DE10052823A1 - Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer Strukturen in Rasteranordnungen - Google Patents
Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer Strukturen in RasteranordnungenInfo
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Abstract
Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer Strukturen, die einen Gesamtdurchmesser zwischen 0,1 Nanometer und 200 Nanometer aufweisen und in definierter Art und Weise zusammen mit Kalibrierungssubstanzen auf einem nanolithographisch reaktiven Träger angeordnet sind.
Description
Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie biomolekularer
Strukturen oder anderer molekularer Strukturen mit einem Gesamtdurchmesser
zwischen 0,1 Nanometer und 200 Nanometer in Rasteranordnungen.
Vielfältige Forschungsergebnisse haben in den letzten Jahren deutlich gemacht,
dass der Zwischenbereich zellulärer "Nano"-Strukturen mit typischen
Abmessungen von etwa 10 Nanometer bis einige hundert Nanometer von größter
Bedeutung für Molekulare Medizin und Pharmaforschung/Entwicklung ist. Dies ist
der Bereich von komplexen Systemen von biologischen Makromolekülen, bei
denen viele einzelne, miteinander in vielfältiger Weise interagierende
Untereinheiten zu einem funktionellen Ganzen verbunden sind. Als Beispiele seien
genannt die dynamische Nanostruktur von Zell-Zell-Kontakte vermittelnden
Komplexen, von membranlokalisierten Proteinkomplexen wie Ionenkanälen oder
Kernporen, von Zytoskelett- und Vesikel-assoziierten Komplexen, sowie der
Komplexe für Replikation, Transkription, Reparatur und Remodellierung des
Genoms.
Der in den letzten Jahren erzielte große Fortschritt in der Entwicklung von
Verfahren der atomaren Kraftmikroskopie, der optischen Nahfeldmikroskopie, der
Fluoreszenzenergietransfermikroskopie, der multispektralen linearen und nicht
linearen Laser-Raster-Mikroskopie sowie der spektralen
Präzisionsdistanzmikroskopie, in Verbindung mit neuen, hochspezifischen und
effizienten molekularen Markierungstechniken macht es möglich, Fragen der
dreidimensionalen (3D) Architektur und Dynamik großer Molekularer Strukturen,
wie z. B. von Multiproteinkomplexen, unter Einschluss physiologischen
Bedingungen mit Aussicht auf Erfolg anzugehen. Im Vordergrund der
beschriebenen Erfindung steht dabei ein Verfahren zur Aufklärung der Topologie
von Molekularen Strukturen, z. B. großen Multiproteinkomplexen, oder Protein-
Nukleinsäurekomplexen von einer unteren Grenze von ca. 10 Nanometer Gesamt-
Durchmesser bis hin zu einer oberen Grenze von einigen 100 Nanometern (1
Nanometer = 1 × 10-9 m). Auf der Ebene der 3D-"Nano"Struktur kommt der
"Anatomie" von supramolekularen Biostrukturen und ihrer Dynamik gegenwärtig
eine fundamentale Rolle bei der zielgerichteten Entwicklung neuer Pharmaka zu.
Beispielsweise ist zu erwarten, dass eine verbesserte Kenntnis der 3D-
Organisation funktionell wichtiger Multiproteinkomplexe, oder von Protein-
Nukleinsäurekomplexen, neue Verfahren zu ihrer Kontrolle ergeben wird. Nach
dem erfolgreichen Abschluss der ersten vollständigen Sequenzierung des
menschlichen Genoms sowie anderer Modellgenome (Genomik) ist eines der
gegenwärtig als vordringlichst angesehenen und mit erheblichen Mitteln
unterstützen Folgevorhaben die Proteomik, d. h. die Erforschung der Strukturen der
aufgrund der DNA-Sequenzinformation gebildeten Proteine und ihrer
pharmakologisch relevanten Wechselwirkungen mit einander und mit anderen
zellulären Strukturen. Als ein Beispiel sei hier die Erforschung von
Transkriptionsrelevanten Multiproteinkomplexen angegeben, die bei der
spezifischen Transkription der genetischen Information in Ribonukleinsäuren (RNA)
von entscheidender Bedeutung sind. Andere Beispiele aus dem Bereich der
Zellkernbiologie betreffen die Multiprotein-Ribonukleinkomplexe, die für das
Processing ("Splicing") der transkribierten RNA in Boten-RNA (m-RNA)
verantwortlich sind (Für weitere Beispiele s. oben).
