DD285992A5

DD285992A5 - CELL FUSION PROCEDURE

Info

Publication number: DD285992A5
Application number: DD33100189A
Authority: DD
Inventors: Guenter Dreyer; Peter Stolley; Ingrid Walther; Dieter Paul; Claudia Junge; Katrin Weihnert; Klaus Richau; Hans-Hartmut Schwarz
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1989-07-20
Filing date: 1989-07-20
Publication date: 1991-01-10

Abstract

Es wird ein Zellfusionsverfahren zur Fusion im elektrischen Feld dargestellt. Das Verfahren ist fuer die Biotechnologie, insbesondere die Hybridomtechnik und die Medizin anwendbar. Die erfindungsgemaesze Verwendung eines Flaechentraegers zur antigenspezifischen Immobilisierung von Zellen aus einem Zellgemisch, zur Durchfuehrung der Elektrofusion und zur Kultivierung der fusionierten Zellen ermoeglicht eine hohe Ausbeute und eine einfache, schnelle Durchfuehrung des Verfahrens.{Zellfusionsverfahren; Elektrofusion; Hybridomtechnik; Flaechentraeger; Immobilisierung, selektiv}A cell fusion method for fusion in the electric field is presented. The method is applicable to biotechnology, especially hybridoma and medicine. The use according to the invention of a surface carrier for the antigen-specific immobilization of cells from a cell mixture, for carrying out the electrofusion and for culturing the fused cells enables a high yield and a simple, rapid performance of the process. Electrofusion; hybridoma; Flaechentraeger; Immobilization, selective}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung i-«t üuf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Gen· und Immuntechnik, und zur Schaffung der Voraussetzungen für Antikörper-Therapien in der Medizin anwendbar.The invention is applicable in the field of biotechnology, in particular gene and immunotechnology, and for the creation of conditions for antibody therapies in medicine.

Characteristic of the known state of the art

Bei den bekannten Fusionsverfahren werden die Fusionspartner gemeinsam suspendiert, durch mechanische oder elektrische Kräfte (Zentrifugation oder Dielektrophorese) in einen Zustand innigen Zell-Zell-Kontaktes versetzt und durch chemische Stoffe oder elektrische Felder miteinander fusioniert. Art und Häufigkeit der entstehenden Fusionsprodukte unterliegen dem Zufall. Die Ausbeute an interessierenden Fusionsprodukten ist gering, insbesondere wenn einer der beiden Fusionspartner im Zellgemisch nur in geringer Konzentratton vorhanden ist (z.B. antigenspezifisch stimulierte B-Lymphozyten in einem Leukozytengemisch). Die interessierenden Fusionsprodukte werden mit Hilfe von Selektionsmedium aus dem Zellgemisch isoliert. Dieser Vorgang ist langwierig und verringert außerdem die Vitalität der Zellhybride. Die in DE 3505147 angegebene technische Lösung ersetzt die rein zufälligen Paarungen durch eine getrennte Fixierung der Fusionspartner (z. B. der Myelomzellen und der Leukozyten) auf zwei Flächenträgern, die mechanisch aufeinander zu bewegt werden, bis es zum Zell-Zell-Kontakt kommt. Nachfolgend wird dieIn the known fusion methods, the fusion partners are suspended together, transferred by mechanical or electrical forces (centrifugation or dielectrophoresis) in a state of intimate cell-cell contact and fused together by chemical substances or electric fields. The type and frequency of the resulting fusion products are subject to chance. The yield of fusion products of interest is low, especially if one of the two fusion partners is present in the cell mixture only in low concentration tone (e.g., antigen-specifically stimulated B lymphocytes in a leukocyte mixture). The fusion products of interest are isolated from the cell mixture using selection medium. This process is lengthy and also reduces the vitality of the cell hybrids. The technical solution given in DE 3505147 replaces the purely random pairings by a separate fixation of the fusion partners (eg the myeloma cells and the leucocytes) on two surface carriers, which are mechanically moved towards each other until cell-cell contact occurs. Below is the

Zellfusion elektrisch Induziert. Die interessierenden Fusionsprodukte (z.B. Hybridoma) müssen allerdings ebenfalls mittels Selektionsmediums isoliert werden, da z. B. eine Separierung der stimulierten B-Lymphozyten aus einem Leukozytengemisch vor der Fusion bei diesem Verfahren nicht möglich ist.Cell Fusion Electrically Induced. However, the fusion products of interest (e.g., hybridoma) must also be isolated by means of selection medium, e.g. B. a separation of the stimulated B-lymphocytes from a leukocyte mixture prior to fusion in this method is not possible.

