördert werden. Eine der Hauptursachen der verzögerten Wundheilung liegt in der mangelnden Formation von Granulationsgewebe. Dies kann entweder durch vermindertes endogenes Wunddebridement verursacht sein, oder es kommt in Folge von Infektionen, Durchblutungsstörungen, immunologischen Erkrankungen zu einer überschiessenden Bildung von Zell- und Gewebedetritus. If these complex interactions are disturbed, delays in the Wound healing occur. Depending on the genesis of the affected processes one speaks of chronic after a 6-8 week wound Wound healing disorders. These occur in a variety of immunological conditions Diseases, varicose veins, arterial occlusive disease, after infections and for example in diabetes mellitus. Measures to promote wound healing serve the accelerated or regular sequence of the previously described Processes. Here are primarily wound cleansing, in addition to granulation To lead procedures. With modern "wound dressings" this can also be done Epithelization are encouraged. One of the main causes of delayed wound healing lies in the lack of formation of granulation tissue. This can be done either decreased endogenous wound debridement may be caused, or may result from infections, circulatory disorders, immunological diseases to one excessive formation of cell and tissue detritus.

Therapeutisch kommen hierbei wundreinigende Maßnahmen zum Einsatz. Therapeutically, wound cleansing measures are used.

Ziel der Reinigung ist die Herstellung eines sauberen Wundgrundes. Dazu müssen zunächst Salbenreste und Krusten beseitigt und eventuell vorhandene Nekrosen abgetragen werden. Letzteres geschieht entweder chirurgisch mit dem scharfen Löffel (Kürrettage) und mit Pinzette und Schere. Alternativ kann man enzymatische Salben verwenden, die vorzugsweise denaturiertes Protein abbauen. Sie enthalten Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin, Enzyme aus bovinem Material wie Pankreasenzyme, oder Kollagenase, Fibrolysin, Streptokinase oder Kälberblutdyasilate. Parallel hierzu erfolgt die regelmäßige Desinfektion beispielsweise mit Kaliumpermanganat oder mit Rivanol® -Bädern. Desinfizierende Maßnahmen können auch mit silber- oder mit jodhaltigen Präparationen durchgeführt werden The aim of cleaning is to create a clean wound bed. To do this initially remnants of ointments and crusts are removed and any existing necrosis be removed. The latter is done either surgically with a sharp spoon (Curettage) and with tweezers and scissors. Alternatively you can use enzymatic ointments use that preferentially break down denatured protein. They contain enzymes like Trypsin, chymotrypsin, enzymes from bovine material such as pancreatic enzymes, or Collagenase, fibrolysin, streptokinase or calf blood dyasilate. In parallel regular disinfection, for example with potassium permanganate or with Rivanol® -Bädern. Disinfectant measures can also be carried out with silver or with iodine Preparations are carried out

Die enzymatischen Präparate zeigen allerdings am Patienten häufig nur eine eingeschränkte Wirksamkeit. Denn die Dosierung des Enzyms ist häufig sehr niedrig und die Halbwertszeit der bekannten Enzympräparate liegt bei 6 bis 12 Stunden. Aus diesem Grund sind tägliche, auch mehrmalige Verbandswechsel notwendig. Einige der Präparate sind Kombinationspräparate mit topisch applizierbaren Antibiotika. Der Nachteil der Kombinationspräparate liegt in der Gefahr einer epikutanen Sensibilisierung. Fast 60-70% der Patienten mit chronischen Ulzera crurum leiden an einer oder mehreren Sensibilisierungen auf Salbengrundlagen oder anderen Bestandteilen topischer Externa. However, the enzymatic preparations often only show one on the patient limited effectiveness. Because the dosage of the enzyme is often very low and the half-life of the known enzyme preparations is 6 to 12 hours. Out For this reason, daily, even repeated dressing changes are necessary. Some of the Preparations are combination preparations with topical antibiotics. The The disadvantage of combination products is the risk of epicutaneous Sensitization. Almost 60-70% of patients with chronic leg ulcers suffer one or more sensitizations based on ointments or others Components of topical externals.

Daher sollte auf den Einsatz lokaler Antibiotika verzichtet werden, da zum einen die Resistenzentwicklung, zum anderen die Sensibilisierungsrate hoch ist. Therefore, the use of local antibiotics should be avoided, because on the one hand the Development of resistance, on the other hand the sensitization rate is high.

