AT505372A2 - Quantitative determination of analyte e.g. mycotoxins, ochratoxin and moniliformin, comprises contacting e.g. analyte with carrier, flowing e.g. analyte through test/reaction zone and determining intensities e.g. color intensity of analyte - Google Patents
Quantitative determination of analyte e.g. mycotoxins, ochratoxin and moniliformin, comprises contacting e.g. analyte with carrier, flowing e.g. analyte through test/reaction zone and determining intensities e.g. color intensity of analyte Download PDFInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von wenigstens einem gelösten oder suspendierten Analyten mit einem Testelement, bei welchem auf einer auf einem Träger festgelegten, immunochromatographisehen Membran, auf welcher wenigstens eine Test- bzw. Reaktionszone aufgebracht wird, eine quantifizierbare Umsetzung durchgeführt wird. Weiters bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Testsystem zur quantitativen Bestimmung von wenigstens einem gelösten oder suspendierten Analyten mittels eines quantifizierbaren Testelements, sowie eine Verwendung eines Testsystems zur quantitativen Bestimmung von wenigstens einem gelösten oder suspendierten Analyten mittels einem quantifizierbaren Testelements.The present invention relates to a method for the quantitative determination of at least one dissolved or suspended analyte with a test element in which a quantifiable reaction is carried out on an immunochromatographic membrane fixed to a support on which at least one test or reaction zone is applied becomes. Furthermore, the present invention relates to a test system for the quantitative determination of at least one dissolved or suspended analyte by means of a quantifiable test element, and to a use of a test system for the quantitative determination of at least one dissolved or suspended analyte by means of a quantifiable test element.
In der Technik ist eine Vielzahl von quantitativen bzw. halb-quantitativen Verfahren bekannt, mit welchen Analyten, insbesondere biologische Analyten quantitativ bzw. halb-quantitativ nachgewiesen werden können. Die meisten dieser Verfahren sind entweder zeitaufwendig oder erlauben lediglich qualitative oder semi-quantitative Nachweise der in einer Probe enthaltenen Substanzen bzw. Schadstoffe. Insbesondere ist eine Vielzahl von Verfahren bekannt, bei welchen eine Dünnschichttechnik durchgeführt wird, bei welchen Teststreifen bzw. Testplatten eingesetzt werden und auf den Testplatten eine immunochromatographisehe Membran festgelegt ist, mit welcher halb-quantitative bzw. qualitative Nachweise von in Proben enthaltenen Schadstoffen durchgeführt werden können.A large number of quantitative or semi-quantitative methods are known in the art with which analytes, in particular biological analytes, can be detected quantitatively or semi-quantitatively. Most of these methods are either time consuming or allow only qualitative or semi-quantitative detection of substances contained in a sample or pollutants. In particular, a variety of methods are known in which a thin-film technique is performed, in which test strips or test plates are used and on the test plates an immunochromatographisehe membrane is set, with which semi-quantitative or qualitative evidence of pollutants contained in samples can be performed ,
Ein derartiges halb-quantitatives Verfahren, welches einen Dünnschicht- bzw. Streifentest mit üblichem, lateralem Fluß anwendet, ist beispielsweise der WO 00/42434 oder der GB 2 300 914 zu entnehmen. In diesen Vorrichtung sind auf einem Teststreifen bzw. einem Testelement mehr als zwei Detektionszonen vorgesehen, die entlang der Länge des Teststreifens in von der Startlinie voneinander beabstandeten Abständen festgelegt sind und die Menge bzw. halb-quantitative Menge des Zielanalyten kann aus der Anzahl von Zonen, welche ein positives Ergebnis zeigen, nachdem die Probe laufen gelassen wurde, ermittelt werden.Such a semi-quantitative method, which uses a thin-layer or strip test with conventional lateral flow, can be found, for example, in WO 00/42434 or GB 2 300 914. In this device, more than two detection zones are provided on a test strip or element, which are defined along the length of the test strip at intervals spaced from each other by the start line, and the quantity or semi-quantitative amount of the target analyte can be determined from the number of zones. which show a positive result after the sample has been run are determined.
Die EP 0 462 376 offenbart einen Versuch unter Verwendung eines doppelten Auslesesystems, das eine Aufnahmeseite auf weist, auf welcher ein Aufnahmereagens aufgebracht ist, welches mit dem Analyten in bezug auf die Bindung des markierten Konjugats konkurriert. Weiters ist eine Konjugat-Aufnahmeseite vorgesehen, an welcher ein Konjugat-Aufnahmeagens festgelegt ist. Die Immobilisierung des Konjugats an dieser Stelle wird dann zur Menge des Analyten in der Testprobe in bezug gesetzt, wobei ein Absinken des detektierbaren Konjugats an der Aufnahmeseite und ein entsprechender Anstieg des detektierbaren Konjugats an der Konjugataufnahmeseite anzeigt, daß eine ansteigende Menge an Analyt in der Probe vorliegt.EP 0 462 376 discloses an experiment using a dual readout system having a receiving side on which a receiving reagent is applied which competes with the analyte for binding of the labeled conjugate. Further, a conjugate receiving side is provided to which a conjugate-receiving agent is fixed. Immobilization of the conjugate at this site is then related to the amount of analyte in the test sample, with a decrease in the detectable conjugate on the receiving side and a corresponding increase in the detectable conjugate on the conjugate receiving side indicating an increasing amount of analyte in the sample is present.
Schließlich beschreibt die WO 97/09620 quantitative und halb-quantitative Versuche, bei welchen das Signal, das durch den Zielanalyten in einer Detektionszone generiert wird, mit einem Signal verglichen wird, das in einem Bereich von Kalibrierungszonen generiert wird, um zu bestimmen, ob die Menge des Analyten, die in der Probe vorliegt, über oder unter den Niveaus liegt, die jenen äquivalent sind, die durch die Kalibrierungszonen festgelegt sind. Zur Berechnung der Menge des Analyten in der Probe können hiebei Standardkurvendaten herangezogen werden.Finally, WO 97/09620 describes quantitative and semi-quantitative experiments in which the signal generated by the target analyte in a detection zone is compared to a signal generated in a range of calibration zones to determine if the signal is Amount of analyte present in the sample is above or below the levels equivalent to those determined by the calibration zones. Standard curve data can be used to calculate the amount of analyte in the sample.
Die vorliegende Erfindung zielt nun darauf ab, ein einfaches und insbesondere schnelles Verfahren zur quantitativen Bestimmung von wenigstens einem gelösten oder suspendierten Analyten in einer Probe zur Verfügung zu stellen. Des weiteren zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, neben dem quantitativen Nachweis von einem gelösten oder suspendierten Analyten mit einem Testelement auch den quantitativen Nachweis von mehreren, nebeneinander in einer Probe enthaltenen Analyten sicher, rasch und zuverlässig zur Verfügung zu stellen.The present invention now aims to provide a simple and, in particular, rapid method for the quantitative determination of at least one dissolved or suspended analyte in a sample. Furthermore, the present invention aims, in addition to the quantitative detection of a dissolved or suspended analyte with a test element, to provide the quantitative detection of several analytes contained side by side in a sample safely, quickly and reliably.