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung ist, bei einem Zelifusionsverfahren Arbeitszeit und Selektionsmaterial einzusparen und einen effektiveren, breiteren Einsatt der Hybridomtechnik für die biotechnologische Produktherstellung zu ermöglichen.The object of the invention is to save working time and selection material in a Zelifusionsverfahren and to enable a more effective, broader Einsatt the hybridoma technique for biotechnological product production.

Presentation of the essence of the invention

Die Aufgabe der Et findung besteh'· darin, ein Verfahren zu finden, mit dessen Hilfe die Ausbeute der elektrisch induzierten Zellfusion bei der Hybridomtechnik gesteigert wird und die weitere Kultivierung der Hybridoma einfach und effektiv ist; insbesondere soll der Anteil an Fusionsprodukten aus einer Myelomzelle und einem antigenspezifisch stimulierten B-Lymphozyten erhöht werden. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß z.B. ein Leukozytengemisch mit antigenspezifisch stimulierten B-Lymphozyten auf einen Flächenträger gegeben wird, dessen Oberfläche chemisch aktiviert ist und an der die zur Stimulierung verwendeten Antigenmoleküle kovalent gebunden sind. Die stimulierten Zellen werden durch die Wechselwirkung zwischen den Zellmembranrezeptoren und den trägerfixierten Antigenmolekülen spezifisch um Flächenträger gebunden. Die restlichen Zellen werden durch Spülen entfernt. Die chemischen Aktivierungsmittel dürfen am Flächenträger zu keinen zusätzlichen positiven Festladungen führen, damit die unspezifische Bindungsfähigkeit für Zellen gering bleibt. Die poröse Struktur des Flächentrf gers ermöglicht eine lonenleitfähigkeit in Richtung der Flächennormalen, so daß ein in dieser Richtung angelegtes elektrisches Feld auf die trägerfixierten Zellen in nahezu gleicher Weise wirkt wie euf suspendierte Zellen in Abwesenheit des Flächenträgers. Der Durchmesser und der Abstand der Poren sind klein gegenüber dem Durchmesser der Zellen. Dadurch wird eine unspezifische Festsetzung der Zellen verhindert und darüber hinaus bei einer Dicke des Flächenträgers kleiner als 500pm eine fast völlige Nutzung der trägerfixierten, stimulierten Zellen für die Zellfusion erreicht. Die erfindungsgemäße Mindestdicke des Flächanträgers von 100pm ermöglicht in allen Verfahrensschritten eine gute Handhabung. Nach dem Spülen wird der Flächenträger mit den gebundenen, stimulierten Zellen auf die untere Elektrode einer horizontalen Parallelplattennnordnung gelegt und mit einer dichten Myelorruellensuspension überschichtet. Die obere Plattenelektrode wird der unteren bis zum Kontakt mit der Myelomzellsuspension genähert. Erfindungsgemäß ist es nicht notwendig, e^!t en besonders kleinen Abstand der Plattenelektroden einzustellen, da die Myelomzellen auf dem Flächenträger sedimentieren. Die hohe Myelomzelldichte und ein zusätzlich angelegtes elektrisches Hochfrequenzfeld gewährleisten, daß nahezu alle trägergebundenen Zellen mit einer Myelomzelle in Membrankontakt gelangen. Die elektrisch induzierte Fusion erfolgt in allgemein bekannter Weise. Durch eine Spülung werden die überflüssigen, nicht fusionierten Myelomzellen vom Flächenträger entfernt, so daß nur die trägergebundenen Fusionsprodukte verbleiben. Sie werden mit dem Flächenträger zur Kultivierung im Wachstumsmedium überführt.The object of the invention is to find a method by means of which the yield of the electrically induced cell fusion in the hybridoma technique is increased and the further cultivation of the hybridoma is simple and effective; In particular, the proportion of fusion products from a myeloma cell and an antigen-specifically stimulated B lymphocytes should be increased. According to the invention the object is achieved in that, for example, a leukocyte mixture is given with antigen-specific stimulated B lymphocytes on a surface support whose surface is chemically activated and to which the antigen molecules used for stimulation are covalently bound. The stimulated cells are bound specifically around surface carriers by the interaction between the cell membrane receptors and the carrier-fixed antigen molecules. The remaining cells are removed by rinsing. The chemical activators must not lead to any additional positive solid charges on the surface support, so that the unspecific binding capacity for cells remains low. The porous structure of the surface carrier enables ionic conductivity in the direction of the surface normal, so that an electric field applied in this direction acts on the carrier-fixed cells in almost the same way as in suspended cells in the absence of the surface carrier. The diameter and the distance of the pores are small compared to the diameter of the cells. This prevents unspecific fixing of the cells and moreover achieves an almost complete use of the carrier-fixed, stimulated cells for cell fusion with a thickness of the surface carrier of less than 500 pm. The inventive minimum thickness of the surface applicator of 100pm allows good handling in all process steps. After rinsing, the surface support with the bound, stimulated cells is placed on the lower electrode of a horizontal parallelplate assembly and overlaid with a dense myelorruell suspension. The upper plate electrode is approximated to the lower one until contact with the myeloma cell suspension. According to the invention it is not necessary, e ^t s particularly small distance between the plate electrodes to adjust because the myeloma cells sediment on the surface support. The high myeloma cell density and an additionally applied high-frequency electric field ensure that almost all carrier-bound cells come into membrane contact with a myeloma cell. The electrically induced fusion takes place in a generally known manner. A rinse removes the superfluous, unfused myeloma cells from the surface support so that only the carrier-bound fusion products remain. They are transferred with the surface carrier for cultivation in the growth medium.

