DE10120803A1 - Separating proteins by two-dimensional electrophoresis, useful for proteome analysis, with second separation by capillary electrophoresis - Google Patents

Separating proteins by two-dimensional electrophoresis, useful for proteome analysis, with second separation by capillary electrophoresis

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DE10120803A1 DE2001120803 DE10120803A DE10120803A1 DE 10120803 A1 DE10120803 A1 DE 10120803A1 DE 2001120803 DE2001120803 DE 2001120803 DE 10120803 A DE10120803 A DE 10120803A DE 10120803 A1 DE10120803 A1 DE 10120803A1
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Abstract

Separating and detecting proteins or protein samples (A) of cellular origin by subjecting them, dissolved in buffer solution, to separation by free-flow electrophoresis, isoelectric focusing or isotachophoresis into individual fractions, which are labeled, and further separation by capillary electrophoresis (CE), using capillaries, with detection of at least one label, is new.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung und Detektion von Proteinen, um eine Beschleunigung der Proteomanalytik zu erreichen.The invention relates to a method for the separation and detection of proteins, to accelerate proteome analysis.

Als Proteom bezeichnet man alle Proteine eines Organismus, einer Zelle, einer Organelle oder einer Körperflüssigkeit zu einem definierten Zeitpunkt und unter genau definierten Bedingungen. In der Proteomanalytik werden Proteine daraufhin untersucht, welche Proteine welche Rolle in biologischen Vorgängen spielen und welchen Proteinen eine besondere Bedeutung in Wechselwirkung mit anderen Proteinen zukommt. Ferner wird im Rahmen der Proteomanalytik der Frage nachgegangen, inwieweit Chemikalien, Wirkstoffe und andere externe Faktoren (Umwelteinflüsse, Hitze, Kälte, Wassermangel, pH-Wert usw.) die zelluläre Proteinexpression beeinflussen. In der Toxikologie und der Pharmakologie wird mit der Proteomanalytik des weiteren versucht, zu ergründen, welche Proteine in welchen Proteinkonstellationen für welche Nebenwirkungen verantwortlich sein könnten. Schließlich wird dort der Frage nachgegangen, ob die Proteinexpression von Mikroorganismen derart beeinfluß werden kann, daß die Raum-Zeit-Ausbeuten von fermentativen Produktionsprozessen verbessert werden können.A proteome is the term for all proteins in an organism, a cell, an organelle or a body fluid at a defined time and under precisely defined ones Conditions. In proteome analysis, proteins are then examined to determine which Proteins which role in biological processes and which proteins one Interaction with other proteins is of particular importance. Furthermore, in In the context of proteome analysis, the question was examined to what extent chemicals and active substances and other external factors (environmental influences, heat, cold, lack of water, pH value etc.) affect cellular protein expression. In toxicology and the Proteome analysis also tries to find out which pharmacology Proteins in which protein constellations are responsible for which side effects could be. Finally, the question of whether protein expression of Microorganisms can be influenced so that the space-time yields of fermentative production processes can be improved.

Aus technischen Gründen - sowohl die Trennung als auch die Detektion betreffend - ist eine vollständige quantitative Beobachtung und Auswertung aller Proteine eines Proteoms bisher nicht möglich; hydrophobe Proteine, Proteine extremer Größe, seien sie besonders groß oder besonders klein, stark sauer oder stark basisch, verursachen ernsthafte Probleme bei der Trennung solcher Proteine, so daß sich vollständige Proteome selbst unter sonst optimalen Bedingungen nicht detektieren lassen. Gegenwärtig wird davon ausgegangen, daß erheblich mehr als 50% aller exprimierten Proteine quantitativ erfaßt werden können. For technical reasons - regarding both the separation and the detection - is a complete quantitative observation and evaluation of all proteins of a proteome not yet possible; Hydrophobic proteins, proteins of extreme size, are special large or particularly small, strongly acidic or strongly alkaline, cause serious problems in the separation of such proteins, so that complete proteomes themselves among others optimal conditions not to be detected. It is currently assumed that significantly more than 50% of all expressed proteins can be quantified.  

Ein erhebliches Problem stellt angesichts der unübersehbaren Vielzahl von exprimierten Proteinen die Probenaufbereitung dar. In der Phase der Probenaufbereitung werden die Weichen dafür gestellt, auch komplexer aufgebaute Proteinmuster zu trennen und zu identifizieren.A significant problem is given the vast number of expressed Proteins are the sample preparation. In the sample preparation phase, the Set the course for separating and closing even more complex protein patterns identify.

