DE10109618A1

DE10109618A1 - Modifying antigen-presenting cells, useful e.g. in antitumor vaccines, by transfer to them of antigen-containing membrane fragments from diseased cells

Info

Publication number: DE10109618A1
Application number: DE10109618A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Zimmermann
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2001-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2002-09-12

Abstract

Modifying antigen-presenting cells (APC), comprising transfer to them of antigens (Ag) from diseased cells (A), is new. APC and (A), or their components, are combined in suspension and contacted by application of an external force, so that Ag-containing, but nucleus-free, membrane components are transferred from (A) to APC. The modified APC are then separated from (A) and cell components. Independent claims are also included for the following: (1) cellular tumor vaccine comprising APC either prepared by the new method or, generally, having incorporated into their cell membranes Ag, or Ag-containing membrane components from diseased cells; and (2) apparatus for modifying APC with (A) or their components.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Handhabung und/oder Be handlung von biologischen und/oder synthetischen Zellen, ins besondere zur Wechselwirkung von Zellen oder Zellbestandtei len, die Antigene darstellen oder tragen (z. B. Tumorzellen), und Zellen, die Antigene präsentieren (wie z. B. Mastzellen oder dendritische Zellen), Verfahren zur Erzeugung von Verbun den aus Antigene präsentierenden Zellen und erkrankten Zellen, z. B. Tumorzellen, oder deren Zellbestandteilen (z. B. Memb ranteilen), Verfahren zur Modifizierung von Antigene präsen tierenden Zellen mit erkrankten Zellen, z. B. Tumorzellen, oder deren Zellbestandteilen (z. B. Membranteilen), Verfahren zur passiven Immunisierung oder Impfung von Organismen gegen Erkrankungen (z. B. virale oder bakterielle Infektionen, Tu morerkrankungen oder dgl.), Verfahren zur Behandlung von In fektions- oder Tumorerkrankungen und/oder Verfahren zur Her stellung von Zusammensetzungen zur passiven Immunisierung oder Impfung von Organismen gegen Infektions- oder Tumorerkrankun gen, Vorrichtungen zur Umsetzung der Verfahren, Verwendungen von Vorrichtungen zur dielektrophoretischen Manipulierung von Zellen zur Modifizierung von Antigene präsentierenden Zellen und Anwendungen der genannten Verfahren.The invention relates to methods for handling and / or loading act of biological and / or synthetic cells, ins especially for the interaction of cells or cell components len that represent or carry antigens (e.g. tumor cells), and cells that present antigens (such as mast cells or dendritic cells), process for producing verbun the cells presenting from antigens and diseased cells, z. B. tumor cells, or their cell components (z. B. Memb rang), present procedures for modifying antigens Turing cells with diseased cells, e.g. B. tumor cells, or their cell components (e.g. membrane parts), methods for passive immunization or vaccination of organisms against Diseases (e.g. viral or bacterial infections, Tu morbidity or the like), method for the treatment of In infection or tumor diseases and / or processes for the manufacture provision of compositions for passive immunization or Vaccination of organisms against infectious or tumor diseases conditions, devices for implementing the methods, uses of devices for dielectrophoretic manipulation of Cells for modifying cells presenting antigens and applications of the methods mentioned.

Es gibt Versuche, zur Tumorbehandlung einen Organismus einer Anregung des Immunsystems zu unterziehen, indem körpereigene oder fremde dendritische Zellen mit Antigenen modifiziert und dem Organismus zugeführt werden. Die dendritischen Zellen wir ken als immunoaktive Zellen, die in Abhängigkeit von den je weiligen Antigenen immunostimulierende Eigenschaften besitzen. Die Bildung und Eigenschaften von dendritischen Zellen werden bspw. von K. Shortman et al. in "Stem Cells", Band 15, 1997, Seite 409 ff. beschrieben. Die Modifizierung der dendritischen Zellen mit Antigenen bedeutet, dass die Antigene in die Oberfläche der dendritischen Zelle eingebaut werden. Als Antigene werden bspw. bestimmte Modellpeptide (siehe P. Paglia et al. in "Minerva Biotecnologica", Band 11, 1999, Seite 261 ff.) oder von den jeweiligen Tumorzellen gebildete Antigene verwendet. Zur Beladung der dendritischen Zellen mit Antigenen von Tumorzellen sind die folgenden Verfahren bekannt.There are attempts to treat an organism for stimulating the immune system in order to treat tumors by modifying the body's own or foreign dendritic cells with antigens and delivering them to the organism. The dendritic cells act as immunoactive cells, which have immunostimulating properties depending on the respective antigens. The formation and properties of dendritic cells are, for example, by K. Shortman et al. in "Stem Cells", Volume 15 , 1997 , page 409 ff. The modification of the dendritic cells with antigens means that the antigens are built into the surface of the dendritic cell. For example, certain model peptides (see P. Paglia et al. In "Minerva Biotecnologica", Volume 11 , 1999 , page 261 ff.) Or antigens formed by the respective tumor cells are used as antigens. The following methods are known for loading the dendritic cells with antigens from tumor cells.

Bei dem bspw. von T. H. Scott-Taylor et al. in "Biochimica et Biophysica Acta", Band 1500, 2000, Seite 265 ff. beschriebenen Verfahren werden Tumorzellen mittels Elektrofusion mit dendri tischen Zellen verschmolzen, die mit den Tumorzellen insbeson dere die Tumor-Antigene aufnehmen und dadurch eine Anregung des Immunsystems auslösen können. Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, dass die Elektrofusion ein komplexer Vorgang ist, der eine anwendungsspezifische Optimierung der Fusionsbedin gungen erfordert. Die Elektrofusion von dendritischen Zellen mit Tumorzellen hat ferner den Nachteil, dass die in der Lite ratur beschriebenen Ausbeuten sehr gering sind und dass, be dingt durch die zufällige Kombination der Gene der beiden Fu sionspartner, Fusionsprodukte mit unterschiedlichen Eigen schaften entstehen, die nach Rückgabe in den Patienten zu un terschiedlichen Immunreaktionen führen können. Um nicht den zu behandelnden Organismus noch mit Tumorzellen zu belasten, müs sen die Tumorzellen vor der Elektrofusion, bspw. mittels ra dioaktiver Bestrahlung, abgetötet werden. Es bleibt jedoch bei den üblichen Bestrahlungsmethoden ein Restrisiko, dass Tumor zellen überleben und zu Metastasen führen. Damit besitzen Im munisierungsverfahren, die auf der Elektrofusion beruhen, nur eine eingeschränkte Zuverlässigkeit, da gewährleistet sein muss, dass die Tumorzellen alle abgetötet sind sowie alle Krankheitserreger, die sich in den Tumorzellen befinden, wie z. B. Viren, ausgeschaltet sind. In the example of TH Scott-Taylor et al. in "Biochimica et Biophysica Acta", volume 1500 , 2000 , page 265 ff., the tumor cells are fused by means of electrofusion to dendritic cells, which in particular absorb the tumor antigens with the tumor cells and can thereby trigger stimulation of the immune system. This method has the disadvantage that electrofusion is a complex process that requires application-specific optimization of the fusion conditions. The electrofusion of dendritic cells with tumor cells has the further disadvantage that the yields described in the literature are very low and that, due to the random combination of the genes of the two fusion partners, fusion products with different properties are formed, which after return in can lead the patient to different immune reactions. In order not to burden the organism to be treated with tumor cells, the tumor cells must be killed before the electrofusion, for example by means of radioactive radiation. With the usual radiation methods, however, there remains a residual risk that tumor cells will survive and lead to metastases. This means that in the immunization process, which is based on electrofusion, there is only limited reliability, since it must be ensured that the tumor cells are all killed and all pathogens that are located in the tumor cells, such as, for example, B. viruses are turned off.

Aus der Publikation von K. Shimizu et al. in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Band 96, 1999, Seite 2268, ist die Verwendung von Tumorzell-Lysaten zur Modifizierung der dendritischen Zel len bekannt. Die Lysate sind Tumorzellen, die durch einen Einfrier- und Auftauvorgang zerstört worden sind. Die Interak tion der dendritischen Zellen mit den Lysaten wird durch eine Langzeitinkubation über rund 20 Stunden induziert. Die Verwen dung der Lysate besitzt neben dem großen Zeitaufwand auch den Nachteil einer eingeschränkten Zuverlässigkeit. Wie bei der Elektrofusion ist eine radioaktive Bestrahlung vorgesehen, um die Gefahr einer zusätzlichen Metastasierung zu vermindern.From the publication by K. Shimizu et al. in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", Volume 96 , 1999 , page 2268, the use of tumor cell lysates for modifying the dendritic cells is known. The lysates are tumor cells that have been destroyed by a freeze and thaw process. The interaction of the dendritic cells with the lysates is induced by long-term incubation for around 20 hours. The use of the lysates has the disadvantage of limited reliability in addition to the large expenditure of time. As with electrofusion, radioactive radiation is provided to reduce the risk of additional metastasis.