Ferner ist die Anlegung von Larven (Maden) der Art Lucilia sericata auf Wunden bekannt. Diese Therapie basiert auf uralten volksmedizinischen und teilweise auf kriegsmedizinischen Erkenntnissen und Beobachtungen über die Verunreinigung von Kriegsverletzungen mit Fliegenmaden. Die Maden dieser Art ernähren sich ausschließlich von nekrotischem Gewebe. Dabei wird dieses Material durch Sekretion von Speichel gleichsam vorverdaut und danach erst von der Made aufgenommen. Es kommt keinesfalls zu einer aktiven Nahrungsaufnahme durch die Maden der L. sericata im Sinne eines Kau- oder Beißaktes. Dadurch ist sichergestellt, daß die Maden nicht in andere Körperbereiche oder in nicht-betroffene Körperhöhlen eindringen können. Die Madentherapie zeigt sehr hohe therapeutische Effektivität. Allerdings ist die gegenwärtige Behandlungsmethode extrem kompliziert, kostenaufwendig und bedarf eines hohen logistischen Aufwandes. Für die Anwendung am Menschen sind die Maden unter kontrollierten Bedingungen zu züchten. Sowohl für die Aufzucht als auch für den Transport vom Labor zum Patienten ist Keimfreiheit zu gewährleisten. Die therapeutische Effektivität ist nicht zu dosieren. Zwar ist es möglich die Anzahl der Maden zu bestimmen, die auf die Wunde aufgebracht wird, nicht aber die von ihnen erbrachte enzymatische Wirksamkeit. Die Maden selber unterliegen einem biologischen Entwicklungsablauf, an dessen Ende die Metamorphose der Larve zur Puppe und danach zur Fliege steht. Aus diesem Grund ist die Applikation der Larven engmaschig zu wiederholen. Für Patienten und medizinische Leistungserbringer ist eine hohe Compliance erforderlich, um die Therapie durchzuführen, da kulturelle und zivilisatorische Grenzen psychologisch überwunden werden müssen. Zudem kann das Einhaken der Mundhaken der Larven recht schmerzhaft sein. Furthermore, larvae of the species Lucilia sericata are applied to wounds known. This therapy is based on ancient folk medicine and partly on war medical findings and observations on the contamination of War injuries with fly maggots. The maggots of this species feed exclusively from necrotic tissue. This material secretions pre-digested by saliva and only then absorbed by the maggot. It the maggots of L. sericata do not actively take in food in the sense of an act of chewing or biting. This ensures that the maggots are not in can penetrate other areas of the body or into unaffected body cavities. The Girl therapy shows very high therapeutic effectiveness. However, that is current treatment method extremely complicated, costly and required a high logistical effort. The maggots are for use on humans to grow under controlled conditions. Both for rearing and for the Transport from the laboratory to the patient must be ensured aseptic. The therapeutic effectiveness cannot be dosed. Although it is possible the number of To determine maggots that are applied to the wound, but not those of them provided enzymatic activity. The maggots themselves are subject to a biological Development process, at the end of which the metamorphosis of the larva into the pupa and after that stands for the fly. For this reason, the application of the larvae is very close to repeat. For patients and medical care providers is a high Compliance required to conduct therapy because of cultural and civilization boundaries have to be overcome psychologically. In addition, that can Hooking the mouth hooks of the larvae can be quite painful.

In dem Bestreben, wirksame Behandlungsverfahren für oberflächliche oder tiefe chronische und akute Wunden jeglicher Genese zu finden, wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate aus Fliegenlarven verschiedener Arten der Gattung Lucilia die genannten Nachteile beheben können. In an effort to provide effective treatments for superficial or deep Finding chronic and acute wounds of any genesis has now been found the enzymes according to the invention or enzyme isolates from fly larvae of various Species of the genus Lucilia can remedy the disadvantages mentioned.

Die erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate stellen eine deutliche Weiterentwicklung der Madentherapie hinsichtlich der Applikation und Dosierung dar. Durch die Bestimmung der enzymatischen Aktivität kann die Therapie besser gesteuert werden. Als Fertigpräparat besitzen die Enzympräparate eine kontinuierliche Leistungsfähigkeit, die nicht vom Entwicklungszyklus der Maden abhängt. The enzymes or enzyme isolates according to the invention represent a clear one Further development of the treatment of the girls with regard to the application and dosage. Therapy can be better controlled by determining the enzymatic activity become. As a finished preparation, the enzyme preparations have a continuous one Efficiency that does not depend on the maggot development cycle.