Im Bereich des Biocomputing gibt es gegenwärtig dramatische Entwicklungen,
deren Einbeziehung in die Analyse der experimentell gewonnenen Topologiedaten
und damit für die Proteomik und die Pharmaforschung von erheblichem Vorteil sein
kann. Mathematische Modellierungsmethoden, unterstützt durch computergrafische
Visualisierung, haben inzwischen einen hohen Grad an berechenbarer Komplexität
erreicht. Diesen Simulationen liegen biochemische oder physikalische
Gesetzmäßigkeiten zu Grunde. Bis zu 50.000 Einzelmoleküle lassen sich bis zu
einer Zeitdauer von 10 Nanosekunden simulieren. Die Modellierung von Dynamik,
Funktion und Biomechanik in molekularbiologischen Anwendungen umfasst bisher
u. a.: Protein-Membran-Komplexe, die Regulation und Packung von Proteinen, DNA-
Bindungsdomänen, sowie verschiedene Strukturproteine. Durch die
mathematische Komplexität ist jedoch eine Beschränkung auf das Verhalten
innerhalb enger Grenzen der strukturellen Hierarchie notwendig. Ein wesentliches
bei solchen Simulationsrechnungen verfolgtes Ziel der modernen Molokularbiologie
und Proteomik ist es, die 3D-Struktur von Komplexen biologischer Makromoleküle
bis ins atomare Detail zu bestimmen: Dies ist erforderlich, um die funktionelle
Wirkung genau zu verstehen und damit effektiver kontrollieren zu können.
Theoretische Modellrechnungen zur Bildung, Umbildung und Auflösung von
Multiproteinkomplexen werden zu einem derartigen vertieften Verständnis ihrer 3D-
Struktur und Dynamik und damit zu einer Optimierung der Wirkstoffentwicklung
wesentlich beitragen. Verfahren des Biocomputing haben es in den letzten Jahren
möglich gemacht, auf der Grundlage von atomaren Strukturdaten von einzelnen
isolierten Untereinheiten auch sterisch mögliche Strukturen von Komplexen aus
solchen Untereinheiten mit hoher "Auflösung" zu berechnen. Es ergeben sich
jedoch oftmals mehrere alternative Struktur-Möglichkeiten, eine experimentelle
atomare Auflösung der Topologie von komplexen Molekularen Strukturen, z. B.
Multiproteinkomplexen, ist mit den hier beschriebenen Analyseverfahren in
absehbarer Zeit zwar kaum erreichbar. Experimentelle Topologie-Messungen mit
einer Distanzauflösung von einigen Nanometern kann die Anzahl der mit atomarer
Auflösung berechneten "möglichen" 3D-Strukturen eines Komplexes ganz erheblich
einschränken. In günstigen Fällen kann es sogar möglich werden, ein bestimmtes
atomar aufgelöstes Modell eines Proteinkomplexes als das einzige mit allen
experimentellen Strukturdaten kompatible zu identifizieren. Liegen (hypothetisches
Beispiel) zwei mit atomarer Auflösung berechnete Alternativen vor, von denen die
eine einen Abstand bestimmter Marker in zwei Untereinheiten A, B von 10
Nanometer, die andere einen Abstand dieser Marker von 20 Nanometer
voraussagt, so kann mithilfe höchstauflösender SPDM (Auflösungsäquivalent z. B. 2
Nanometer) eine der zwei Alternativen verworfen werden, so dass nur noch die
andere infrage kommt.
Zur Untersuchung der räumlichen Topologie von Molekularen Strukturen, z. B. von
Multiproteinkomplexen, werden außerordentlich hohe Strukturauflösungsmethoden
benötigt. Da die typischen Abmessungen der individuellen Bereiche (z. B. einzelne
Proteinuntereinheiten) im Bereich von 5-10 Nanometer liegen, sind je nach
analysiertem Komplex und Zielsetzung Strukturparametermessungen (z. B. 3D-
Distanzen zwischen den Schwerpunkten einzelner Untereinheiten von
Multiproteinkomplexen oder Multiprotein-Nukleinsäurekomplexen) bis hinunter zu
wenigen Nanometern erforderlich. Im Vordergrund der Erfindung stehen
insbesondere solche Molekularen Strukturen, deren Topologie mit anderen
Verfahren (z. B. Elektronenmikroskopie, Röntgenkristallographie, Magnetische
Resonanz) nicht oder nur mit unverhältnismäßig großem Einsatz an Sach- und
Personalmitteln sowie an Zeit bestimmt werden kann. Beispielsweise setzten
kristallographische Untersuchungen die Bildung wenigstens von Mikrokristallen
voraus, ein oftmals langwieriges Verfahren; die Elektronenmikroskopie erlaubt
ebenso wie die Kristallographie nur in begrenztem Maße die Berücksichtigung.
physiologischer Bedingungen; Magnetische Resonanzverfahren erlauben zwar
Strukturuntersuchungen unter physiologischen Lösungsbedingungen, sind jedoch
auf absehbare Zeit auf die Analyse großer Multiproteinkomplexe und anderer
vergleichbar großer Molekularer Strukturen kaum anwendbar.
