DE10054093A1 - Detecting antigens by fluorescence immunoassay, useful e.g. for diagnosis, by performing both competitive and sandwich assays to cover a broad concentration range - Google Patents
Detecting antigens by fluorescence immunoassay, useful e.g. for diagnosis, by performing both competitive and sandwich assays to cover a broad concentration rangeInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Analyten mittels Fluoreszenzimmuntests, wobei analytspezifische Antikörper, die sich an Antigene binden und auf Oberflächen immobilisiert werden, mit einem Fluorophor markiert sind und durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die gebundene Antigenmenge ermittelt wird.The invention relates to a method for determining antigens in analytes by means of fluorescence immunoassays, with analyte-specific antibodies that attach themselves Bind antigens and be immobilized on surfaces with a Fluorophore are marked and by evanescent field excitation and measurement of the Fluorescence intensity of the bound amount of antigen is determined.
Die internationale Anmeldung WO 98/02732 beschreibt Vorrichtungen für Fluoreszenzimmuntest mit verschiedenen Prozessverläufen (Assays). Dabei können kompetitive Assays und Sandwichassays genutzt werden. Bei dem kompetitiven Assays wird eine bekannte Menge analytspezifischer Antikörper, die mit Fluorophor markiert sind, mit einer unbekannten zu quantifizierenden Menge Antigenen gemischt. Dabei muss die Menge der Antikörper größer sein als die Menge der Antigene. Die Antikörper binden an die Antigene an. Da die Menge der Antikörper größer ist als die Menge der Antigene, verbleiben ungebundene Antikörper im Analyten. Das so entstandene Gemisch aus nicht gebundenen markierten Antikörpern und an die Antigenen gebundenen Antikörpern wird mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht, auf der das Antigen immobilisiert wurde. An die immobilisierten Antigene binden die noch freien markierten Antikörper auf der Oberfläche an, während die schon gebundenen markierten Antikörper im Analyten oberhalb der Oberfläche verbleiben. Die Menge, der an der Oberfläche gebundenen Antikörper kann durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität quanitifziert werden. Die Menge der Antikörper, die an das auf der Oberfläche immobilisierte Antigen gebunden ist, verhält sich umgekehrt proportional zur Antigenkonzentration, die nachgewiesen werden soll. Zum Anderen wird der sogenannte Sandwichassay vorgestellt. Voraussetzung hierfür ist, dass ein Paar von analytspezifischen Antikörpern existiert, die beide gleichzeitig an das Antigen binden können, ohne dass diese analytspezifischen Antikörper sich gegenseitig behindern. Dabei wird einer der beiden analytspezifischen Antikörper mit einem Fluorophor markiert. Der andere der analytspezifischen Antikörper ist auf einer Oberfläche immobilisiert. Nach der Reaktion und Oberflächenanbindung des zweiten Antikörpers werden die Fluorophore bei Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt und es wird ein Fluoreszenzsignal erhalten, das bei dieser Form des Immuntests direkt proportionale zur Antigenkonzentration ist.International application WO 98/02732 describes devices for Fluorescence immunoassay with different processes (assays). there competitive assays and sandwich assays can be used. In which competitive assays will use a known amount of analyte-specific antibodies, which are labeled with fluorophore with an unknown one to be quantified Amount of antigens mixed. The amount of antibodies must be larger than the amount of antigens. The antibodies bind to the antigens. Since the The amount of antibodies is greater than the amount of antigens unbound antibodies in the analyte. The resulting mixture of not bound labeled antibodies and bound to the antigens Antibodies are brought into contact with a surface on which the antigen was immobilized. The free ones bind to the immobilized antigens labeled antibodies on the surface while the already bound labeled antibodies remain in the analyte above the surface. The Amount of antibody bound to the surface can by Evanescent field excitation and measurement of fluorescence intensity quantified become. The amount of antibody that is immobilized on the surface Antigen bound is inversely proportional to Antigen concentration to be detected. On the other hand, the so-called sandwich assay presented. The prerequisite for this is that a couple of analyte-specific antibodies exist, both of which Antigen can bind without these analyte-specific antibodies hinder each other. One of the two is analysis-specific Antibody labeled with a fluorophore. The other of the analyte-specific Antibody is immobilized on a surface. After the reaction and The fluorophores are attached to the surface of the second antibody Irradiation with light of a certain wavelength is excited and it becomes a Fluorescence signal obtained directly in this form of immunoassay is proportional to the antigen concentration.