Die Erfindung betrifft daher Enzyme oder Enzymisolate mit wundheilender Wirkung, erhältlich aus Fliegenlarven der Gattung Lucilia. The invention therefore relates to enzymes or enzyme isolates with wound healing effects, available from fly larvae of the genus Lucilia.

Geeignete Arten aus der Gattung Lucilia sind beispielsweise Lucilia sericata, Lucilia sarcophaga und Sarcophaga carnaria. Die Gattung Lucilia ist ubiquitär vorhanden und ein Fachmann kann diese Insekten leicht auffinden, beispielsweise durch Auslegen von frischem Fleisch. Suitable species from the genus Lucilia are, for example, Lucilia sericata, Lucilia sarcophaga and Sarcophaga carnaria. The genus Lucilia is ubiquitous and a person skilled in the art can easily find these insects, for example by laying out fresh meat.

Die Erfindung betrifft ferner Enzyme oder Enzymisolate mit wundheilender Wirkung, erhältlich aus 5 bis 8 Tage alten Fliegenlarven der Gattung Lucilia. Dabei beginnt die Zeitrechnung mit dem Schlüpfen der Larven aus dem Ei. The invention further relates to enzymes or enzyme isolates with wound healing effects, available from 5 to 8 day old fly larvae of the genus Lucilia. The begins Time when the larvae hatch from the egg.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Enzyme oder Enzymisolate mit wundheilender Wirkung, das durch gekennzeichnet ist, dass die Larven der Gattung Lucilia vor der Verpuppung getötet und homogenisiert werden, und das erhaltene Homogenisat wird anschließend von nicht gelösten Bestandteilen befreit und die löslichen Bestandteile werden konserviert. The invention also relates to a method for producing the enzymes or enzyme isolates with wound healing effects, which is characterized by the larvae of the genus Lucilia be killed and homogenized before pupation, and the obtained Homogenisate is then freed from undissolved components and the soluble components are preserved.

Die Homogenisierung erfolgt beispielsweise durch Ultraschall oder durch mechanische Homogenisierung. Die Larven können vor der Homogenisierung geteilt werden, in einen vorderen Kopfteil und in einen hinteren Körperteil. Die Trennung des Homogenisats in feste und lösliche Bestandteile erfolgt beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation. Die Konservierung der Enzyme oder Enzymisolate mit wundheilender Wirkung erfolgt durch Kühlung während des gesamten Verfahrens und Einfrieren der erhaltenen löslichen Homogenisate oder durch Gefriertrocknung. Ferner können weitere bekannte Mittel zur Stabilisierung von Enzymen oder Enzymisolate eingesetzt werden wie Puffer, Proteaseinhibitoren oder Salze. The homogenization is carried out, for example, by ultrasound or by mechanical Homogenization. The larvae can be divided into one before homogenization front headboard and into a rear body part. The separation of the homogenate in Solid and soluble components are made, for example, by filtration or centrifugation. The preservation of the enzymes or enzyme isolates with wound healing effects takes place by cooling throughout the process and freezing the obtained soluble homogenates or by freeze-drying. Furthermore, other known ones Agents for stabilizing enzymes or enzyme isolates are used, such as buffers, Protease inhibitors or salts.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate erfolgt beispielsweise dadurch, dass Eier oder Larven der Arten Lucilia sericata und Sarcophaga carnaria auf frischem Fleisch gehalten werden. Die Larven wachsen und gedeihen auf dem Fleisch und werden kurz vor Eintritt in das Verpuppungsstadium geerntet. Vorteilhaft ist dabei die Larven in der Zeit von Tag 5 bis Tag 8 nach dem Schlüpfen aus dem Ei zu ernten. The enzymes or enzyme isolates according to the invention are produced for example in that eggs or larvae of the species Lucilia sericata and Sarcophaga carnaria are kept on fresh meat. The larvae grow and thrive on the meat and become shortly before entering the pupation stage harvested. The larvae are advantageous from day 5 to day 8 after Harvest hatching from the egg.