Zur Lösung dieser Aufgabe ist das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen von wenigstens einem gelösten oder suspendier- ten Analyten mit einem Testelement im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß der wenigstens eine gelöste oder suspendierte Analyt und jeweils ein mit einer eine Färb- oder Fluoreszenzreaktion bewirkenden Substanz markierter zugehöriger Anti-Analyt oder der gelöste oder suspendierte Analyt und ein mit einer Färb- oder Fluoreszenzreaktion bewirkenden Substanz markierter Analyt mit der in einer definierten Menge auf dem Träger festgelegten, im-munochromatographischen Membran in Kontakt gebracht wird; daß der wenigstens eine gelöste oder suspendierte Analyt und der zugehörige markierte Anti-Analyt oder der gelöste oder suspendierte Analyt und der zugehörige markierte Analyt von der immunochroma-tographischen Membran aufgenommen werden und durch die wenigstens eine Test- bzw. Reaktionszone, enthaltend entweder den wenigstens einen Analyten oder den zugehörigen Anti-Analyten, fließen gelassen werden; und daß die Intensität des wenigstens einen Analyten und/oder des zugehörigen Anti-Analyten in der Reaktionszone ermittelt wird. Indem, wie dies erfindungsgemäß vorgesehen ist, der wenigstens eine gelöste oder suspendierte Analyt und entweder der jeweils eine mit einer eine Färb- oder Fluoreszenzreaktion bewirkenden Substanz markierte, zugehörige Anti-Analyt oder der mit einer Färb- oder Fluoreszenzreaktion bewirkenden Substanz markierte Analyt über eine auf einem Träger festgelegte immunochro-matographische Membran laufen gelassen wird und auf der immuno-chromatographisehen Membran eine Test- bzw. Reaktionszone vorgesehen ist, in welcher entweder der wenigstens eine Analyt oder der zugehörige Anti-Analyt enthalten ist, gelingt es im Zuge einer Konkurrenzreaktion zwischen entweder dem markierten Anti-Analyten bzw. dem markierten Analyten und dem jeweils zugehörigen, nicht-markierten Anti-Analyten oder Analyten eine Farbreaktion in der Reaktionszone zu bewirken, wobei die Färb- bzw. Fluoreszenzintensität umgekehrt proportional zu der in der Probe enthaltenen Menge an Analyten ist. Dadurch kann durch Abgleich der ermittelten Färb- bzw. Fluoreszenzintensität mit einer Eichkurve bzw. Farbtabelle bzw. statistischen Auswertungen ein quantitati- ven Nachweis der in der Probe enthaltenen Menge an Analyt geführt werden. Besonders günstig bzw. vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß zur Messung der Intensität zur Quantifizierung des Analyten ein relativer Signalabgleich mit einer weiteren Test- oder Kontrollzone nicht erforderlich ist, sondern vielmehr eine direkte, absolute Messung der Intensität der Reaktionszone zur Quantifizierung eines Analyten mittels einer externen Kalibrierungsfunktion bzw. einem Eichelement ausreichend ist, wodurch eine insbesondere extrem rasche, quantitative Messung des Analyten möglich wird.To achieve this object, the method according to the invention for the quantitative analysis of at least one dissolved or suspended analyte with a test element is essentially characterized in that the at least one dissolved or suspended analyte and in each case one associated with a substance causing a color or fluorescence reaction Analyte or the analyte dissolved or suspended and an analyte labeled with a dye or fluorescence reaction are brought into contact with the immunochromatographic membrane fixed in a defined amount on the support; that the at least one dissolved or suspended analyte and the associated labeled anti-analyte or the dissolved or suspended analyte and the associated labeled analyte are taken up by the immunochromatographic membrane and by the at least one test or reaction zone containing either the at least one Analyte or the associated anti-analyte, to be flowed; and that the intensity of the at least one analyte and / or the associated anti-analyte in the reaction zone is determined. By, as provided for in the invention, the at least one dissolved or suspended analyte and either the respectively one with a color or fluorescent reaction-causing substance labeled associated anti-analyte or labeled with a dye or fluorescence reaction substance labeled analyte on a on running a immunochromatographic membrane fixed to the support, and on the immunochromatographic membrane a test or reaction zone is provided, in which either the at least one analyte or the corresponding anti-analyte is contained, it succeeds in the course of a competing reaction between either effecting a color reaction in the reaction zone on the labeled anti-analyte or labeled analyte and the associated non-labeled anti-analyte or analyte, the color or fluorescence intensity being inversely proportional to the amount of analyte present in the sample , This can be done by matching the determined color or fluorescence intensity with a calibration curve or color table or statistical evaluations a quantitative proof of the amount of analyte contained in the sample. It is particularly favorable or advantageous for the method according to the invention that for measuring the intensity for quantification of the analyte a relative signal comparison with a further test or control zone is not required, but rather a direct, absolute measurement of the intensity of the reaction zone for quantification of an analyte an external calibration function or a calibration element is sufficient, whereby a particularly extremely rapid, quantitative measurement of the analyte is possible.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird das Verfahren so geführt, daß die eine Färb- oder Fluoreszenzreaktion bewirkende Substanz aus gefärbten Partikeln, wie Gold, Latex oder Kieselgel, fluoreszierenden Substanzen, magnetischen Teilchen und/oder Kohle gewählt wird. Indem die eine Färb- bzw. Fluoreszenzreaktion bewirkende Substanz aus gefärbten Partikeln, magnetischen Teilen und/oder Kohle gewählt wird, gelingt es insbesondere, eine genaue Abstufung der Intensitäten der wenigstens einen bzw. mehreren Reaktionszonen zu erzielen, so daß ein sehr genauer Nachweis der Menge des in der Probe gelösten oder suspendierten, wenigstens einen Analyten möglich wird.According to a preferred development of the invention, the process is carried out such that the substance causing a color or fluorescence reaction is selected from colored particles, such as gold, latex or silica gel, fluorescent substances, magnetic particles and / or carbon. In particular, by selecting the colored or fluorescent reaction substance from colored particles, magnetic parts and / or carbon, it is possible to achieve a precise grading of the intensities of the at least one or more reaction zones, so that a very accurate detection of the amount of the dissolved or suspended in the sample, at least one analyte is possible.
Gemäß einer Weiterbildung des Verfahrens wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so geführt, daß zur quantitativen Bestimmung der von der immunochromatographischen Membran aufgenommenen Menge des gelösten oder suspendierten Analyten die Laufzeit des Analyten auf der immunochromatographischen Membran fest-gelegt wird. Indem die Laufzeit des Analyten auf der immunochromatographischen Membran festgelegt wird, gelingt eine weitere Präzisierung des vorliegenden Verfahrens, da neben definierten Mengen an eingesetzten Reaktanten auch die Reaktionszeit und somit die Menge an Lösung bzw. Suspension, welche auf der immunochromatographischen Membran aufgenommen werden kann, festgelegt wird. Durch Festlegen der Laufzeit auf 15 s bis 30 min, insbesondere 1 min bis 10 min, wird sichergestellt, daß ein extrem • +· · · · ·· · « · • · · · ··· · · ·· · · • · · · · ···· · ··· • · · · · ··· · .......- *5 - ’ rascher und reproduzierbarer, quantitativer Nachweis des wenigstens einen gelösten oder suspendierten Analyten möglich wird. Um die durch die immunochromatographische Membran aufgenommene Flüs-sigkeits- bzw. Suspensionsmenge noch weiter zu präzisieren, kann gegebenenfalls ein Aufnahmekissen, welches für die Aufnahme der Suspension bzw. Lösung des Analyten ausgebildet ist, auf dem Träger nach der immunochromatographischen Membran festgelegt sein, um dadurch die Flüssigkeitsmenge, welche über die immunochromatographische Membran gelaufen ist, sicherzustellen und insbesondere einen Rückfluß dieser Lösung bzw. Suspension mit Sicherheit zu vermeiden, welcher Rückfluß die Reproduzierbarkeit des Verfahrens und insbesondere die Nachweisgenauigkeit im quantitativen Bereich negativ beeinflußt würde. Gegebenenfalls kann zu diesem Zweck auch ein Adsorbenskissen eingesetzt werden.According to a development of the method, the method according to the invention is preferably carried out so that the transit time of the analyte on the immunochromatographic membrane is determined for the quantitative determination of the amount of dissolved or suspended analyte taken up by the immunochromatographic membrane. By setting the transit time of the analyte on the immunochromatographic membrane, a further refinement of the present method succeeds, because in addition to defined amounts of reactants used, the reaction time and thus the amount of solution or suspension which can be recorded on the immunochromatographic membrane, determined becomes. By setting the running time to 15 s to 30 min, in particular 1 min to 10 min, it is ensured that an extremely • + ···································································· It is possible to obtain rapid and reproducible quantitative detection of at least one dissolved or suspended analyte. English:. German: v3.espacenet.com/textdoc? In order to further clarify the amount of liquid or suspension absorbed by the immunochromatographic membrane, a receiving pad, which is designed to receive the suspension or solution of the analyte, may optionally be fixed on the carrier after the immunochromatographic membrane in order thereby To ensure the amount of liquid which has passed through the immunochromatographic membrane, and in particular to prevent reflux of this solution or suspension with certainty, which reflux would adversely affect the reproducibility of the process and in particular the accuracy of detection in the quantitative range. Optionally, an adsorbent pad can also be used for this purpose.
Indem, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung der vorliegenden Erfindung entspricht, als Test- bzw. Reaktionszonen quantitative Mengen von mit dem jeweiligen Analyten oder dem entsprechenden Anti-Analyten wechselwirkenden bzw. reagierenden Substanzen auf definierte Bereiche aufgebracht werden, kann nicht nur die Menge der für eine Reaktion zur Verfügung stehenden Substanzen festgelegt werden, sondern auch beispielsweise in nebeneinander bzw. hintereinander liegenden Bereichen unterschiedliche Mengen an reaktionsfähigen Analyten bzw. Anti-Analyten festgelegt werden, wodurch die Testgenauigkeit durch Bereitstellen von entsprechenden Vergleichen noch weiter erhöht werden kann.By applying, as test or reaction zones, quantitative amounts of substances interacting or reacting with the respective analyte or the corresponding anti-analyte to defined areas, as is the case with a preferred development of the present invention, not only the amount of one can In addition, different amounts of reactive analytes or anti-analytes are determined, for example, in adjacent areas or areas one behind the other, whereby the test accuracy can be further increased by providing corresponding comparisons.