Es hat sich herausgestellt, daß die Löslichkeit die Auftrennung von Proteinen erheblich beeinflußt. Proteine, die sich gut in Wasser lösen, bereiten in der Regel keine Probleme hinsichtlich der Auftrennbarkeit. Proteine mit stabilen Sekundär- oder Tertiärstrukturen, die schwer wasserlöslich sind, werden hinsichtlich ihres Löslichkeitsverhaltens durch Zugabe von chaotropen Substanzen wie beispielsweise Guanidin-Hydrochlorid oder Harnstoff stabilisiert. Dabei kann es jedoch zu unerwünschten Reaktionen einzelner Proteine kommen, wodurch ein ursprünglich in einer Form vorliegendes Protein in mehrere Formen übergeht und so die Heterogenität der bereits vorliegenden Probe zusätzlich erweitert.It has been found that the solubility significantly increases the separation of proteins affected. Proteins that dissolve well in water generally pose no problems in terms of separability. Proteins with stable secondary or tertiary structures, which are difficult to dissolve in water are characterized by their solubility behavior Add chaotropic substances such as guanidine hydrochloride or Stabilized urea. However, this can lead to undesirable reactions by individuals Proteins come, whereby a protein originally in one form comes in several Forms passes and so the heterogeneity of the sample already available extended.

Membran-Proteine, deren natürliche Umgebung Lipidmembranen sind und die während ihrer Isolation voneinander direkt wieder zum Agglomerieren neigen und wieder unlöslich werden, sind besonders schwer zu handhaben. Diese hydrophoben Proteine können nur im gelösten Zustand gehalten werden, wenn Detergentien zugegeben werden, die jedoch häufig die nachfolgenden Stadien der Proteinauftrennung beeinträchtigen können.Membrane proteins, the natural environment of which are lipid membranes and which occur during their isolation from each other tend to agglomerate again and become insoluble again are particularly difficult to handle. These hydrophobic proteins can only be found in be kept in a dissolved state when detergents are added, however can often affect the subsequent stages of protein separation.

Hohe Proteinkonzentrationen sind zwar für die meisten Auftrennverfahren und Auswerteprozeduren im hohen Maße erwünscht, gehen jedoch mit dem Risiko einher, daß sich Aggregationen ausbilden. Im Gegensatz dazu sind niedrige Proteinkonzentrationen, die sich positiv auf das Löslichkeitsverhalten auswirken, mit zusätzlichen Vorbereitungsschritten vor der eigentlichen Separation verbunden.High protein concentrations are necessary for most separation processes and Evaluation procedures are highly desirable, but involve the risk that form aggregations. In contrast, low protein levels, that have a positive effect on solubility behavior, with additional ones Preparation steps connected before the actual separation.

Die bisherigen Auftrenntechniken im Bereich der molaren Masse von Proteinen sind die Elektrophorese einerseits und die Chromatographie andererseits. Jedoch vermag keine dieser beiden Auftrenntechniken von Proteinen alleine wesentlich mehr als 100 verschiedene Komponenten zu trennen. Da jedoch eine einfache Zelle in der Regel bereits mehrere 1000 verschiedene Spezies von Proteinen enthält und die Menge der in einer Probe enthaltenen Proteine um den Faktor 106 differieren kann, muß eine ausreichend große Trennkapazität zur Verfügung gestellt werden, die nur durch gekoppelte, mehrdimensionale Auftrennverfahren geschaffen werden kann. Proteine haben den Charakter von Zwitterionen und können dementsprechend positiv oder negativ geladen sein. Mit Elektrophoreseverfahren können einzelne Komponenten entsprechend ihrer Mobilität im elektrischen Feld getrennt werden. Die elektrophoretische Mobilität jedes Proteins ist ein charakteristischer Wert. Im Rahmen der Proteomanalytik werden zwei Elektrophorese-Verfahren angewendet, die isoelektrische Fokussierung (IEF) und die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE).The previous separation techniques in the area of the molar mass of proteins are Electrophoresis on the one hand and chromatography on the other. However, none can of these two protein separation techniques alone, considerably more than 100 separate different components. However, since a simple cell usually already contains several 1000 different species of proteins and the amount of them in one Proteins contained in the sample can differ by a factor of 106, must be sufficient large separation capacity is made available, which can only be achieved through coupled, multi-dimensional separation process can be created. Proteins have that Character of zwitterions and can accordingly be positively or negatively charged  his. With electrophoresis methods, individual components can be made according to their Mobility can be separated in the electric field. The electrophoretic mobility of everyone Protein is a characteristic value. In the context of proteome analysis, two Electrophoresis method applied, the isoelectric focusing (IEF) and the Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).

Bei der isoelektrischen Fokussierung bewegen sich die einzelnen Proteine auf dem Gel innerhalb eines pH-Gradienten zu ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt, an dem sie ihre Nettoladung ausgleichen und so ihre elektrophoretische Mobilität einbüßen. Bewegt sich ein Protein aufgrund thermischer Diffusionserscheinungen aus der pH-Region, die der isoelektrischen Ladung entspricht, so nimmt es wieder eine Ladung an und bewegt sich im elektrischen Feld wieder zurück zu der Stelle im pH-Gradienten, die seinem isoelektrischen Punkt entspricht.With isoelectric focusing, the individual proteins move on the gel within a pH gradient to their respective isoelectric point at which their Balance the net charge and thus lose your electrophoretic mobility. Is moving a protein due to thermal diffusion from the pH region that the corresponds to isoelectric charge, it takes on a charge again and moves in the electric field back to the point in the pH gradient that is his corresponds to the isoelectric point.

