DE10135497A1

DE10135497A1 - Separating proteins by two-dimensional electrophoresis, useful for proteome analysis, with second separation by capillary electrophoresis

Info

Publication number: DE10135497A1
Application number: DE2001135497
Authority: DE
Inventors: Heinz Eipel; Markus Hammermann; Herbert Platsch; Gerhard Weber
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-07-20
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2003-01-30

Abstract

Separating and detecting proteins or protein samples (A) of cellular origin by subjecting them, dissolved in buffer solution, to separation by free-flow electrophoresis, isoelectric focusing or isotachophoresis into individual fractions, which are labeled, and further separation by capillary electrophoresis (CE), using capillaries, with detection of at least one label, is new.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung und Detektion und zur Markierung von Proteinen, um eine Beschleunigung der Proteomanalytik zu erreichen. The invention relates to a method for separation and detection and Labeling of proteins to accelerate proteome analysis.

Als Proteom bezeichnet man alle Proteine eines Organismus, einer Zelle, einer Organelle oder einer Körperflüssigkeit zu einem definierten Zeitpunkt und unter genau definierten Bedingungen. In der Proteomanalytik werden Proteine daraufhin untersucht, welche Proteine welche Rolle in biologischen Vorgängen spielen und welchen Proteinen eine besondere Bedeutung in Wechselwirkung mit anderen Proteinen zukommt. Ferner wird im Rahmen der Proteomanalytik der Frage nachgegangen, inwieweit Chemikalien, Wirkstoffe und andere externe Faktoren (Umwelteinflüsse, Hitze, Kälte, Wassermangel, pH-Wert usw.) die zelluläre Proteinexpression beeinflussen. In der Toxikologie und der Pharmakologie wird mit der Proteomanalytik des weiteren versucht, zu ergründen, welche Proteine in welchen Proteinkonstellationen für welche Nebenwirkungen verantwortlich sein könnten. Schließlich wird dort der Frage nachgegangen, ob die Proteinexpression für Mikroorganismen derart beeinflusst werden kann, das die Raum-Zeit-Ausbeuten von fermentativen Produktionsprozessen verbessert werden können. A proteome is the term for all proteins in an organism, a cell, an organelle or a body fluid at a defined time and under precisely defined ones Conditions. In proteome analysis, proteins are then examined to determine which Proteins which role in biological processes and which proteins one Interaction with other proteins is of particular importance. Furthermore, in In the context of proteome analysis, the question was explored to what extent chemicals and active substances and other external factors (environmental influences, heat, cold, lack of water, pH value etc.) affect cellular protein expression. In toxicology and the Proteome analysis also tries to find out which pharmacology Proteins in which protein constellations are responsible for which side effects could be. Finally, the question of whether protein expression for Microorganisms can be influenced in such a way that the space-time yields of fermentative production processes can be improved.

Aus technischen Gründen - sowohl die Trennung als auch die Detektion betreffend - ist eine vollständige quantitative Beobachtung und Auswertung aller Proteine eines Proteoms bisher nicht möglich; hydrophobe Proteine, Proteine extremer Größe, seien sie besonders groß oder besonders klein, stark sauer oder stark basisch, verursachen ernsthafte Probleme bei der Trennung solcher Proteine, so dass sich vollständige Proteome selbst unter sonst optimalen Bedingungen nicht detektieren lassen. Gegenwärtig wird davon ausgegangen, das erheblich mehr als 50% aller exprimierten Proteine quantitativ erfasst werden können. Ein erhebliches Problem stellt angesichts der unübersehbaren Vielzahl von exprimierten Proteine die Probenaufbereitung dar. In der Phase der Probenaufbereitung werden die Weichen dafür gestellt, auch komplexe aufgebaute Proteinmuster zu trennen und zu identifizieren. For technical reasons - regarding both the separation and the detection - is a complete quantitative observation and evaluation of all proteins of a proteome not yet possible; Hydrophobic proteins, proteins of extreme size, are special large or particularly small, strongly acidic or strongly basic, cause serious problems in the separation of such proteins, so that complete proteomes self underneath optimal conditions not to be detected. It is currently assumed that significantly more than 50% of all expressed proteins can be quantified. A significant problem is given the vast number of expressed Proteins are the sample preparation. In the sample preparation phase, the Set the course to separate and close even complex protein patterns identify.