Dort, wo die zu untersuchenden Molekularen Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe,
in einer essentiell "zweidimensionalen Anordnung" vorliegen, wie bei
Kernporenkomplexen in isolierten Membranen, stehen nach dem Stand der
Technik verschiedene Verfahren zur Verfügung. Neben klassischen
elektronenmikroskopischen Techniken werden hier insbesondere die Atomare
Kraftmikroskopie und "Optische Pinzetten"-Verfahren angewandt, die vor allem
hochaufgelöste Höhenprofile und deren dynamische Änderungen zu messen
gestattet, ggf. in Verbindung mit elektrophysiologischen Funktionsanalysen; in einer
Variante dieser Mikroskopiemethode, der Atomaren Kraft-Spektroskopie, sind auch
Messungen der Kraftwechselwirkungen zwischen Untereinheiten Molekularer
Strukturen möglich. Ein weiteres Verfahren mit einem weiter gesteigerten
Auflösungspotential ist die Optische Nahfeldmikroskopie. Die genannten Methoden
können auch bei begleitenden Untersuchungen an isolierten, d. h. aus ihrem
zellulären oder membranösen Kontext herausgelösten Molekularen Strukturen, z. B.
Multiproteinkomplexen, vorteilhaft angewandt werden. Z. B. kann durch eine solche
Analyse ein genaueres Verständnis des Einflusses physikochemischer Parameter
(z. B. pH, Ionenkonzentration, Temperaturänderungen, Druck), auf die Topologie
des Multiproteinkomplexes gewonnen werden. Bis vor wenigen Jahren war es
allgemeine Meinung, dass lichtoptische Ultrastrukturanalysen individueller
Molekularer Strukturen wegen der auf etwa eine halbe Lichtwellenlänge begrenzten
optischen Auflösung von einigen hundert Nanometern aus grundsätzlichen
physikalischen Gründen nicht möglich seien. Diese Grenzen der optischen
Auflösung können jedoch in vielen Fällen überwunden werden, wenn es gelingt,
spezifische Wechselwirkungen des Lichtes mit den zu analysierenden Molekülen zu
nutzen. Beispielsweise erlauben Verfahren des "Point Spread Function (PSF)
Engineering" gegenwärtig eine fernfeldlichtmikroskopische Auflösung (angegeben
als "Full Width at Half Maximum, FWHM, der Punktbildfunktion/"Point Spread
Function", PSF) von 100 nm in alle drei Raumrichtungen. Theoretische
Überlegungen zeigen, dass mit derartigen Methoden unter Verwendung von Licht
im sichtbaren Spektralbereich noch Auflösungen (FWHM) von 20-30 nm erreicht
werden könnten. Ein anderes neues Verfahren von erheblicher Bedeutung für die
Analyse Molekularer Strukturen betrifft die Optische Nahfeldmikroskopie, mit der in
einer für fluoreszenzoptische Anwendungen geeigneten Anordnung laterale
Auflösungen im Bereich von einigen zehn Nanometern erreicht wurden.
Optische Auflösungen (FWHM) von 20-30 nm wären ausreichend, sehr große
Molekulare Strukturen zumindest teilweise zu analysieren; in vielen Fällen von
erheblicher biomedizinischer/pharmazeutischer Relevanz wird jedoch selbst eine
optische Auflösung von 20-30 nm für sich alleine genommen nicht ausreichend
sein. Mithilfe von spektralen Fluoreszenzresonanzenergietransfermessungen ist es
möglich, Distanzen von wenigen Nanometern zwischen zwei Fluorochrom-
Positionen in einer Struktur abzuschätzen. Beispielsweise kann auf diese Weise
die räumliche Struktur von Chromatin weiter aufgeklärt werden. Diese Technik ist
zwar in der Lage, höchstaufgelöste Distanzbestimmungen im gesamten infrage
kommenden Bereich von Molekularen Strukturen zu machen. Nach dem Stand der
Technik erlaubt das Verfahren jedoch nicht, die Topologie vielfach markierter
individueller Molekularer Strukturen zu analysieren; ferner versagt sie bei
Abständen größer als ca. 10 nm. Für eine effektive Topologieanalyse ist es jedoch
von großem Vorteil, neben kleineren Abständen (z. B. 3 nm) auch größere
Abstände weiter entfernter Bereiche (z. B. 20 nm) detektieren können. Theoretische
Verfahren des Biocomputing sind von größter Bedeutung für die Berechnung einer
eingeschränkten Zahl "möglicher" Strukturalternativen; sie können die Interpretation
experimenteller Messungen an "tatsächlichen" Strukturen wesentlich verbessern,
jedoch nicht ersetzen. Zusammenfassend kann festgestellt werden: Der Bedeutung
des Problems entsprechend gibt es eine Vielzahl von experimentellen Verfahren
zur Struktur- und Topologieanalyse von Molekularen Strukturen. Zum Teil sind
diese Verfahren jedoch nur zur Analyse relativ großer Abstände bzw. sehr kleiner
Abstände geeignet, oder sie einen erheblichen Personal- und Zeitaufwand und sind
daher für Analysen von zahlreichen Molekularen Strukturen in relativ kurzer Zeit
nicht optimal.