Die Larven werden dazu zunächst äußerlich weitgehend keimfrei gemacht. Dies erfolgt durch mehrere Waschschritte in aseptischen Lösungen in absteigender Konzentration. In den letzten Waschschritten wird sterilisierte NaCl-Lösung eingesetzt und dadurch eine weitgehende äußere Keimfreiheit der Larven hergestellt. Danach werden die Larven dekapitiert, d. h. das vordere Drittel wird vom Rest des Larvenkörpers abgetrennt. Beide Larventeile werden sofort getrennt in einem Trägermedium auf Eis asserviert. Das Trägermedium kann entweder wässriger oder hydrophober Natur sein. Geeignete Trägermedien sind beispielsweise sterile physiologische Kochsalzlösung, Puffer, sterile Elektrolylösungen, Albuminlösungen, aber auch tierische und pflanzliche Öle, ölige Lösungen, Fette, beispielsweise Vaseline, Wollwachse, Wollwachsalkohole, Kakaobutter oder Paraffine. For this purpose, the larvae are first made largely sterile on the outside. this happens through several washing steps in aseptic solutions in decreasing concentration. Sterilized NaCl solution is used in the last washing steps and thereby the larvae are largely sterile. After that the Larvae decapitated, d. H. the front third is separated from the rest of the larval body. Both parts of the larva are immediately stored separately on ice in a carrier medium. The Carrier medium can be either aqueous or hydrophobic in nature. suitable Carrier media are, for example, sterile physiological saline, buffers, sterile Electrolytes solutions, albumin solutions, but also animal and vegetable oils, oily ones Solutions, fats, for example petroleum jelly, wool waxes, wool wax alcohols, Cocoa butter or paraffins.

Danach werden die Larventeile homogenisiert. Dies geschieht in mehreren Schritten mittels Ultraschallhomogenisatoren und/oder mechanischen Homogenisatoren. Die Homogenisierungsschritte erfolgen bei ständiger Kühlung von etwa 4°C Celsius. Die Homogenisierung erfolgt in dem zuvor verwendeten Trägermedium. The larvae parts are then homogenized. This happens in several steps by means of ultrasonic homogenizers and / or mechanical homogenizers. The Homogenization steps take place with constant cooling of around 4 ° C Celsius. The homogenization takes place in the carrier medium previously used.

Nach Erhalt der homogenen Flüssigkeit wird der Extrakt steril filtriert, beispielsweise mit einem Filter der einen Porendurchmesser von 0,1 bis 0,4 µm. Im fetzten Schritt wird der Extrakt aliquotiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die dauerhafte Lagerung erfolgt bei einer Temperatur von etwa -21°C bis -80°C. After the homogeneous liquid has been obtained, the extract is sterile filtered, for example with a filter with a pore diameter of 0.1 to 0.4 µm. In the final step, the Extract aliquoted and frozen in liquid nitrogen. Permanent storage takes place at a temperature of about -21 ° C to -80 ° C.

Die erhaltenen sterilfiltrierten Extrakte können auch lyophilisiert werden. The sterile-filtered extracts obtained can also be lyophilized.

Die erfindunggemäßen Extrakte können auch mit üblichen Reinigungsmethoden weiter gereinigt oder fraktioniert werden wie Chromatographie, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), Säulenchromatographie, Salzfällungen oder Elektrophorese. The extracts according to the invention can also be further processed using conventional cleaning methods be purified or fractionated like chromatography, High pressure liquid chromatography (HPLC), column chromatography, salt precipitation or electrophoresis.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen wirksamen Gehalt an den erfindungsgemäßen Enzymen oder Enzymisolaten mit wundheilender Wirkung zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Trägerstoff, Zusatzstoff und/oder anderen Wirk- und Hilfsstoffen. The invention also relates to pharmaceuticals characterized by an effective content on the enzymes or enzyme isolates according to the invention with wound healing effects together with a pharmaceutically suitable and physiologically compatible Carrier, additive and / or other active and auxiliary substances.

Aufgrund der pharmakologischen Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Enzymen oder Enzymisolate zur Therapie von oberflächlichen oder tiefen chronischen und akuten Wunden jeglicher Genese. The pharmacological properties of the invention are suitable Enzymes or enzyme isolates for the therapy of superficial or deep chronic and acute wounds of any genesis.