Das SDS-PAGE-Verfahren sieht das Beladen sämtlicher Proteine mit Natriumdodecylsulfat (= SDS) vor; die negativen SDS-Protein-Komplexe bewegen sich in Richtung Anode im elektrischen Feld und lassen sich entsprechend ihrer molekularen Größen in der Polyacrylamidmatrix trennen. Aus der Kombination des IEF- und des SDS- PAGE-Verfahrens entstand die 2D-Gel-Elektrophorese (2D-PAGE) nach Klose und O'Farell 1975 (Journal of Biol. Chem. 1975, 250, 4007 bis 4020; Humangenetik 1975, 25, 231 bis 245).The SDS-PAGE process sees the loading of all proteins Sodium dodecyl sulfate (= SDS); the negative SDS-protein complexes move in Towards the anode in the electric field and can be adjusted according to their molecular Separate sizes in the polyacrylamide matrix. From the combination of the IEF and SDS The 2D gel electrophoresis (2D PAGE) according to Klose and O'Farell 1975 (Journal of Biol. Chem. 1975, 250, 4007 to 4020; Human Genetics 1975, 25, 231 to 245).

Dieses Verfahren sieht eine Trennung der Proteine in der ersten Dimension mit der isoelektrischen Fokussierung nach ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt vor. Als zweite Dimension wird eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Auftrennung der Proteine nach ihrer Größe durchgeführt. Diese Methode stellt derzeit die einzige Vorgehensweise dar, mit der komplexe Proteinmixturen mit hoher Auflösung aufgetrennt werden können. Die Vorteile des 2D-PAGE-Verfahrens sind die zwei zueinander komplementären Trennprinzipien, nämlich IEF- und SDS-PAGE-Verfahren nach Ladung und Molgewicht. Diese Technik läßt sich prinzipiell bei allen Proteinen nutzen. Das Auflösungsvermögen dieser Methode kann durch den Einsatz von engen pH- Gradienten in der isoelektrischen Fokussierung deutlich erhöht werden ("Zoom-Gele").This method sees a separation of the proteins in the first dimension with the isoelectric focusing according to their respective isoelectric point. Second Dimension will be a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Separation of the proteins carried out according to their size. This method is currently the is the only procedure with which complex protein mixtures with high resolution can be separated. The advantages of the 2D PAGE method are the two Complementary separation principles, namely IEF and SDS-PAGE processes according to cargo and molecular weight. In principle, this technique can be used for all proteins use. The resolving power of this method can be achieved by using narrow pH Gradients in the isoelectric focusing can be increased significantly ("zoom gels").

Andererseits bestehen bei diesem Verfahren auch Nachteile dahingehend, daß einige Erfahrung und einiges Geschick bei der Probenaufbereitung erforderlich werden. Die Auftragsmenge ist begrenzt, so daß schwach exprimierte Proteine nicht direkt detektiert werden können. Protein-Transfer von der ersten zur zweiten Dimension ist schwierig und schlecht reproduzierbar. Eine einfache Automatisierungsmöglichkeit ist bei diesem Verfahren nicht gegeben. Auch werden nicht alle Proteine durch dieses Verfahren detektiert. Für Molekulargewichte kleiner als 10.000 und für Molekulargewichte größer als 100.000 werden keine befriedigenden und aussagekräftigen Resultate erhalten. Nach der Trennung im Gel müssen die Proteine noch aufwändig gefärbt werden.On the other hand, there are also disadvantages with this method in that some Experience and some skill in sample preparation may be required. The The quantity applied is limited so that weakly expressed proteins are not directly detected  can be. Protein transfer from the first to the second dimension is difficult and difficult to reproduce. An easy automation option is with this Procedure not given. Also, not all proteins are made by this procedure detected. For molecular weights less than 10,000 and for molecular weights greater than 100,000 will not get satisfactory and meaningful results. After When separated in the gel, the proteins still have to be stained in a complex manner.

Das Färben kann zum Beispiel mit Farbstoffen wie Coomassie-Blau, mit kolloidalem Silber, mit Zink/Imidazol- oder mit Fluoreszenzfarbstoffen wie SYPRO® Ruby, SYPRO® Orange oder SYPRO® Red. Allen eingesetzten Färbemethoden ist gemeinsamen, daß die Bindung zwischen Protein und Färbereagenz nicht kovalent, sondern auf der Basis von ionischen, hydrophoben oder Van-der-Waals-Wechselwirkung erfolgt. Im Anschluß an die Färbung werden die Gele in der Regel mit Hilfe eines Scanners oder eines Fluoreszenz- Scanners digitalisiert.The dyeing can, for example, with dyes such as Coomassie blue, with colloidal Silver, with zinc / imidazole or with fluorescent dyes such as SYPRO® Ruby, SYPRO® Orange or SYPRO® Red. All dyeing methods used have in common that the Binding between protein and staining reagent is not covalent, but based on ionic, hydrophobic or van der Waals interaction occurs. Following the The gels are usually stained with the aid of a scanner or a fluorescent Scanners digitized.