Es hat sich herausgestellt, dass die Löslichkeit die Auftrennung von Proteinen erheblich beeinflusst. Proteine, die sich gut im Wasser lösen, bereiten in der Regel keine Probleme hinsichtlich der Auftrennbarkeit. Proteine mit stabilen Sekundär- oder Tertiärstrukturen, die schwer wasserlöslich sind, werden hinsichtlich ihres Löslichkeitsverhaltens zur Zugabe von chaotropen Substanzen wie beispielsweise Guanidin-Hydrochlorid oder Harnstoff stabilisiert. Dabei kann es jedoch zu unerwünschten Reaktionen einzelner Proteine kommen, wodurch ein ursprünglich in einer Form vorliegendes Protein in mehrere Formen übergeht und so die Heterogenität der bereits vorliegenden Probe zusätzlich erweitert wird. It has been found that the solubility of protein separation is significant affected. Proteins that dissolve well in water are generally not a problem in terms of separability. Proteins with stable secondary or tertiary structures, those that are sparingly water-soluble are added in terms of their solubility behavior of chaotropic substances such as guanidine hydrochloride or urea stabilized. However, this can lead to undesirable reactions of individual proteins come, whereby a protein originally present in one form comes in several forms passes and thus the heterogeneity of the sample already available is further expanded.

Membran-Proteine, deren natürliche Umgebung Lipidmembranen sind und die während ihrer Isolation voneinander direkt wieder zum Agglomerieren neigen und wieder unlöslich werden, sind besonders schwer zu handhaben. Diese hydrophoben Proteine können im gelösten Zustand gehalten werden, wenn Detergentien zugegeben werden, die jedoch häufig die nachfolgenden Stadien der Proteinauftrennung beeinträchtigen können. Membrane proteins, the natural environment of which are lipid membranes and which occur during their isolation from each other tend to agglomerate again and become insoluble again are particularly difficult to handle. These hydrophobic proteins can be kept in a dissolved state when detergents are added, however can often affect the subsequent stages of protein separation.

Hohe Proteinkonzentrationen sind zwar für die meisten Auftrennverfahren und Auswerteprozeduren im hohen Maße erwünscht, gehen jedoch mit dem Risiko einher, dass sich Aggregationen ausbilden können. Im Gegensatz dazu sind niedrige Proteinkonzentrationen, die sich positiv auf das Löslichkeitsverhalten auswirken, mit zusätzlichen Vorbereitungsschritten vor der eigenen Separation verbunden. High protein concentrations are necessary for most separation processes and Evaluation procedures are highly desirable, but are associated with the risk that can form aggregations. In contrast, are low Protein concentrations that have a positive effect on solubility behavior additional preparation steps before your own separation.

Die bisherigen Auftrenntechniken im Bereich der molaren Masse von Proteinen sind die Elektrophorese einerseits und die Chromatographie andererseits. Jedoch vermag keine dieser beiden Auftrenntechniken von Proteinen alleine wesentlich mehr als 100 verschiedene Komponenten zu trennen. Da jedoch eine einfache Zelle in der Regel bereits mehrere Tausend verschiedene Spezies von Proteinen enthält und die Menge der in einer Probe enthaltenen Proteine um den Faktor 106 differieren kann, muss eine ausreichend bemessene Trennkapazität zur Verfügung gestellt werden, die nur durch gekoppelte, mehrdimensionale Auftrennverfahren geschaffen werden kann. The previous separation techniques in the area of the molar mass of proteins are Electrophoresis on the one hand and chromatography on the other. However, none can of these two protein separation techniques alone, considerably more than 100 separate different components. However, since a simple cell usually already contains several thousand different species of proteins and the amount of them in one Proteins contained in the sample can differ by a factor of 106, must be sufficient rated separation capacity is provided, which can only be achieved by coupled, multi-dimensional separation process can be created.

Proteine haben den Charakter von Zwitterionen und können dementsprechend positiv oder negativ geladen sein. Mit Elektrophorese-Verfahren können einzelne Komponenten entsprechend ihrer Mobilität im elektrischen Feld getrennt werden. Die elektrophoretische Mobilität jedes Proteins ist ein charakteristischer Wert. Im Rahmen der Proteomanalytik werden zwei Elektrophorese-Verfahren angewendet, die isoelektrische Fokussierung (IEF) und die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Proteins have the character of zwitterions and can therefore be positive or be negatively charged. Using electrophoresis procedures, individual components can be be separated according to their mobility in the electrical field. The electrophoretic Mobility of each protein is a characteristic value. As part of proteome analysis two electrophoresis methods are used, isoelectric focusing (IEF) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).