Gegenüber bekannten Verfahren verknüpft das erfindungsgemäße Verfahren einfach und vorteilhaft die elektrisch induzierte Zellfusion mit einer Vorselektion der antigenspezifisch stimulierten Zellen.Compared with known methods, the method according to the invention simply and advantageously combines the electrically induced cell fusion with a preselection of the antigen-specifically stimulated cells.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt seine Vorteile besonders dort, wo die Konzentration der stimulierten Zellen im Zellgemisch gering ist. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß der chemisch aktivierte Flächenträger unter bekannten Bedingungen (feucht, steril) lagerungsfähig und verschickbar ist. Dies ermöglicht eine schnelle Fusion und Kultivierung am Ort der Gewinnung des Zellgemisches. .The inventive method shows its advantages especially where the concentration of the stimulated cells in the cell mixture is low. A further advantage is that the chemically activated surface carrier is storable and can be shipped under known conditions (moist, sterile). This allows rapid fusion and culture at the site of recovery of the cell mixture. ,

exemplary

Die Milzzellen einer mit HSA immunisierten Maus (Balb/c) werden von Erythrozyten befreit (Ficoll-Visotrast-Gradient mit 1,08g/cm³), zweimal in PBS gewaschen und in PBS resuspendiert (Zelldichte 10⁵/μΙ). 25 μΙ der Milzzellsuspension werden auf einen chemisch aktivierten und mit HSA-Molekülen gekoppelten Flächenträger von 144 mm 0 und 0,2mm Stärke geschichtet (Typ UF60, Institut für Polymerenchemie der AdW der DDR, Teltow-Seehof) und 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37⁰C inkubiert. Die chemische Aktivierung erfolgt mit einem Chlorameisensäurenorbornylester und die HSA-Kopplung in Boratpuffer pH8,3 mit 1 pg HSA/ml. Der mit Milzzellen beschichtete Flächenträger wird in PBS gespült, bis nur noch die antigenspezifisch stimulierten B-Lymphozyten gebunden bleiben. Der Flächenträger wird in eine isotone, ionenarme Fusionslösung überführt (spezifische Leitfähigkeit 180ps/cm) und auf die untere Plattenelektrode der Fusionskammer gelegt. Auf den Flächenträger werden 30μΙ Myelomzellsuspension geschichtet (1,5 · 10^s Zellen in ionenarmer Fusionslösung), und die obere Plattenelektrode wird der unteren auf einen Abstand von 0,5 mm genähert. An die Plattenelektroden wird 3 Minuten lang oin schwaches, hochfrequentes elektrisches Wechselfeld angelegt (ii» IHz, 12V). Für 2 Sekunden wird die elektrische Spannung auf 35V gesteigert und unmittelbar darauf der elektrische Fus'onsimpuls appliziert (30 V, 8ps). Der Flächenträger wird der Fusionskammer entnommen, mit 30μΙ Wachstumsmedium überschichtet und 10 Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert (37⁰C, 8% COj). Durch Spülen mit Wachstumsmedium werden die nicht fusionierten Myelomzellen vom Flächenträger entfernt. Die trägerfixierten Fusionsprodukte werden in 1 ml Wachstumsmedium (RPMI + 15% US) kultiviert. Die Reklonierung und die Analysierung der Kulturüberstände zeigen, daß nahezu alle Zellklone HSA-spezifische Antikörper produzieren.The spleen cells of an HSA-immunized mouse (Balb / c) are freed from erythrocytes (Ficoll-Visotrast gradient at 1.08 g / cm ³ ), washed twice in PBS and resuspended in PBS (cell density 10 ⁵ / μΙ). 25 μΙ of the spleen cell suspension are layered on a chemically activated and coupled with HSA molecules surface support of 144 mm 0 and 0.2 mm thickness (type UF60, Institute of Polymer Chemistry AdW of the GDR, Teltow-Seehof) and 30 minutes in a humid chamber at 37 ⁰ C incubated. The chemical activation is carried out with a chloroformate and the HSA coupling in borate buffer pH8.3 with 1 pg HSA / ml. The splint carrier coated with spleen cells is rinsed in PBS until only the antigen-specific stimulated B lymphocytes remain bound. The surface support is transferred into an isotonic, ion-poor fusion solution (specific conductivity 180 ps / cm) and placed on the lower plate electrode of the fusion chamber. 30μΙ of myeloma cell suspension are layered on the surface support (1.5 x 10 ^s cells in low-ionic fusion solution), and the upper plate electrode is approached to the lower one at a distance of 0.5 mm. The plate electrodes are placed in a low-frequency, high-frequency alternating electric field for 3 minutes (ii »IHz, 12V). For 2 seconds, the electrical voltage is increased to 35V and immediately applied to the electrical Fus'onsimpuls (30 V, 8ps). The surface carrier is taken from the fusion chamber, covered with 30μΙ growth medium and incubated for 10 minutes in a humid chamber (37 ⁰ C, 8% COj). Rinsing with growth medium removes the unfused myeloma cells from the surface support. The carrier-fixed fusion products are cultured in 1 ml growth medium (RPMI + 15% US). Recloning and analyzing the culture supernatants show that almost all cell clones produce HSA-specific antibodies.