Die Erzeugung einer Assoziation aus dendritischen Zellen und Tumorzellen wird auch von C. M. Celluzzi et al. in "The Jour nal of Immunology", Band 160, 1998, Seite 3081 ff. beschrie ben. Die Assoziation erfolgt entweder durch eine elektrisch stimulierte Zellfusion oder durch eine physikalische Wechsel wirkung bei einer Langzeitinkubation, die zu einer sogenannten Scheinfusion (mock fusion) führt. Auch bei diesem Verfahren treten die genannten Probleme auf. Die zur Auslösung der Im munreaktion verwendete Zellassoziation trägt mit dem Zellkern der Tumorzelle ein erhebliches Metastasierungsrisiko in sich. Außerdem erfordert die Bildung von Scheinfusionen eine zeit aufwendige Koinkubation mit einer Dauer von mehr als zehn Stunden.The generation of an association from dendritic cells and tumor cells is also described by CM Celluzzi et al. in "The Journal of Immunology", volume 160 , 1998 , page 3081 ff. The association takes place either through an electrically stimulated cell fusion or through a physical interaction during a long-term incubation, which leads to a so-called mock fusion. The problems mentioned also occur with this method. The cell association used to trigger the immune reaction carries with the cell nucleus of the tumor cell a considerable risk of metastasis. In addition, the formation of sham fusions requires a time-consuming co-incubation lasting more than ten hours.

In der unveröffentlichten Patentanmeldung DE 100 53 783.9 wird ein Verfahren zur Modifizierung dendritischer Zellen beschrie ben, bei dem Antigene von erkrankten Zellen auf die dendriti schen Zellen übertragen werden, in dem die dendritischen Zel len mit den erkrankten Zellen oder deren Zellbestandteilen durch Einführen in eine gemeinsame Suspension und Ausübung äu ßerer Kräfte in Kontakt gebracht werden. Dieses Verfahren wird in der flüssigen Suspension aller beteiligten Zellarten durch geführt. In the unpublished patent application DE 100 53 783.9 described a method for modifying dendritic cells ben, with the antigens of diseased cells on the dendriti cells are transmitted in which the dendritic cell len with the diseased cells or their cell components by introducing them into a common suspension and exercising external forces are brought into contact. This procedure will in the liquid suspension of all cell types involved guided.

Aus der Publikation von N.-S. Yang et al. ("Proc. Natl. Acad. Sci. USA" Bd. 87, 1990, S. 9568 ff.) ist eine physikalische Methode zur Einbringung von DNA-Molekülen mit beschleunigten Festpartikeln (sogenannte Mikroprojektile) in Zellen bekannt. Die Mikroprojektile sind beschichtete Gold- oder Wolframparti kel mit einer Größe von 1 µm. Die DNA wird auf der Partikel oberfläche gebunden. Das Einschießen mit Geschwindigkeiten im Bereich von 500 m.s^-1 erfolgt unter Verwendung von Druckquellen oder elektrischen Feldern. Dieses Verfahren zur DNA- Transfektion wird auch als biolistischer Partikeleinschuß be zeichnet.From the publication by N.-S. Yang et al. ("Proc. Natl. Acad. Sci. USA" Vol. 87, 1990, pp. 9568 ff.) A physical method for introducing DNA molecules with accelerated solid particles (so-called microprojectiles) into cells is known. The microprojectiles are coated gold or tungsten particles with a size of 1 µm. The DNA is bound on the particle surface. The injection at speeds in the range of 500 ms ^-1 takes place using pressure sources or electric fields. This method of DNA transfection is also known as biolistic particle injection.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, neue Verfahren zur Behand lung biologischer Zellen anzugeben, bei dem Zellen miteinander zur Wechselwirkung gebracht werden. Es soll insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Modifizierung dendritischer Zellen geschaffen werden, mit dem die Nachteile herkömmlicher Techni ken überwunden werden und das sich durch einen schnellen Ver fahrensablauf und den Ausschluss eines Metastasierungsrisikos auszeichnet. Das erfindungsgemäße Verfahren soll auch in Bezug auf die Reproduzierbarkeit der Einstellung von Wechselwir kungsbedingungen verbessert sein. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens und Anwendungen des Verfahrens anzugeben. Es soll ferner ein neu es, erweitertes Verfahren zur Modifizierung von Zellen in Sus pensionen geschaffen werden.The object of the invention is to develop new methods of treatment biological cells, where cells with each other to interact. It is supposed to be a improved method for modifying dendritic cells be created with the disadvantages of conventional technology cen be overcome and that by a quick Ver process and the exclusion of a risk of metastasis distinguished. The method according to the invention is also intended to relate on the reproducibility of the interrelationship conditions should be improved. The object of the invention is also to implement the method and To indicate applications of the method. It is also said to be a new one es, advanced method for modifying cells in Sus pensions are created.

Eine erste Grundidee der Erfindung ist es, biologische und/oder synthetische Zellen, Zellbestandteile oder Makromole küle miteinander zu Wechselwirkungen zu veranlassen, indem die jeweiligen Teilchen miteinander in Kontakt gebracht werden, wobei sich mindestens eine Gruppe der zur Wechselwirkung ge brachten Zellen, Zellbestandteile oder Makromoleküle in einem adhärenten Zustand auf einem Festphasensubstrat befindet. Das Festphasensubstrat wird durch ein planares Substrat, z. B. Substrat mit mindestens einer Glas-, Kunststoff- oder Membran oberfläche, oder ein partikelförmiges Substrat gebildet. Das Festphasensubstrat mit den adhärenten Zellen wird in eine Flüssigkeit eingebracht, in der die jeweils andere Gruppe von Zellen, Zellbestandteilen oder Makromolekülen suspendiert ist. Die suspendierten Teilchen werden in der Suspension äußeren Kräften derart ausgesetzt, dass die verschiedenen Zelltypen oder Zellbestandteile sich gegenseitig berühren. Die Erfinder haben festgestellt, dass eine Berührung unter Einwirkung äuße rer Kräfte ausreicht, um ausschließlich Membrankomponenten mit den Antigenen von den erkrankten Zellen oder Zellbestandteilen auf die Antigene präsentierenden, z. B. dendritischen, Zellen zu übertragen. Zellkerne und andere Bestandteile der erkrank ten Zellen oder Zellbestandteile bleiben in der Suspension.A first basic idea of the invention is biological and / or synthetic cells, cell components or macromoles to induce interactions with one another by the respective particles are brought into contact with one another, where at least one group of ge to interact brought cells, cell components or macromolecules in one adherent state is located on a solid phase substrate. The Solid phase substrate is through a planar substrate, e.g. B. Substrate with at least one glass, plastic or membrane surface, or a particulate substrate is formed. The Solid phase substrate with the adherent cells is in a Introduced liquid in which the other group of Cells, cell components or macromolecules is suspended. The suspended particles become outer in the suspension Forces exposed to the different cell types or cell components touch each other. The inventors have found that touching under influence forces is sufficient to use only membrane components the antigens from the diseased cells or cell components presenting to the antigens, e.g. B. dendritic cells transferred to. Nuclei and other components of the diseased cells or cell components remain in the suspension.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Antigene präsentierenden Zellen auf dem Festphasensubstrat ge bunden, das in der Suspensionsflüssigkeit angeordnet ist. Die erkrankten Zellen oder Zellbestandteile, von denen Antigene auf die adsorbierten Zellen übertragen werden sollen, werden in die Suspension gegeben. Nach der gegenseitigen Wechselwir kung werden die modifizierten adsorbierten Zellen von den noch freien erkrankten Zellen oder Zellbestandteilen in der Suspen sion getrennt und für die jeweiligen Anwendung, insbesondere die Anregung des Immunsystems eines Organismus, bereitge stellt. Die Trennung erfolgt vorzugsweise durch Entfernung der erkrankten Zellen oder Zellbestandteile aus der Suspension oder Überführung des Festphasensubstrats in eine andere Umge bung. Anschließend werden die modifizierten Zellen vom Fest phasensubstrat abgelöst. Dies erfolgt beispielsweise durch ei nen enzymatischen Prozess. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird das Verfahren zur Erzeugung immunologisch akti ver dendritischer Zellen verwendet. According to a preferred embodiment of the invention, the Antigen presenting cells on the solid phase substrate bound, which is arranged in the suspension liquid. The diseased cells or cell components, one of which is antigens to be transferred to the adsorbed cells added to the suspension. After mutual interaction The modified adsorbed cells from the still free diseased cells or cell components in the suspen sion separately and for the respective application, in particular stimulating the immune system of an organism provides. The separation is preferably done by removing the diseased cells or cell components from the suspension or transfer of the solid phase substrate into another vice environment. Then the modified cells from the festival phase substrate detached. This is done, for example, by egg an enzymatic process. According to a preferred aspect of Invention is the method for generating immunologically active ver dendritic cells used.