Bei der isoelektrischen Fokussierung bewegen sich die einzelnen Proteine auf dem Gel innerhalb eines pH-Gradienten zu ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt, an dem sie ihre Nettoladung ausgleichen und so ihre elektrophoretische Mobilität einbüßen. Bewegt sich ein Protein aufgrund thermischer Diffusionserscheinungen aus der pH-Region, die der isoelektrischen Ladung entspricht, so nimmt es wieder eine Ladung an und bewegt sich im elektrischen Feld wieder zurück zu der Stelle im pH-Gradienten, die seinem isoelektrischen Punkt entspricht. With isoelectric focusing, the individual proteins move on the gel within a pH gradient to their respective isoelectric point at which their Balance the net charge and thus lose your electrophoretic mobility. Is moving a protein due to thermal diffusion from the pH region that the corresponds to isoelectric charge, it takes on a charge again and moves in the electric field back to the point in the pH gradient that is his corresponds to the isoelectric point.

Das SDS-PAGE-Verfahren sieht das Beladen sämtlicher Proteine mit Natriumdodecylsulfat ( = SDS) vor; die negativen SDS-Protein-Komplexe bewegen sich in Richtung Anode im elektrischen Feld und lassen sich entsprechend ihrer molekularen Größen in der Polyacrylamidmatrix trennen. The SDS-PAGE process sees the loading of all proteins Sodium dodecyl sulfate (= SDS); the negative SDS-protein complexes move in Direction anode in the electric field and can be according to their molecular Separate sizes in the polyacrylamide matrix.

Aus der Kombination des IEF- und des SDS-PAGE-Verfahrens entstand die 2D-Gel- Elektrophorese (2D-PAGE) nach Klose und O'Farrell 1975 (J. Biol. Chm. 1975, 250, 4007 bis 4020, Humangenetik, 1975, 25, 231 bis 245). The combination of the IEF and SDS-PAGE processes resulted in the 2D gel Electrophoresis (2D-PAGE) according to Klose and O'Farrell 1975 (J. Biol. Chm. 1975, 250, 4007 to 4020, human genetics, 1975, 25, 231 to 245).

Dieses Verfahren sieht eine Trennung der Proteine in der ersten Dimension mit der isoelektrischen Fokussierung nach ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt vor. Als zweite Dimension wird eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Auftrennung der Proteine nach ihrer Größe durchgeführt. Diese Methode stellt derzeit die einzige Vorgehensweise dar, mit welcher komplexe Proteinmixturen mit hoher Auflösung aufgetrennt werden können. Die Vorteile des 2D-PAGE-Verfahrens sind die zwei zueinander komplementären Trennprinzipien, nämlich IEF- und SDS-PAGE-Verfahren nach Ladung und Molgewicht. Diese Technik lässt sich prinzipiell bei allen Proteinen nutzen. Das Auflösungsvermögen dieser Methode kann durch den Einsatz von engen pH- Gradienten in der isoelektrischen Fokussierung deutlich erhöht werden ("Zoom-Gele"). This method sees a separation of the proteins in the first dimension with the isoelectric focusing according to their respective isoelectric point. Second Dimension will be a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Separation of the proteins carried out according to their size. This method is currently the is the only procedure with which complex protein mixtures with high resolution can be separated. The advantages of the 2D-PAGE method are the two Complementary separation principles, namely IEF and SDS-PAGE methods according to cargo and molecular weight. In principle, this technique can be used for all proteins use. The resolving power of this method can be achieved by using narrow pH Gradients in the isoelectric focusing can be increased significantly ("zoom gels").

Andererseits bestehen bei den aufgezählten Verfahren auch Nachteile dahingehend, dass einige Erfahrung und einiges Geschick bei der Probenaufbereitung erforderlich sind. Die Auftragsmenge ist begrenzt, so dass schwach exprimierte Proteine nicht direkt detektiert werden können. Der Protein-Transfer von der ersten zur zweiten Dimension ist schwierig und schlecht reproduzierbar. Eine einfache Automatisierungsmöglichkeit ist bei diesem Verfahren nicht gegeben. Auch werden nicht alle Proteine durch dieses Verfahren detektiert. Für Molekulargewichte kleiner als 10.000 und für Molekulargewichte größer als 100.000 werden keine befriedigenden und aussagekräftigen Resultate erhalten. Nach der Trennung im Gel müssen die Proteine noch aufwändig gefärbt werden. On the other hand, there are also disadvantages with the methods listed in that some experience and some skill in sample preparation are required. The The quantity applied is limited so that weakly expressed proteins are not directly detected can be. Protein transfer from the first to the second dimension is difficult and difficult to reproduce. A simple automation option is with this Procedure not given. Also, not all proteins are made by this procedure detected. For molecular weights less than 10,000 and for molecular weights greater than 100,000 will not get satisfactory and meaningful results. After Separation in the gel means that the proteins still have to be stained with great effort.