Schließlich kann, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprich, als Test- bzw. Reaktionszone Linien bzw. Balken, die sich über die gesamte Breite der immunochromatographischen Membran erstrecken, punktförmige oder andere geometrische Formen aufweisende Bereiche, welche sich wenigstens über einen Teil der Breite der immunochromatographischen Membran erstrecken, eingesetzt werden. Durch eine derartige Auswahl der geometrischen Form der Reaktionszone gelingt es nicht nur, einen einzigen, gelösten oder suspendierten ··· - ·δ -·· - Analyten auf einmal auf einem Teststreifen bzw. einer Testplatte nachzuweisen, sondern eine Mehrzahl von möglicherweise in einer zu untersuchenden Probe enthaltenen Analyten gleichzeitig qualitativ nachzuweisen. Darüber hinaus kann, wie bereits ausgeführt, durch Auswahl von unterschiedlichen Mengen an in den Reflexions-zonen enthaltenen Analyten bzw. Anti-Analyten auch die Intensität der jeweiligen Nachweisreaktion beeinflußt werden und somit eine noch genauere Quantifizierung der in einer Probe enthaltenen, zu untersuchenden Substanzen durchgeführt werden.Finally, as this corresponds to a preferred embodiment of the method according to the invention, as a test or reaction zone lines or beams extending over the entire width of the immunochromatographic membrane, punctiform or other geometric shapes having areas which at least over part of Width of the immunochromatographic membrane extend, are used. Such selection of the geometric shape of the reaction zone makes it possible not only to detect a single, dissolved or suspended ··· · · δ - ·· analyte at once on a test strip or a test plate, but to detect a plurality of possibly in one qualitatively detect the analyte contained in the sample at the same time. In addition, as already stated, by selecting different amounts of analyte or anti-analyte contained in the reflection zones, the intensity of the respective detection reaction can also be influenced and thus an even more accurate quantification of the substances to be examined contained in a sample is carried out become.
Um eine besonders genaue Aufgabe der Menge der reaktionsfähigen Substanzen in der Test- bzw. Reaktionszone sicherzustellen, wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so geführt, daß die Test- bzw. Reaktionszone(n) durch Sprühen, Tropfen oder über eine Maske aufgebracht wird (werden).In order to ensure a particularly precise task of the amount of reactive substances in the test or reaction zone, the process according to the invention is preferably carried out such that the test or reaction zone (s) is (are) applied by spraying, dropping or masking. ,
Indem, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens entspricht, die mit dem Analyten oder dem Anti-Analyten wechselwirkenden bzw. reagierenden Substanzen aus dem Analyten selbst, Proteinkonjugaten des wenigstens einen Analyten, Anti-Analyt-Antikörpern, Fragmenten von Anti-Analyt-Antikörpern, Proteinen, Aptameren sowie Konjugaten biologischer Polymere gewählt werden, gelingt es, eine Vielzahl von zu untersuchenden, biologischen bzw. organischen Substanzen schnell und genau, d.h. quantitativ, mittels des erfindvingsgemäßen Verfahrens zu untersuchen.By, as corresponds to a preferred development of the method according to the invention, the analyte or the anti-analyte interacting or reacting substances from the analyte itself, protein conjugates of the at least one analyte, anti-analyte antibodies, fragments of anti-analyte antibodies , Proteins, aptamers and conjugates of biological polymers, it is possible, a variety of to be examined, biological or organic substances quickly and accurately, ie quantitatively, by means of the method according to the invention.
Indem das Verfahren derartig geführt wird, daß für jeden zu bestimmenden, gelösten oder suspendierten Analyten oder seinen entsprechenden Anti-Analyten wenigstens eine gesonderte, diskrete Reaktionszone auf der immunochromatographisehen Membran aufgebracht wird, wird einerseits sichergestellt, daß eine Vermischung von zu untersuchenden Substanzen und somit eine Überlagerung von Reaktanten für den Fall, daß mehrere zu untersuchende Substanzen in ein und derselben Probe enthalten sind, in dem Grenzgebiet der Reaktionszonen mit Sicherheit vermieden wird. Außerdem gelingt es dadurch, diskrete Reaktionsbereiche sicherzustellen, welche eine 1 * ; s s | | I ί ü I iBy carrying out the process in such a way that at least one separate, discrete reaction zone is applied to the immunochromatographic membrane for each analyte or its corresponding analyte to be determined, dissolved or suspended, on the one hand it is ensured that a mixture of substances to be investigated and thus one Overlay of reactants in the event that several substances to be investigated are contained in the same sample, is avoided in the border region of the reaction zones with certainty. In addition, it is possible to ensure discrete reaction areas, which a 1 *; s | | | I ί i i
• · * · · · ·*· · · ·· · · • · · · · ··· · · ··# • · · · · · · · » .......-**7 -* eindeutige und reproduzierbare Intensität der Reaktion zeigen, so daß der nachzuweisende Analyt nicht nur quantitativ nachgewiesen werden kann, sondern das Verfahren jederzeit reproduzierbar geführt werden kann. Für einen besonders eindeutigen und insbesondere eine hohe Genauigkeit aufweisenden, quantitativen Nachweis wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so geführt, daß die Intensität der Reaktionszone durch Vergleich mit einem Hintergrund ermittelt wird. Indem die Intensität der Reaktionszone gegen einen Hintergrund ermittelt wird, liegt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren automatisch eine Vergleichszone vor, welche den Intensitätsab-gleich der Reaktionszone dahingehend erleichtert, daß in dem Versuch selbst ein Standard, gegen welchen gemessen werden kann, zur Verfügung gestellt wird. Mit Vorhandensein eines derartigen Standards gelingt es beispielsweise durch einfachen optischen Vergleich einer zu untersuchenden Probe mit einer vorliegenden Farb-karte oder von Fluoreszenz Intensitäten, die Menge an in einem zu untersuchenden Analyten enthaltener Substanz zu bestimmen. Für einen genaueren und somit eine höhere Präzision aufweisenden, quantitativen Nachweis wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so geführt, daß die Intensität der Reaktionszone im Vergleich mit dem Hintergrund mit einem photometrischen oder fluorometrischen Meßgerät, insbesondere einem photometrischen oder fluorometrischen Reflexionsgerät, einem Spektrometer oder einer CCD-Kamera gemessen wird. Durch Verwendung eines photometrischen oder fluorometrischen Meßgeräts können optische Täuschungen, welche bei Abgleich mit freiem Auge passieren können, mit Sicherheit vermieden werden. Indem, wie dies einer weiteren bevorzugten Verfahrensführung entspricht, das Meßergebnis auf einer Anzeigevorrichtung des Geräts angezeigt wird, wird ein vollständig automatisiertes Verfahren zur Verfügung gestellt, mit welchem rasch und zuverlässig die quantitative Menge eines zu untersuchenden Analyten in einer Probe nachgewiesen und die Nachweiszeit insgesamt weiter abgesenkt werden kann. • · ·· · · · · · · • ·♦· · · ·· · · • · · · ····· · ··* • · · · · ··· · *% ·· ··· ·· ··• * * * · · · * * * · · · · · · · · · · ··················································· ».......- ** 7 - * show clear and reproducible intensity of the reaction, so that the analyte to be detected can not only be detected quantitatively, but the process can be performed reproducibly at any time. For a particularly clear, and in particular a high accuracy, quantitative detection, the inventive method is preferably performed so that the intensity of the reaction zone is determined by comparison with a background. By determining the intensity of the reaction zone against a background, the method according to the invention automatically provides a comparison zone which facilitates the intensity equalization of the reaction zone so that a standard against which it is possible to measure is provided in the experiment itself. With the presence of such a standard, it is possible to determine, for example, by simple optical comparison of a sample to be examined with a given color card or fluorescence intensities, the amount of substance contained in an analyte to be examined. For a more precise and therefore more precise quantitative detection, the method according to the invention is preferably carried out such that the intensity of the reaction zone is compared with the background with a photometric or fluorometric measuring device, in particular a photometric or fluorometric reflecting device, a spectrometer or a CCD. Camera is measured. By using a photometric or fluorometric measuring device, optical illusions, which can happen when compared with the naked eye, can be avoided with certainty. By indicating the measurement result on a display device of the device, as is the case with another preferred method, a completely automated method is provided with which the quantitative amount of an analyte to be examined in a sample can be detected quickly and reliably, and the detection time overall can be lowered. • ······························································· •·· ···
Indem, wie dies einer bevorzugten Verfahrensführung entspricht, die Ermittlung des Gehalts des wenigstens einen Analyten in der Flüssigkeit oder Suspension durch Vergleich mit standardisierten Werten, wie einer Eichkurve, ermittelt wird, kann die Fehlerquote des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter abgesenkt und die Genauigkeit des Nachweises weiter erhöht werden.By determining the content of the at least one analyte in the liquid or suspension by comparison with standardized values, such as a calibration curve, as is the case with a preferred process procedure, the error rate of the method according to the invention can be further lowered and the accuracy of the detection further increased become.
Um sicherzustellen, daß das erfindungsgemäße Verfahren korrekt funktioniert hat und nicht beispielsweise die immunochroma-tographische Membran und/oder die Reaktionszone, die auf der im-munochromatographischen Membran festgelegt ist, beispielsweise durch unsachgemäße Lagerung Fehlfunktionen aufweist bzw. nicht mehr aktiv ist, wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so geführt, daß zusätzlich eine Kontrollinie bzw. Kontrollzone aufgebracht wird und daß als Substrat für die Kontrollinie bzw. Kontrollzone ein immobilisierter Anti-Spezies-spezifischer Antikörper des Anti-Analyt-Antikörpers eingesetzt wird. Durch Vorsehen einer Kontrollinie bzw. Kontrollzone kann sichergestellt werden, daß sowohl die immunochromatographische Membran als auch zumindest die wenigstens eine Reaktionszone auf dieser Membran aktiv sind und nicht ein fehlerhaftes Testsystem vorliegt und somit auch das erfindungsgemäße Verfahren korrekt und störungsfrei ausgeführt wurde.To ensure that the inventive method has worked correctly and not, for example, the immunochromatographic membrane and / or the reaction zone, which is fixed on the immunochromatographic membrane, for example, by improper storage malfunctions or is no longer active, the inventive Method preferably performed so that in addition a control line or control zone is applied and in that an immobilized anti-species-specific antibody of the anti-analyte antibody is used as the substrate for the control line or control zone. By providing a control line or control zone can be ensured that both the immunochromatographic membrane and at least the at least one reaction zone on this membrane are active and not a faulty test system is present and thus the inventive method was carried out correctly and trouble-free.