Unter Wechselwirkung der Zellen oder Zellbestandteile wird allgemein jede Art von mechanischer oder stofflicher oder an derweitiger Wechselwirkung, insbesondere Wechselwirkungen, bei denen eine Substanzübertragung oder eine Übertragung von Zell bestandteilen auf eine dendritische Zelle erfolgen, betrach tet. Die Zellen werden durch Bildung chemischer Verbindungen oder physikalischer Assoziationen gekoppelt, so dass sich die Zellmembranen berühren. Wenn sich die Zellmembranen berühren, kommt es zur gegenseitigen Wechselwirkung. Es werden bspw. Membranstücken des einen Zelltyps auf den anderen Zelltyp ü bertragen.Interaction of cells or cell components generally any type of mechanical or material or other further interaction, in particular interactions which is a substance transfer or a transfer of cells constituents on a dendritic cell, considered tet. The cells are formed by forming chemical compounds or physical associations, so that the Touch cell membranes. When the cell membranes touch, there is mutual interaction. For example, Membrane pieces of one cell type on the other cell type ü transferred.

Ein entscheidender Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Modifizierung der Antigene präsentierenden Zellen inner halb kurzer Zeiten wie bei der herkömmlichen Elektrofusion durchgeführt werden kann, wobei jedoch gegenüber den herkömm lichen Fusions- oder Scheinfusionstechniken vorteilhafterweise nur Zellbestandteile mit den gewünschten Antigenen, nicht je doch ganze Tumorzellen an die dendritischen Zellen angekoppelt werden. Damit wird erstmalig das Metastasierungsrisiko bei An wendung der dendritischen Zellen eliminiert.A decisive advantage of the invention is that the modification of the antigen presenting cells inside half short times as with conventional electrofusion can be carried out, however compared to the conventional Lichen fusion or sham fusion techniques advantageously only cell components with the desired antigens, not ever however, whole tumor cells are coupled to the dendritic cells become. This is the first time that the risk of metastasis at An elimination of dendritic cells.

Die Bindung der Gruppe der Antigene übertragenden Zellen oder der Gruppe der Antigene präsentierenden Zellen an ein Festpha sensubstrat besitzt den Vorteil, dass die Parameter der gegen seitigen Wechselwirkung, insbesondere ausgeübte Kräfte, Wech selwirkungsdauer, Temperatur, beteiligte Substanzen, mit hoher Genauigkeit, Reinheit und Reproduzierbarkeit eingestellt wer den können.Binding of the group of cells carrying antigens or the group of cells presenting antigens to a solid pha sensubstrat has the advantage that the parameters of the counter mutual interaction, especially exerted forces, altern duration of action, temperature, substances involved, with high Accuracy, purity and reproducibility are set that can.

Als Verfahren zur Kontaktierung und Aneinanderkopplung der Zellen durch Ausübung äußerer Kräfte sind alle an sich bekann ten Verfahren zur Manipulierung von Zellen oder Partikeln ver wendbar, wie z. B. die Dielektrophorese, die Sedimentation, die Zentrifugation, der hypo-osmolare Schock, die Ausübung von Strömungskräften (z. B. Vermischung und Schütteln), Filter techniken, optische Manipulierung mit Laserpinzetten und der gleichen. Die äußeren Kräfte werden so stark eingestellt, dass die Zellen auch im aneinanderhaftenden Zustand bleiben, wenn die Kraftwirkung abgeschaltet oder beendet wird.As a method for contacting and coupling the Cells through the exercise of external forces are all known per se procedures for manipulating cells or particles reversible, such as B. dielectrophoresis, sedimentation, centrifugation, hypo-osmolar shock, exercise of Flow forces (e.g. mixing and shaking), filters techniques, optical manipulation with laser tweezers and the same. The external forces are set so strongly that the cells also remain in the adherent state when the force effect is switched off or ended.

Zur Modifizierung von Antigene präsentierenden Zellen mit er krankten Zellen oder Zellbestandteilen, wie z. B. Membranvesi keln, die vorteilhafterweise leicht aus erkrankten Zellen, z. B. Tumorzellen, oder Zellbestandteilen oder Partikeln, z. B. Virushüllen, gewonnen werden können, werden beide Zelltypen in einen Wechselwirkungsbereich gebracht und dort äußeren Kräften zur gegenseitigen Kontaktierung ausgesetzt. Die Kräfte zur Kontaktierung werden anwendungsabhängig so lange ausgeübt, bis sich die gewünschte chemische oder physikalische Bindung aus gebildet hat. Dies wird ggf. durch Beobachtung oder Vermessung der Zellen oder des Zellverbundes festgestellt.For modifying cells presenting antigens with er diseased cells or cell components, such as B. Membrane Vesi keln, which is advantageously easily from diseased cells, for. B. Tumor cells, or cell components or particles, e.g. B. Virus envelopes that can be obtained are found in both cell types brought an interaction area and there external forces exposed to mutual contact. The powers to Depending on the application, contacting is carried out until the desired chemical or physical bond has formed. If necessary, this is done by observation or measurement of the cells or of the cell network.

Es können gleichzeitig einzelne oder mehrere Zellen beider Zelltypen zur Wechselwirkung gebracht werden.Single or multiple cells of both can be used simultaneously Cell types are brought into interaction.

Gemäß einer abgewandelten Ausführungsform der Erfindung werden die Antigene präsentierenden Zellen mit erkrankten Zellen im adsorbierten Zustand in Kontakt gebracht, so dass Antigene der erkrankten Zellen auf die Antigene präsentierenden Zellen übertragen werden. Die Übertragung der Antigene erfolgt wie derum, in dem Membranbestandteile der erkrankten Zellen an den Antigene präsentierenden Zellen anhaften oder in deren Membra nen eingebaut oder aufgenommen werden.According to a modified embodiment of the invention the antigen presenting cells with diseased cells in the adsorbed state contacted so that antigens of the diseased cells on the antigen presenting cells be transmitted. The transfer of the antigens takes place as therefore, in the membrane components of the diseased cells to the Antigen presenting cells attach or in their membra be installed or included.

Eine weitere Grundidee der Erfindung ist es, biologische und/oder synthetische Zellen, Zellbestandteile oder Makromole küle miteinander zu Wechselwirkungen zu veranlassen, indem die jeweiligen Teilchen miteinander in Kontakt gebracht werden, wobei sich die zur Wechselwirkung gebrachten Zellen, Zellbestandteile oder Makromoleküle in einem suspendierten Zustand in einer Suspension befinden. Es erfolgt eine Modifizierung von Antigene präsentierenden Zellen mit erkrankten Zellen im suspendierten Zustand. Antigene präsentierende Zellen und er krankte Zellen oder Zellbestandteile von erkrankten Zellen (z. B. Tumorzellen oder Tumorzellbestandteile, Bakterien, Vi ren/Virenhüllen, Stammzellen, Knochenmarkzellen oder Epithel zellen) werden in einer Suspension äußeren Kräften derart aus gesetzt, dass die verschiedenen Zelltypen oder Zellbestandtei le sich gegenseitig berühren. Der Erfinder hat festgestellt, dass eine Berührung unter Einwirkung äußerer Kräfte ausreicht, um ausschließlich Membrankomponenten mit den Antigenen von den erkrankten Zellen oder Zellbestandteilen auf die Antigene prä sentierenden Zellen zu übertragen. Zellkerne und andere Be standteile der erkrankten Zellen bleiben in der Suspension. Die modifizierten Antigene präsentierenden Zellen werden von den noch freien erkrankten Zellen oder Zellbestandteilen in der Suspension getrennt und für die jeweiligen Anwendung, ins besondere die Anregung des Immunsystems eines Organismus, be reitgestellt. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird das Verfahren zur Erzeugung immunologisch aktiver Zellen verwendet. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbeson dere die Modifizierung von suspendierten Antigene präsentie renden Zellen, wie T-Zellen, B-Zellen oder Mastzellen verwen det.Another basic idea of the invention is biological and / or synthetic cells, cell components or macromoles to induce interactions with one another by the respective particles are brought into contact with one another, where the interacting cells, cell components or macromolecules in a suspended state are in a suspension. There is a modification of antigen presenting cells with diseased cells in the suspended state. Antigen presenting cells and he diseased cells or cell components of diseased cells (e.g. Tumor cells or tumor cell components, bacteria, Vi ren / virus envelopes, stem cells, bone marrow cells or epithelium cells) are exposed to external forces in this way in a suspension set that the different cell types or cell components le touch each other. The inventor found that touch under the influence of external forces is sufficient, to only use membrane components with the antigens from the diseased cells or cell components on the antigens pre transmit cells. Cell nuclei and other be Parts of the diseased cells remain in the suspension. The modified antigen presenting cells are from the still free diseased cells or cell components in of the suspension separately and for the respective application, ins special stimulation of the immune system of an organism, be Semi asked. According to a preferred aspect of the invention is the process of generating immunologically active cells used. The subject of the present invention is in particular present the modification of suspended antigens cells such as T cells, B cells or mast cells det.