Das Färben kann z. B. mit Farbstoffen wie Coomassie-Blau, mit kolloidalem Silber, mit Zink/Imidazol oder mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Sypro®Ruby, Sypro®Orange oder Sypro®Red. Allen eingesetzten Färbemethoden ist gemeinsam, dass die Bindung zwischen Protein und Färbereagenz nicht kovalent, sondern auf der Basis von ionischen, hydrophoben oder Van-der-Waals-Wechselwirkungen erfolgt. Im Anschluß an die Färbung werden die Gele in der Regel mit Hilfe eines Scanners oder eines Fluoreszenz-Scanners digitalisiert. The dyeing can e.g. B. with dyes such as Coomassie blue, with colloidal silver, with Zinc / imidazole or with fluorescent dyes such as Sypro®Ruby, Sypro®Orange or Sypro®Red. All the dyeing methods used have in common that the bond between Protein and staining reagent are not covalent, but based on ionic, hydrophobic or van der Waals interactions. Following the coloring The gels are usually scanned using a scanner or a fluorescence scanner digitized.

In US 6,043,025 und in US 6,127,134 wird ein Prozeß und ein Kit beschrieben, mit welchem man Unterschiede in zwei oder mehreren Proteinproben detektieren kann. Die Proteinextrakte von unterschiedlichen Proben werden mit verschiedenen, positiv geladenen Fluoreszenzfarbstoffen kovalent markiert, vereinigt und dem 2D-PAGE-Verfahren unterworfen. Identische Proteine aus den verschiedenen Proben können dann anhand ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlänge im gleichen Gel detektiert und quantifiziert werden. A process and a kit are described in US Pat. No. 6,043,025 and US Pat. No. 6,127,134 which one can detect differences in two or more protein samples. The Protein extracts from different samples are loaded with different, positively charged ones Fluorescent dyes covalently labeled, combined and the 2D PAGE method subjected. Identical proteins from the different samples can then be identified based on their different fluorescence wavelengths detected and quantified in the same gel become.

Gemäß der in US 6,127,134 offenbarten Lösung werden die Proteine einer ersten Zelle mittels bekannter Behandlungstechniken präpariert, wobei die erste Zelle aus einer ersten Gruppe von Zellen stammt. Die Proteine werden mit einem ersten Farbstoff aus einem Paar von Farbstoffen kovalent markiert. Danach erfolgt die Präparation einer zweiten Zelle mittels bekannter Behandlungstechniken, die einer zweiten Gruppe von Zellen entnommen wurde. Die Proteine dieser zweiten Zelle werden mit einem zweiten Farbstoff kovalent markiert. According to the solution disclosed in US 6,127,134, the proteins are a first cell prepared using known treatment techniques, the first cell from a first Group of cells. The proteins are paired with a first dye covalently marked by dyes. Then a second cell is prepared using known treatment techniques taken from a second group of cells has been. The proteins of this second cell become covalent with a second dye marked.

Alternativ zu den genannten Färbemethoden können auch radioaktive Verfahren eingesetzt werden. Dazu werden die Zellen mit bestimmten isotopenmarkierten Verbindungen wie beispielsweise ³⁵S-Cystein oder ³²PO₄ ^3- versetzt. Im Anschluß an die 2D-PAGE wird zur Digitalisierung in diesen Fällen gewöhnlich ein Phosphorimager eingesetzt. Mit Bildauswerteprogrammen wie beispielsweise MELANIE, PDQUEST, IMAGEMASTER oder Z3 werden in den erhaltenen digitalisierten Gelen anschließend die Proteinspots detektiert, quantifiziert und zugeordnet. Die Erkennung der einzelnen Spots sowie die Zuordnung der Spots zwischen den einzelnen Gelen ( = "Matchen") sind sehr zeitaufwändig und erfordern manuelles Eingreifen des Operators. As an alternative to the staining methods mentioned, radioactive methods can also be used. For this purpose, the cells are mixed with certain isotope-labeled compounds such as, for example, ³⁵ S-cysteine or ³² PO ₄ ^3- . Following the 2D PAGE, a phosphor imager is usually used for digitization in these cases. With image evaluation programs such as MELANIE, PDQUEST, IMAGEMASTER or Z3, the protein spots are then detected, quantified and assigned in the digitized gels obtained. The detection of the individual spots and the assignment of the spots between the individual gels (= "matches") are very time-consuming and require manual intervention by the operator.

Die gesamte Prozedur, ausgehend von der Elektrophorese bis hin zur Färbung, Detektion und Quantifizierung gemäß des 2D-PAGE-Verfahrens ist äußerst personalintensiv und zeitintensiv. The entire procedure, starting from electrophoresis to staining, detection and quantification according to the 2D-PAGE method is extremely personnel-intensive and time-consuming.