Unter dem Begriff "chronische und akute Wunden jeglicher Genese" werden beispielsweise Wunden verstanden wie Operationswunden, die gezielt oder ungewollt sekundär heilen sollen, Schnitt-, Stich-, Schürf-, Biß-, Brand-, oder Schussverletzungen, und andere Wunden, die nicht primär mittels chirurgischer Naht oder einem primären Wundverschluß behandelt werden können. Ferner sind mit dem Begriff der akuten Wunden, alle Wunden gemeint, die durch eine Superinfektion nicht primär abheilen können und alle Wunden, deren Manifestation 4 Wochen und weniger beträgt. Chronische Wunden sind alle Verletzungen, die mit der Aufhebung der Integrität des Epithels einhergehen und länger als 4 Wochen manifest sind. Insbesondere sind hiermit schlecht heilende Wunden auf der Basis eines Diabetes mellitus, einer Varikose oder einer Venenthrombose, eines rheumatischen Leidens, einer Vaskulitis, einer arteriellen Verschlusskrankheit, eines Leidens der Lymphgefäße, hämatologischer Erkrankungen und unter oder nach Infektionen der Wunden gemeint. Under the term "chronic and acute wounds of any genesis" For example, wounds are understood as surgical wounds that are targeted or unwanted should heal secondarily, cut, stab, abrasion, bite, fire or shot injuries, and other wounds that are not primarily surgical or primary Wound closure can be treated. Furthermore, the term acute Wounds, all wounds that are not primarily healed by superinfection can and all wounds, the manifestation of which is 4 weeks and less. Chronic wounds are all injuries that come with the annulment of the integrity of the patient Epithelium go along and are manifest for more than 4 weeks. In particular, hereby poorly healing wounds based on diabetes mellitus, varicosis or venous thrombosis, rheumatic disease, vasculitis, arterial Occlusive disease, lymphatic disease, haematological diseases and meant under or after infections of the wounds.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das dadurch gekennzeichnet, dass man die erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate mit wundheilender Wirkung mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und gegebenenfalls weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt. The invention also relates to a method for producing a medicament which characterized in that the enzymes or enzyme isolates according to the invention with wound healing effects with a pharmaceutically suitable and physiological compatible carriers and, if appropriate, other suitable active, additional or Brings excipients in a suitable dosage form.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate mit wundheilender Wirkung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Therapie von oberflächlichen oder tiefen chronischen und akuten Wunden jeglicher Genese. The invention also relates to the use of the enzymes according to the invention or Enzyme isolates with wound healing effects for the manufacture of medicinal products for therapy of superficial or deep chronic and acute wounds of any origin.

Die Applikation der erfindungsgemäßen Arzneimittel erfolgt in der Regel topisch. The medicaments according to the invention are generally applied topically.

Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für die topische Anwendung auf der Haut liegen vorzugsweise als Salbe, Lösung, Suspension, Creme, Puder, liposomalen oder oleosomalen Formulierungen, Gel, Lotion, Paste, Spray, Aerosol oder Öl vor. Als Träger können Vaseline, Lanolin, Polyethylenglycole, Alkohole und Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate sind im allgemeinen in einer Konzentration von 0,1 Gew.-% bis 100 Gew.-% der Zusammensetzung vorhanden, beispielsweise von 1,0 Gew.-% bis 60 Gew.-%. Suitable pharmaceutical compositions for topical application on the Skin preferably lie as an ointment, solution, suspension, cream, powder, liposomal or oleosomal formulations, gel, lotion, paste, spray, aerosol or oil. As Carriers can include petroleum jelly, lanolin, polyethylene glycols, alcohols, and combinations of two or more of these substances are used. The invention Enzymes or enzyme isolates are generally in a concentration of 0.1% by weight. up to 100% by weight of the composition, for example from 1.0% by weight to 60% by weight.

Auch eine transdermale Verabreichung ist möglich. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen für transdermale Anwendungen können als einzelne Pflaster vorliegen, die für einen langzeitigen engen Kontakt mit der Epidermis des Patienten geeignet sind. Solche Pflaster enthalten geeigneterweise die erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate in einer gegebenenfalls gepufferten wäßrigen Lösung, gelöst und/oder dispergiert in einem Haftmittel oder dispergiert in einem Polymer. Eine geeignete Wirkstoff-Konzentration beträgt von etwa 0,1% Gew.-% bis 75 Gew.-%, vorzugsweise von 1% Gew.-% bis 70 Gew.-%. Als eine besondere Möglichkeit kann der Wirkstoff, wie beispielsweise in Pharmaceutical Research, 2(6): 318 (1986) beschrieben, durch Elektrotransport oder Iontophorese freigesetzt werden. Transdermal administration is also possible. Suitable pharmaceutical Compositions for transdermal applications can be used as single patches exist for long-term close contact with the patient's epidermis are suitable. Such plasters suitably contain those according to the invention Enzymes or enzyme isolates in an optionally buffered aqueous solution, dissolved and / or dispersed in an adhesive or dispersed in a polymer. A suitable active ingredient concentration is from about 0.1% by weight to 75% by weight, preferably from 1% by weight to 70% by weight. As a special possibility, the Active ingredient, as described for example in Pharmaceutical Research, 2 (6): 318 (1986), released by electrotransport or iontophoresis.