Nach der Kontaktierung ist es, in Abhängigkeit von den spezi fischen Eigenschaften der erkrankten Zellen, unter Umständen vorteilhaft, den Einbau der Antigene in den zu modifizierenden Zellen durch einen Feldpuls, der zum reversiblen dielektri schen Durchbruch der Membran führt, zu verstärken (z. B. feld induzierte Endozytose). Es wird, z. B. mit einer Elektroden einrichtung, wie sie an sich zur Elektroporation von Zellen bekannt ist, ein Durchbruchpuls in hypo- oder iso-osmolarer Lösung induziert. Dies hat den Vorteil, dass Membranbestandteile besonders schnell von den zu modifizierenden Zellen auf genommen werden.After contacting it, depending on the speci fish properties of the diseased cells, under certain circumstances advantageous to incorporate the antigens in the to be modified Cells by a field pulse leading to reversible dielectri membrane breakthrough leads to reinforcement (e.g. field induced endocytosis). It is e.g. B. with an electrode device as such for electroporation of cells is known a breakthrough pulse in hypo- or iso-osmolar Solution induced. This has the advantage that membrane components particularly quickly from the cells to be modified be taken.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Antigene präsentierenden Zellen mit Zellbestandteilen von er krankten Zellen, insbesondere mit Membranbestandteilen, in Kontakt gebracht, um die Antigene von diesen zu übernehmen. Hierzu werden die gewünschten Zellbestandteile zunächst von den Kernen und dem Zytoplasma der erkrankten Zellen abgetrennt und dann mit den Antigene präsentierenden Zellen zur Wechsel wirkung gebracht. Als Zellbestandteile werden vorzugsweise Membranbruchstücke, die sich spontan zu Membranvesikeln for mieren, verwendet.According to a further embodiment of the invention, the Antigen presenting cells with cell components from it diseased cells, especially with membrane components, in Contacted to take over the antigens from these. For this, the desired cell components are first of all the nuclei and the cytoplasm of the diseased cells and then alternating with the cells presenting the antigens brought effect. As cell components are preferred Membrane fragments that spontaneously form membrane vesicles for lubricate, used.

Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Ver fahren zur passiven Immunisierung oder Impfung von Organismen gegen Erkrankungen, insbesondere Tumorerkrankungen, bereitge stellt. Zur Umsetzung des Verfahrens werden allogene. z. B. dendritische Zellen, d. h. Zellen von einem anderen (gesunden) Menschen, sowie z. B. Tumorzellen des Patienten entnommen, ge gen den die behandelten Zellen immunologisch aktiviert werden sollen. Die entnommenen Zellen werden einem der genannten Ver fahren zur gegenseitigen Wechselwirkung unterzogen, so dass die dendritischen Zellen Tumor-Antigene aufnehmen. Die behan delten dendritischen Zellen werden anschließend dem Probanden (Patienten) rückinjiziert. Als Tumorzellen können auch bereits bestrahlte (abgetötete) Tumorzellen verwendet werden. Eine er findungsgemäße passive Immunisierung kann analog auch gegen bakterielle oder virale Infektionen erfolgen.According to another aspect of the invention, a ver drive for passive immunization or vaccination of organisms against diseases, especially tumor diseases provides. To implement the procedure, allogeneic. z. B. dendritic cells, d. H. Cells from another (healthy) People, as well as B. Tumor cells taken from the patient, ge against which the treated cells are activated immunologically should. The removed cells are one of the Ver drive to mutual interaction, so that the dendritic cells absorb tumor antigens. The behan Deleted dendritic cells are then the subject (Patient) injected back. As tumor cells can already irradiated (killed) tumor cells can be used. A he passive immunization according to the invention can analogously also against bacterial or viral infections occur.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein zellulärer Impfstoff, der Zellen enthält, die mit Antigenen von erkrankten Zellen oder Zellbestandteilen modifiziert sind. The invention also relates to a cellular vaccine, which contains cells with antigens from diseased cells or cell components are modified.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Manipu lierung biologischer Zellen. Die Vorrichtung enthält insbeson dere mindestens ein Festphasensubstrat zur Aufnahme der zu mo difizierenden Zellen, eine Einrichtung zur Lagerung und Zufüh rung von Zellen oder Zellbestandteilen in einen Wechselwir kungsbereich (z. B. Flüssigkeitsbehälter), in dem das Festpha sensubstrat angeordnet ist, eine Manipulierungseinrichtung im Wechselwirkungsbereich, z. B. ein Mikroelektrodensystem zur dielektrophoretischen Manipulierung von Zellen, ggf. eine Mess- und Beobachtungseinrichtung zur Erfassung des Ergebnis ses der Zellbehandlung, und eine Extraktionseinrichtung.The invention also relates to a device for manipulation biological cells. The device contains in particular whose at least one solid phase substrate for receiving the mo differentiating cells, a device for storage and feeding interaction of cells or cell components area (e.g. liquid container) in which the solid phase is arranged, a manipulation device in the Interaction area, e.g. B. a microelectrode system for dielectrophoretic manipulation of cells, possibly a Measuring and observation device for recording the result ses of cell treatment, and an extraction device.

Die Erfindung wird vorzugsweise zur passiven Immunisierung oder Impfung gegen Tumorwachstum angewendet.The invention is preferably used for passive immunization or vaccination against tumor growth.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:Further details and advantages of the invention will become apparent from the following description of exemplary embodiments with reference can be seen in the accompanying drawings. Show it:

Fig. 1 eine schematische Illustration der erfin dungsgemäßen Modifizierung dendritischer Zellen, und Fig. 1 is a schematic illustration of the inventive modification of dendritic cells, and

Fig. 2 schematische Schnittansichten erfindungs gemäßer Vorrichtungen. Fig. 2 are schematic sectional views of devices according to the Invention.

Das Grundprinzip der Erfindung, nämlich der Einbau von Antige nen in Antigene präsentierende Zellen durch deren Kontaktie rung mit erkrankten Zellen oder Zellbestandteilen unter Wir kung äußerer Kräfte, kann jeweils mit dem Ziel einer Immunthe rapie mit den verschiedensten Typen erkrankter Zellen reali siert werden. Als Antigene präsentierende Zellen können erfin dungsgemäß insbesondere dentritische Zellen, T-Zellen, B- Zellen oder Mastzellen verwendet werden. Die Erfindung wird im folgenden ohne Beschränkung am Beispiel der Modifizierung dendritischer Zellen beschrieben. Als "Antigen" werden hier alle biologischen Moleküle verstanden, auf die ein Organismus mit einer Immunantwort reagiert. Die Antigene können natürli chen oder artifiziellen Ursprungs sein. Sie können von Zellen, Zellbestandteilen, synthetischen Teilchen (wie z. B. Membran vesikeln) oder frei aus der Suspension auf die zu modifizie renden Zellen übertragen werden. Neben Tumorzellen können bspw. auch Bakterien, Viren/Virenhüllen, Stammzellen, Knochen markzellen oder Epithelzellen verwendet werden, um Antigene oder Membranbestandteile dieser Zellen auf die dendritischen Zellen zu übertragen. Im Folgenden wird die Erfindung ohne Einschränkung in Bezug auf die Modifizierung festphasenadsor bierter, dendritischer Zellen mit Tumorzellen erläutert.The basic principle of the invention, namely the incorporation of antigen cells present in antigens through their contact tion with diseased cells or cell components under We kung external forces, each with the goal of an immune therapy with various types of diseased cells reali be settled. Cells presenting as antigens can be invented according to the invention, in particular dentritic cells, T cells, B cells Cells or mast cells can be used. The invention is in following without limitation using the example of the modification dendritic cells. As an "antigen" are here understood all biological molecules on which an organism responded with an immune response. The antigens can be natural be of artificial or artificial origin. You can of cells, Cell components, synthetic particles (such as membrane vesicles) or freely from the suspension to be modified cells are transmitted. In addition to tumor cells For example, bacteria, viruses / virus envelopes, stem cells, bones marrow cells or epithelial cells are used to generate antigens or membrane components of these cells to the dendritic Cells to transfer. In the following the invention is without Restriction on modification of solid phase adsor bier, dendritic cells with tumor cells explained.