Angesichts der skizzierten technischen Probleme liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Trennverfahren für Proteine zu entwickeln, welches den Einsatz von Gelen reduziert, schnell und einfach durchführbar ist sowie insbesondere automatisierbar und eine einfache Quantifizierung der aufgetrennten Proteine erlaubt. In view of the technical problems outlined, the invention has the object to develop a separation process for proteins, which requires the use of gels reduced, quick and easy to carry out and in particular automatable and a simple quantification of the separated proteins allows.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Trennung und Detektion von Proteinen gelöst, wobei die Proteinproben in einer Trennpufferlösung enthalten sind und die nachfolgenden Verfahrensschritte durchlaufen werden:

- Die Proteinproben werden in einem ersten Trennschritt gemäß der Free- Flow-Elektrophorese mit der isoelektrischen Fokussierung (IEF) oder der Isotachophorese in einzelne Fraktionen zerlegt und mit einem Markierungsstoff versetzt;
- in einem zweiten Trennschritt werden die Proteinfraktionen gemäß der Kapillarelektrophorese in einer oder mehreren Kapillaren aufgetrennt, wobei in der oder den Kapillaren ein Markierungsstoff detektiert wird.

According to the invention, this object is achieved by a method for the separation and detection of proteins, the protein samples being contained in a separation buffer solution and the following method steps being carried out:

- In a first separation step, the protein samples are broken down into individual fractions according to free-flow electrophoresis with isoelectric focusing (IEF) or isotachophoresis and a marker is added;
- In a second separation step, the protein fractions are separated in one or more capillaries according to capillary electrophoresis, a marker substance being detected in the capillary or capillaries.

Die Vorteile des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens liegen vor allem darin, dass die Auftrennung der Proteine bzw. der zellulären Proteine nunmehr automatisiert werden kann. Dadurch läßt sich der Probendurchsatz im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren parallelisieren und dadurch erheblich steigern. Ferner kann mit dem vorgeschlagenen Verfahren die jetzige komplizierte personalintensive Bildauswertung entfallen. Ferner kann die aufzutragende Probenauftragsmenge erheblich verringert werden. Das Markieren der Proteinproben beispielsweise mittels der Fluoreszenzmarkierung erhöht die Empfindlichkeit und damit das Auflösungsvermögen hinsichtlich der Detektion schwach exprimierter Proteine erheblich. The advantages of the method proposed according to the invention are primarily that that the separation of the proteins or the cellular proteins is now automated can be. This allows the sample throughput to be compared to conventional Parallelize procedures and thereby significantly increase them. Furthermore, with the proposed method, the current complicated, personnel-intensive image evaluation omitted. Furthermore, the sample application quantity to be applied can be considerably reduced become. The labeling of the protein samples, for example by means of the Fluorescent labeling increases the sensitivity and thus the resolving power with regard to the detection of weakly expressed proteins.

In einer vorteilhaften Ausführungsvariante des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens, werden nach dem ersten Trennschritt erhaltene Proteinfraktionen mit einem Markierungsstoff versetzt. Dies kann z. B. durch Zugabe eines Fluoreszenzfarbstoffes wie z. B. Sypro®Ruby, Sypro®Orange oder Sypro®Red erfolgen. Die Fluoreszenzfarbstoffe wie Sypro®Ruby, Sypro®Orange oder Sypro®Red werden nur adsorptiv gebunden, z. B. durch hydrophobe, ionische oder Van-der-Waals'sche Kräfte. In an advantageous embodiment variant of the one proposed according to the invention Process, protein fractions obtained after the first separation step with a Marking substance added. This can e.g. B. by adding a fluorescent dye such as z. B. Sypro®Ruby, Sypro®Orange or Sypro®Red. The fluorescent dyes like Sypro®Ruby, Sypro®Orange or Sypro®Red are only adsorptively bound, e.g. B. by hydrophobic, ionic or Van der Waals forces.

In einem zweiten Trennschritt werden ein oder mehrere Kapillaren eingesetzt, die in bevorzugter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens Polyacrylamidgel enthalten. Die Detektion der einzelnen Proteine erfolgt im zweiten Trennschritt mit laserinduzierter Fluoreszenz. Um eine Verbesserung des Laufverhaltens der Proteine im Rahmen der Kapillarelektrophorese zu erzielen, kann Natriumdodecylsulfat zum Trennpuffer beigegeben werden. Um eine parallele Abarbeitung einer größeren Zahl von Proteinproben nach der Free-Flow-Elektrophorese zu ermöglichen, können alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte parallel durch eine entsprechende Anzahl von Kapillaren getrennt detektiert und quantifiziert werden. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, dass ein handelsübliches Gerät zur DNA-Sequenzierung eingesetzt wird. In vorteilhafter Weise kann in der einen oder den mehreren eingesetzten Kapillaren im zweiten Trennschritt ein Fluoreszenzfarbstoff detektiert werden. In a second separation step, one or more capillaries are used, which are in preferred embodiment of the process according to the invention polyacrylamide gel contain. The individual proteins are also detected in the second separation step laser-induced fluorescence. To improve the running behavior of the proteins in the To achieve capillary electrophoresis, sodium dodecyl sulfate can be used Separation buffer can be added. To process a large number of Allow protein samples after free flow electrophoresis Wells of a microtiter plate parallel by a corresponding number of Capillaries can be detected and quantified separately. This can e.g. B. thereby achieved that a commercially available device for DNA sequencing is used. In can advantageously in the one or more capillaries used in second separation step, a fluorescent dye can be detected.