Es ist allgemein bekannt, dass beim Sandwichassay die Nachweisgrenze kleiner und die Empfindlichkeit größer als beim kompetitiven Assay ist. Der Sandwichassay hat den Vorteil, dass bereits eine kleinere Antigenkonzentration ein erfassbares Signal erzeugt und auch kleine Änderungen bei geringen Antigenkonzentration ein erfassbares Signal empfindlich erkannt werden können. Demgegenüber hat der kompetitive Assay den Nachteil, dass kleine Antigenkonzentrationen bereits ein großes Signal erzeugen und entsprechend kleine Änderungen nur schwer gemessen werden können. Bei hohen Antigenkonzentrationen ist dieses Verhältnis gerade umgekehrt. Hierbei wird beim Sandwichassay ein kaum erfassbares Signal erzeugt, da die feste Phase zu schnell abgesättigt wird, und im zeitlichen Verlauf kein weiterer Anstieg der Fluoreszenz mehr erfolgt. Der kompetitive Assay ist hier bei den hohen Antigenkonzentrationen wegen der angesprochenen umgekehrten Proportionalität von Antigenkonzentration und Fluoreszenzintensität vorteilhafter. In der Praxis ist die Konzentration eines Analyten vor seiner Messung unbekannt, und daher nicht klar, welche Assayform, der Sandwich oder der kompetitive Assay, für die Bestimmung optimal ist. It is generally known that the detection limit is smaller in the sandwich assay and the sensitivity is greater than that of the competitive assay. The Sandwich assay has the advantage of already having a lower antigen concentration generates a detectable signal and also small changes with small ones Antigen concentration a detectable signal can be detected sensitively can. In contrast, the competitive assay has the disadvantage that small Antigen concentrations already generate a large signal and accordingly small changes are difficult to measure. At high Antigen concentrations, this relationship is exactly the opposite. Here will generates a barely detectable signal in the sandwich assay because the solid phase is saturated too quickly, and no further increase in time Fluorescence occurs more. The competitive assay is here at the high Antigen concentrations because of the reverse Proportionality of antigen concentration and fluorescence intensity more advantageous. In practice, the concentration of an analyte is before it Measurement unknown, and therefore not clear which assay form, the sandwich or the competitive assay for which determination is optimal.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in Analyten mittels Fluoreszenzimmuntests, wobei analytspezifische Antikörper, die sich an Antigene binden und auf Oberflächen immobilisiert sind, mit einem Fluorophor markiert sind und durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die gebundene Antigenmenge ermittelt wird, zu finden, bei der der Verfahrensablauf optimiert ist.The object of the invention is to provide a method for determining antigens Analytes using fluorescence immunoassays, using analyte-specific antibodies, that bind to antigens and are immobilized on surfaces with a Fluorophore are marked and by evanescent field excitation and measurement of the Fluorescence intensity to determine the amount of bound antigen is found at the process flow is optimized.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass
According to the invention the object is achieved in that
- - analytspezifische Antikörper in der Art eines Paares verwendet werden, die beide an das Antigen, das mehr als eine Bindungsstelle aufweist, binden können, und eines der beiden Antikörper des Paares mit einem Fluorophor markiert ist;- analyte-specific antibodies used in the manner of a pair be both of the antigen, the more than one Has binding site, can bind, and one of the two Antibody of the pair is labeled with a fluorophore;
- - eine bekannte Menge des mit einem Fluorophor markierten Antikörpers mit einem Analyten unbekannter Antigenkonzentration gemischt wird, wobei die Anzahl der Bindungsstellen für diesen Antikörper größer ist als die Anzahl der Bindungsstellen auf dem Antigen;A known amount of that labeled with a fluorophore Antibody with an analyte of unknown antigen concentration is mixed, the number of binding sites for this Antibody is greater than the number of binding sites on the Antigen;