In US 6,043,025 und in US 6,127,134 wird ein Prozeß und ein Kit beschrieben, mit welchem man Unterschiede in zwei oder mehreren Proteinproben detektieren kann. Die Proteinextrakte von unterschiedlichen Proben werden mit verschiedenen, positiv geladenen Fluoreszenzfarbstoffen kovalent markiert, vereinigt und der 2D-PAGE unterworfen. Identische Proteine aus den verschiedenen Proben können dann anhand ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlänge im gleichen Gel detektiert und quantifiziert werden.A process and a kit are described in US Pat. No. 6,043,025 and US Pat. No. 6,127,134 which one can detect differences in two or more protein samples. The Protein extracts from different samples are loaded with different, positively charged ones Fluorescent dyes covalently labeled, combined and subjected to 2D PAGE. Identical proteins from the different samples can then be identified based on their different fluorescence wavelengths detected and quantified in the same gel become.

Alternativ zu den genannten Färbemethoden können auch radioaktive Verfahren eingesetzt werden. Dazu werden die Zellen mit bestimmten isotopenmarkierten Verbindungen wie beispielsweise 35S-Cystein oder 32PO4 3- versetzt. Im Anschluß an die 2D-PAGE wird zur Digitalisierung in diesen Fällen gewöhnlich ein Phosphorimager eingesetzt. Mit Bildauswerteprogrammen wie beispielsweise MELANIE, PDQUEST und IMAGEMASTER oder Z3 werden in den erhaltenen digitalisierten Gelen anschließend die Proteinspots detektiert, quantifiziert und zugeordnet. Die Erkennung der einzelnen Spots sowie die Zuordnung der Spots zwischen den einzelnen Gelen (= "Matchen") sind sehr zeitaufwändig und erfordern manuelles Eingreifen des Operators.As an alternative to the staining methods mentioned, radioactive methods can also be used. For this purpose, the cells are mixed with certain isotope-labeled compounds such as 35 S-cysteine or 32 PO 4 3- . Following the 2D PAGE, a phosphor imager is usually used for digitization in these cases. With image evaluation programs such as MELANIE, PDQUEST and IMAGEMASTER or Z3, the protein spots are then detected, quantified and assigned in the digitized gels obtained. The detection of the individual spots and the assignment of the spots between the individual gels (= "matches") are very time-consuming and require manual intervention by the operator.

Die gesamte Prozedur, ausgehend von der Elektrophorese bis hin zur Färbung, Detektion und Quantifizierung gemäß des 2D-PAGE-Verfahrens ist sowohl personalaufwändig als auch zeitintensiv. The entire procedure, starting from electrophoresis to staining, detection and quantification according to the 2D PAGE method is both labor intensive and also time consuming.  

Angesichts der skizzierten technischen Probleme liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Trennverfahren für Proteine zu entwickeln, welches den Einsatz von Gelen reduziert, schnell und einfach durchführbar sowie insbesondere automatisierbar ist und eine einfache Quantifizierung der aufgetrennten Proteine erlaubt.In view of the technical problems outlined, the object of the invention to develop a separation process for proteins, which requires the use of gels reduced, quick and easy to carry out and in particular automatable and a simple quantification of the separated proteins allows.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Trennung und Detektion von Proteinen gelöst, wobei die Proteinproben in einer Trennpufferlösung enthalten sind und die nachfolgenden Verfahrensschritte durchlaufen werden:
According to the invention, this object is achieved by a method for the separation and detection of proteins, the protein samples being contained in a separation buffer solution and the following method steps being carried out:

  • - die Proteinproben werden in einem ersten Trennschritt gemäß der Free-Flow- Elektrophorese mit der isoelektrischen Fokussierung (IEF) oder der Isotachophorese in einzelne Fraktionen zerlegt und mit einem reaktiven Markierungsstoff verknüpft;- The protein samples are separated in a first step according to the free flow Electrophoresis with isoelectric focusing (IEF) or Isotachophoresis broken down into individual fractions and with a reactive Linked marking substance;
  • - in einem zweiten Trennschritt werden die Proteinfraktionen gemäß der Kapillarelektrophorese in mehreren Kapillaren gleichzeitig aufgetrennt, wobei in den einzelnen Kapillaren der reaktive Markierungsstoff detektiert wird.- In a second separation step, the protein fractions according to the Capillary electrophoresis separated in several capillaries simultaneously, whereby in the reactive capillary is detected in the individual capillaries.

Die Vorteile des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens liegen vor allem darin, daß die Auftrennung der Proteine bzw. der zellulären Proteine nunmehr automatisierbar ist. Dadurch läßt sich der Probendurchsatz erheblich steigern. Ferner kann mit dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren die jetzige komplizierte personalintensive Bildauswertung entfallen. Ferner kann die aufzutragende Probenauftragsmenge erheblich verringert werden. Durch ein Markierungsverfahren wie die Fluoreszenzmarkierung kann die Empfindlichkeit und damit das Auflösungsvermögen hinsichtlich der Detektion schwach exprimierter Proteine erheblich erhöht werden.The advantages of the method proposed according to the invention are primarily that the separation of the proteins or the cellular proteins can now be automated. This significantly increases the sample throughput. Furthermore, with the The proposed method according to the invention, the current complicated personnel-intensive No image evaluation. Furthermore, the sample application quantity to be applied can be considerable be reduced. Through a labeling process like fluorescent labeling can the sensitivity and thus the resolution with regard to the detection weakly expressed proteins can be increased significantly.