Die erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate können ferner auch auf die Wunde appliziert werden durch Wundauflagen aus Gaze, aus Alginaten, aus hydrokolloidalen Materialen, Schaumstoffen und Silikonauflagen, die mit diesen Enzymen oder Enzymisolaten beschichtet, getränkt oder behandelt wurden und deshalb in der Lage sind, die Enzyme oder Enzymisolate in oder auf die Wunde oder/Wundoberfläche abzugeben. The enzymes or enzyme isolates according to the invention can also be applied to the wound are applied through wound dressings made of gauze, made of alginates, made of hydrocolloidal Materials, foams and silicone pads that are made with these enzymes or Enzyme isolates were coated, soaked or treated and therefore capable are the enzymes or enzyme isolates in or on the wound or / wound surface leave.

Geeignete feste oder galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten (Mikro)Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel oder Trägerstoffe, wie die Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als häufig verwendete Hilfsstoffe seien Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Cellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuß- oder Sesamöl, Polyethylenglykol und Lösungsmittel wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole wie Glycerin, genannt. Suitable solid or galenical forms of preparation are, for example, granules, Powders, dragees, tablets (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, solutions, Suspensions, emulsions, drops or injectable solutions as well as preparations with protracted active ingredient release, in the production of customary auxiliaries or Carriers, such as the carriers, explosives, binders, coating, swelling, sliding or Lubricants, flavors, sweeteners and solubilizers, use Find. Magnesium carbonate, titanium dioxide, Lactose, mannitol and other sugars, talc, milk protein, gelatin, starch, cellulose and their derivatives, animal and vegetable oils such as cod liver oil, sunflower, peanut or sesame oil, polyethylene glycol and solvents such as sterile water and or polyhydric alcohols such as glycerin.

Ferner können die erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate auch in galenischen Zubereitungen eingesetzt werden, die die Enzyme in inaktiver Form enthalten und die dann in oder auf die Wunde auftragen werden und durch Zugabe von spezifischen Substanzen aktiviert werden. Furthermore, the enzymes or enzyme isolates according to the invention can also be used in galenic Preparations are used which contain the enzymes in inactive form and which then be applied in or on the wound and by adding specific Substances are activated.

Einfache Beispiele sind die Verwendung eines Pulvers oder von Lyophylisaten, die mit physiologischen Lösungen (z. B. 0,9% NaCl) aufgelöst werden. Simple examples are the use of a powder or of lyophilizates that come with physiological solutions (e.g. 0.9% NaCl) can be dissolved.

Bei ausreichender Stabilität kann die galische Zubereitung auch eine Lösung sein. With sufficient stability, the galic preparation can also be a solution.

Die Applikation der geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen erfolgt nach mechanischer Wundreinigung. Die mechanische Wundreinigung erfolgt beispielsweise durch ein Bad oder Spülung der Wunde mit Ringerlaktat. Die Wunde wird wahlweise nach Applikation der erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate mittels hydrokolloidaler Wunddressings oder mittels selbstklebender Operations-Folie bedeckt. Verbandswechsel mit jeweils neuer Gabe der erfindungsgemäßen Enzyme oder Enzymisolate erfolgen täglich. The appropriate pharmaceutical compositions are applied after mechanical wound cleaning. Mechanical wound cleaning takes place, for example by bathing or flushing the wound with Ringer's lactate. The wound becomes optional after application of the enzymes or enzyme isolates according to the invention by means of hydrocolloid wound dressings or covered with self-adhesive surgical film. Dressing change with new administration of the enzymes according to the invention or Enzyme isolates are done daily.

example 1 Production of the enzymes or enzyme isolates according to the invention