- - der andere nichtmarkierte Antikörper des Paares auf einer Oberfläche immobilisiert ist und das Antigen mit den daran gebundenen fluorophormarkierten Antikörpern gebunden wird;- the other unlabeled antibody of the pair on one Surface is immobilized and the antigen with it bound fluorophore-labeled antibodies;
- - die Anzahl der auf der Oberfläche gebundenen fluorophormarkierten Antikörper durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die Antigenmenge nachfolgend aufzeigt;- the number of bound on the surface fluorophore-labeled antibodies by evanescent field excitation and measurement of fluorescence intensity the amount of antigen shows below;
- - die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht wird, auf der das Antigen immobilisiert ist;- the unbound fluorophore-labeled antibodies with a Surface is brought into contact on which the antigen is immobilized;
- - die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper an das immobilisierte Antigen gebunden werden; - the unbound fluorophore-labeled antibodies to the immobilized antigen are bound;
- - die Anzahl der an das immobilisierte Antigen gebundenen fluorophormarkierten Antikörper durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die Antigenmenge aufzeigt und- the number of bound to the immobilized antigen fluorophore-labeled antibodies by evanescent field excitation and measurement of the fluorescence intensity shows the amount of antigen and
- - die Antigenkonzentration im Analyten aus den Werten der Sandwichassay-Messung und aus den Werten des kompetitiven Assays ermittelt wird.- the antigen concentration in the analyte from the values of the Sandwich assay measurement and from the values of the competitive Assays is determined.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand zweier Ausführungsbeispiele näher erläutert. Die dazugehörige Zeichnung zeigt eine schematische Darstellung eines kombinierten Sandwich-kompetitive-Assays für β-HCG und HCG.The invention is explained in more detail below with the aid of two exemplary embodiments explained. The accompanying drawing shows a schematic representation a combined sandwich competitive assay for β-HCG and HCG.
Das C-reactive Protein (Antigen) ist ein Protein aus der Familie der Pentraxine. Es besteht aus 5 nicht kovalent verbundenen Untereinheiten und hat eine Molmasse von 105 kDa. Seine mittlere Serumkonzentration liegt bei etwa 800 µg/l, und 99% der normalen Bevölkerung hat eine CRP-Konzentration von unter 10 mg/l. Dieser CRP-Wert kann bei Patienten mit bakteriellen Infektionen auf über 300 mg/l ansteigen, und daher ist seine Bestimmung für die medizinische Diagnostik interessant.The C-reactive protein (antigen) is a protein from the family of pentraxins. It consists of 5 non-covalently linked subunits and has one Molar mass of 105 kDa. Its mean serum concentration is around 800 µg / l, and 99% of the normal population has a CRP concentration of below 10 mg / l. This CRP value can be used in patients with bacterial infections rise to over 300 mg / l, and therefore its purpose for the medical diagnostics interesting.
Zur Bestimmung wird ein definiertes Probenvolumen (z. B. 35 µl Serum), welches den zu bestimmenden CRP-Analyten enthält, mit einer definierten Messlösung, welche einen fluoreszenzmarkierten Anti-CRP spezifischen Antikörper (z. B. der Anti CRP-Antikörper Clone C6 der Firma Biodesign, der nachträglich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurde) enthält versetzt und eine bestimmte Zeit (z. B. 2 Minuten) bei einer festgelegten Temperatur (z. B. Raumtemperatur) inkubiert. Hierdurch bindet der markierte Anti-CRP-Antikörper an den Analyten. A defined sample volume (e.g. 35 µl serum) is used for the determination, which contains the CRP analyte to be determined, with a defined one Measurement solution which has a fluorescence-labeled anti-CRP specific Antibodies (e.g. the anti CRP antibody Clone C6 from Biodesign, the was subsequently marked with a fluorescent dye) contains added and a certain time (e.g. 2 minutes) at a specified temperature (e.g. Room temperature) incubated. The labeled anti-CRP antibody thereby binds on the analyte.