In einer vorteilhaften Ausführungsvariante des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens werden nach dem ersten Trennschritt erhaltene Proteinfraktionen mit einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff verknüpft. Dies kann zum Beispiel durch Kopplung der N- Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) oder Isothiocyanate von Fluoreszenzfarbstoffen an freie Aminogruppen der Proteine erfolgen. Vorzugsweise werden an den Proteinen die freien Aminogruppen der N-Termini oder Lysine als Kopplungsstellen ausgewählt; daneben eignen sich als Kopplungsstellen an Proteinen auch Cysteine, an welche dann beispielsweise reaktive Maleimid-Derivate von Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt werden.In an advantageous embodiment variant of the one proposed according to the invention Protein fractions obtained after the first separation step are processed using a reactive fluorescent dye linked. This can be done, for example, by coupling the N- Hydroxysuccinimide esters (NHS esters) or isothiocyanates of fluorescent dyes free amino groups of the proteins occur. Preferably on the proteins free amino groups of the N-termini or lysine selected as coupling sites;  In addition, cysteines are also suitable as coupling sites on proteins, to which then For example, reactive maleimide derivatives of fluorescent dyes can be coupled.

Im Unterschied zu Fluoreszenzfärbungen im Polyacrylamidgel sind die Farbstoffe beim erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren kovalent an die einzelnen Proteine gebunden. Die üblicherweise nach der 2D-Elektrophorese verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe wie Sypro® Ruby, Sypro® Orange oder Sypro® Red sind nur adsorptiv gebunden, wie zum Beispiel durch hydrophobe, ionische oder von der- Waals'sche Kräfte. In einem zweiten Trennschritt werden Kapillaren eingesetzt, die in bevorzugter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens Polyacrylamidgel enthalten. Die Detektion der einzelnen Proteine erfolgt im zweiten Trennschritt mit laserinduzierter Fluoreszenz.In contrast to fluorescent stains in polyacrylamide gel, the dyes are with Methods proposed according to the invention covalently to the individual proteins bound. Usually used after 2D electrophoresis Fluorescent dyes such as Sypro® Ruby, Sypro® Orange or Sypro® Red are only adsorptively bound, such as by hydrophobic, ionic or Waals forces. In a second separation step, capillaries are used, which in preferred embodiment of the process according to the invention polyacrylamide gel contain. The individual proteins are also detected in the second separation step laser-induced fluorescence.

Um eine Verbesserung des Laufverhaltens der Proteine im Rahmen der Kapillarelektrophorese zu erzielen, kann Natriumdodecylsulfat zum Trennpuffer beigegeben werden. Um eine parallele Abarbeitung einer größeren Zahl von Proteinproben nach der Free-Flow-Elektrophorese zu ermöglichen, können alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte parallel durch ebenso viele Kapillaren getrennt detektiert und quantifiziert werden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß ein handelsübliches Gerät zur DNA-Sequenzierung eingesetzt wird. In vorteilhafter Weise kann in jeder Kapillare im zweiten Trennschritt ein Fluoreszenzfarbstoff detektiert werden.To improve the running behavior of the proteins in the context of To achieve capillary electrophoresis, sodium dodecyl sulfate can be used as a separation buffer be added. To process a large number of protein samples in parallel After free flow electrophoresis, all wells can be one Microtiter plate detected and quantified in parallel by as many capillaries become. This can be achieved, for example, by using a commercially available device is used for DNA sequencing. Advantageously, in each capillary second separation step, a fluorescent dye can be detected.

Die empfindliche Fluoreszenzdetektion gewährleistet einen großen dynamischen Bereich und eine hohe Empfindlichkeit. Durch die hohe Trennleistung der Kapillarelektrophorese wird eine wesentlich bessere Auflösung in der zweiten Dimension verglichen mit dem 2D- PAGE-Gelverfahren erreicht. Aufgrund der hohen Automatisierbarkeit beider Trennschritte, der FFE und der Kapillarelektrophorese läßt sich ein wesentlich höherer Durchsatz erzielen und damit eine bessere statistische Absicherung der gemessenen Ergebnisse erwarten.The sensitive fluorescence detection ensures a large dynamic range and high sensitivity. Due to the high separation performance of capillary electrophoresis a much better resolution in the second dimension compared to the 2D PAGE gel process achieved. Because of the high degree of automation of both Separation steps, the FFE and the capillary electrophoresis can be a much higher one Achieve throughput and thus better statistical validation of the measured Expect results.