Des Weiteren ist die Erfindung durch die Ankopplung ganzer er krankter Zellen, die ggf. vorher abgetötet wurden, oder von deren Membranbestandteilen an die dendritischen Zellen umsetz bar. Die Membranbestandteile werden entweder aus den erkrank ten Zellen zuerst gewonnen und dann mit den dendritischen Zel len zur Wechselwirkung gebracht oder von den erkrankten Zellen während der Kontaktierung mit den dendritischen Zellen auf diese übertragen. Die Wechselwirkung der dendritischen Zellen mit den erkrankten Zellen besitzt den Vorteil eines verein fachten Verfahrensablaufes, da der Schritt der gesonderten Be reitstellung der Membranbestandteile entfällt. Es müssen je doch besondere Maßnahmen zum Metastasierungs- oder Infektions schutz getroffen werden, falls die erkrankten Zellen komplett an die dendritischen Zellen angekoppelt werden. Werden die Membranbestandteile gesondert präpariert, besitzt dies den Vorteil, dass die modifizierten dendritischen Zellen in ihrer Größe und in ihren funktionellen Eigenschaften kaum verändert sind. Die modifizierten Zellen bewegen sich auf dem Weg zum Lymphknoten und verhalten sich dort wie unmodifizierte Zellen. Damit wird die immunstimulierende Funktion der dendritischen Zellen verbessert. Im Folgenden wird ohne Einschränkung vorrangig auf die Wechselwirkung dendritischer Zellen mit Memb ranbestandteilen, die gesondert präpariert wurden, Bezug ge nommen.Furthermore, the invention is by coupling all of it diseased cells that may have been previously killed, or from their membrane components to the dendritic cells bar. The membrane components are either diseased from the ten cells first and then with the dendritic cell len interacted or from the diseased cells during contact with the dendritic cells transfer this. The interaction of dendritic cells with the diseased cells has the advantage of an association fold procedure, since the step of separate Be The membrane components are no longer required. It must ever but special measures for metastasis or infection protection if the diseased cells are complete be coupled to the dendritic cells. Will the Prepared membrane components separately, this has the Advantage that the modified dendritic cells in their Size and hardly changed in its functional properties are. The modified cells move towards Lymph nodes and behave there like unmodified cells. With this, the immunostimulating function of the dendritic Cells improved. In the following, priority is given without restriction on the interaction of dendritic cells with Memb ran components that were prepared separately, reference ge accepted.

Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, dass die an einer Festphase adsorbierten dendritischen Zellen einer seits und die erkrankten Zellen oder deren Zellbestandteile andererseits in einer gemeinsamen Suspension äußeren Kräften ausgesetzt werden. Dies ermöglicht eine Kurzzeitkontaktierung, die je nach Art der äußeren Kräfte im Bereich von Mikrosekun den oder Millisekunden, wenigen Minuten oder bis zu ein bis zwei Stunden liegen kann. Damit wird gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhebliche Reduzierung der Behandlungsdauer er zielt. Der Anteil der dendritischen Zellen, die die Behandlung ohne Funktionseinbuße überleben, wird damit erhöht. Die Wirk samkeit des erfindungsgemäßen Impfstoffs auf der Grundlage mo difizierter dendritischer Zellen wird erhöht. Im Folgenden wird ohne Einschränkung auf die Ausübung von Strömungskräften in der gemeinsamen Suspension, z. B. durch Bewegung des die Suspension enthaltenden Gefäßes oder anderweitiges Vermischen, und/oder elektrischen Kräften Bezug genommen. Die äußeren Kräfte können analog durch die dielektrophoretische Kräfte, Zentrifugationskräfte, optische Kräfte und/oder die weiteren, oben genannten Kräfte ausgeübt werden. Dabei sind die entspre chenden, an sich bekannten Techniken zur Handhabung von Zellen oder Zellbestandteilen einsetzbar.An essential feature of the invention is that the dendritic cells adsorbed on a solid phase hand and the diseased cells or their cell components on the other hand, in a common suspension, external forces get abandoned. This enables a short-term contact, which depending on the type of external forces in the microsecond range or milliseconds, a few minutes or up to one to can be two hours. This is compared to conventional Procedure a significant reduction in treatment time aims. The percentage of dendritic cells that make up the treatment Surviving without loss of function is increased. The effect samkeit of the vaccine according to the invention based on mo differentiated dendritic cells is increased. Hereinafter is used without restriction to the application of flow forces in the common suspension, e.g. B. by moving the Vessel containing suspension or other mixing, and / or electrical forces. The outer Forces can be analogously determined by the dielectrophoretic forces, Centrifugation forces, optical forces and / or the others, above forces are exercised. The corresponding are techniques known per se for handling cells or cell components can be used.

Die Modifizierung von allgemein Antigene präsentierenden Zel len in Suspensionen, die auch Gegenstand der Erfindung ist, erfolgt an sich, wie es in DE 100 53 783.9 mit dentritischen Zellen erläutert ist. Im folgenden wird ohne Einschränkung die Erfindung am Beispiel der Festphasen-Modifizierung erläutert.The modification of cells which generally present antigens len in suspensions, which is also the subject of the invention, takes place as it is in DE 100 53 783.9 with dentritic Cells is explained. In the following, the Invention explained using the example of the solid phase modification.

Fig. 1 zeigt schematisch den Präparationsschritt 1. zur Her stellung von Membranvesikeln aus Tumorzellen, den Kontaktierungsschritt 2. zur Modifizierung der dendritischen Zellen und den Trennungsschritt 3. zur Abtrennung der modifizierten dendritischen Zellen vom Festphasensubstrat. Im Folgenden wer den zunächst der Präparationsschritt an einem Verfahrensbei spiel und anschließend die Kontaktierungs- und Trennungs schritte erläutert. Fig. 1 shows schematically the preparation step 1. to manufacture membrane vesicles from tumor cells, contacting step 2 . to modify the dendritic cells and separation step 3 . for separating the modified dendritic cells from the solid phase substrate. In the following, the preparation step is first explained using a process example and then the contacting and separation steps.

Preparation step 1

Beim Präparationsschritt werden Membranvesikel aus Tumorzellen durch ein an sich bekanntes Homogenisierungsverfahren mit an schließender Entfernung der Zellkerne hergestellt. Die Verfah rensweise wird bspw. von J. M. Graham et al. in "Molekularbio logische Membrananalyse", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, 1998, erläutert.In the preparation step, membrane vesicles become tumor cells through a known homogenization process subsequent removal of the cell nuclei. The procedure For example, J.M. Graham et al. in "Molecular Bio logical membrane analysis ", Spectrum Akademischer Verlag GmbH, 1998, explained.