Um insbesondere die Genauigkeit des Verfahrens weiter zu erhöhen und auch sicherzustellen, daß Kreuzreaktionen mit ähnlichen, in einer Probe enthaltenen Substanzen bzw. Analyten ausgeschlossen sind, wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt so geführt, daß der wenigstens eine gelöste oder suspendierte Analyt und mit jeweils wenigstens zwei Anti-Analyten in Kontakt gebracht wird, wobei mindestens einer der Anti-Analyten mit einer Färb- oder Fluoreszenzreaktion bewirkenden Substanz markiert ist, und der Analyt und die zugehörigen Anti-Analyten mit der in einer definierten Menge auf dem Träger festgelegten immunochromato-graphischen Membran in Kontakt gebracht werden.In order in particular to further increase the accuracy of the process and to ensure that cross-reactions with similar substances or analytes contained in a sample are excluded, the process according to the invention is preferably carried out such that the at least one dissolved or suspended analyte and each having at least two Anti-analyte is contacted, wherein at least one of the anti-analyte is labeled with a dye or fluorescence-causing substance, and the analyte and the associated anti-analyte with the defined in a defined amount on the support immunochromatographic membrane in Be brought in contact.
Die vorliegende Erfindung zielt weiters auf ein rasch und zuverlässig ansprechendes Testsystem zur quantitativen Bestimmung von wenigstens einem gelösten oder suspendierten Analyten mittels eines quantifizierbaren Testelements ab, mit welchem nicht nur schnell, sondern auch zuverlässig und reproduzierbar gelöste oder suspendierte Analyten in biologischen Proben nachgewiesen und identifiziert werden können.The present invention further aims at a rapidly and reliably responding test system for the quantitative determination of at least one dissolved or suspended analyte by means of a quantifiable test element with which not only fast but also reliably and reproducibly dissolved or suspended analytes in biological samples are detected and identified can.
Ein derartiges Testsystem ist gemäß der vorliegenden Erfindung im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß ein Träger vorgesehen ist, auf welchem eine definierte Menge einer immunochro-matographischen Membran festgelegt ist; daß auf die immunochroma-tographische Membran wenigstens eine Reaktionszone festgelegt ist und daß ein photometrisches oder fluorometrisches Meßgerät zur Bestimmung der Menge eines durch die Reaktionszone des Testelements gelaufenen, gelösten oder suspendierten Analyten, des markierten Analyten und/oder des markierten Anti-Analyten enthalten ist. Indem auf einer definierten Menge einer immunochromato-graphischen Membran wenigstens eine Reaktionszone festgelegt ist und ein photometrisches oder fluorometrisches Meßgerät zur Bestimmung der Menge eines durch die Reaktionszone des Testelements gelaufenen, gelösten oder suspendierten Analyten oder Anti-Analyten vorhanden ist, gelingt ein eindeutiger, rascher und reproduzierbarer, quantitativer Nachweis des gelösten oder suspendierten Analyten.Such a test system according to the present invention essentially characterized in that a support is provided on which a defined amount of an immunochromatographic membrane is fixed; in that at least one reaction zone is defined on the immunochromatographic membrane and that a photometric or fluorometric measuring device is included for determining the amount of an analyte dissolved, suspended or suspended through the reaction zone of the test element, the labeled analyte and / or the labeled anti-analyte. By defining at least one reaction zone on a defined amount of an immunochromatographic membrane and providing a photometric or fluorometric measuring device for determining the amount of dissolved, suspended or suspended analyte or anti-analyte passed through the reaction zone of the test element, a clearer, faster and more accurate approach is achieved reproducible, quantitative detection of the dissolved or suspended analyte.
Indem, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Testsystems entspricht, als photometrisches oder fluorometrisches Meßgerät ein photometrisches oder fluoromet-risches Reflexionsgerät, ein Spektrometer oder eine CCD-Kamera eingesetzt ist, können feine Farbunterschiede von photometrischen Reaktionen bzw. kleine Reflexionsunterschiede von fluorometrisch reagierenden Substanzen eindeutig und reproduzierbar nachgewiesen werden.By, as corresponds to a preferred development of the test system according to the invention, as a photometric or fluorometric measuring device, a photometric or fluoromet- risches reflection device, a spectrometer or a CCD camera is used, fine color differences of photometric reactions or small reflection differences of fluorometrically reacting substances clearly and reproducibly detected.
Indem, wie dies einer Weiterbildung der Erfindung entspricht, als photometrisches oder fluorometrisches Meßgerät ein • · · ·· · ·· · ♦ · • · · · ·*· · · ·* · · • · · * ···«· ···· • · · · · ··· · .......- ϊο -* tragbares Gerät eingesetzt ist, gelingt es nicht nur, eine kleinbauende Versuchsanordnung zur Verfügung zu stellen, sondern auch ein Testsystem, mit welchem direkt vor Ort, d.h. beispielsweise beim Endverbraucher Substanzen in bezug auf das Vorhandensein eines fraglichen Analyten zu untersuchen.By, as in accordance with a further development of the invention, a photometric or fluorometric measuring instrument a • • • ····················································································· • It is not only possible to provide a small - scale test set-up, but also a test system with which directly Place, ie For example, at the end user to examine substances for the presence of a questionable analyte.
Indem, wie dies einer Weiterbildung der vorliegenden Erfindung entspricht, das Meßergebnis unmittelbar auf einer Anzeige des Meßgerätes, insbesondere einem Display, angezeigt ist, wird eine noch weitere Vereinfachung des Testsystems zur Verfügung gestellt und es gelingt insbesondere, ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, welches keinerlei spezielle fachliche Vorbildung erfordert, sondern durch jedermann an jedem beliebigen Ort angewandt werden kann.By, as this corresponds to a development of the present invention, the measurement result is displayed directly on a display of the meter, in particular a display, an even further simplification of the test system is provided and it is possible in particular to provide a test system which No special technical training required, but can be applied by anyone at any location.
Indem, wie dies einer Weiterbildung der Erfindung entspricht, ein Testsystem eingesetzt wird, in welchem eine Mehrzahl von Teststreifen gleichzeitig eingesetzt ist und daß die Mehrzahl von Teststreifen in einem gemeinsamen Halter festgelegt ist, kann ein quantitativer Nachweis einer Mehrzahl von gleichzeitig in einer zu untersuchenden Probe vorliegenden, verschiedenen Analyten in beliebiger Kombination zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus kann ein derartiges System selbstverständlich auch für einen Negativnachweis bzw. mehrere Negativ- und Positivnachweise nebeneinander verwendet werden.By, as in a further development of the invention, a test system is used in which a plurality of test strips is used simultaneously and that the plurality of test strips is fixed in a common holder, a quantitative detection of a plurality of simultaneously in a sample to be examined present, various analytes can be provided in any combination. In addition, such a system can of course be used for a negative proof or multiple negative and positive proofs side by side.
Indem, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung entspricht, eine Mehrzahl von Reaktionszonen auf ein und demselben Testelement aufgebracht ist, gelingt eine weitere, apparative Vereinfachung des Testsystems und insbesondere können dann beispielsweise Testsysteme zur Verfügung gestellt werden, in welchen üblicherweise gemeinsam auftretende Analyten auf ein und demselben Testelement aufgebracht sind, so daß nicht mehrere gesonderte Nachweisverfahren geführt werden müssen oder verschiedene Testsysteme nebeneinander zum Einsatz gebracht werden müssen, sondern ein und dasselbe Testsystem und -verfahren den quantitativen ·· ·· ···♦ ·· ·» φφ 9 ·· · · · · · · · t 9 · · · ··· · · ·· · · 9 · · ψ · ·«· « · ·«« ► · · · · ··· · ·· ♦· ··· Jt *· φφBy applying a plurality of reaction zones to one and the same test element, as is the case with a preferred development, a further simplification of the test system is achieved and, in particular, test systems can be provided, for example, in which analytes commonly occurring together on one and the same Test element are applied so that no multiple separate detection methods must be performed or different test systems must be used side by side for use, but one and the same test system and method the quantitative ······· ♦ ··· »φφ 9 ·· · ···································································································································································································································· * · Φφ
Nachweis beispielsweise mehrerer zu untersuchender Analyten erbringt .Detection of, for example, several analytes to be examined yields.