Die Auftrennung der Proteinproben kann im ersten Trennschritt in vorteilhafter Weise in eine Mikrotiterplatte erfolgen, wobei eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird, deren Anzahl von Vertiefungen der Anzahl der getrennten Proteinfraktionen entspricht. Die Anzahl der Kapillaren, die im zweiten Trennschritt gemäß der Kapillarelektrophorese eingesetzt werden, entspricht der Anzahl der in der Mikrotiterplatte eingebrachten Anzahl von Probenfraktionen. The separation of the protein samples can advantageously in the first separation step in a microtiter plate is used, a microtiter plate being used, the number thereof of wells corresponds to the number of separated protein fractions. The number of Capillaries used in the second separation step according to capillary electrophoresis corresponds to the number of the number of Sample fractions.  

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren, welches in zwei Trennschritten unter Ausnutzung der Free-Flow-Elektrophorese und der Kapillarelektrophorese erfolgt, sei nachfolgend näher beschrieben unter Benennung der benutzten Komponenten.The method proposed according to the invention, which in two separation steps Free-flow electrophoresis and capillary electrophoresis were used described in more detail below, naming the components used.

Bei der von Hannig entwickelten Free-Flow-Elektrophorese (Hannig in Electrophoresis 1982, 3, 235-243) fließt senkrecht zu einem elektrischen Feld ein kontinuierlicher Pufferfilm. An einer Seite der Free-Flow-Elektrophoresekammer wird an einer definierten Stelle die Proteinprobe zugeführt. Im ersten Trennschritt können für das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren zwei unterschiedliche Methoden der Free-Flow-Elektrophorese eingesetzt werden: die isoelektrische Fokussierung und die Isotachophorese.In the free-flow electrophoresis developed by Hannig (Hannig in Electrophoresis 1982, 3, 235-243) a continuous flows perpendicular to an electric field Buffer film. On one side of the free-flow electrophoresis chamber is on a defined Place the protein sample fed. In the first separation step, according to the invention proposed methods two different methods of free flow electrophoresis are used: isoelectric focusing and isotachophoresis.

Zur isoelektrischen Fokussierung wird mit Hilfe von Trägerampholyten (Gerhard Weber und Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 1649-1653), die zusammen mit dem Puffer appliziert werden, ein pH-Gradient zwischen den beiden Elektroden senkrecht zur Fließrichtung des Pufferfilms erzeugt, der die Proteine aufgrund ihrer Ladung im freien Fluß auftrennt (FFE-IEF). Am anderen Ende der Free-Flow-Elektrophoresekammer werden die Einzelfraktionen durch eine Reihe von Schläuchen in den einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgesammelt.Carrier ampholytes (Gerhard Weber and Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 1649-1653), which together with the buffer be applied, a pH gradient between the two electrodes perpendicular to Direction of flow of the buffer film, which the proteins due to their charge in the open River separates (FFE-IEF). At the other end of the free flow electrophoresis chamber the individual fractions are separated by a series of tubes in each Wells of a microtiter plate are collected.

Alternativ zur FFE-IEF kann die Isotachophorese im ersten Trennschritt verwendet werden. In einem diskontinuierlichen Puffersystem, bestehend aus Leit- und Folgeelektrolyt, bildet sich im elektrischen Feld ein Potentialgradient aus. Im Bereich der Ionen mit niedriger Mobilität ist die Feldstärke höher als im Bereich der mobileren Ionen. Da die Wanderung aller Ionen mit gleicher Geschwindigkeit erfolgen muß, bilden sich aus den Proteinproben gemischreine Zonen der einzelnen Proteine aus. Im Gleichgewichtszustand folgt das Ion mit der höchsten Mobilität dem Leit-Ion des Leitelektrolyten, das mit der niedrigsten Mobilität wandert vor dem Folgeelektrolyten; die anderen wandern dazwischen in der Reihenfolge abnehmender Mobilitäten. In der Praxis wird eine Intervall-Isotachophorese durchgeführt (Gerhard Weber und Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 3090-3093). Nach dem Aufbringen der Proteinprobe und dem Aufbringen der Elektrolyte auf die Free-Flow-Elektrophoresekammer wird für wenige Minuten, vorzugsweise 2 Minuten, Hochspannung zur Trennung der Proteine angelegt, anschließend werden die getrennten Fraktionen spannungslos über eine Reihe von Schläuchen in die einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gefördert. As an alternative to FFE-IEF, isotachophoresis can be used in the first separation step become. In a discontinuous buffer system consisting of control and Subsequent electrolyte, a potential gradient forms in the electrical field. In the field of Ions with low mobility have a higher field strength than in the area of more mobile ions. Since all ions must migrate at the same speed, they form from the protein samples mixed pure zones of the individual proteins. in the Equilibrium state, the ion with the highest mobility follows the leading ion of the Conductive electrolyte that migrates with the lowest mobility in front of the subsequent electrolyte; the others move in between in the order of decreasing mobility. In practice an interval isotachophoresis is performed (Gerhard Weber and Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 3090-3093). After applying the protein sample and the Applying the electrolytes to the free-flow electrophoresis chamber is done for a few Minutes, preferably 2 minutes, high voltage to separate the proteins, then the separated fractions are de-energized over a series of Tubes conveyed into the individual wells of a microtiter plate.  