Diese inkubierte Lösung wird nun über zwei unterschiedliche Oberflächenbereiche geleitet. Auf dem einen Oberflächebereich ist für die Durchführung eines Sandwichassays ein weiterer Anti-CRP-Antikörper (wie z. B. der Anti-CRP-Antikörper Clone C2 der Firma Biodesign) immobilisiert. In diesem Bereich bindet das mit dem ersten Anti-CRP-Antikörper (Clone C6) verbundene CRP-Antigen (Analyt). Auf dem anderen Oberflächenbereich ist für die Durchführung eines kompetitiven Assays das Antigen CRP immobilisiert. In diesem Bereich bindet der fluorophormarkierte Anti-CRP-Körper, der nicht an das CRP-Antigen aus der Probe gebunden hat. An beiden Oberflächen wird nun durch Evanescentfeldanregung mit einer Lichtquelle und mit Hilfe eines Detektors das jeweilige Fluoreszenzlicht gemessen. Der CRP-Gehalt der Probe lässt sich nun mittels einer zuvor ermittelten Kalibrationskurve feststellen.This incubated solution is now made up of two different ones Surface areas directed. On one surface area is for the Performing a sandwich assay of another anti-CRP antibody (such as the anti-CRP antibody Clone C2 from Biodesign) is immobilized. In this Area binds that associated with the first anti-CRP antibody (Clone C6) CRP antigen (analyte). On the other surface area is for that Performed a competitive assay to immobilize the CRP antigen. In the fluorophore-labeled anti-CRP body does not bind to this area has bound the CRP antigen from the sample. Now on both surfaces by evanescent field excitation with a light source and with the help of a Detector measured the respective fluorescent light. The CRP content of the sample can now be determined using a previously determined calibration curve.
Das Protein hCG (Antigen) besteht aus einer α und einer β Polypeptid Untereinheit. Die α Untereinheiten der menschlichen hormonellen Glycoproteine (hLH, hFSH, hTSH, hCG) sind nahezug identisch. Die β Untereinheiten, welche ebenso einige identische Aminosäuresequenzen untereinander besitzen, sind unterschiedlich genug, um die biologische und immunologische Spezifität dieser Hormone zu erzeugen.The protein hCG (antigen) consists of an α and a β polypeptide Subunit. The α subunits of human hormonal glycoproteins (hLH, hFSH, hTSH, hCG) are almost identical. The β subunits, which also have some identical amino acid sequences different enough to reflect the biological and immunological specificity of this To produce hormones.
Zur Bestimmung des Protein hCG (Antigen) wird ein definiertes Probenvolumen (z. B. 35 µl Serum), welches den zu bestimmenden Analyten (hCG und β-hCG) enthält, mit einer definierten Messlösung, welche einen fluorophormarkierten Anti-β-HCG spezifischen Antikörper (z. B. der Anti hCG-Antikörper Clone 2F4/3 der Firma DPC Bierman, Kat. Nr. BM 290, der nachträglich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurde) versetzt, und eine bestimmte Zeit (z. B. 2 Minuten) bei einer festgelegten Temperatur (z. B. Raumtemperatur) inkubiert. Hierdurch bindet der markierte Anti-β-HCG-Antikörper an das β-HCG, sowohl beim freien, wie auch beim gebundenen β-HCG der Probenlösung (siehe Fig. 1).To determine the protein hCG (antigen), a defined sample volume (eg 35 µl serum), which contains the analyte to be determined (hCG and β-hCG), is used with a defined measurement solution, which is a fluorophore-labeled anti-β-HCG specific Antibodies (e.g. the anti hCG antibody Clone 2 F4 / 3 from DPC Bierman, Cat. No. BM 290 , which was subsequently labeled with a fluorescent dye), and a certain time (e.g. 2 minutes) incubated at a specified temperature (e.g. room temperature). As a result, the labeled anti-β-HCG antibody binds to the β-HCG, both in the free and in the bound β-HCG of the sample solution (see FIG. 1).