Claims

1. Zeilfusionsverfahren consisting of the introduction of different cells or cell mixtures in a weakly conductive, isotonic, aqueous solution between two parallel plate electrodes, the application of a high-frequency alternating electric field (oeelectrophoresis), the subsequent application of a high DC electric pulse and the recovery of the fused cells, characterized in that a cell mixture is given with stimulated cells before introduction between the plate electrodes on a surface carrier, on the surface of which the antigenic molecules used for cell stimulation are covalently bound, the stimulated cells are bound via the interaction between cell membrane receptors and the carrier-fixed antigen molecules specific to the surface carrier The unbound cells are removed by rinsing from the surface support without detaching the bound cells, the surface support with the bound, stimulated cell is introduced between the plate electrodes, myeloma cells are placed in high density on the surface carrier, the myeloma cells are brought into contact with the sedimentation and under additional action of an applied high-frequency alternating electric field with the surface carrier bound, stimulated cells in membrane contact, the cell pairs by a high-frequency alternating electric field and a subsequent high DC pulse are fused in a conventional manner, the surface carrier is freed by rinsing of the superfluous, unfused myeloma cells, without replacing the bound fusion products and these fusion products are transferred with the surface carrier outside the fusion device for culturing in the growth medium.

2. cell fusion process according to claim 1, characterized in that a cellulosic membrane is used as the surface support is prepared by complete alkaline hydrolysis of conventional acetate (2V2-) membrane / has a residual acetyl content of less than 1% and whose thickness is between 100 and 500pm, preferably 150 to 250pm.

3. Cell fusion method according to claim 1 or 2, characterized in that a surface support is used, which is porous, the pores are smaller than 100 nm and the pore distance is small compared to the diameter of the stimulated cells.

4. cell fusion method according to claim 1, characterized in that the surface carrier, are covalently bonded to the surface of the antigen molecules used for cell stimulation, was activated before the covalent binding by such chemical means, the no additional positive fixed charges on the surface of the surface carrier produce.

5. cell fusion process according to claims 2 and 4 or 2,3 and 4, characterized in that are used as a chemical agent for activating the surface carrier Natriumperjodat or Chlorameisensäurenorbonylester.

6. Cell fusion method according to claims 2 or 5, characterized in that as the cell mixture in the stimulating cells B lymphocytes are used, which were stimulated with antigen molecules and fixed by interactions between the membrane receptors of the stimulated cells and the covalently bound to the surface carrier antigen molecules to the surface carrier were.