Für den erfindungsgemäß vorgeschlagenen ersten Schritt zur Trennung der Proteine - sowohl für die FFE-IEF als auch für die Free-Flow-Isotachophorese - wird beispielsweise das Elektrophoresegerät "OCTOPUS" der Fa. Dr. Weber GmbH eingesetzt. In diesem Elektrophoresegerät werden nach der isoelektrischen Fokussierung FFE-IEF (oder der Isotachophorese) einzelne Proteinfraktionen (vorzugsweise 96) in Mikrotiterplatten erhalten. Die Proteine in diesen Fraktionen werden mit einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff verknüpft. Dazu eignen sich Derivate wie beispielsweise die N- Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) oder die Isothiocyanate von Fluoreszenzfarbstoffen, die an freie Aminogruppen der Proteine gekoppelt werden. Insbesondere eignen sich N- Termini oder Lysine der Proteine bzw. der Proteinfraktionen. Daneben sind auch Verknüpfungen von entsprechenden derivatisierten Fluoreszenzfarbstoffen an die Carboxylat-, Thiol- oder Hydroxylgruppen der Proteine ohne weiteres möglich.For the first step according to the invention for separating the proteins - both for FFE-IEF and for free-flow isotachophoresis - for example the electrophoresis device "OCTOPUS" from Dr. Weber GmbH used. In this After the isoelectric focusing, FFE-IEF (or the Isotachophoresis) individual protein fractions (preferably 96) in microtiter plates receive. The proteins in these fractions are reactive Fluorescent dye linked. Derivatives such as the N- Hydroxysuccinimide esters (NHS esters) or the isothiocyanates of fluorescent dyes, which are coupled to free amino groups of the proteins. N- are particularly suitable Termini or lysine of the proteins or protein fractions. Are also next to it Links of corresponding derivatized fluorescent dyes to the Carboxylate, thiol or hydroxyl groups of the proteins are readily possible.

Im nachfolgenden Trennschritt lassen sich die kovalent fluoreszenzmarkierten Proteine unter Anwendung der Kapillarelektrophorese separieren. Vorzugsweise werden dazu die Kapillaren mit einem Polyacrylamidgel gefüllt. Die Detektion erfolgt bevorzugt mit laserinduzierter Fluoreszenz, wobei zur Verbesserung des Laufverhaltens der Proteine in der Kapillarelektrophorese Natriumdodecylsulfat zum Trennpuffer gegeben werden kann. Idealerweise werden alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte parallel in ebenso vielen Kapillaren getrennt, detektiert und anschließend quantifiziert. In bevorzugter und einfacher Weise wird ein handelsübliches Gerät zur DNA-Sequenzierung eingesetzt, beispielsweise ein MEGA-Bace von Amersham Pharmacia oder ein anderes Gerät ähnlicher Bauart. Ein Vorteil gegenüber der herkömmlichen 2D-Gelelektrophorese mit anschließender nicht kovalenter Färbung mit Bildauswertung zur Quantifizierung liegt darin, daß die nach der hier beschriebenen Methode erhaltenen Elektropherogramme mit handelsüblicher Software leicht quantifizierbar sind.In the subsequent separation step, the covalently fluorescently labeled proteins can be separate using capillary electrophoresis. For this purpose, the Capillaries filled with a polyacrylamide gel. The detection is preferably carried out with laser-induced fluorescence, whereby to improve the running behavior of the proteins in capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate can be added to the separation buffer. Ideally, all wells of the microtiter plate are parallel in as many Capillaries separated, detected and then quantified. More preferred and easier A commercially available device for DNA sequencing is used, for example a MEGA-Bace from Amersham Pharmacia or another device of a similar design. On Advantage over conventional 2D gel electrophoresis followed by no covalent staining with image evaluation for quantification is that after the Electropherograms obtained here using commercially available software are easily quantifiable.

Durch die wesentlich empfindlicher einzustufende Fluoreszenzdetektion ist ein großer dynamischer Bereich und eine hohe Empfindlichkeit gewährleistet. Weiterhin kann durch die hohe Trennleistung innerhalb der Kapillarelektrophorese eine wesentlich bessere Auflösung der Proteinproben oder der Proteinproben zellulären Ursprungs in der zweiten Dimension verglichen mit dem 2D-PAGE-Verfahren erreicht werden. Aufgrund der wesentlich besseren Automatisierbarkeit beider Methoden, der Free-Flow-Elektrophorese und der Kapillarelektrophorese wird ein wesentlich höherer Durchsatz und damit eine bessere statistische Absicherung der Ergebnisse erfolgen. Nach Durchführung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens ist eine Programmsequenz zur Auswertung der Elektropherogramme zu erstellen; ferner sind zur Realisierung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens beispielsweise eine Free-Flow-Elektrophorese-Apparatur ("Octopus" der Firma Dr. Weber GmbH) erforderlich sowie zum Beispiel ein MEGA-Bace Sequenzer der Fa. Amersham oder ein ähnliches Gerät.Due to the much more sensitive fluorescence detection, a large one dynamic range and high sensitivity guaranteed. Furthermore, by the high separation performance within capillary electrophoresis is a much better one Dissolution of the protein samples or the protein samples of cellular origin in the second Dimension compared to the 2D PAGE method can be achieved. Due to the both methods, free flow electrophoresis, can be automated much better and capillary electrophoresis becomes a much higher throughput and thus one better statistical validation of the results. After performing the The method proposed according to the invention is a program sequence for evaluation  create the electropherograms; are also to implement the invention proposed method, for example, a free-flow electrophoresis apparatus ("Octopus" from Dr. Weber GmbH) and, for example, a MEGA-Bace Sequencer from Amersham or a similar device.