Die hier beschriebene Erfindung hat die Analyse der Topologie der
supramolekularen Biostruktur und Dynamik solcher biochemisch,
molekularbiologisch und zellbiologisch bereits charakterisierter "Cluster" von
funktionellen biologischen Makromolekülen mit schwacher Wechselwirkung der
Untereinheiten (z. B. Multiproteinkomplexen) zum Ziel. Überschreiten die
Abmessungen eines einzelnen biologischen Makromoleküls in wenigstens einer
Richtung eine Größe von 10 nm, so ist auch die Analyse eines einzelnen Moleküls
erfindungsgemäß. Erfindungsgemäß sind ferner Analysen synthetisch hergestellter
oder mit biotechnologischen oder chemischen Verfahren modifizierter anderer
Makromoleküle und Makromolekülkomplexe, die in natürlichen biologischen
Systemen nicht vorkommen, sofern die hier beschriebenen Analyseverfahren
angewandt werden. Im folgenden sollen alle genannten
Makromoleküle/Makromolekülkomplexe abkürzend als "Molekulare Strukturen"
bezeichnet werden. Unter "Topologie" wird im Folgenden die relative Lage von
geeignet gekennzeichneten ("markierten") Bereichen der Molekularen Struktur
bezeichnet, zum Beispiel die durch geometrische Distanzbeziehungen
gekennzeichneten Lagebeziehungen von markierten Untereinheiten in einem
Multiproteinkomplex, oder die durch geometrische Distanzbeziehungen
gekennzeichneten Lagebeziehungen von markierten Bereichen in einem aus
Proteinen und Nukleinsäuren oder Nukleinsäureabschnitten bestehenden Komplex.
Die im folgenden beschriebene Erfindung erlaubt es, die oben genannten Nachteile
des Standes der Technik wesentlich zu verringern. Dabei werden in einer neuen,
erfindungsgemäßen Weise verbunden:
- - Nanolithographische Präparationsverfahren und, die eine Anordnung der zu analysierenden Molekularen Strukturen in Rastern ("Arrays") erlauben, die eine auch fernfeldlichtmikroskopische SPDM-Analyse routinemäßig ermöglichen.
- - Verfahren des PSF-Engineering, soweit dies für höchstauflösende Topologieuntersuchungen (z. B. bei zu messenden Distanzen im Bereich von 20 nm und darunter) erforderlich ist.
- - Methoden der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM), unter Verwendung von spektralen Kalibrierungsverfahren auf nanolithographischer Basis.
Im Zusammenhang mit geeigneten, erfindungsgemäßen nanolithographisch
unterstützten Kalibrierungstechniken werden lichtoptische topologische Vielfach-
Messungen an Molekularen Strukturen vom Bereich von einem bis wenigen
Nanometer bis in den Bereich der konventionellen optischen Auflösung von 100 bis
mehrere hundert Nanometer ermöglicht. Bei der bevorzugten
fernfeldlichtmikroskopischen Anwendung ist es möglich, mit dem hier
beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren bis zu mehreren hundert bis
mehrere tausend individuelle Molekulare Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe
oder Multiprotein-Nukleinsäurekomplexe, simultan im Rahmen desselben
fernfeldlichtmikroskopischen Gesichtsfeldes zu analysieren und damit eine rasche,
topologische Hochpräzisionsanalyse zu ermöglichen, insbesondere auch unter
physiologischen Bedingungen (Temperatur, Ionenmilieu, Wirkstoffkonzentration,
elektrische und magnetische Felder).
Die Bildung, Umbildung und Disintegration von Molekularen Strukturen, wie z. B.
Multiproteinkomplexen ist ein entscheidender Prozess ihrer funktionellen Wirkung.
Beispielsweise ist bekannt, dass die enzymatische Wirksamkeit eines
Proteinkomplexes in entscheidender Weise von seiner Topologie unter
physiologischen Bedingungen abhängt. Diese Topologie kann insbesondere auch
durch Pharmaka verändert werden. Die erfindungsgemäße Analyse der 3D- bzw.
4D (3D plus Zeit)-Topologie in Abhängigkeit von Wirkstoffeinflüssen gestattet daher
einen wesentlichen Beitrag für eine weitere Optimierung der Wirkstoffentwicklung;
sie erlaubt es, simultan Molekulare Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe unter
verschiedenen Bedingungen (z. B. Wirkstoffe) auf hierdurch induzierte topologische
Veränderungen getestet werden. Soweit die Molekularen Strukturen, z. B.