Die empfindliche Fluoreszenz der Detektion gewährleistet einen großen dynamischen Bereich und eine hohe Empfindlichkeit. Durch die hohe Trennleistung der Kapillarelektrophorese wird eine wesentlich bessere Auflösung in der zweiten Dimension, verglichen mit den 2D-PAGE-Gelverfahren erreicht. Aufgrund der erzielbaren hohen Automatisierbarkeit beider Trennschritte, der FFE und der Kapillarelektrophorese, läßt sich ein wesentlich höherer Durchsatz erzielen und damit eine bessere statistische Absicherung der gemessenen Ergebnisse gewinnen. The sensitive fluorescence of the detection ensures a large dynamic Range and high sensitivity. Due to the high separation performance of the Capillary electrophoresis becomes a much better resolution in the second dimension, compared to the 2D PAGE gel method. Because of the achievable high Automation of both separation steps, the FFE and the capillary electrophoresis, lets achieve a significantly higher throughput and thus a better statistical Gain assurance of the measured results.

Die Auftrennung der Proteinproben kann im ersten Trennschritt in vorteilhafter Weise in eine Mikrotiterplatte erfolgen, wobei eine Mikrotiterplatte eingesetzt werden kann, deren Anzahl von Vertiefungen der Anzahl der getrennten Proteinfraktionen entspricht. Die Anzahl der Kapillaren, die im zweiten Trennschritt gemäß der Kapillarelektrophorese eingesetzt werden kann, entspricht der Anzahl der in der Mikrotiterplatte eingebrachten Anzahl von Probenfraktionen. The separation of the protein samples can advantageously in the first separation step in a microtiter plate can be used, wherein a microtiter plate can be used, the Number of wells corresponds to the number of separated protein fractions. The Number of capillaries in the second separation step according to capillary electrophoresis can be used corresponds to the number of inserted in the microtiter plate Number of sample fractions.

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren, welches in zwei Trennschritten unter Ausnutzung der Free-Flow-Elektrophorese (FFE) und der Kapillarelektrophorese erfolgt, sei nachfolgend näher beschrieben unter Nennung der benutzten Komponenten. The proposed method according to the invention, which in two separation steps Free-flow electrophoresis (FFE) and capillary electrophoresis are used, be described in more detail below with a mention of the components used.

Bei der von Hannig entwickelten Free-Flow-Elektrophorese (Hannig in Electrophoresis 1982, 3, 235-243) fließt senkrecht zu einem elektrischen Feld ein kontinuierlicher Pufferfilm. An einer Seite der Free-Flow-Elektrophoresekammer wird an einer definierten Stelle die Proteinprobe zugeführt. Im ersten Trennschritt können für das vorgeschlagene Verfahren zwei unterschiedliche Methoden der Free-Flow-Elektrophorese eingesetzt werden: Die isoelektrische Fokussierung und die Isotachophorese. In the free-flow electrophoresis developed by Hannig (Hannig in Electrophoresis 1982, 3, 235-243) a continuous flows perpendicular to an electric field Buffer film. On one side of the free flow electrophoresis chamber is on a defined Place the protein sample. In the first separation step, the proposed Two different methods of free flow electrophoresis are used become: Isoelectric focusing and isotachophoresis.

Zur isoelektrischen Fokussierung wird mit Hilfe von Trägerampholyten (Gerhard Weber und Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 1649-1653), die zusammen mit dem Puffermedium appliziert werden, ein pH-Gradient zwischen den beiden Elektroden senkrecht zur Fließrichtung des Pufferfilms erzeugt, der die Proteine aufgrund deren Ladung im freien Fluß auftrennt (FFE-IEF). Am anderen Ende der Free-Flow- Elektrophoresekammer werden die Einzelfraktionen durch eine Reihe von Schläuchen in den einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte - um ein Beispiel zu nennen - aufgesammelt. Carrier ampholytes (Gerhard Weber and Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 1649-1653), which together with the Buffer medium are applied, a pH gradient between the two electrodes perpendicular to the direction of flow of the buffer film, which the proteins due to Charge separates in free flow (FFE-IEF). At the other end of the free flow The individual fractions are separated by a series of tubes into the electrophoresis chamber the individual wells of a microtiter plate - to give an example - collected.