Indem, wie dies einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung entspricht, die Mehrzahl von Reaktionszonen nebeneinander, d.h. in einer Höhe, auf dem Testelement aufgebracht ist, wird sichergestellt, daß zusätzlich zu dem Nachweis von möglicherweise mehreren in einer Probe enthaltenen Analyten jeder Analyt reproduzierbar nach ein und derselben Laufzeit über die immunochroma-tographische Membran nachgewiesen werden kann und darüber hinaus beispielsweise durch Aufbringen von unterschiedlichen Konzentrationen von ein und derselben nachzuweisenden Substanz bzw. deren Anti-Analyten in nebeneinander liegenden Reaktionszonen die Nach-weisgenauigkeit noch weiter erhöht wird, indem eine eindeutige Zuordnung der erhaltenen Intensität der Reaktion möglich gemacht wird.By, as corresponds to a preferred embodiment of the invention, the plurality of reaction zones next to each other, i. at a level at which the test element is applied, it is ensured that, in addition to the detection of possibly several analytes contained in a sample, each analyte can be reproducibly detected over the immunochromatographic membrane after one and the same transit time and moreover, for example, by applying different concentrations of one and the same substance to be detected or their anti-analyte in adjacent reaction zones, the detection accuracy is further increased by a clear assignment of the obtained intensity of the reaction is made possible.
Indem, wie dies bereits ausgeführt ist, die Mehrzahl von Reaktionszonen zum Nachweis für unterschiedliche Analyten ausgebildet ist, gelingt der gleichzeitige quantitative Nachweis mehrerer zu untersuchender Analyten.By, as already stated, the plurality of reaction zones for the detection of different analytes is formed, the simultaneous quantitative detection of several analytes to be examined succeeds.
Die vorliegende Erfindung zielt weiters auf die Verwendung eines Testsystems zur quantitativen Bestimmung von wenigstens einem gelösten oder suspendierten Analyten mittels einem quantifizierbaren Testelements, wobei dieses Testsystem zum Nachweis von niedermolekularen Substanzen, Peptiden, Fragmenten von Antikörpern, Aptameren, biologischen Polymeren, Proteinkonjugaten und Proteinfragmenten eingesetzt wird.The present invention further aims to use a test system for the quantitative determination of at least one dissolved or suspended analyte by means of a quantifiable test element, which test system is used for the detection of low molecular weight substances, peptides, fragments of antibodies, aptamers, biological polymers, protein conjugates and protein fragments ,
Insbesondere wird das Testsystem zum quantitativen Nachweis von unerwünschten Kontaminanten und Drogen sowie chemischen Rückständen, insbesondere Toxinen, insbesondere Mykotoxinen, insbesondere Trichothecenen, wie Nivalenol, Deoxynivalenol, 3-Acetyl-Deoxynivalenol, 15-Acetyl-Deoxynivalenol, Fusarenon X, T-2 Toxin, HT-2 Toxin, Fumonisinen, wie Fumonisin Bl, B2 oder B3, Ochrato-xinen, wie Ochratoxin A, B, C oder D, Zearalenonen, Moniliformin oder Aflatoxinen, wie Aflatoxin Bl, B2 Gl oder G2, Ml, M2, Alka- loide, Drogen, sowie Allergenen, Pestiziden, Hormonen, Antibiotika, Additive und Zusatzstoffen, Inhaltsstoffe/Wirkstoffen,In particular, the test system is used for the quantitative detection of undesirable contaminants and drugs as well as chemical residues, especially toxins, especially mycotoxins, especially trichothecenes such as nivalenol, deoxynivalenol, 3-acetyl-deoxynivalenol, 15-acetyl-deoxynivalenol, fusarenone X, T-2 toxin, HT-2 toxin, fumonisins, such as fumonisin B1, B2 or B3, ochratoxins, such as ochratoxin A, B, C or D, zearalenones, moniliformin or aflatoxins, such as aflatoxin B1, B2G1 or G2, M1, M2, alkali loide, drugs, and allergens, pesticides, hormones, antibiotics, additives and additives, Ingredients / Active Ingredients,
Acrylamiden, genetisch veränderten Organismen sowie Umweltschadstoffen und Rückständen eingesetzt. Mit einer derartigen Verwendung gelingt somit der rasche und zuverlässige Nachweis einer Vielzahl von Schadstoffen, Pharmazeutika oder auch Toxinen beispielsweise in Lebensmitteln, Tierfuttermitteln oder dgl.Acrylic amides, genetically modified organisms and environmental pollutants and residues used. With such a use, therefore, the rapid and reliable detection of a variety of pollutants, pharmaceuticals or toxins, for example, in food, animal feed or the like.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von in der beiliegenden Zeichnung schematisch dargestellten Ausführungsbeispielen sowie Beispielen näher erläutert. In dieser zeigen:The invention will be explained in more detail with reference to embodiments schematically illustrated in the accompanying drawings and examples. In this show:
Fig. 1 die Darstellung eines auf einem Träger festgelegten Testsystems gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer Nachweiszone und einer Kontrollzone;FIG. 1 shows the representation of a test system according to the present invention with a detection zone and a control zone;
Fig. 2 einen Vergleich von Standardkurven beim Nachweis von Deoxynivalenol;Figure 2 is a comparison of standard curves in the detection of deoxynivalenol.
Fig. 3 eine Regressionslinie für die Kalibrierung eines Deoxyni-valenol-Streifentests;Fig. 3 is a regression line for the calibration of a deoxyni valenol strip test;
Fig. 4 die T2-Toxinkonzentration von Extrakten, die mit einem T2-Testsystem gemessen sind;Fig. 4 shows the T2 toxin concentration of extracts measured with a T2 test system;
Fig. 5 ein weiteres Beispiel eines Streifentests, in welchem mehrere punktförmige Reaktionsbereiche nebeneinander zum Nachweis von Fuminisin Bl, Aflatoxin Bl, Chloramphenicol und Clenbuterol aufgetragen sind, wobei Fig. 5a eine Testplatte ohne Kontrollinie zeigt und Fig. 5b dieselbe Testplatte mit Kontrollinie zeigt; und Fig. 6 eine Testplatte, in welcher drei allergenspezifische, monoklonale Antikörper, nämlich von Haselnuß, Walnuß und Mandel, auf einer immunochromatographischen Membran immobilisiert wurden.5 shows another example of a strip test in which a plurality of punctiform reaction areas are shown side by side for the detection of fuminisin Bl, aflatoxin B1, chloramphenicol and clenbuterol, wherein FIG. 5a shows a test plate without a control line and FIG. 5b shows the same test plate with a control line; and Fig. 6 shows a test plate in which three allergen-specific monoclonal antibodies, namely hazelnut, walnut and almond, were immobilized on an immunochromatographic membrane.
In den nachfolgenden Ausführungsbeispielen, welche auf die obengenannten Figuren Bezug nehmen, wird die Erfindung weiter erläutert . • · · · •·· · · ♦ ··· « • · ·In the following embodiments, which refer to the above figures, the invention will be further explained. • · · · · · · · · · · · · · · · ·
·- 1*3 -*· - 1 * 3 - *
Beispiel 1example 1
In Beispiel 1 ist, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist, eine Testplatte bzw. ein Teststreifen für die quantitative Detektion von Deoxynivalenol (DON) in Weizen oder Weizenmehl in einem Konzentrationsbereich von 250 bis 1.600 ppb dargestellt. Der Teststreifen, welcher allgemein mit 1 angedeutet ist, weist an seinem Startende 2 ein Freigabekissen 3 auf, welches in einer nicht dargestellten Vertiefung bzw. ein Gefäß, enthaltend den gelösten oder suspendierten, zu untersuchenden Analyten sowie entweder einen markierten Anti-Analyten oder einen markiertem Analyten, eintaucht. Von diesem Freigabekissen beginnend läuft die zu untersuchende Probe bzw. der Analyt in Richtung des Pfeils 4 über eine analytische Nitrozellulose-Membran 5, welche ebenso wie das Freigabekissen auf einem Träger, beispielsweise einer Kunststoffplatte, aufgebracht ist. Im mittleren Bereich der Nitrozellulose-Membran 5 ist im vorliegenden Fall eine Reaktionslinie 6, bestehend aus einem Proteinkonjugat des Zielanalyten Deoxynivalenol aufgebracht. Die für die Konjugation verwendeten Proteine waren hier beispielsweise Rinderserumalbumin, Ovalbumin oder Konalbu-min. Die Reaktionszone wurde im vorliegenden Fall unter Verwendung einer Sprühvorrichtung auf die Nitrozellulose-Membran 5 aufgebracht. In Abstand von der Reaktionslinie 6 ist im Beispiel gemäß Fig. 1 eine Kontrollinie 7, bestehend aus einem Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper, aufgebracht, um die korrekte Testentwicklung zu bestätigen, da Maus-Antikörper in dem Versuch verwendet wurden.In Example 1, as shown in Fig. 1, a test plate or a test strip for the quantitative detection of deoxynivalenol (DON) in wheat or wheat flour in a concentration range of 250 to 1,600 ppb is shown. The test strip, which is generally indicated by 1, has at its start end 2 a release pad 3, which in a well, not shown, containing the dissolved or suspended analyte to be examined and either a labeled anti-analyte or a labeled Analytes, dips. Starting from this release pad, the sample or analyte to be examined runs in the direction of the arrow 4 over an analytical nitrocellulose membrane 5 which, like the release pad, is applied to a carrier, for example a plastic plate. In the middle region of the nitrocellulose membrane 5, a reaction line 6 consisting of a protein conjugate of the target analyte deoxynivalenol is applied in the present case. The proteins used for the conjugation were here, for example, bovine serum albumin, ovalbumin or Konalbu-min. The reaction zone in the present case was applied to the nitrocellulose membrane 5 using a spray device. At a distance from the reaction line 6, in the example of Fig. 1, a control line 7 consisting of a rabbit anti-mouse antibody was applied to confirm the correct test development since mouse antibodies were used in the experiment.