Multiproteinkomplexe, in fixierter Form vorliegen, so kann die Analyse der Dynamik
der Topologie durch Vergleich der Präparate in verschiedenen funktionellen
Phasen erfolgen. Für die langfristige Perspektive eines "High Through Put
Screening" besonders vorteilhaft sind dabei fernfeldmikroskopische Verfahren, da
diese vollkommen "berührungsfrei" arbeiten und in kurzer Zeit (z. B. einige Minuten
oder sogar Sekunden) lichtmikroskopische Informationen von hunderten oder
tausenden von Molekularen Strukturen registriert und der Datenanalyse zugeführt
werden können. In Verbindung mit der erfindungsgemäßen nanolithographischen
Kalibrierung, die auch simultan mit der Vermessung der zu analysierenden
Molekularen Strukturen erfolgen kann, und geeigneter Rechnerkapazität, kann
auch eine vergleichbar rasche Analyse der gewonnenen Daten realisiert werden.
Die erfindungsgemäße Anwendung des SPDM-Verfahrens auf die
Topologieanalyse von Molekularen Strukturen in Rasteranordnungen auf einem
nanolithographisch reaktiven Träger erfolgt in folgender Weise:
Das erfindungsgemäße Verfahren soll zunächst am Beispiel der Analyse von
biologisch/pharmazeutisch wichtigen Molekularen Strukturen dargestellt werden.
Methodischer Ausgangspunkt der erfindungsgemäßen Vorgehensweise ist die
Identifizierung von funktionell wichtigen Molekularen Strukturen, beispielsweise von
Multiproteinkomplexen, deren makromolekulare Untereinheiten und gegenseitige
Wechselwirkung aufgrund biochemischer/molekularbiologischer Untersuchungen
bereits hinreichend gut charakterisiert sind. Als Beispiele seien hier genannt die
vielfältigen, hochspezialisierten und funktionell essentiellen, an Membranen (z. B.
Zellmembran, Kernhülle, Vesikel) oder fibrilläre Strukturen (z. B. Elemente des
Zytoskeletts) gebundenen Multiproteinkomplexe; die Komplexe der
Proteindegradationsmaschinerie, die in ihrer Komplexität diejenige der
Proteinsynthese erreichen; sowie die aus zahlreichen Untereinheiten bestehenden
Komplexe der Replikations-, Transkriptions- und Reparatur-"Maschinerie" des
Genoms im Zellkern. Weitere Beispiele sind Verbindungen der oben genannten
Multiproteinkomplexe mit Nukleinsäuren oder Nukleinsäureabschnitten.
Beispielsweise erfolgen die Replikation, Transkription und Reparatur der DNA, die
Bildung von Boten-RNA (m-RNA) aus der transkribierten RNA und deren Transport
vom Zellkern zum Zytoplasma, sowie die Proteinsynthese in solchen Multiprotein-
Nukleinsäure-Komplexen.
Es wird ein nanolithographisch Reaktiver Träger RT mit einer Reaktiven Oberfläche
RO verwendet, wie zum Beispiel bei Grunze et al. beschrieben (Grunze et al.,
Applied Physics Letters, Volume 75, Number 16, 1999; Advance Materials, Volume
12, 808, 2000).
In einem Bereich des Reaktiven Trägers wird durch ein nanolithographisches
Verfahren ein Muster K1 mit Reaktiven Features KF1.1, KF1.2, KF1.3 . . . KF1.N.,
KF2.1, . . . KFM. N erzeugt. Im oben genannten Beispiel werden funktionelle Gruppen
von selbstaggregierenden Monolagen (SAMs) durch einen Elektronenstrahl
kontrolliert modifizieren (Umwandlung von Nitrogruppen in Aminogruppen), so dass
definierte reaktive Features für eine molekülspezifische Ankopplung entstehen.
Mittels dieses nanolitographischen Verfahrens kann man gezielte und räumlich
genau definierte molekulare Modifikation nanostrukturierter Oberflächen herstellen
die die Eigenschaften für einen Träger für das erfindungsgemäße Verfahren
gewährleisten. Die Ausdehnung in einer oder mehreren Raumrichtungen muss
erheblich kleiner als die durch die optische Auflösung des für die
lichtmikroskopische Analyse verwendeten Optischen Systems OS sein.