Alternativ zur skizzierten FFE-IEF kann die Isotachophorese im ersten Trennschritt eingesetzt werden. In einem diskontinuierlichen Puffersystem, bestehend aus Leit- und Folgeelektrolyt, bildet sich im elektrischen Feld ein Potentialgradient aus. Im Bereich der Ionen mit niedriger Mobilität ist die Feldstärke höher als im Bereich der mobileren Ionen. Da die Wanderung aller Ionen mit gleicher Geschwindigkeit erfolgen muß, bilden sich aus dem Proteinprobengemisch reine Zonen der einzelnen Proteine aus. Im Gleichgewichtszustand folgt das Ion mit der höchsten Mobilität dem Leit-Ion des Leitelektrolysten, das mit der niedrigsten Mobilität wandert vor dem Folgeelektrolyten; die anderen wandern dazwischen in der Reihenfolge abnehmender Mobilitäten. In der Praxis wird eine Intervall-Isotachophorese durchgeführt (Gerhard Weber und Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 3090-3093). Nach dem Aufbringen der Proteinprobe und dem Aufbringen der Elektrolyte auf der Free-Flow-Elektrophoresekammer wird für wenige Minuten, vorzugsweise 2 Minuten, Hochspannung zur Trennung der Proteine angelegt, anschließend werden die getrennten Fraktionen spannungslos über eine Reihe von Schläuchen in die einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte befördert. As an alternative to the FFE-IEF outlined, isotachophoresis can be performed in the first separation step be used. In a discontinuous buffer system consisting of control and Subsequent electrolyte, a potential gradient forms in the electrical field. In the field of Ions with low mobility have a higher field strength than in the area of more mobile ions. Since all ions have to migrate at the same speed, they form pure zones of the individual proteins from the protein sample mixture. in the Equilibrium state, the ion with the highest mobility follows the leading ion of the Lead electrolysts that migrate with the lowest mobility in front of the subsequent electrolyte; the others move in between in the order of decreasing mobility. In practice an interval isotachophoresis is performed (Gerhard Weber and Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 3090-3093). After applying the protein sample and the Applying the electrolytes to the free-flow electrophoresis chamber is done for a few Minutes, preferably 2 minutes, high voltage is applied to separate the proteins, then the separated fractions are de-energized over a series of Tubes conveyed into the individual wells of a microtiter plate.

Für den erfindungsgemäß vorgeschlagenen ersten Schritt zur Trennung der Proteinproben - sowohl für die FFE-IEF als auch für die Free-Flow-Isotachophorese - wird beispielsweise das Elektrophoresegerät "OCTOPUS" der Firma Dr. Weber GmbH eingesetzt. For the first step according to the invention for separating the protein samples - both for the FFE-IEF and for the free-flow isotachophoresis - for example the electrophoresis device "OCTOPUS" from Dr. Weber GmbH used.

In diesem zur Durchführung des Elektrophoreseverfahrens geeigneten Gerät werden nach der isoelektrischen Fokussierung FFE-IEF (oder der Isotachophorese) einzelne Proteinfraktionen (vorzugsweise 96) in Mikrotiterplatten erhalten. Die Proteine in diesen Fraktionen können mit einem Markierungsstoff, beispielsweise einem Fluoreszenzfarbstoff versetzt werden. Dazu eignen sich beispielsweise Farbstoffe wie Sypro®Orange, Sypro®Red oder Sypro®Ruby. In this device suitable for carrying out the electrophoresis process, according to the FFE-IEF (or isotachophoresis) single isoelectric focusing Protein fractions (preferably 96) obtained in microtiter plates. The proteins in these Fractions can be with a label, such as a fluorescent dye be transferred. Dyes such as Sypro®Orange are suitable for this, Sypro®Red or Sypro®Ruby.