Am Ende der immunochromatographi sehen Membran 5 ist zur vollständigen Aufnahme von überschüssigem, gelöstem oder suspendiertem Analyt schließlich ein Adsorbenskissen 8 vorgesehen, in welchem nicht nur die überschüssige Lösung aufgenommen wird, sondern auch der Rückfluß der Lösung mit Sicherheit verhindert wird. Als Absorbenskissen 8 ist im vorliegenden Fall ein Baumwollkissen aufgebracht. • ·· · · · ·· · · · • · · · ·«« · · «· · · • ·· · ··· « · t«· • · · · · ··· · ......*- 14 "At the end of the immunochromatographi see membrane 5 is finally provided for complete uptake of excess, dissolved or suspended analyte an adsorbent pad 8, in which not only the excess solution is received, but also the reflux of the solution is prevented with certainty. As Absorbenskissen 8 a cotton pad is applied in the present case. •·························································································· * - 14 "
Der Versuchsablauf wurde wie folgt geführt. Monoklonale Anti-DON-Antikörper wurden mit kolloidalem Gold konjugiert und wurden als selektives Aufnahmereagens verwendet. Als zu untersuchende Probe, welche den Analyten enthält, wurde eine Bodenprobe in einem Verhältnis von 1:4 (Gewicht/Volumen) mit destilliertem Wasser unter Verwendung eines Mischers für 3 min extrahiert. Die Probe wurde 5 bis 10 min absitzen gelassen. Der Extrakt wurde weiter 1:2 mit destilliertem Wasser verdünnt und 50 μΐ wurden für den Test verwendet. Im Fall von zu hoher Kontaminationen mit dem Analyten sind selbstverständliche Verdünnungs-reihen ohne weiteres möglich. Für den markierten Anti-Analyten wird eine ausreichende Menge an monoklonalem Antikörper, im vorliegenden Maus-monoklonalem Antikörper, für die Kopplungsreaktion mit kolloidalem Gold, welches Teilchengrößen von etwa 40 nm aufweist, herangezogen. Für eine erste Verdünnung wurde die berechnete Menge an Antikörper zu 1 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 8,5 hinzugefügt. Die Antikörper-Lösung wurde dann mit einer kolloidalen Goldlösung in einem Zentrifugenrohr vermischt und 90 min bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Rühren auf einer Schüttelplattform vermischt. Die nicht umgesetzten, verbleibenden Bindungsstellen an dem Maus-monoklonalen Antikörper wurden durch den Zusatz von 2 % BSA bzw. Rinderserumalbumin und Inkubation der Mischung für weitere 90 min gebunden. Um nicht gebundene Antikörper abzutrennen wurde für 30 min bei 8000 G zentrifugiert und mit 30 ml destilliertem Wasser bei einem pH von 8,5 gewaschen.The experimental procedure was conducted as follows. Monoclonal anti-DON antibodies were conjugated to colloidal gold and used as a selective uptake reagent. As a sample to be examined containing the analyte, a soil sample was extracted in a ratio of 1: 4 (weight / volume) with distilled water using a mixer for 3 minutes. The sample was allowed to sit for 5 to 10 minutes. The extract was further diluted 1: 2 with distilled water and 50 μΐ was used for the test. In the case of too high contaminations with the analyte, obvious dilution series are readily possible. For the labeled anti-analyte, a sufficient amount of monoclonal antibody, in the present mouse monoclonal antibody, is used for the coupling reaction with colloidal gold, which has particle sizes of about 40 nm. For a first dilution, the calculated amount of antibody was added to 1 ml of distilled water at pH 8.5. The antibody solution was then mixed with a colloidal gold solution in a centrifuge tube and mixed for 90 minutes at room temperature with gentle stirring on a shaking platform. The unreacted residual binding sites on the mouse monoclonal antibody were bound by the addition of 2% BSA or bovine serum albumin and incubation of the mixture for an additional 90 minutes. To separate unbound antibody was centrifuged for 30 min at 8000 G and washed with 30 mL of distilled water at pH 8.5.
Der Versuchsextrakt wurde mit der Auf nahmereagens - Puffermischung in einer Mikrotitervertiefung durch mehrmaliges Pipettieren sorgfältig vermischt. Der Streifentest wurde dann vertikal in die Vertiefung, welche eine genau definierte Menge Lösung und Aufnahmereagens enthielt, für eine Testdauer von 3 min eingetaucht. Das kolloidale Gold ermöglichte die Entwicklung von gefärbten, roten Linien nach einer selektiven Retention durch die immobilisierten Reagentien. Die Reaktionslinie 6 wurde bei 8,0 ± • · · · · · · · · · · • · · · ·♦· · « ·· · t • · · · ·· · * · «·* • · · · · · · · · .......- Ϊ5 -* ” . 5 mm vom Boden der immunochromatographischen Membran 5 aufge bracht und hatte eine Breite von etwa 1,0 ± 1 mm. Die Kontrolle-nie 7 hatte eine konstante Intensität unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit des Zielanalyten für die schnelle, optische Bestätigung der korrekten Testleistung und um zu bestätigen, daß die eingesetzte Testplatte aktiv und wirkungsvoll ist. Die Kon-trollinie 7 wurde bei etwa 13 bis 14 mm vom Boden der immunochromatographischen Membran 5 aufgebracht und hatte einen Abstand von dem Absorbenskissen von etwa 3 mm.The test extract was thoroughly mixed with the receiving reagent buffer mixture in a microtiter well by repeated pipetting. The strip test was then dipped vertically into the well containing a well-defined amount of solution and uptake reagent for a test period of 3 minutes. The colloidal gold allowed the development of colored red lines after selective retention by the immobilized reagents. Reaction line 6 was measured at 8.0 ± • · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · .......- Ϊ5 - * ". 5 mm from the bottom of the immunochromatographic membrane 5 introduced and had a width of about 1.0 ± 1 mm. The control-never 7 had a constant intensity independent of the presence or absence of the target analyte for the rapid, visual confirmation of the correct test performance and to confirm that the test plate used is active and effective. The control line 7 was applied at about 13 to 14 mm from the bottom of the immunochromatographic membrane 5 and had a distance from the absorbent pad of about 3 mm.
Eine positive Probe resultierte in einer schwach gefärbten Linie in der Reaktionszone 6. Alternativ würde eine negative Probe in der Ausbildung einer deutlich sichtbaren Linie in der Reaktionszone 6 resultieren, da im vorliegenden Fall eine Konkurrenzreaktion zwischen dem nachzuweisenden Analyten und dem markierten Anti-Analyten sowie dem Analyten in der Reaktionszone 6 stattfand. Der Teststreifen 1 wurde dann mit einem tragbaren Lesegerät entwickelt, um die Reaktionszone 6 abzutasten. Die Testergebnisse sind unmittelbar nach der dreiminütigen Testentwicklungszeit abzulesen.A positive sample resulted in a slightly colored line in the reaction zone 6. Alternatively, a negative sample would result in the formation of a clearly visible line in the reaction zone 6, since in the present case a competing reaction between the analyte to be detected and the labeled anti-analyte and the Analyte in the reaction zone 6 took place. The test strip 1 was then developed with a portable reader to scan the reaction zone 6. The test results can be read immediately after the three-minute test development time.
Fig. 2 stellt den Vergleich von zwei Standardkurven im Bereich von 0 bis 2.000 ppb DON dar, wobei insbesondere in der Kurve 9 ein gerader Bereich 10 eindeutig auftritt, in welchem der Versuch quantitativ reproduzierbar geführt werden kann.FIG. 2 shows the comparison of two standard curves in the range from 0 to 2,000 ppb DON, wherein in particular in the curve 9 a straight region 10 clearly occurs, in which the experiment can be carried out in a quantitatively reproducible manner.
Durch Vergleich mit einer derartigen Eichkurve kann das tragbare Lesegerät unmittelbar und ohne Verzögerung eine Auswertung des Versuchs durchführen. Es ist unerheblich festzuhalten, daß, wenn statt kolloidalem Gold ein fluoreszierendes Reagens verwendet wird, unmittelbar eine Auswertung beispielsweise unter Verwendung einer UV-Lampe mit freiem Auge und Vergleich mit Testkarten durchgeführt werden kann.By comparison with such a calibration curve, the portable reader can perform an evaluation of the experiment immediately and without delay. It is irrelevant to note that when a fluorescent reagent is used instead of colloidal gold, an evaluation can be made immediately using, for example, a naked-eye UV lamp and comparison with test cards.