Die Tumorzellen werden mit einem Glas-Potter homogenisiert. Es werden bspw. mit einem üblichen Labor-Potter (Spaltbreite z. B. 150 µm) 5-ml-Proben mehrfach (z. B. 15-fach) homogenisiert. Anschließend wird die homogenisierte Suspension zentrifugiert. Im Ergebnis der Zentrifugation befinden sich die schweren Zellbestandteile, insbesondere die Kerne und Organellen, im Pellet. Die Zellbestandteile geringerer Dichte (Membranbe standteile) befinden sich im Überstand. Es erfolgt bspw. eine Zentrifugation bei 3500 rpm (2000.g) mit einer Dauer von 15 Minuten. Nach der Zentrifugation wird der Überstand vom Pellet getrennt. Aus den Membranbestandteilen bilden sich Membranve sikeln, d. h. geschlossene, lediglich mit der Suspensionsflüs sigkeit gefüllte Membranhüllen in Kugelform. Die Membranvesi keln besitzen charakteristische Durchmesser von weniger als 1 µm. In den Membranen der Membranvesikeln sind die Tumoranti gene mit dem immunstimulierenden MHCI-Komplex enthalten. Die Vesikelsuspensionen werden z. B. als 4-ml-Proben im Kühl schrank gelagert. Die ursprüngliche Osmolalität der Vesikel suspensionen wird zur Vermeidung einer Verletzung der Membranvesikeln durch osmotischen Druck von zunächst 20 mOsm auf eine höhere Osmolalität (z. B. 80 mOsm) eingestellt. Dies erfolgt bspw. mit 10-facher PBS (80 µl 10-fach PBS + 4 ml Vesikel suspension).The tumor cells are homogenized with a glass Potter. It are, for example, with a conventional laboratory Potter (gap width e.g. 150 µm) 5 ml samples homogenized several times (e.g. 15 times). The homogenized suspension is then centrifuged. The result of the centrifugation is the heavy one Cell components, especially the nuclei and organelles, in Pellet. The cell components of lower density (membrane components) are in the supernatant. There is, for example Centrifugation at 3500 rpm (2000.g) with a duration of 15 Minutes. After centrifugation, the supernatant is removed from the pellet Cut. Membrane ves form from the membrane components sicles, d. H. closed, only with the suspension rivers liquid filled membrane covers in spherical form. The membrane vesi have characteristic diameters of less than 1 µm. The tumoranti are in the membranes of the membrane vesicles Contain genes with the immunostimulating MHCI complex. The Vesicle suspensions are e.g. B. as 4 ml samples in the refrigerator stored in a cabinet. The original osmolality of the vesicles Suspensions are used to avoid injury to the membrane vesicles by osmotic pressure of initially 20 mOsm on one higher osmolality (e.g. 80 mOsm) set. this happens e.g. with 10-fold PBS (80 µl 10-fold PBS + 4 ml vesicles suspension).

Im Ergebnis des Präparationsschrittes 1. ist der Zellkern von den Membranvesikeln getrennt, wie dies in Fig. 1 schematisch illustriert ist. Die erfindungsgemäße Modifizierung der dendritischen Zellen erfolgt lediglich mit den Membranvesi keln, die die Tumorantigene tragen.As a result of preparation step 1 . the cell nucleus is separated from the membrane vesicles, as is schematically illustrated in FIG. 1. The modification of the dendritic cells according to the invention takes place only with the membrane vesicles which carry the tumor antigens.

Für Analyse- oder Testzwecke kann eine Einfärbung der Membran proteine vorgesehen sein. Zur Einfärbung wird zunächst die Tu morzellsuspension mit dem Markierungsfarbstoff (z. B. FITC) versetzt. Anschließend erfolgt eine Entfernung des ungebunde nen Farbstoffes aus der Suspension. Die Zellsuspension (1.2 ml, PBS, 1.10⁷/ml) wird mit 50. . .150 µM FITC (36 µl, Stamm lösung 5 mM in DMF) versetzt. Die Färbung dauert bei 37°C rund 5. . .15 min. Zur Entfernung des ungebundenen Farbstoffes er folgen mehrere Waschschritte mit einem den restlichen Farb stoff bindenden Protein (z. B. mit PBS-BSA, 20°C, 1% BSA), jeweils kombiniert mit Zentrifugationsschritten. Anschließend erfolgt ein Waschen in einer Pufferlösung, eine Zentrifugation und die Bereitstellung des Pellets mit den Tumorzellen in ei nem PMSF-Puffer, der hypo-osmolar ist, so dass die Tumorzellen anschwellen. Als PMSF-Puffer ist die folgende Zusammensetzung vorgesehen: 10 mM Tris, 0.5 mM Proteasen-Inhibitor PMSF (Phe nylmethylsulfonylfluorid), pH 7.2.For analysis or test purposes, the membrane proteins can be colored. For coloring, the tumor dye suspension is first mixed with the marking dye (e.g. FITC). The unbound dye is then removed from the suspension. The cell suspension (1.2 ml, PBS, 1.10 ⁷ / ml) is 50. .150 µM FITC (36 µl, stock solution 5 mM in DMF) added. The coloring takes around 5 at 37 ° C. .15 minutes. To remove the unbound dye, he followed several washing steps with a protein binding the rest of the dye (e.g. with PBS-BSA, 20 ° C, 1% BSA), each combined with centrifugation steps. This is followed by washing in a buffer solution, centrifugation and provision of the pellet with the tumor cells in a PMSF buffer which is hypo-osmolar, so that the tumor cells swell. The following composition is provided as the PMSF buffer: 10 mM Tris, 0.5 mM protease inhibitor PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), pH 7.2.

Contacting step 2 / separation step 3.

Zur Kontaktierung wird zunächst ein Festphasensubstrat mit ad sorbierten dendritischen Zellen bereitgestellt. Das Festpha sensubstrat wird dann mit der Vesikelsuspension in eine ge meinsame Suspension überführt, in der die Kontaktierung der Membranvesikeln mit den dendritischen Zellen unter Wirkung äu ßerer Kräfte erfolgt.For contacting, a solid-phase substrate with ad sorbed dendritic cells. The Festpha Sensubstrat is then with the vesicle suspension in a ge transferred common suspension in which the contacting of the Membrane vesicles with the dendritic cells under the action Greater forces occur.

Die dem Körper des zu behandelnden Organismus entnommenen dendritischen Zellen werden als Monolage oder Submonolage auf dem Festphasensubstrat angeordnet. Dies erfolgt durch ein ge eignetes Immobilisierungsverfahren. Die Immobilisierung er folgt durch mechanisches Aufbringen der Zellen auf die Fest phase, gegebenenfalls unter Verwendung von Bindungsschichten auf der Festphasenoberflache. Es können Zellen beispielsweise durch Unterdruck an eine Filtermembran angesaugt werden (ana log zur Filtration). Für die Bindungsschichten werden bei spielsweise Fibronection, Collagen, Poly-Lysin, Gelatine, Matrigel, FBS (Fötales Kälberserum) oder Alginat verwendet. Als Festphasensubstrat werden beispielsweise Kunststoff- oder Glassubstrate verwendet. Vorzugsweise werden die dendritischen Zellen auf mikroporösen Kunststoffmembranen immobilisiert. Als Membranen werden beispielsweise PET- oder PC-Membranen (Dicken rund 15 bis 25 µm, Porengrößen rund 0,4 bis 1 µm, Porosität rund 15 bis 20%) verwendet. Bei diesen Substraten überdeckt jede Zelle im adhärenten Zustand vorzugsweise eine Pore, al ternativ aber auch mehrere Poren.Those taken from the body of the organism to be treated dendritic cells are called monolayers or submonolayers the solid phase substrate. This is done by a ge suitable immobilization process. Immobilization follows by mechanical application of the cells to the hard phase, optionally using bond layers on the solid phase surface. For example, cells can be sucked into a filter membrane by vacuum (ana log for filtration). For the bond layers are at for example fibronection, collagen, poly-lysine, gelatin, Matrigel, FBS (fetal calf serum) or alginate are used. Plastic or, for example, are used as the solid phase substrate Glass substrates used. Preferably the dendritic Cells immobilized on microporous plastic membranes. As Membranes are, for example, PET or PC membranes (thicknesses around 15 to 25 µm, pore sizes around 0.4 to 1 µm, porosity around 15 to 20%) is used. Covered with these substrates each cell in the adherent state preferably a pore, al Alternatively, it also has several pores.

Das Festphasensubstrat wird mit den Zellen in einer erfin dungsgemäßen Vorrichtung, deren Einzelheiten unten unter Bezug auf Fig. 2 erläutert werden, in einem Wechselwirkungsbereich gemeinsam mit der Suspension von erkrankten Zellen oder Zell bestandteilen, z. B. den oben erläuterten Membranvesikeln an geordnet. Im Wechselwirkungsbereich erfolgt die Übertragung der Antigene auf die dendritischen Zellen. The solid phase substrate with the cells in a device according to the invention, the details of which are explained below with reference to FIG. 2, in an interaction area together with the suspension of diseased cells or cell components, e.g. B. arranged the membrane vesicles explained above. In the interaction area, the antigens are transferred to the dendritic cells.