Im nachfolgenden Trennschritt lassen sich die durch Markierungsstoffe fluoreszenzmarkierten Proteine unter Anwendung des Kapillarelektrophoreseverfahrens separieren. Dazu können die Kapillaren mit einem Polyacrylamidgel befüllt werden. Die Detektion erfolgt bevorzugt mit laserinduzierter Fluoreszenz, wobei zur Verbesserung des Laufverhaltens der Proteine in der Kapillarelektrophorese Natriumdodecylsulfat zum Trennpuffer beigegeben werden kann. Idealerweise werden alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte parallel in eben so vielen Kapillaren getrennt, detektiert und anschließend quantifiziert. In bevorzugter und ein einfaches Vorgehen gewährleistender Weise wird ein handelsübliches Gerät zur DNA-Sequenzierung eingesetzt, beispielsweise ein MEGA-Bace von Amersham Pharmacia oder ein anderes Gerät ähnlicher Bauart. Ein Vorteil gegenüber der herkömmlichen 2D-Gelelektrophorese liegt darin, dass die nach der hier beschriebenen Methode erhaltene Elektropherogramme unter Einsatz handelsüblicher Softwarepakete leicht quantifiziert werden können. In the subsequent separation step, the markers can be used fluorescence-labeled proteins using the capillary electrophoresis method separate. The capillaries can be filled with a polyacrylamide gel. The Detection is preferably carried out with laser-induced fluorescence, with the aim of improving the Running behavior of the proteins in capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate Separation buffer can be added. Ideally, all of the wells of the Microtiter plate separated in parallel in just as many capillaries, detected and then quantified. In a preferred manner and which ensures a simple procedure, a commercially available device for DNA sequencing used, for example a MEGA-Bace from Amersham Pharmacia or another device of similar design. An advantage over The conventional 2D gel electrophoresis is that according to the one described here Method obtained electropherograms using commercially available software packages can be easily quantified.

Durch die wesentlich empfindlicher einzustufende Fluoreszenzdetektion ist ein großer dynamischer Bereich und eine hohe Empfindlichkeit gewährleistet. Weiterhin kann durch die hohe Trennleistung innerhalb der Kapillarelektrophorese eine wesentlich bessere Auflösung der Proteinproben oder der Proteinproben zellulären Ursprungs in der zweiten Dimension, verglichen mit dem 2D-PAGE-Verfahren erreicht werden. Aufgrund der wesentlich besseren Automatisierbarkeit beider Methoden, der Free-Flow-Elektrophorese und der Kapillarelektrophorese wird ein wesentlich höherer Durchsatz und damit eine höhere Parallelität und eine bessere statistische Absicherung der Ergebnisse erhalten. Nach Durchführung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens ist eine Programmsequenz zur Auswertung der Elektropherogramme zu erstellen. Ferner sind zur Realisierung des Verfahrens eine Free-Flow-Elektrophoreseapparatur ("Octopus") wie z. B. von der Firma Dr. Weber GmbH erhältlich, erforderlich sowie ein Sequenzer z. B. MEGA- Bace der Firma Amersham oder ein ähnlich beschaffenes Gerät. The fluorescence detection, which is much more sensitive, is a large one dynamic range and high sensitivity guaranteed. Furthermore, by the high separation performance within capillary electrophoresis is a much better one Dissolution of the protein samples or the protein samples of cellular origin in the second Dimension compared to the 2D PAGE method can be achieved. Due to the both methods, free flow electrophoresis, can be automated much better and capillary electrophoresis becomes a much higher throughput and thus one Get higher parallelism and better statistical validation of the results. To Implementation of the method proposed according to the invention is one To create a program sequence for evaluating the electropherograms. Furthermore, the Realization of the method a free-flow electrophoresis ("Octopus") such. B. from the company Dr. Weber GmbH available, required and a sequencer z. B. MEGA Bace from Amersham or a similar device.

Claims

1. Process for the separation and detection of proteins or protein samples of cellular origin, the proteins being contained in a separation buffer solution and the following process steps being carried out:

the protein samples are broken down into individual fractions in a first separation step according to free-flow electrophoresis after isoelectric focusing (IEF) or isotachophoresis and a marker is added,

- In a second separation step, the protein fractions are separated simultaneously in one or more capillaries according to capillary electrophoresis, with the labeling substances which are not covalently bound to the proteins being detected in one or more capillaries.

2. The method according to claim 1, characterized in that after the first Separate all proteins in the protein fractions obtained with a fluorescent marker material are added.

3. The method according to claim 2, characterized in that the marking substances adsorptive by Van der Waals, ionic or hydrophobic interactions the proteins are bound.

4. The method according to claim 1, characterized in that in the second separation step the capillary used or the multiple capillaries used Contain polyacrylamide gel.

5. The method according to claim 1, characterized in that in the second separation step the capillary used or the multiple capillaries used agarose contain.

6. The method according to claim 1, characterized in that in the second separation step the capillary or capillaries used are empty.

7. The method according to claim 1, characterized in that in the second separation step the capillary or capillaries used are synthetic Contain polymer matrix.

8. The method according to claim 1, characterized in that the detection in the second Separation step takes place by means of laser-induced fluorescence.

9. The method according to claim 1, characterized in that during the Capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate to the protein-containing Separation buffer is added.