Gekennzeichnet durch die Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM)
der Punktbildfunktion (Point Spread Function, PSF) verwendeten Optischen
Systems in der betreffenden Raumrichtung, und deren Abstand voneinander größer
ist als die FWHM des verwendeten Optischen Systems. Es werden nun eine oder
mehrere Kalibrierungssubstanz(en) K1, K2 . . . mit einer oder mehreren spektralen
Signaturen Kspecs 1, Kspecs 2, Kspecs 3 an die Reaktiven Features KF1, KF2,
KF3 . . . gebunden, wobei der geometrische Abstand zwischen Kspecs 1, Kspecs 2,
Kpecs 3 usw. auf den Kalibrierungssubstanzen aus anderen Messungen oder aus
den zur Herstellung verwendeten Reaktionsbedingungen bekannt ist. Durch
Wiederholung des nanolithographischen Verfahrens in einem Bereich MEAS des
Reaktiven Trägers RT ein Muster M1 mit Reaktiven Features MF1.1, MF1.2, . . .
MF1.L, MF2.1, MF2.2, . . . MF. L. K erzeugt wird, wobei der mittlere Durchmesser der
Reaktiven Features MF kleiner/gleich dem mittleren geschätzten oder anderweitig
bestimmten Durchmesser der zu analysierenden Molekularen Strukturen MS ist,
und der Abstand der Reaktiven Features MF von einander sowie von den zur
Kalibrierung verwendeten Reaktiven Features KF größer ist als die FWHM des OS
in der betreffenden Richtung. Es werden eine oder mehrere zu messende
Molekulare Struktur(en) MS1, MS2, MS3, . . . (Meßobjekte) an die Reaktiven
Features MF . . . gebunden. Die zu messenden Molekularen Struktur/en MS an
bestimmten chemisch/biochemisch/molekularbiologisch identifizierten Stellen mit
mindestens zwei spektralen Signaturen specs 1, specs 2, specs 3 . . . markiert
werden, die bevorzugt mit denen zur Markierung der Kalibrierungssubstanz
verwendeten identisch sind. Die Abstände und relativen Lagebeziehungen der
durch die spektralen Signaturen identifizierten Positionen auf der/den
Kalibrierungssubstanzen bzw. in den Meßobjekten nach Verfahren der Spektralen
Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) bestimmt wird, wobei die Kalibrierung der
Distanzbestimmung mithilfe der spektral markierten Kalibrierungssubstanzen K1,
K2, . . . erfolgt.
Zur lichtmikroskopischen Identifizierung der Molekularen Strukturen, wie z. B. von
Multiproteinkomplexen und ihrer Untereinheiten, sowie ggf. weiterer Teilregionen,
werden spezifische molekulare Markierungsmethoden eingesetzt. Diese
Markierungsverfahren müssen abgestimmt sein auf das angewandte
Mikroskopieverfahren. Beispielsweise steht für Untersuchungen an fixierten
Molekularen Strukturen bereits jetzt eine Fülle von Möglichkeiten zur Verfügung,
wie die spezifische Bindung von fluoreszierenden Proteinen; insoweit
Nukleinsäuren an der betreffenden Multiproteinkomplexe oder ihrer biologischen
Funktion beteiligt sind, kann deren Position durch Fluoreszenz-in situ
Hybridisierungstechniken mit Fluorochromen von verschiedener spektraler
Signatur (gekennzeichnet beispielsweise durch Unterschiede im
Anregungs/Emissionsspektrum bzw. in der Fluoreszenzlebensdauer) markiert
werden.
Seit einigen Jahren ergeben sich jedoch darüber hinaus ständig sich erweiternde
Möglichkeiten einer in vivo-Markierung spezifischer Untereinheiten von
Multiproteinkomplexen sowie ihrer funktionellen Wechselwirkungspartner. Unter in
vivo-Markierung werden hier Markierungsverfahren verstanden, die eine Analyse
der Molekularen Strukturen unter physiologischen Bedingungen erlauben, zum
Beispiel in einem flüssigen Medium, bei einer auch in lebenden Zellen
vorkommenden Konzentration von Wasserstoffionen (pH) und anderen Ionen und
Molekülen. Zur Zeit sind hier insbesondere Methoden der Verbindung der zu
analysierenden Bereiche mit Konstrukten von "Green Fluorescent Proteins"
verschiedener spektraler Signatur zu nennen. Andere, gegenwärtig in Entwicklung
begriffene Verfahren betreffen die in vivo-Markierung von spezifischen Proteinen,
z. B. mithilfe von einzelsträngigen fluorochromierten oder anders modifizierten
Oligonukleotiden. Zusätzlich zu Unterschieden im Anregungs- und
Emissionsspektrum sind hier insbesondere spektrale Signaturunterschiede
aufgrund der Fluoreszenzlebensdauer von größtem Interesse. Unter spektraler
Signatur werden im Folgenden alle physikalischen Eigenschaften verstanden, die
eine lichtoptische Identifizierung der Markierung gestatten. Unter Licht wird hier der
Bereich elektromagnetischer Strahlung vom Ultravioletten (Vakuumwellenlänge 200
nm) bis zum Infraroten (Vakuumwellenlänge 2000 nm) verstanden. Insbesondere
werden unter spektraler Signatur Fluoreszenzeigenschaften mit der oben
genannten Charakterisierung verstanden. Gegenwärtig kommen für
Fluoreszenzmarkierungen 6-10 gleichzeitig einsetzbare, durch die spektrale
Signatur diskriminierbare Verfahren in Betracht. Durch konsequente
Weiterentwicklung der kürzlich in die Biowissenschaften eingeführten
Fluoreszenzmarkierung mithilfe von "Nanokristallen" (Halbleitersystemen von
1-100 nm Durchmesser), sowie der Synthese neuer, photostabiler Fluorochrome mit
einem erweiterten Spektrum von Fluoreszenzlebensdauern ist die Möglichkeit einer
erheblichen Vermehrung der molekularen Markierungsmöglichkeiten gegeben.