Larven der Arten Lucilia sericata und Sarcophaga carnaria werden auf frischem, und nicht oder gering kontaminiertem Pferdefleisch gehalten und kurz vor Eintritt in das Verpuppungsstadium geerntet. In mehreren Waschschritten in aseptischen Lösungen in absteigender Konzentration und in den letzten Waschschritten in sterilisierter NaCl- Lösung wird eine weitgehende äußere Keimfreiheit der Larven hergestellt. Danach werden die Larven dekapitiert, d. h. das vordere Drittel wird vom Rest des Larvenkörpers abgetrennt. Beide Larventeile werden sofort getrennt in einem Trägermedium auf Eis asserviert. Das Trägermedium kann entweder wässriger oder hydrophober Natur sein. Danach werden die Präparate homogenisiert. Dies geschieht in mehreren Schritten mittels Ultraschallhomogenisatoren und mechanischen Homogenisatoren. Auf eine ständige Kühlung bei etwa 4°C Celsius wird geachtet. Nach Erhalt einer homogenen Flüssigkeit wird der Extrakt steril filtriert (Milliporefilter). Im letzten Bearbeitungsschritt wird der Extrakt aliquotiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die dauerhafte Lagerung erfolgt bei etwa -21°C bis -80°C. Larvae of the species Lucilia sericata and Sarcophaga carnaria are grown on fresh, and not or only slightly contaminated horse meat and kept shortly before entering the Pupation stage harvested. In several washing steps in aseptic solutions in descending concentration and in the last washing steps in sterilized NaCl Solution is largely an external sterility of the larvae. After that the larvae are decapitated, i.e. H. the front third is from the rest of the larval body separated. Both parts of the larva are immediately separated in a carrier medium on ice asserviert. The carrier medium can be either aqueous or hydrophobic in nature. The preparations are then homogenized. This happens in several steps using ultrasonic homogenizers and mechanical homogenizers. On a constant cooling at around 4 ° C is observed. After receiving a homogeneous Liquid, the extract is sterile filtered (Millipore filter). In the last processing step the extract is aliquoted and frozen in liquid nitrogen. The permanent one Storage takes place at around -21 ° C to -80 ° C.

Example 2 wound treatment

Bei einer 82 Jahre alten Patientin, die seit Jahren an chronisch rezidivierender Ulcera curum leidet, wurde der gemäß Beispiel 1 hergestellte Enzymextrakt mit jeweils 2 ml eingesetzt. Die Ulzera sind venöser Herkunft und werden durch die Einnahme von Schmerzmitteln im Sinne einer Vaskulitis mit beeinflußt. Bei Beginn der Behandlung lagen mehrere zum Teil fibrinös belegte Ulzera an beiden Unterschenkeln vor. Nach Rücksprache mit der Patientin began die Behandlung mit systemischer Gabe von Steroiden und gleichzeitiger lokaler Applikation des gemäß Beispiel 1 hergestellten Enzymextrakts zur Förderung des Debridements. Es wurden vergleichend Fibrolan® Salbe und wässrige Lösungen des erfindungsgemäßen Extraktes eingesetzt. Fibrolan® Salbe ist ein in der Roten Liste angegebenes Präparat enthaltend als Wirkstoffe Plasmin aus Rinderplasma und Desoxyribonuclease aus Rinderpankreas. Bei den Extrakten aus den Larven wurde zwischen den Extrakten aus dem Vorderteil und dem Hinterteil der Larven unterschieden. Die Zuordnung erfolgte am Anfang der Therapie und wurde über die gesamte Dauer der Behandlung beibehalten. In an 82 year old patient who has had chronic recurrent ulcers for years curum suffers, the enzyme extract prepared according to Example 1 was 2 ml each used. The ulcers are of venous origin and are caused by the ingestion of Painkillers in the sense of vasculitis also affected. At the start of treatment there were several ulcers, some of which were fibrinous, on both lower legs. To In consultation with the patient, treatment began with systemic administration of Steroids and simultaneous local application of that prepared according to Example 1 Enzyme extract to promote debridement. There were comparative Fibrolan® Ointment and aqueous solutions of the extract according to the invention are used. Fibrolan® Ointment is a preparation in the red list containing plasmin as active ingredients from bovine plasma and deoxyribonuclease from bovine pancreas. With the extracts from the larvae were between the extracts from the front and the rear of the Larvae distinguished. The assignment was made at the beginning of therapy and was over maintain the entire duration of treatment.

Es zeigte sich, dass die okklusive Applikation der erfindungsgemäßen Extrakte der Anwendung mit Fibrolan® Salbe in bezug auf debridierende Wirkung und der Geschwindigkeit des Wundverschlusses deutlich überlegen war. Der Behandlungserfolg wurde an Hand von Farbaufnahmen dokumentiert. It was found that the occlusive application of the extracts of the invention Use with Fibrolan® ointment in relation to the debriding effect and the Speed of wound closure was clearly superior. The success of treatment was documented using color photographs.