Fig. 3 zeigt eine Kalibrierung eines gewählten Arbeitsbereichs des Testsystems unter Verwendung von Deoxynivalenol. Die Analytenquantifizierung kann hiebei unter Verwendung von natürlich kontaminierten Proben durchgeführt werden, indem eine Formel Y = -ΑΧ + Ρ für ein Konkurrenzversuchsformat, wie dies in Fig. 3 dargestellt ist, herangezogen wird. Das verwendete Verfahren kann matrixabhängig sein und muß gemäß der zu untersuchenden Matrix gewählt werden. Das Reaktionszonensignal wird immittelbar nach Ende der Testzeit mit einem Lesegerät gemessen und die Daten werden mit zur Verfügung stehender Software verarbeitet, was unmittelbar ein quantitatives Ergebnis liefert.Fig. 3 shows a calibration of a selected working range of the test system using deoxynivalenol. The analyte quantification can be carried out here using naturally contaminated samples by using a formula Y = -ΑΧ + Ρ for a competition test format, as shown in FIG. The method used may be matrix-dependent and must be chosen according to the matrix to be investigated. The reaction zone signal is measured immediately after the end of the test time with a reader and the data is processed with available software, which immediately gives a quantitative result.
Beispiel 2Example 2
In Beispiel 2, welches im wesentlichen wie Beispiel 1 geführt wird, wird anstelle des quantitativen Nachweises von Deoxy-nivalenol jener einer Konzentration von T2-Toxinextrakt nachgewiesen, welche mit einem spezifischen T2-Streifentest gemessen wird. Der Teststreifen für die Testplatte ist hiebei ident zu jenem von Beispiel 1 und wie er in Fig. 1 dargestellt ist aufgebaut, mit der Ausnahme, daß monoklonale Anti-T2-Antikörper mit kolloidalem Gold konjugiert wurden und die markierten Anti-Analy-ten in der zu untersuchenden Probe darstellen. Das Testverfahren wurde ansonsten wie in Beispiel 1 ausgeführt, mit der Ausnahme, daß die Testdauer 5 min betrug. Der Arbeitsbereich des quantitativen Tests für T2-Toxin liegt hiebei im Bereich von 1 bis 100 ppb.In Example 2, which is conducted essentially as Example 1, instead of the quantitative detection of deoxy-nivalenol, that of a concentration of T2 toxin extract is measured, which is measured with a specific T2-strip test. The test strip for the assay plate is hereby identical to that of Example 1 and as shown in Figure 1 except that anti-T2 monoclonal antibody was conjugated to colloidal gold and the labeled anti-analytes were prepared in the represent sample to be examined. The test procedure was otherwise carried out as in Example 1, except that the test duration was 5 minutes. The range of activity of the quantitative test for T2 toxin is in the range of 1 to 100 ppb.
Beispiel 3Example 3
Die im vorliegenden Beispiel eingesetzten, plattenförmigen Testsysteme sind in Fig. 5 dargestellt. In Fig. 5a ist ein Testsystem dargestellt, in welchem die immunochromatographische Membran 5 direkt mit dem nachzuweisenden Analyten bzw. dem markierten Anti-Analyten oder dem markierten Analyten in Kontakt gebracht wird. Eine Freigabezone ist nicht vorgesehen. In Fig. 5a ist eine Mehrzahl von punktförmigen Reaktionszonen 6 auf die immunochromatographische Membran 5 aufgebracht, wobei jede der Re- aktionszonen ein Analyt-Protein-Konjugat enthält. Das Testsystem gemäß Fig. 5a weist schließlich noch ein Absorbenskissen 8 für die Aufnahme von überschüssigem Reagens bzw. überschüssiger, von die nachzuweisende Substanz enthaltender Lösung auf.The plate-shaped test systems used in the present example are shown in FIG. FIG. 5 a shows a test system in which the immunochromatographic membrane 5 is brought into direct contact with the analyte to be detected or the labeled anti-analyte or the labeled analyte. A release zone is not provided. In Fig. 5a, a plurality of punctiform reaction zones 6 are applied to the immunochromatographic membrane 5, each of the reaction zones containing an analyte-protein conjugate. Finally, the test system according to FIG. 5a also has an absorbent pad 8 for receiving excess reagent or excess solution containing the substance to be detected.
In Fig. 5b ist die analoge immunochromatographische Membran 5 dargestellt, in welcher wiederum Reaktionszonen bzw. Testpunkte 6, enthaltend vier verschiedene Analyt-Protein-Konjugate, aufgebracht sind. Zusätzlich zu den Testpunkten 6 weist Fig. 5b eine Kontrollinie 7 zum Nachweis, ob der Versuch positiv gelaufen ist, auf, welche wie in Beispiel 1 ausgebildet ist. Schließlich ist auch in Fig. 5b ein Absorbenskissen 8 zur Aufnahme von überschüssiger Analytlösung bzw. -Suspension vorgesehen, um einen Rückfluß des Analyten in das ReaktionsSystem zu vermeiden.FIG. 5b shows the analogous immunochromatographic membrane 5 in which in turn reaction zones or test points 6 containing four different analyte-protein conjugates are applied. In addition to the test points 6, Fig. 5b has a control line 7 for proving whether the test is positive, which is formed as in Example 1. Finally, an absorbent pad 8 for receiving excess analyte solution or suspension is also provided in FIG. 5b in order to avoid a backflow of the analyte into the reaction system.
Im einzelnen wird Beispiel 3 wie folgt ausgeführt.More specifically, Example 3 is executed as follows.
Es wurden Proteinkonjugate, gekoppelt an BSA und/oder Ovalbumin und Conalbumin A, von Fumonisin Bl und Aflatoxin Bl, Chlor-amphenicol und Clenbuterol in Form von kreisförmigen Flächen 6 aufgetragen. Wahlweise wurde ein Kaninchen anti-Maus Antikörper eingesetzt um die Korrektheit der Testdurchführung zu prüfen. Die Konzentrationen der Konjugate wurden zur Testoptimierung im Bereich von 0,05 mg/ml bis 5 mg/ml eingesetzt. Eine Mischung aus monoklonalen oder polyklonalen Antikörper konjugiert an kolloidalem Gold und mit jeweils spezifischer Affinität gegen die einzelnen Analyten wurde zur selektiven Erkennung und Bindung der Ziel-analyten eingesetzt. Die Intensität der Kreiszonen wurde mit einem entsprechenden Lesegerät vermessen und über eine extern erstellte Kalibrationsfunktion quantifiziert.Protein conjugates coupled to BSA and / or ovalbumin and conalbumin A, of fumonisin Bl and aflatoxin Bl, chloro-amphenicol and clenbuterol in the form of circular areas 6 were applied. Optionally, a rabbit anti-mouse antibody was used to check the correctness of the test procedure. The concentrations of the conjugates were used for test optimization in the range of 0.05 mg / ml to 5 mg / ml. A mixture of monoclonal or polyclonal antibodies conjugated to colloidal gold and each with specific affinity for each analyte was used to selectively recognize and bind the target analytes. The intensity of the circular zones was measured with a suitable reader and quantified by an externally created calibration function.