(a) Osmotic-induced incorporation of the vesicles into dendritic cell

Die Suspension im Wechselwirkungsbereich kann isoton oder hy poton gebildet sein. Die hypotone Suspension wird bevorzugt, da in dieser die dendritischen Zellen angeschwollen sind. Die angeschwollenen dendritischen Zellen sind mit größerer Effek tivität mit den Membranvesikeln modifizierbar. Zur Herstellung der isotonen Suspension wird z. B. eine Suspension aus PBS (z. B. 5 ml, 280 mOsm) verwendet. Zur Herstellung der hypotonen Suspension wird z. B. eine Suspension aus hypo-osmolarem PBS (z. B. 100 µl, 80 mOsm) aufgenommen.The suspension in the interaction area can be isotonic or hy poton be formed. The hypotonic suspension is preferred because the dendritic cells are swollen in it. The swollen dendritic cells are more effective activity can be modified with the membrane vesicles. For the production the isotonic suspension is e.g. B. a suspension of PBS (e.g. 5 ml, 280 mOsm) was used. To make the hypotonic Suspension is z. B. a suspension of hypo-osmolar PBS (e.g. 100 µl, 80 mOsm) added.

Die isotone oder hypotone Suspension wird dann im Wechselwir kungsbereich mit der Vesikelsuspension (z. B. 2 ml, 80 mOsm) zusammengeführt, um die erfindungsgemäße Modifizierung der dendritischen Zellen mit den Membranvesikeln zu bewirken. Hierzu erfolgt zunächst eine Inkubation bei 37°C (10 min). An schließend erfolgt eine Einstellung der Suspension auf einen iso-osmolaren Zustand (z. B. mit 147 µl 10-fach PBS auf 280 mOsm). Dadurch werden die dendritischen Zellen verklei nert, es entsteht eine unregelmäßig gekrümmte Membranoberflä che, deren Gestalt den Einbau der Membranvesikel in die Memb ran, Endozytosevorgänge und ein äußeres Adherieren fördert. Es folgt eine Inkubation bei 37°C für rund 1.5. . .2 Stunden. Während dieser Inkubation erfolgt die Modifizierung der dendritischen Zellen.The isotonic or hypotonic suspension then interacts area with the vesicle suspension (e.g. 2 ml, 80 mOsm) merged to the modification of the invention to effect dendritic cells with the membrane vesicles. For this purpose, incubation is first carried out at 37 ° C (10 min). to the suspension is then adjusted to one Iso-osmolar state (e.g. with 147 µl 10-fold PBS 280 mOsm). This will reduce the size of the dendritic cells nert, there is an irregularly curved membrane surface che, the shape of which incorporates the membrane vesicles into the membrane ran, endocytosis processes and external adherence promotes. It followed by an incubation at 37 ° C for around 1.5. , .2 hours. The modification of the dendritic cells.

Die äußeren Kräfte werden beispielsweise in Form von Strö mungskräften ausgeübt. Hierzu wird die Membran mit den dendri tischen Zellen und/oder die Suspensionsflüssigkeit im Wechsel wirkungsbereich bewegt. Die Bewegung erfolgt vorzugsweise der art, dass im Wechselwirkungsbereich nahe der Oberfläche des Festphasensubstrats turbulente Strömungen auftreten, durch die in der Suspension befindliche Teilchen möglichst zahlreich und mit möglichst hohen Kräften gegen das Festphasensubstrat ge strömt werden.The external forces are, for example, in the form of currents exercised. For this, the membrane with the dendri table cells and / or the suspension liquid alternately area of effect moved. The movement is preferably the kind that in the interaction area near the surface of the Solid-phase substrate turbulent flows occur through which Particles in the suspension as numerous as possible and with the highest possible forces against the solid phase substrate be flocked.

Anschließend erfolgt eine Waschung mit PBS (280 mOsm), um die nicht-angekoppelten (noch freien) Membranvesikel zu entfernen.This is followed by washing with PBS (280 mOsm) to remove the Remove uncoupled (still free) membrane vesicles.

Das nun vorliegende Festphasen trägt modifizierte dendritische Zellen, die beim Trennungsschritt 3. zur Bereitstellung des zellulären Tumorimpfstoffs vom Festphasensubstrat abgelöst werden (siehe Fig. 1, rechts unten). Der Tumorimpfstoff ent hält die Antigene der Tumorzelle direkt in der Membran oder in angehefteten Membranbestandteilen.The solid phase now present carries modified dendritic cells which are used in separation step 3 . to provide the cellular tumor vaccine detached from the solid phase substrate (see Fig. 1, bottom right). The tumor vaccine contains the antigens of the tumor cell directly in the membrane or in attached membrane components.

Die Trennung der modifizierten dendritischen Zellen vom Fest phasensubstrat kann durch geeignete, an sich bekannte Ablöse techniken erfolgen. Es ist beispielsweise möglich, die Tren nung durch Inkubation in einer hypoosmolaren Pufferlösung oder durch einen enzymatischen Abbau durchzuführen. Dabei werden beispielsweise die folgenden Verfahrensschritte umgesetzt:The separation of the modified dendritic cells from the solid phase substrate can by suitable, known per se techniques are done. For example, it is possible to use the doors by incubation in a hypoosmolar buffer solution or by enzymatic degradation. In doing so For example, the following process steps are implemented:

(b) Electrically-induced vesicle incorporation into dendritic cell

Beim elektrisch induzierten Einbau der Vesikeln wird das Fest phasensubstrat mit den dendritischen Zellen im Wechselwir kungsbereich wie oben beschrieben mit einer Vesikelsuspension zusammengeführt. Z. B. 800 µl der Suspension mit den Vesikeln und dem eingetauchten Festphasensubstrat werden einem elektri schen Feldpuls ausgesetzt, der die äußeren Kräfte zur Modifi zierung der dendritischen Zellen bildet. Die Ausübung des Feldpulses erfolgt mit einer Elektrodeneinrichtung der erfin dungsgemäßen Vorrichtung (siehe Fig. 2). Die Parameter des Feldpulses betragen bspw. 1 kV/cm, Dauer: 20 µs. Nach der Aus übung der Feldpulse erfolgt eine Inkubation bei Raumtemperatur und anschließend zur Regenerierung der Zellen eine Inkubation bei 37°C für eine Stunde. Schließlich wurden die Proben mit PBS (280 mOsm) gewaschen, um die nicht fusionierten, freien Vesikeln zu entfernen, und der Trennungsschritt durchgeführt. Alternativ zur Ausübung des Feldpulses können die Vesikeln auch dielektrophoretisch an die festphasen-adsorbierten dentritischen Zellen herangeführt werden. Die genannten äuße ren Kräfte werden durch die unter Wirkung von hochfrequenten elektrischen Feldern gebildeten Polarisationskräfte gebildet.When the vesicles are electrically induced, the solid-phase substrate is combined with the dendritic cells in the interaction region as described above with a vesicle suspension. For example, 800 µl of the suspension with the vesicles and the immersed solid-phase substrate are exposed to an electrical field pulse which forms the external forces for modifying the dendritic cells. The field pulse is exercised with an electrode device of the device according to the invention (see FIG. 2). The parameters of the field pulse are, for example, 1 kV / cm, duration: 20 µs. After the field pulses have been practiced, they are incubated at room temperature and then incubated at 37 ° C. for one hour to regenerate the cells. Finally, the samples were washed with PBS (280 mOsm) to remove the unfused free vesicles and the separation step was carried out. As an alternative to exercising the field pulse, the vesicles can also be introduced dielectrophoretically to the solid-phase-adsorbed dentritic cells. The aforementioned external forces are formed by the polarization forces formed under the action of high-frequency electrical fields.

Embodiments of an apparatus for modifying An own presenting cells

Fig. 2 zeigt zwei Ausführungsformen erfindungsgemäßer Vorrich tungen, die sich durch die Art der Kraftausübung bei der Wech selwirkung zwischen den adsorbierten dendritischen Zellen und den suspendierten Teilchen unterscheiden. In beiden Fällen sind die dendritischen Zellen 1 auf dem Festphasensubstrat 2 angeordnet, das mit einem Rahmen (nicht dargestellt) an einem Träger 3 befestigt ist. Der Träger 3 ist mit einer Halterung so angeordnet, dass das Festphasensubstrat 2 in einen Flüssig keits- oder Suspensionsbehälter (z. B. Küvette 4 hineinragt. Fig. 2 shows two embodiments of Vorrich lines according to the invention, which differ by the type of force in the interaction between the adsorbed dendritic cells and the suspended particles. In both cases, the dendritic cells 1 are arranged on the solid-phase substrate 2 , which is attached to a carrier 3 with a frame (not shown). The carrier 3 is arranged with a holder so that the solid-phase substrate 2 protrudes into a liquid or suspension container (e.g. cuvette 4) .