Nach dem Stand der Technik ist derzeit eine Erweiterung auf ca. 16
Markierungsmöglichkeiten grundsätzlich durchführbar. Es ist erfindungsgemäß, die
Markierung auch vor der Bindung der Molekularen Strukturen an den Reaktiven
Träger (s. 2.) oder gleichzeitig mit dieser Bindung durchzuführen, oder eine
Mischung dieser Verfahren, d. h. einige Markierungen vor der Bindung an den
Reaktiven Träger (RT), einige Markerungen während der Bindung an den RT,
sowie einige Markierungen nach der erfolgten Bindung der Molekularen Strukturen
an den RT durchzuführen.
Die lichtoptische Analyse der markierten und an den Reaktiven Träger in einer
Rasteranordnung gebundenen Molekularen Strukturen erfolgt mit
lichtmikroskopischen, bevorzugt fernfeldlichtmikroskopischen Techniken. Neue
fernfeldlichtmikroskopische Verfahren des "Point-Spread-Function-Engineering"
gestatten derzeit experimentell, die optische Auflösung (FWHM) in einer oder
mehreren Raumrichtungen auf etwa 100 Nanometer (d. h. um ein Mehrfaches des
konventionellen Wertes) zu verbessern. Theoretische Analysen ergaben, dass
langfristig im Fernfeld eine optische Auflösung von wenigen zehn Nanometern
(entsprechend einem Zwanzigstel oder weniger der eingesetzten Lichtwellenlänge)
physikalisch möglich ist, sofern spezifische Wechselwirkungsbedingungen realisiert
werden können. Erfindungsgemäß ist der Einsatz aller lichtmikroskopischen,
insbesondere fernfeldlichtmikroskopischen Verfahren unter Einschluss von
Methoden des PSF-Enginering, die sich in geeigneter Weise mit Verfahren der
Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) kombinieren lassen.
Bei dem Verfahren der SPDM handelt es sich um eine Methode der digitalen
Fluoreszenzmikroskopie, die in Verbindung mit den oben beschriebenen Verfahren
der spektral unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierung individueller biologischer
Makromoleküle die Analyse der Topologie von Molekularen Strukturen weit
jenseits der jeweiligen optischen Auflösung (FWHM) des verwendeten
Mikroskopiesystems erlauben. Physikalisch beruht dieses Verfahren auf der
Positionsanalyse spektral diskriminierter "punktförmiger" Einzelobjekte.
Erfindungsgemäß sind auch solche Strukturen, die nur in einer oder zwei
Raumrichtungen eine "punktförmige" Ausdehnung besitzen, d. h. eine Ausdehnung,
die wesentlich kleiner ist als die optische Auflösung (FWHM) des zur Analyse
verwendeten lichtoptischen Systems in dieser Richtung. Bei der Untersuchung von
fluoreszenzmarkierten Genom-Nanostrukturen (hauptsächlich auch Proteinen und
Nukleinsäuren bestehende Molekulare Strukturen) in Zellkernen wurde unter
Verwendung der konfokalen Laser-Rastermikroskopie ein 3D-
"Auflösungsäquivalent" von ca. 50 Nanometer erreicht; d. h. in einzelnen Zellkernen
konnten noch individuelle 3D-Distanzen von 50 Nanometern detektiert werden. Ein
Auflösungsäquivalent von 50 nm ist z. B. ausreichend, zur Analyse der Topologie
von Genom-Nanostrukturen wesentlich beitragen zu können.