Die Zielanalyten wurden in verdünnter Form, einerseits als Standard gelöst in methanolischer Lösung (Lösung 1, wie in Tabelle 1 dargestellt), und andererseits an einem realen Probenextrakt aus Tierfutter dotiert, wie in Tabelle 2 dargestellt, mit den Zielsubstanzen getestet. Die Ergebnisse sind wie folgt in Form von SignalIntensitäten dargestellt, umgerechnet in Konzentrationswerte mittels der externen Kalibrationsfunktion. • · • · · · · - 18 -The target analytes were in diluted form, on the one hand as a standard dissolved in methanolic solution (solution 1, as shown in Table 1), and on the other hand on a real sample extract from animal feed, as shown in Table 2, tested with the target substances. The results are shown as signal intensities as follows, converted into concentration values using the external calibration function. • · • · · · · - 18 -
Tabelle 1Table 1
DiaScan output Testergebnis Dotierung Lösung 1 #1_1 [AU] #1_2 #1_3 [pg/kg] [pg/kg] Aflatoxin Bl 68 65 69 4,60 5,00 Fumonisin Bl 42 45 41 2810,00 2620,00 Chloramphenicol 46 49 51 0,40 0,33 Clenbuterol 37 38 37 1,20 0,95DiaScan output Test result Doping Solution 1 # 1_1 [AU] # 1_2 # 1_3 [pg / kg] [pg / kg] Aflatoxin Bl 68 65 69 4,60 5,00 Fumonisin Bl 42 45 41 2810,00 2620,00 Chloramphenicol 46 49 51 0.40 0.33 Clenbuterol 37 38 37 1.20 0.95
Tabelle 2Table 2
Futterprobe dotiert DiaS #1_1 can ou [AU] #1_2 tput #1_3 Testergebnis [pg/kg] Dotierung [pg/kg] Aflatoxin Bl 120 124 127 25,00 21,00 Fumonisin Bl 63 68 64 1285,00 1095,00 Chloramphenicol 19 23 19 2,51 2,25 Clenbuterol 95 101 100 0,73 0,52Feed sample doped DiaS # 1_1 can ou [AU] # 1_2 tput # 1_3 Test result [pg / kg] Doping [pg / kg] Aflatoxin Bl 120 124 127 25.00 21.00 Fumonisin Bl 63 68 64 1285.00 1095.00 Chloramphenicol 19 23 19 2.51 2.25 Clenbuterol 95 101 100 0.73 0.52
Beispiel 4Example 4
Im vorliegenden Beispiel wurde ein Test für die simultane Detektion von allergenen Haselnuß-, Walnuß und Mandelproteinen durchgeführt. In diesem Beispiel wurde, wie dies in Fig. 6 dargestellt ist, eine analytische Nitrozellulose-Membran 5 als immuno-chromatographische Membran in Kombination mit einem Freigabe-bzw. Probenkissen 3 verwendet. Die zu untersuchenden Proben liefen dabei in Richtung des Pfeils 4. Auf der Nitrozellulose-Membran 5 waren drei Reaktions- bzw. Testzonen 6 von jeweils einem Reagens in derselben Höhe vom Boden der Testplatte 1 für eine simultane Detektion der drei allergenen Nußproteine von wäßrigen Extrakten aus Nahrungsmitteln, von welchen angenommen wurde, daß diese Nüsse enthalten, aufgebracht. Die Reaktionszonen 6 waren monoklonale Antikörper gegen die folgenden Zielproteine, gewählt 19 „ aus Cor all für Haselnuß (48 kDa allergen), Jug r2 für Walnuß (45 kDa allergen) und Pru du4 für Mandel (14 kDa allergen). Die Reak-M tionszonen 6 hatten eine Maximalfläche von 5 mm x 5 mm. Die aufgebrachten Konzentrationen lagen im Bereich von 0,5 bis 5 mg/1, um das verfügbare Ziel allergene Protein zu binden. Für die Kon-trollinie 7 wurde ein Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper verwendet, um die korrekte Testentwicklung zu bestätigen. Die Kontrollinie 7 mit 0,75 mg/ml wurde 1 μΐ/cm auf eine Kontaktspitzenabgabeplatt-form aufgesprüht.In the present example, a test was carried out for the simultaneous detection of allergenic hazelnut, walnut and almond proteins. In this example, as shown in Fig. 6, a nitrocellulose analytical membrane 5 was used as an immuno-chromatographic membrane in combination with a release or. Sample pad 3 used. The samples to be tested ran in the direction of arrow 4. On the nitrocellulose membrane 5 were three reaction or test zones 6 of one reagent at the same height from the bottom of the test plate 1 for simultaneous detection of the three allergenic nut proteins of aqueous extracts Foodstuffs believed to contain nuts. Reaction zones 6 were monoclonal antibodies to the following target proteins, selected 19 "from coral for hazelnut (48 kDa allergen), Jug r2 for walnut (45 kDa allergen) and Pru du4 for almond (14 kDa allergen). The reaction zones 6 had a maximum area of 5 mm × 5 mm. The applied concentrations ranged from 0.5 to 5 mg / l to bind the available target allergenic protein. For control line 7, a rabbit anti-mouse antibody was used to confirm the correct test development. Control line 7 at 0.75 mg / ml was sprayed 1 μΐ / cm onto a contact tip dispensing platform.
Polyklonale Antikörper wurden als zweiter Antikörper in den Sandwich-Versuchen verwendet und mit kolloidalem Gold zur Verwendung als selektives Aufnahmereagens konjugiert. Eine Mischung von Aufnahmereagens für jedes Ziel-Allergen wurde vermischt. Das Probenextrakt wurde sorgfältig in einer Vertiefung mit der Aufnahme-reagentien-Puffermischung in einem Verhältnis 1:1 durch mehrmaliges Pipettieren und Freigeben vermischt. Die hergestellte Mischung, enthaltend den Extrakt, wurde in einer dosierten Menge auf das Freigabekissen 3 des Streifentests aufgebracht. Die flüssige Probe wurde auf der Membran für eine Testdauer von 10 min fließen gelassen und der Überschuß wurde auf einem Absorbenskis-sen 8 gesammelt.Polyclonal antibodies were used as the second antibody in the sandwich experiments and conjugated with colloidal gold for use as a selective uptake reagent. A mixture of uptake reagents for each target allergen was mixed. The sample extract was carefully mixed in a well with the uptake-reagent buffer mixture in a ratio of 1: 1 by repeated pipetting and release. The prepared mixture containing the extract was applied in a metered amount to the release pad 3 of the strip test. The liquid sample was allowed to flow on the membrane for a test period of 10 minutes and the excess was collected on an absorbent scissor 8.
Das kolloidale Gold ermöglichte die Entwicklung von gefärbten, roten Zonen nach einer selektiven Retention der Allergenproteine durch die immobilisierten Reagentien. Die Kontrollinie hatte eine konstante Intensität unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielallergene für die schnelle, visuelle Bestätigung, daß der Test korrekt funktioniert. Eine positive Probe resultierte in der Ausbildung einer sichtbaren Reaktionszone. Alternativ resultierte eine negative Probe in keiner Signalausbildung auf der Reaktionszone. Die Signalintensität auf jeder Reaktionszone war proportional der Proteinkonzentration.The colloidal gold allowed the development of colored red zones after selective retention of the allergen proteins by the immobilized reagents. The control line had a constant intensity independent of the presence or absence of the target allergens for rapid, visual confirmation that the test is functioning correctly. A positive sample resulted in the formation of a visible reaction zone. Alternatively, a negative sample resulted in no signal formation on the reaction zone. The signal intensity on each reaction zone was proportional to the protein concentration.
Proben von Walnuß, Mandel und Haselnuß wurden für die Bestimmung der Spezifität der Antikörper verwendet. Geröstete Haselnüsse, weiße Mandeln und nicht behandelte Walnüsse wurden ver- ·· · · · ·· · ···· · · ·· · · • · ···· 9 99« • · • · · · · · - 20**- -t wendet. Für jede gewählte Nuß wurden 200 g gemahlene Nüsse mit 400 ml eiskaltem, destilliertem Wasser vermischt, in einem Mi-" scher für etwa 90 s bei 6 N dispergiert und durch ein 125 pm Sieb für 30 min hindurchgeleitet. Das überstehende Material wurde neuerlich mit 200 ml eiskaltem, destilliertem Wasser dispergiert und neuerlich durch ein Sieb laufengelassen. Die Siebfraktionen wurden über Nacht bis zur totalen Trockenheit lyophylisiert. Das resultierende Pulver wurde bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.Walnut, almond and hazelnut samples were used to determine the specificity of the antibodies. Roasted hazelnuts, white almonds, and untreated walnuts were added to each other. 9 99 «• · · · · · · · - 20 * * - -t turns. For each chosen nut, 200 g of ground nuts were mixed with 400 ml of ice-cold distilled water, in a Mi- " sheared for about 90 s at 6 N and passed through a 125 μm sieve for 30 min. The supernatant was redispersed with 200 ml of ice-cold distilled water and again passed through a sieve. The sieve fractions were lyophilized overnight to total dryness. The resulting powder was stored at -20 ° C until further use.
Der Nuß-Streifentest wurde zum Einsatz mit einem Meßgerät entwickelt, welches verwendet wird, um die Intensität der Reaktionszonen 6 abzutasten. In Abhängigkeit von der Art des Meßgeräts wird eine mittlere, relative Intensität oder eine mittlere Bildpunktintensität in der Reaktionszone 6 gemessen. Die Auswahl der Flächengröße der Reaktionszone erlaubt es, einen möglichen Konzentrationsbereich der gewählten Zielproteine, welche abgetastet werden, einzustellen bzw. anzupassen. Die Intensität der Reaktionszone 6 kann vom unteren bis zum oberen Ende der Testzone in der Richtung des Flusses in Abhängigkeit von der Menge der al-lergenen Proteine in der Probe abnehmen. Die Ergebnisse können in pg/ml Proteinextrakt oder mg Nuß/kg untersuchtem Nahrungsmittel angegeben werden.The nut strip test was developed for use with a meter which is used to sense the intensity of the reaction zones 6. Depending on the type of meter, a mean, relative intensity or average pixel intensity in the reaction zone 6 is measured. The selection of the area size of the reaction zone makes it possible to adjust or adapt a possible concentration range of the selected target proteins which are scanned. The intensity of reaction zone 6 may decrease from the bottom to the top of the test zone in the direction of flow, depending on the amount of allergenic proteins in the sample. The results can be expressed in pg / ml protein extract or mg nut / kg of food studied.
Die Kontrollinie 7 war innerhalb einer Minute sichtbar, was die korrekte Testentwicklung bestätigt, während 10 bis 15 min für die vollständige Signalentwicklung an den Reaktionszonen 6 erforderlich waren, in Abhängigkeit von der gewählten Matrix.Control line 7 was visible within one minute, confirming the correct test development, while 10 to 15 minutes were required for complete signal development at reaction zones 6, depending on the matrix chosen.
Die Testergebnisse konnten direkt nach der Testentwicklungszeit abgelesen werden.The test results could be read directly after the test development time.
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