Bei einer 87 Jahre alten Patientin, die seit Jahren an Ulzera curum vaskulitischer Genese leidet, wurde der gemäß Beispiel 1 hergestellte Enzymextrakt eingesetzt. Nach der systemischen Einnahme von Steroiden traten keine weiteren Ulzerationen auf. Die Lokaltherapie erfolgte vergleichend mit Fibrolan® Salbe und den erfindungsgemäßen Extrakten. Das Ulkus, welches mit den erfindungsgemäßen Extrakten behandelt wurde zeigte am Anfang eine stärkere nekrotische und fibrinöse Belegung als der Vergleichsulkus, der mit Fibrolan® Salbe behandelt wurde. In an 87 year old patient who has had vasculitic ulcer for years Genesis suffers, the enzyme extract prepared according to Example 1 was used. To No systemic ulceration occurred after systemic steroid use. The Local therapy was compared with Fibrolan® ointment and the invention Extracts. The ulcer, which was treated with the extracts according to the invention initially showed a stronger necrotic and fibrinous coverage than that Comparative ulcer that was treated with Fibrolan® ointment.

Nach 8 Tagen Behandlung zeigte sich ein deutlich schnelleres Debridement des Ulcus, welches mit den erfindungsgemäßen Extrakten behandelt wurde, im Vergleich mit der Fibrolan® Salbe. Der Behandlungserfolg wurde an Hand von Farbaufnahmen dokumentiert. After 8 days of treatment there was a significantly faster debridement of the ulcer, which was treated with the extracts according to the invention in comparison with the Fibrolan® ointment. The treatment success was based on color pictures documented.

Claims

1. Enzymes or enzyme isolates with wound healing effects, obtainable from Fly larvae of the genus Lucilia.

2. Enzymes or enzyme isolates according to claim 1, characterized in that they from the species Lucilia sericata, Lucilia sarcophaga or Sarcophaga carnaria come.

3. Enzymes or enzyme isolates according to claims 1 or 2, characterized characterized that they come from 5 to 8 day old fly larvae.

4. Process for the production of enzymes or enzyme isolates with wound healing Effect according to one or more of claims 1 to 3, by characterized that larvae of the genus Lucilia were killed before pupation and are homogenized, the homogenate obtained is then not dissolved components is freed and the soluble components preserved become.

5. The method according to claim 4, characterized in that 5 to 8 days old Fly larvae are used.

6. The method according to claims 4 or 5, characterized in that the Homogenization is done mechanically or by ultrasound.

7. The method according to one or more of claims 4 to 6, by characterized by the separation of insoluble components by Centrifugation or filtration takes place.

8. The method according to claim 7, characterized in that a sterile filtration with a filter with a pore diameter of 0.1 µm to 0.4 µm.

9. Medicinal products characterized by an effective content of Enzymes according to the invention or enzyme isolates with wound healing effects according to claims 1 to 3 together with a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable carrier.

10. Use of the enzymes or enzyme isolates with wound healing effect according to of claims 1 to 3 for the manufacture of medicaments for the therapy of superficial or deep chronic and acute wounds of any origin.

11. Use according to claim 10, characterized in that a pharmaceutical composition used for topical application on the skin will, like ointment, solution, suspension, cream, powder, liposomal or oleosomal formulations, gel, lotion, paste, spray, aerosol or oil.

12. Use according to claims 10 or 11, characterized in that the enzymes or enzyme isolates in a concentration of 0.1% by weight to 100% by weight be used in the pharmaceutical composition.

13. Use according to claim 12, characterized in that the enzymes or enzyme isolates according to claims 1 to 3 in a concentration of 1.0 wt .-% to 60 wt .-% used in the galenical composition become.

14. Use according to claim 10, characterized in that a pharmaceutical composition for transdermal applications as plasters available.

15. Use according to claim 10, characterized in that the enzymes or enzyme isolates according to claims 1 to 3 in a wound dressing Gauze, from alginates, from hydrocolloidal materials, foams or Silicone pads, each coated with these enzymes or enzyme isolates, or are soaked.

16. Use according to claim 10, characterized in that the enzymes or enzyme isolates according to claims 1 to 3 in pharmaceutical preparations are used, which contain the enzymes in inactive form and which then in or be applied to the wound and by adding specific Substances are activated.