Diese inkubierte Lösung wird nun über zwei unterschiedliche Oberflächenbereiche geleitet. Auf dem einen Oberflächebereich ist für die Durchführung eines Sandwichassays ein weiterer Anti-β-hCG-Antikörper (wie z. B. der Anti-β-hCG-Antikörper Clone Bio-BCG-005 der Firma DPC Bierman) immobilisiert. In diesem Bereich bindet das mit dem ersten fluorophormarkierte Anti-β-hCG-Antikörper verbundene β-hCG-Antigen der Probenlösung (Analyt). Auf dem anderen Oberflächenbereich ist für die Durchführung eines kompetitiven Assays das Antigen HCG (oder alternativ auch β-HCG) immobilisiert. In diesem Bereich bindet der markierte Anti-β-hCG-Antikörper, der weder an das freie β-hCG noch an das hCG aus der Probe gebunden hat. An beiden Oberflächen wird nun durch Evanescentfeldanregung mit einer Lichtquelle und mit Hilfe eines Detektors das jeweilige Fluoreszenzlicht gemessen. Der β-hCG-Gehalt dieser Probe lässt sich nun mittels einer zuvor ermittelten Kalibrationskurve ermitteln. Aus dem Sandwichassay ist die Konzentration des β-hCGs in der Probe zu ermitteln, während aus dem kompetitiven Assay die gesamte hCG-Konzentration, d. h. β-hCG und hCG ermittelt werden kann. Auch die Konzentration von hCG ist hiermit bestimmt. Sie entspricht der Gesamt-hCG-Konzentration minus der β-hCG-Konzentration.This incubated solution is now made up of two different ones Surface areas directed. On one surface area is for the Carrying out a sandwich assay of another anti-β-hCG antibody (such as z. B. the anti-β-hCG antibody Clone Bio-BCG-005 from DPC Bierman) immobilized. In this area it binds with the first fluorophore Anti-β-hCG antibody-linked β-hCG antigen in the sample solution (analyte). On the other surface area is for performing one competitive assays the antigen HCG (or alternatively also β-HCG) immobilized. The labeled anti-β-hCG antibody, the has bound neither to the free β-hCG nor to the hCG from the sample. On Both surfaces are now stimulated with an evanescent field Light source and with the help of a detector the respective fluorescent light measured. The β-hCG content of this sample can now be determined using a determine the determined calibration curve. It's from the sandwich assay Determine the concentration of the β-hCG in the sample, while from the competitive assay the total hCG concentration, i.e. H. β-hCG and hCG can be determined. The concentration of hCG is also determined with this. she corresponds to the total hCG concentration minus the β-hCG concentration.
Claims (1)
analytspezifische Antikörper in der Art eines Paares verwendet werden, die beide an das Antigen, das mehr als eine Bindungsstelle aufweist, binden können, und eines der beiden Antikörper des Paares mit einem Fluorophor markiert ist;
eine bekannte Menge des mit einem Fluorophor markierten Antikörpers mit einem Analyten unbekannter Antigenkonzentration gemischt wird, wobei die Anzahl der Bindungsstellen für diesen Antikörper größer ist als die Anzahl der Bindungsstellen auf dem Antigen;
der andere nichtmarkierte Antikörper des Paares auf einer Oberfläche immobilisiert ist und das Antigen mit den daran gebundenen fluorophormarkierten Antikörpern gebunden wird;
die Anzahl der auf der Oberfläche gebundenen fluorophormarkierten Antikörper durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die Antigenmenge nachfolgend aufzeigt;
die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht wird, auf der das Antigen immobilisiert ist;
die ungebundenen fluorophormarkierten Antikörper an das immobilisierte Antigen gebunden werden;
die Anzahl der an das immobilisierte Antigen gebundenen fluorophormarkierten Antikörper durch Evanescentfeldanregung und Messung der Fluoreszenzintensität die Antigenmenge aufzeigt und
die Antigenkonzentration im Analyten aus den Werten der Sandwichassay-Messung und aus den Werten des kompetitiven Assays ermittelt wird.Method for the determination of antigens in analytes by means of fluorescence immunoassays, wherein analyte-specific antibodies which bind to antigens and are immobilized on surfaces are labeled with a fluorophore and the bound amount of antigen is determined by evanescent field excitation and measurement of the fluorescence intensity, characterized in that
analyte-specific antibodies are used in the manner of a pair, both of which can bind to the antigen which has more than one binding site, and one of the two antibodies of the pair is labeled with a fluorophore;
mixing a known amount of the fluorophore-labeled antibody with an analyte of unknown antigen concentration, the number of binding sites for that antibody being greater than the number of binding sites on the antigen;
the other unlabeled antibody of the pair is immobilized on a surface and the antigen is bound with the fluorophore-labeled antibodies bound thereto;
the number of fluorophore-labeled antibodies bound to the surface by evanescent field excitation and measurement of the fluorescence intensity shows the amount of antigen below;
contacting the unbound fluorophore-labeled antibody with a surface on which the antigen is immobilized;
the unbound fluorophore-labeled antibodies are bound to the immobilized antigen;
the number of fluorophore-labeled antibodies bound to the immobilized antigen by evanescent field excitation and measurement of the fluorescence intensity shows the amount of antigen and
the antigen concentration in the analyte is determined from the values of the sandwich assay measurement and from the values of the competitive assay.
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