Claims (13)

1. Verfahren zur Auftrennung und Detektion von Proteinen oder Proteinproben zellulären Ursprungs, wobei die Proteine in einer Trennpufferlösung enthalten sind und die nachfolgenden Verfahrensschritte durchlaufen werden:
  • - Die Proteinproben werden in einem ersten Trennschritt gemäß der Free-Flow- Elektrophorese nach der isoelektrischen Fokussierung (IEF) oder Isotachophorese in einzelne Fraktionen zerlegt und mit einem reaktiven Markierungsstoff verknüpft.
  • - In einem zweiten Trennschritt werden die Proteinfraktionen gemäß der Kapillarelektrophorese in mehreren Kapillaren gleichzeitig aufgetrennt, wobei in den einzelnen Kapillaren der reaktive Markierungsstoff detektiert wird.
1. Process for the separation and detection of proteins or protein samples of cellular origin, the proteins being contained in a separation buffer solution and the following process steps being carried out:
  • - In a first separation step, the protein samples are broken down into individual fractions according to free-flow electrophoresis after isoelectric focusing (IEF) or isotachophoresis and linked with a reactive marker.
  • - In a second separation step, the protein fractions are separated in several capillaries according to the capillary electrophoresis, the reactive marker being detected in the individual capillaries.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem ersten Trennschritt alle Proteine in den erhaltenen Proteinfraktionen mit einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff verknüpft werden.2. The method according to claim 1, characterized in that after the first Separate all proteins in the obtained protein fractions with a reactive one Fluorescent dye linked. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß N- Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) oder Isothiocyanate von Fluoreszenzfarbstoffen an freie Aminogruppen der Proteine gekoppelt werden.3. The method according to claim 2, characterized in that N- Hydroxysuccinimide esters (NHS esters) or isothiocyanates from Fluorescent dyes are coupled to free amino groups of the proteins. 4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsstellen freie Aminogruppen wie N-Termini oder Lysine der Proteine sind.4. The method according to claim 3, characterized in that the coupling points are free amino groups such as N-termini or lysine of the proteins. 5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Jodoacetamido-, Maleimid-, [Acetylmercaptosuccinoyl]amino-(= SAMSA), Pyridyldithio­ propionamid-(= PDP) oder Bromomethyl-Derivate von Fluoreszenzfarbstoffen an freie Sulfhydrilgruppen der Proteine gekoppelt werden.5. The method according to claim 2, characterized in that iodoacetamido, Maleimid-, [acetylmercaptosuccinoyl] amino - (= SAMSA), pyridyldithio propionamide - (= PDP) or bromomethyl derivatives of fluorescent dyes free sulfhydrile groups of the proteins are coupled. 6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsstelle freie Sulfhydrilgruppen der Cysteine sind. 6. The method according to claim 5, characterized in that the coupling point are free sulfhydrile groups of the cysteines.   7. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Fluoreszenzfarbstoffe an Carboxylate oder Hydroxylgruppen der Proteine gekoppelt werden.7. The method according to claim 2, characterized in that the reactive Fluorescent dyes on carboxylates or hydroxyl groups of the proteins be coupled. 8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren ein Poyacrylamidgel enthalten.8. The method according to claim 1, characterized in that in the second Separation step, the capillaries used contain a polyacrylamide gel. 9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren Agarose enthalten.9. The method according to claim 1, characterized in that in the second Separation step contain the capillaries used agarose. 10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren leer sind.10. The method according to claim 1, characterized in that in the second Separation step the inserted capillaries are empty. 11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren eine synthetische Polymermatrix enthalten.11. The method according to claim 1, characterized in that in the second Separation step, the capillaries used contain a synthetic polymer matrix. 12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion im zweiten Trennschritt mit laserinduzierter Fluoreszenz erfolgt.12. The method according to claim 1, characterized in that the detection in second separation step with laser-induced fluorescence. 13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß während der Kapillar- Elektrophorese Natriumdodecylsulfat zum die Proteine enthaltenden Trennpuffer beigegeben wird.13. The method according to claim 1, characterized in that during the capillary Electrophoresis of sodium dodecyl sulfate to the separation buffer containing the proteins is added.
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