Mithilfe der Verbindung der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie mit weiteren
Entwicklungen im Bereich des "Point Spread Function Engineering" und der
"Molekularen Kalibrierung" ist es grundsätzlich möglich, bei geeigneter Markierung
von Unterbereichen der zu analysierenden Multiproteinkomplexe, z. B. eines
Multiproteinkomplexes, ein 3D-Auflösungsäquivalent von wenigen Nanometer zu
erreichen:
- a) Theoretische Analysen der das Auflösungsäquivalent bestimmenden Faktoren haben ergeben, dass unter Verwendung eines geeigneten Fernfeldmikroskopischen Mikroskopiesystems ("Point Spread Function Engineering (PSF)" Mikroskopie, z. B. 4Pi, STED, SMI-Mikroskopie), geeigneter Markierung sowie multiplen Messungen in Verbindung mit "Molekularer Kalibrierung", Auflösungsäquivalente von theoretisch sogar unter einem Nanometer zu erreichen sind ("Picometer range");
- b) Experimentell wurden kürzlich (1999/2000) an markierten "physikalischen" Testobjekten mit ausreichender Photostabilität der eingesetzten Fluorochrome und in Verbindung mit den genannten neuen Methoden der Mikroskopie Distanzen von 10 bis 60 Nanometer mit einem Fehler (Standardabweichung) von 1-2 Nanometer gemessen. Insgesamt ist damit die grundsätzliche Durchführbarkeit topologischer Analysen von geeignet markierten Molekularen Strukturen theoretisch und experimentell gesichert.
Claims (10)
1. Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer
Strukturen, dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen Strukturen einen
Gesamtdurchmesser zwischen 0,1 Nanometer und 200 Nanometer aufweisen, in
definierter Art und Weise zusammen mit Kalibrierungssubstanzen auf einem
nanolithographisch reaktiven Träger angeordnet sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen
Strukturen MS, biologische Makromoleküle wie Proteine, insbesondere
Multienzymkomplexe, biologische oder synthetische Membranen,
Oligonucleotide, DNS, RNS, mRNS, Genomstrukturen und/oder andere
makromolekulare Bestandteile von Zellen und/oder technische Mikrostrukturen
sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass ein
nanolithographisch reaktiver Träger RT mit einer reaktiven Oberfläche RO
verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktive Träger
RT mit einer reaktiven Oberfläche R mittels lithographischer Techniken und
Materialien kontrolliert modifiziert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Bereich
KAL des Reaktiven Trägers durch nanolithographische Verfahren ein Muster K1
mit Reaktiven Features KF1.1, KF1.2, KF1.3 . . . KF1.N., KF2.1, . . . KFM. N erzeugt
wird, deren Ausdehnung in einer oder mehreren Raumrichtungen erheblich
kleiner als die durch die optische Auflösung des für die lichtmikroskopische
Analyse verwendeten Optischen Systems (OS) ist, gekennzeichnet durch die
Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM) der Punktbildfunktion
(Point Spread Function, PSF) von OS in der betreffenden Raumrichtung, und
deren Abstand voneinander größer ist als die Halbwertsbreite FWHM des
verwendeten Optischen Systems (OS).
6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass durch
nanolithographische Verfahren eine oder mehrere Kalibrierungssubstanz(en) K1,
K2 . . . mit einer oder mehreren spektralen Signaturen Kspecs 1, Kspecs 2, Kspecs
3 an die Reaktiven Features KF1, KF2, KF3 . . . gebunden wird/werden, wobei der
geometrische Abstand und die Verteilung zwischen Kspecs 1, Kspecs 2, Kspecs 3
usw. und den Kalibrierungssubstanzen genau definiert und bekannt ist;
7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass durch
nanolithographische Verfahren in einem Bereich (MEAS) des Reaktiven Trägers
RT ein Muster M1 mit Reaktiven Features MF1.1, MF1.2, . . . MF1.L, MF2.1,
MF2.2, . . . MF* erzeugt wird, wobei der mittlere Durchmesser der Reaktiven
Features MF kleiner/gleich dem mittleren geschätzten oder anderweitig
bestimmten Durchmesser der zu analysierenden Molekularen Strukturen MS ist,
und der Abstand der Reaktiven Features MF von einander sowie von den zur
Kalibrierung verwendeten Reaktiven Features KF größer ist als die
Halbwertsbreite (FWHM) des verwendeten Optischen Systems (OS) in der
betreffenden Richtung;
8. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere
zu messende Molekulare Struktur(en) MS1, MS2, MS3,.(Messobjekte) an die
Reaktiven Features MF gebunden werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die zu messende/n
Molekularen Strukturen MS an bestimmten chemisch 1 biochemisch 1 molekular
biologisch identifizierten Stellen mit mindestens zwei spektralen Signaturen specs
1, specs 2, specs 3 . . . markiert werden, die bevorzugt mit denen zur Markierung
der Kalibrierungssubstanz verwendeten identisch sind.
10. Die Abstände und relativen Lagebeziehungen der durch die spektralen
Signaturen identifizierten Positionen auf der/den Kalibrierungssubstanz/en bzw.
in den Messobjekten nach Verfahren der Spektralen
Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) bestimmt wird, wobei die Kalibrierung der
Distanzbestimmung mit Hilfe der spektral markierten Kalibrierungssubstanzen K1,
K2, . . . erfolgt.
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