Zur Ausübung von Strömungskräften ist eine Schwenkeinrichtung 5, mit der der Träger 3 beweglich ist, und/oder eine Rührein richtung 6, 7 vorgesehen, mit der die Suspensionsflüssigkeit 8 im Innern der Küvette 4 beweglich ist. Die Rühreinrichtung 6, 7 wird beispielsweise durch einen magnetischen Rührer gebil det.To exert flow forces, a swivel device 5 , with which the carrier 3 is movable, and / or a stirring device 6 , 7 is provided, with which the suspension liquid 8 is movable inside the cuvette 4 . The stirring device 6 , 7 is, for example, gebil det by a magnetic stirrer.

Zum elektrisch induzierten Einbau der Vesikeln in die adsor bierten dendritischen Zellen ist gemäß dem unteren Teil von Fig. 2 eine Elektrodeneinrichtung 9, 10 im Innern der Küvette 4 vorgesehen. Die Elektrodeneinrichtung besteht beispielsweise aus metallischen Beschichtungen (z. B. aus Platin), die auf der Innenseite der Küvette 4 angeordnet und elektrisch mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) verbunden sind. Das Festphasensubstrat 2 mit den Zellen 1 ragt in den Zwischenraum zwischen den Elektroden 9, 10, der mit der Suspensionsflüssig keit 8 gefüllt ist. Der Träger 3 liegt auf dem oberen Rand der Küvette 4 auf.For the electrically induced installation of the vesicles in the adsorbed dendritic cells, an electrode device 9 , 10 is provided in the interior of the cuvette 4 according to the lower part of FIG. 2. The electrode device consists, for example, of metallic coatings (for example made of platinum) which are arranged on the inside of the cuvette 4 and are electrically connected to a control device (not shown). The solid phase substrate 2 with the cells 1 protrudes into the space between the electrodes 9 , 10 , which is filled with the suspension liquid speed 8 . The carrier 3 lies on the upper edge of the cuvette 4 .

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist des weiteren mit Flüssig keitszufuhreinrichtungen, Temperierungseinrichtungen und Mani pulatoren ausgestattet, die anwendungsabhängig vorgesehen und in Fig. 2 nicht dargestellt sind. Die erfindungsgemäße Vor richtung kann auch als Durchflusssystem gebildet sein, in dem laufend eine Modifizierung von Zellen gemäß dem erfindungsge mäßen Verfahren unter ständiger Zuführung von erkrankten Zel len oder Zellbestandteilen oder Antigene präsentierenden Zel len erfolgt.The device according to the invention is further equipped with liquid supply devices, temperature control devices and manipulators, which are provided depending on the application and are not shown in FIG. 2. The device according to the invention can also be formed as a flow system in which cells are continuously modified in accordance with the method according to the invention with the constant supply of diseased cells or cell components or cells presenting antigens.

Wichtige Merkmale der Erfindung sind im Folgenden zusammen gefasst:
Important features of the invention are summarized below:

a) The inventors have found that a passive immun Survival or vaccination surprisingly without fusion of can reach dendritic cells with diseased cells. It is sufficient if the cells are contacted becomes. Close contact between cells of both cell types can by chemical compounds or by physi cal forces such. B. dielectrophoresis, centrifugation, fil techniques, etc., with particular advantage if the dendritic cells are in an adsorbed state are a solid phase substrate. The contact is made preferably carried out so that when the mechani electrical or electrical forces the contacted cells do not separate from each other.
b) It is sufficient if the membrane of the tumor cells in close physical or chemical contact with the brought dendritic cells or when irradiated (abge killed) tumor cells can be used.
c) It is particularly advantageous to make contact via the perform electrophoresis in microstructures. This owns in particular the advantage that in microelectrode systems lo Kal high fields can be achieved.
d) It is advantageous to have an adherent tumor to provide membrane pieces in the dendritic cells and the se through the use of strongly hypo-osmolar solutions increase. This results from the fact that after transfer Endocytosis is observed in iso-osmolar solutions. The However, the use of iso-osmolar solutions is fundamentally also possible.
e) It is particularly advantageous to use a field-induced endozy trigger tose. This means that according to physical or chemical contacting a breakthrough pulse in hypo-osmolar Solution is induced.

Claims

1. A method for modifying antigen-presenting cells, in which antigens are transferred from diseased cells or their cell components to the antigen-presenting cells, characterized in that the antigen-presenting cells are arranged on a solid phase substrate and are introduced with the diseased cells or their cell components be brought into contact in a common suspension and exertion of external forces, where membrane components with antigens without cell nuclei are transferred from the diseased cells or the cell components to the cells presenting the antigens, and then the modified cells are separated from the solid phase substrate.

2. The method according to claim 1, wherein the antigens present tating cells with the diseased cells or the cell stand by exerting flow forces, e.g. B. Stir or shaking, dielectrophoretic forces, centrifugation forces, filter techniques, sedimentation, hypo-osmolar Shock and / or optical forces are brought into contact.

3. The method of claim 2, wherein the antigens present tating cells with the diseased cells or the cell components by pipetting into the suspension and generating flow forces by mixing in contact be brought.

4. The method according to claim 3, wherein the suspension in egg an isotonic solution is formed.

5. The method according to claim 3, wherein the suspension in egg a hypotonic solution is formed.

6. The method according to any one of claims 2 to 5, wherein the Antigen presenting cells and the diseased cells or the cell components in the suspension of a field treatment be subjected.

7. The method according to claim 6, wherein the field treatment Exercise at least one high voltage electrical pulse and / or the application of polarizing forces under effect of dielectrophoresis.

8. The method according to any one of the preceding claims, at which the cell components comprise membrane vesicles made of Membrane pieces of the diseased cells are formed.

9. The method according to claim 8, wherein the membrane vesicles by homogenizing and centrifuging the diseased cells be generated.

10. The method according to any one of the preceding claims, at the cells presenting the antigens are dentritic cells, Include T cells, B cells or mast cells.

11. The method according to any one of the preceding claims, at which the diseased cells or cell components are tumor cells, Epithelial cells, stem cells, bone marrow cells or virus envelopes include.

12. The method according to any one of the preceding claims, at a short-term contact with the dendritic cells the diseased cells or their cell components.

13. The method according to claim 1, wherein at least one cell species moved to the other species with external forces until they touch each other.

14. The method according to claim 1, wherein the external forces so that the cells are pressed against each other.

15. The method according to claim 1, wherein between the antigens presenting cells and the diseased cells or their Cell components an exchange of substances or cellbe components takes place.

16. The method according to any one of the preceding claims, at the one endocytosis induced by an electric field follows.

17. Cellular tumor vaccine presenting the antigens Contains cells by a method according to any of the above claims have been modified.

18. Cellular tumor vaccine presenting the antigens Contains cells, in their cell membranes antigens or antigen supporting membrane components of diseased cells, in particular Tumor cells are built.

19. Device for modifying cells presenting antigens, with diseased cells or their cell components, comprising:
a solid phase substrate for receiving adherent antigen-presenting cells, which is arranged with a carrier ( 3 ) in a liquid container ( 4 ) for receiving a suspension of diseased cells or their cell components,
a device for exerting external forces for contacting the suspension components with the adherent antigen-presenting cells, and
an extraction device for obtaining the antigens presenting cells.

20. The apparatus according to claim 19, which a homogenization and centrifugation device for producing core-free Has membrane vesicles of the diseased cells.

21. The apparatus of claim 19 or 20, wherein the device for exerting external forces comprises a pivoting device ( 5 ) for moving the carrier ( 3 ) relative to the liquid container ( 4 ) and / or a stirring device ( 6 , 7 ).

22. The apparatus according to claim 19 or 20, wherein the device for exerting external forces comprises an electrode device for exerting an electrical field pulse in the interior of the liquid container ( 4 ).

23. Method for modifying antigen presenting Cells where the antigens from diseased cells to the antigen ne presenting cells are transmitted, characterized in that the antigen presenting cells with the diseased cells or their cell components by introducing them into a common me suspension and exertion of external forces in contact be, membrane components with antigens without cell nuclei from the diseased cells or the cell components to the Antigen presenting cells are transmitted and an ab separation of the modified antigen presenting cells from free diseased cells or cell components in the suspen sion takes place.